KR100873090B1

KR100873090B1 - 엘라그산을 함유하는 진주초 추출물의 제조방법 및엘라그산의 분리방법

Info

Publication number: KR100873090B1
Application number: KR1020070009916A
Authority: KR
Inventors: 이영익; 신민수; 강은화
Original assignee: (주)리즈바이오텍
Priority date: 2007-01-31
Filing date: 2007-01-31
Publication date: 2008-12-09

Abstract

본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 엘라그산을 함유하는 진주초 추출물의 제조방법 및 엘라그산의 분리방법에 관한 것이다. 본 발명에 따르면 필란두스(Phyllanthus)속 식물인 진주초로부터 추출한 엘라그산을 함유하는 진주초 추출물 및 엘라그산을 분리정제하는데 최적의 조건을 확립함으로써, 추출물의 활성을 극대화하였다. 특히, 본 발명의 엘라그산을 함유한 진주초 추출물 및 이로부터 분리된 엘라그산은 B형 간염 바이러스 e항원 분비를 억제하면서 세포독성이 낮으므로 간기능 개선, B형 간염 바이러스에 관련된 질환 및 이로 인한 간염 예방 및 치료에 효과적으로 사용될 수 있다.

<화학식 1>

진주초, 진주초 추출물, 엘라그산, B형 간염 바이러스

Description

엘라그산을 함유하는 진주초 추출물의 제조방법 및 엘라그산의 분리방법{Extraction method of Phyllanthus urinaria extract containing ellagic acid and isolation method of ellagic acid}

도 1은 본 발명에 따른 엘라그산 함유 진주초 추출물 및 엘리그산의 분리과정을 나타낸 개략도이고,

도 2은 본 발명에 따른 엘리그산의 바이러스 복제 간암 세포인 HepG2 2.2.15 세포에서 e항원 분비 억제율을 측정한 그래프이고,

도 3는 본 발명에 따른 엘라그산의 여러 용매에서의 흡광도를 나타낸 그래프이고,

도 4는 본 발명에 따른 진주초로부터 대량의 엘라그산 및 엘라그산 함유 진주초 추출물을 분리하는 과정을 나타낸 개략도이고,

도 5은 본 발명에 따른 엘라그산(도 5a) 및 엘라그산 함유 진주초 추출물(도 5b)의 e항원 분비 억제를 나타낸 그래프이다.

본 발명은 엘라그산을 함유하는 진주초 추출물의 제조방법 및 엘라그산의 분리방법에 관한 것이다.

B형 간염 바이러스(HBV)는 인체에 특이적으로 감염되는 헤파드나비리대(Hepadnaviridae) 계통의 바이러스로서, 잠복기는 60~110일 정도이며 다양한 정도의 임상기를 거쳐 90~95%는 감염으로부터 완전히 회복된다. 감염에서 회복되지 않은 환자의 경우에는, HBV DNA가 사람 간세포의 게놈 DNA에 동화되어 만성 활동성 간염, 간경변, 간암 등으로 발전하게 된다. HBV에 의한 만성 간염은 다른 질환과 마찬가지로 만성 바이러스 감염증, 임파종 질환 및 만성신장장애를 일으켜, 결국 사망에까지 이르게 하는 치사율이 매우 높은 질환이라 할 수 있다. 간염(hepatitis)은 우리나라에서 대략 전체인구의 5~8%가, 전 세계적으로는 약 3억 5천만 명의 간염환자가 존재하는 것으로 추산되고 있다(Tiollais and Buendia, Sci . Am., 264: 48, 1991).

B형 간염 바이러스 복제시 3 개(c, s, e항원)의 주요 항원이 만들어지는데 c(core)항원은 구조적 항원 결정체이며 s(surface)항원은 바이러스 표면 단백질에 의해 나타나는 항원 결정체이다. e항원은 B형 간염 바이러스 감염 여부를 알아내는 혈액에서의 표시물질이다. e항원은 B형 간염의 번식에 필수 조건은 아니며 B형 간염 바이러스의 생활사에서의 역할은 아직 확실히 밝혀져 있지 않다. 그러나, e 항원의 유전자가 유사 동물 바이러스에서 보존된 것으로 미루어 볼 때 상기 항원이 중요한 역할을 수행하리라는 것이 추측되고 있다. 따라서, e항원은 바이러스를 제거하기 위한 면역학적인 목표물로서, 특히 숙주가 바이러스를 제거하는데 중요한 역할을 한다(Pignatelli, M. et al., J. Hepal. 4, 15-16, 1987). 용해성인 e항원은 혈액 상에서 순환되며 분비되는 성질을 가지고 있다. e항원은 혈청에 분비되어 존재하며 태반을 통해 어머니에게서 신생아에게 전달될 가능성은 있으나 s항원이 전달될 가능성은 없다. e항원 양성인 어머니로부터 태어난 신생아는 HBV에 감염되면 만성으로 가기가 쉽다.

간염 바이러스에 의한 질환을 치료하는 이상적인 방법은 감염된 간 세포를 활발하게 파괴시키면서 간염 바이러스의 중화 항체로 재생하고 있는 간세포에 바이러스가 재감염되는 것을 막고, 이와 동시에 HBV 증식을 억제시켜 간염 바이러스를 제거하는 것이다. 실제로 간염 바이러스는 강력한 발암인자로서, 우리나라 암 사망률 제3위를 차지하는 간암의 경우 환자 70%가 B형, 10%가 C형 간염 바이러스의 감염에 의한 것으로 보고되어 있으므로 바이러스의 전염을 차단하고 바이러스 증식을 억제하는 것은 간암의 위험성을 줄이는 지름길이 된다.

대부분의 바이러스 질환에서와 마찬가지로 항 HBV 의약품도 개발되어 사용되는 제품이 많지 않아 임상 의사들이 간염 등을 치료하는데 곤란을 겪고 있다. 실제로 바이러스학은 상당히 발전되어 HBV를 포함한 인체에 질병을 일으키는 대부분 바이러스의 증식 과정이 잘 밝혀져 있고, 현재는 이를 토대로 병원성 바이러스에 대한 치료제를 개발하려는 경쟁이 치열해지고 있다.

현재 개발되어 유통되고 있는 B형 간염 백신은 효율적이고 안전하여 백신 자체로서의 문제는 별로 없지만, 생산 단가가 매우 높은데다 3 번에 걸쳐 주사해야 하는 등 여러 가지 불편과 예방 비용의 상승요인을 가지고 있어서 저개발국가들에 대한 보급 확대의 어려움이 따르고 있다.

지금까지 사용된 항바이러스 제제로는 주로 뉴클레오시드 유도체(nucleoside analogue)를 이용하여 개발된 제품이 있다. 이외에도 천연물로부터 새로운 물질을 얻어 항바이러스 제제를 생산할 수 있다면 제약산업뿐 아니라 다른 생물학 분야에도 광범위하게 이용될 것으로 보인다.

최근 식물 유래의 천연물이 B형 간염 바이러스의 항원과 항체의 결합을 저해하면서 바이러스의 증식을 억제한다고 보고되어 천연물로부터 항 간염 활성을 갖는 물질을 탐색하려는 시도가 박차를 가하게 되었지만 그 구체적인 작용 기작에 대해서는 현재까지 명확히 밝혀진 것이 없는 실정이다.

진주초(珍株草, Phyllanthus urinaria)는 필란두스속에 속하는 1년생 초본이다. 진주초의 줄기는 곧게 자라며 줄기에는 여러 개의 가지가 착생한다. 기록에 의하면 50 cm 내외로 자란다고 되어 있지만 비배(肥培) 조건만 좋게 하면 20~30 cm가 더 자랄 수가 있다. 가지는 줄기뿐만 아니라 줄기 밑 부분에서 다수 착생할 수가 있다. 줄기는 매우 메마르고 전초를 건조할 때 잎은 매우 잘 떨어지기 때문에 건조물에는 줄기와 가지만이 남는다. 잎은 가지에 엇갈려 착생 하나 잎자루는 매우 짧다. 잎은 장타원형 또는 피침형이지만 잎새 끝 부분은 약간 날카롭다. 잎의 길이는 2 cm 내외이고 꽃은 자웅일가인데, 특징적인 것은 꽃이 잎사귀와 줄기가 붙어있는 데에 착생하며 꽃자루는 짧다는 것이다. 그 모양은 마치 노란 작은 방망이가 붙어 있는 것 같고 6~7 월에 개화하며 얼핏 보기에는 좁쌀알이 붙어 있는 것 같이 보인다. 과실은 삭과이고 동글납작하고 약간 하수상태로 줄기에 붙어있다. 초가을에 성숙되면 과피가 세 갈래로 갈라지면서 까만색의 종자를 산개(散開)한다. 또한, 여우구슬, 야합진주, 야합초, 엽후주, 유감초, 어린초라고도 부른다.

필란두스속 식물은 전 세계적으로 넓게 분포되어 자라고 약 700여 종이 최소한 10 개의 속으로 나뉘어져 구별된다(Holm-Nielsen, L. B., 1979. Comments on the distribution and evolution of the genus Phyllanthus, 277-290, In: K. Larsen and L. B. Holm-Nielsen (eds.), Tropical botany, Academic Press, New York). 이러한 필란두스속 식물은 인도, 중국, 태국, 브라질 등에서 민간약재로서 널리 쓰여져 왔는데, 그 효과도 광범위하여 항 경련작용(Calixto, J. B. et al., Antispasmodic effects of an alkaloid extracted from Phyllanthus sellowianus. Braz. J. Med. Biol. Res., 17:3-4, 313-321,1984), 진통 작용(Santos, A. R. et al., Analgesic effects of callus culture extracts from selected species of Phyllanthus in mice, J. Pharm. Pharmacol., 46:9, 755-759, 1994), 해독작용(Syamasundar, K. V. et al., Antiheoatotoxic principles of Phyllanthus niruri herbs, J. Ethnopharmacol., 14:1, 41-44, 1985)등이 있는 것으로 보고된 바 있다(Bunyapraphatsara, N., 1987, Uses of Phyllanthus species in traditional Thai medicine. Translated from nine books in Thai. Medicinal Plant Infomation Center, Mahidol Univ., Bangkok; Kirtikar, K. P, and B. D. Basu., 1975, Indian medicinal plants. 2nd ed. 4 vols. Jayyed Press, New Delhi; Morton, J. F., 1981, Atlas of medicinal plants of Middle America; Bahamas to Yucatan Charles C., Thomas Publ., Springfield, IL.).

한편 간염 및 간암을 유발하는 B형 간염 바이러스에 대한 억제제 및 치료제로서의 가능성도 시사되었으며 필란두스속 식물 중 필란두스 아마루스(Phyllanthus urinarua), 필란두스 데빌리스(Phyllanthus debilis), 필란두스 프라터루스(Phyllanthus fraternus), 필란두스 니루리(Phyllanthus niruri), 필란두스 우리나리아(Phyllanthus urinarua) 등이 효과가 있다는 간접적인 결과도 도출된바 있다(Unander, D. W. et al., 1990. Phyllanthus species:Sources of new antiviral compounds, 518-521. In: J. Janick and J. E. Simon(eds), Advances in new crops. Timber Press, Portland. OR).

현재까지 이들 필란두스 식물로부터 간염과 간암에 예방 및 치료 효과가 있 는 활성물질을 분리하려는 시도가 계속되고 있으나, 유효성분을 추출하는 방법에 차이가 많으며 효과를 측정하는 방법도 정립되어 있지 않아 기작 및 효과를 정확하게 밝힌 예는 없다. 실제로 필란두스 식물 중 연구가 가장 많이 되어 있는 필란두스 니루리(Phyllanthus niruri)의 예에서 칼릭토와 요시(Calixto, J. B and Joshi, B. S.) 등은 필란두스 니루리의 구성성분 중 알칼로이드(alkaloid)가 유효성분으로 작용한다고 보고하였으나, 시아마순다(Syamasundar, K. V.) 등은 헥산 추출물에 활성성분이 포함되어 있다고 주장하였다(Calixto, J. B. et al., Antispasmodic effects of an alkaloid extracted from Phyllanthus sellowianus. Braz. J. Med. Biol. Res., 17:3-4, 313-321, 1984; Joshi, B.S. et al., Isolation and structure of ent-norsecurinine, an alkaloid from Phyllanthus niruri, J, Nat. Prod., 49:4, 614-620, 1986; Syamasundar, K. V. et al., Antihepatotoxic principles of Phyllanthus niruri herbs. J. Ethnopharmacol., 14:1, 41-44, 1985). 또한 다른 연구진들은 70% 에틸알콜을 이용한 추출물에 활성성분이 있다고 보고하거나, 메탄올 추출물에 활성성분이 포함되어 있다고 하는 등 효과적인 활성성분의 분리, 정제 및 그 작용 기작을 밝히는 과정에도 논란이 많은 실정이다(Shimizu, M. et al., Studies on aldose reductase inhibitors from natural product. Chem. Pharm. Bull. (Tokyo), 37:9, 2531-2532, 1989; Santos, A. R. et al., Analgesic effects of callus culture extracts from selected species of Phyllanthus in mice. J. Pharm. Phamacol., 46:9, 755-759, 1994).

또한 필란두스 우리나리아의 경우에도 그 수성 추출물이 활성물질을 포함되고 B형 간염 바이러스로 인한 질환의 치료에 사용될 수 있다고 알려져 왔다(대한민국 공개특허 제96-0033462호; Herbs of the genus Phyllanthus in the treatment of chronic hepatitis B. J. Lab. clin. Med., 126: 4, 350-352, 1995).

이에, 본 발명자들은 천연물 중 항 B형 간염 바이러스 활성을 보이는 물질을 선별하여 간염 치료제로 개발하고자 연구한 결과, B형 간염 바이러스 e항원(HBeAg) 분비 억제하고 면역력도 증진시키며 세포 독성이 낮아 B형 간염의 예방 또는 치료에 유용한 엘라그산 함유 진주초 추출물 및 엘라그산 분리의 최적 조건을 확립함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 필란두스속 식물인 진주초에서 항 B형 간염 바이러스 물질인 엘라그산 및 엘라그산을 함유하는 진주초 추출물의 추출방법 또는 엘라그산의 분리방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 추출방법 또는 분리방법에 의해 추출 또는 분리된 엘라그한 함유 진주초 추출물 또는 엘라그산을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 엘라그산 함유 진주초 추출물 또는 엘라그산을 유효성분으로 함유하는 B형 간염 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공하는 데 있다.

상기 기술적 과제를 달성하기 위하여, 본 발명은 진주초로부터 엘라그산 함유 진주초 추출물의 제조방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 진주초로부터 엘라그산의 분리방법을 제공한다.

나아가, 본 발명은 진주초 건조물을 pH는 4~11 및 0.85~0.95% 염화나트륨 수용액으로 추출하여 엘라그산 함유 진주초 추출물을 얻는 단계(단계 1); 상기 단계 1에서 얻은 진주초 추출물을 40% 에틸알콜에 용해시킨 후, 2가 음이온 HP-20 컬럼에 로딩하고 에틸알콜의 농도를 99% 이상까지 증가시키면서 용출시키는 단계(단계 2); 및 상기 단계 2에서 얻은 70~99% 에틸알콜로 용출시킨 추출물을 분취용 액체 크로마토그래피를 수행하여 엘라그산을 함유하는 구간만을 분취하는 단계(단계 3)를 포함하여 이루어지는 엘라그산 단순 및 다량 분리방법을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 진주초로부터 엘라그산 함유 진주초 추출물의 제조방법을 제공한다.

상기 추출물은 증류수, 에틸알콜 및 염화나트륨 수용액으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 1종 이상의 추출용매에 진주초 건조물을 침적하여 얻을 수 있다. 상기 침적 과정은 수회 반복 수행할 수 있다. 이후, 상기 추출 과정에서 용출된 추출용액을 여과하여 추출액을 얻은 후 원심분리를 거쳐 침전물을 제거하고 상층액을 취함으로써 본 발명에 따른 진주초 추출물을 얻을 수 있다.

상기 추출용매는 염화나트륨 수용액이 바람직하다. 특히, 상기 염화나트륨 수용액의 pH는 4~11이고, 농도는 0.85~0.95%인 것이 더욱 바람직하다. 상기 염화나트륨 수용액을 이용한 추출 과정은 2회 이상 반복 수행할 수 있다.

여러 추출용매 사용시의 진주초로부터 엘라그산 수획률을 확인하기 위한 실험에서, 증류수, 100% 에틸알콜, 50% 에틸알콜, pH 7.2의 0.9% 염화나트륨 수용액, pH 8.0의 0.9% 염화나트륨 수용액 및 pH 9.0의 0.9% 염화나트륨 수용액 이용시에 1 N 수산화나트륨 수용액 이용시보다 엘라그산의 수획율이 높게 나타남을 확인할 수 있다. 따라서, 진주초로부터 엘라그산을 추출하기 위하여 증류수, 100% 에틸알콜, 50% 에틸알콜, pH 7.2의 0.9% 염화나트륨 수용액, pH 8.0의 0.9% 염화나트륨 수용액 및 pH 9.0의 0.9% 염화나트륨 수용액을 이용할 수 있고, 보다 고수율로 엘라그산을 분리하기 위해서는 pH 8.0의 0.9% 염화나트륨 용액의 사용이 효율적임을 알 수 있다(표 4 참조).

본 발명에 따른 상기 화학식 1로 표시되는 엘라그산(ellagic acid)은 C₁₄H₆O₈의 분자식을 갖고, 300~360 ℃의 녹는점 및 노란색 분말의 성상을 나타내는 페놀성 화합물이다. 엘라그산 또는 그의 히드록시기 대신 독립적으로 수소 또는 알콕시드기를 포함하는 엘라그산 유도체는 바이러스성 간염 상태로 유지되는 B형 간염 바이러스 e항원의 분비를 억제하여 만성 또는 급성 간염의 예방 및 치료 효과가 있음이 보고되어 있다(대한민국 등록특허 제0555907호).

상기 방법은 진주초 건조물을 pH는 4~11 및 0.85~0.95% 염화나트륨 수용액으로 추출하여 엘라그산 함유 진주초 추출물을 얻는 단계(단계 1); 상기 단계 1에서 얻은 진주초 추출물을 클로로포름과 메탄올 혼합용매를 전개용매로 사용하여 실리카겔 컬럼 크로마토그래피를 수행하고 분획시키는 단계(단계 2); 상기 단계 2에서 얻은 엘라그산 함유 진주초 분획물을 클로로포름:메탄올:물 혼합용매를 전개용매로 사용하여 실라카겔 컬럼 크로마토그래피를 재수행하고 재분획시키는 단계(단계 3); 및 상기 단계 3에서 얻은 엘라그산 함유 진주초 분획물을 아세토니트릴:포름산 혼합용매를 전개용매로 사용하여 분취용 액체크로마토그래피를 수행하고 엘라그산을 함유하는 구간 만을 분취하는 단계(단계4)를 포함하여 이루어지는 엘라그산 분리방법을 제공한다.

본 발명에 따른 상기 분리방법에 있어서, 상기 단계 1은 엘라그산 함유 진주초 추출물을 추출하는 방법으로써, 전술한 추출방법과 동일하다.

본 발명에 따른 상기 분리방법에 있어서, 상기 단계 2는 상기 단계 1에서 얻은 진주초 추출물을 클로로포름과 메탄올 혼합용매를 전개용매로 사용하여 실리카겔 컬럼 크로마토그래피를 수행하고 분획시키는 단계이다. 상기 단계 1에서 얻은 진주초 추출물을 90 부피% 메탄올에서 10 부피% 메탄올로 농도 구배된 클로로포름과 메탄올 혼합용매를 전개용매로 사용하여 시간당 475~525 ml의 속도로 실리카겔 컬럼 크로마토그래피를 수행하여 엘라그산 함유 진주초 분획물을 얻을 수 있다.

본 발명에 따른 상기 분리방법에 있어서, 상기 단계 3은 단계 2에서 얻은 엘라그산 함유 진주초 분획물을 클로로포름:메탄올:물 혼합용매를 전개용매로 사용하여 실라카겔 컬럼 크로마토그래피를 재수행하고 재분획시키는 단계이다. 상기 클로로포름, 메탄올 및 물의 혼합용매는 순서대로 70:10:1의 부피비로 혼합하여 사용할 수 있으며 컬럼의 용출속도는 시간당 95~105 ml인 것이 바람직하다. 상기 엘라그산 함유 진주초 분획물은 TLC 패턴에 따라 Rf값= 0.5의 분획물로 분취할 수 있다.

본 발명에 따른 상기 분리방법에 있어서, 상기 단계 4는 상기 단계 3에서 얻 은 엘라그산 함유 진주초 분획물을 아세토니트릴:포름산 혼합용매를 전개용매로 사용하여 분취용 액체크로마토그래피를 수행하고 엘라그산을 함유하는 구간만을 분취하는 단계이다. 상기 분취용 액체크로마토그래피의 전개용매로는 아세토니트릴:포름산의 혼합용매를 10:90의 부피비에서 시작하여 최종 부피비가 45:55가 되도록 농도 구배시켜 사용하고, 상기 컬럼의 용출속도는 분당 9.5~10.5 ml인 것이 바람직하다. 엘라그산에 해당하는 피크가 관찰되는 구간을 분취하여 엘라그산을 얻을 수 있다.

본 발명에 따른 진주초로부터 엘라그산을 단순 및 다량 분리하는 방법에 있어서, 상기 단계 1은 진주초 건조물을 pH 4~11 및 0.85%~0.95% 염화나트륨 수용액으로 추출하여 상기 화학식 1로 표시되는 엘라그산 함유 진주초 추출물을 얻는 단계로서, 전술한 진주초 추출물을 얻는 방법과 동일한 방법으로 수행할 수 있다.

본 발명에 따른 진주초로부터 엘라그산을 단순 및 다량 분리하는 방법에 있어서, 상기 단계 2는 상기 단계 1에서 얻은 진주초 추출물을 에틸알콜에 용해시킨 후, 컬럼 크로마토그래피를 수행하여 에틸알콜의 농도를 증가시키면서 용출시키는 단계이다. 상기 단계 1의 진주초 추출물을 용해시키는 최초 에틸알콜의 농도는 40%인 것이 바람직하며, 상기 컬럼 크로마토그래피에 로딩하여 최종 용출 시점의 에틸알콜 농도는 99%까지 증가시키는 것이 바람직하다. 또한, 상기 단계 2에서 사용되는 컬럼 크로마토그래피는 2가 음이온 HP-20(Dianion HP-20)을 사용하는 것이 바람직하다.

본 발명에 따른 진주초로부터 엘라그산을 단순 및 다량 분리하는 방법에 있어서, 상기 단계 3은 상기 단계 2의 2가 음이온 컬럼 크로마토그래피로부터 용출된 에틸알콜 용출 추출물을 분취용 액체 크로마토그래피를 수행하여 엘라그산을 함유하는 구간만을 분취하는 단계이다. 이때, 상기 분취용 액체 크로마토그래피를 수행하는 상기 용출 추출물은 70% 이상 99% 이하의 에틸알콜로 추출한 용출 추출물이 바람직하다. 엘라그산을 함유한 구간은 전술한 엘라그산 함유 분획물에서의 TLC 패턴에 따라 선택할 수 있다.

또한, 본 발명은 진주초로부터 상기 추출방법 또는 분리방법에 의해 추출 또는 분리되는 엘라그산 함유 진주초 추출물 또는 엘라그산을 제공한다.

나아가, 본 발명은 엘라그산 함유 진주초 추출물 또는 엘라그산을 유효성분으로 함유하는 B형 간염 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 엘라그산 함유 진주초 추출물 또는 엘라그산을 유효성분으로 함유하는 간기능 개선제를 제공한다.

B형 간염 바이러스 e항원은 B형 간염 바이러스의 유전정보를 담고 있는 것으로 알려져 있다. 따라서, 혈액 중 B형 간염 바이러스 e항원의 존재, 즉 B형 간염 바이러스 e항원 검사가 양성으로 나온다면 이는 혈액 중에 복제가 가능한 완전한 형태의 B형 간염 바이러스가 존재함을 의미한다. 그러므로 상기 e항원의 분비를 억제하는 물질은 B형 간염 바이러스의 예방 및 치료에 있어서 중요한 역할을 한다(Pignatelli, M. et al., J. Hepal., 4. 15-16, 1987).

본 발명에 따른 엘라그산 함유 진주초 추출물 또는 엘라그산이 B형 간염 바이러스에 대한 항 B형 간염 바이러스 e항원의 세포 외 분비에 미치는 알아보기 위한 효소면역측정실험을 수행한 결과, 본 발명에 따른 엘라그산 함유 진주초 추출물 또는 엘라그산은 세포 외부(extracellular)로 분비되는 바이러스 e항원의 생성을 급격히 감소시킴으로써 강력한 항 B형 간염 바이러스 활성을 나타내었다(실험예 1, 도 5a 및 도 5b 참조).

본 발명에 따른 엘라그산 함유 진주초 추출물 또는 엘라그산을 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물은 상술한 바와 같이, 분자 수준에서 B형 간염 바이러스 e항원(HBeAg)의 분비를 효과적으로 억제함으로써, 바이러스에 의한 인체 면역 무반응을 억제하여 인체에 대한 독성이나 부작용이 없는 간기능 개선제의 약학적 조성물을 조성할 수 있다.

따라서, 본 발명에 따른 엘라그산 함유 진주초 추출물 또는 엘라그산은 B형 간염 바이러스 e항원(HBeAg)의 분비를 더욱 효과적으로 억제하여 B형 간염의 예방 및 치료제 및 간기능 개선제로 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명에 따르면, B형 간염 예방 및 치료, 및 간 기능 개선을 위하여, 엘라그산 함유 진주초 추출물 또는 엘라그산을 유효성분으로서 약학적으로 허용되는 담체와 혼합하여 이들 질병의 예방 및 치료용 약학 조성물을 제조할 수 있다.

상기 약학 조성물은 통상적으로 사용되는 부형제, 붕해제, 감미제, 활택제, 향미제 등을 추가로 포함할 수 있으며, 통상적인 방법에 의해 정제, 캅셀제, 산제, 과립제, 현탁제, 유제, 시럽제, 기타 액제 또는 비경구 투여용 제제와 같은 단위 투여형 또는 수회 투여형 약학적 제제로 제형화 될 수 있다.

본 발명의 엘라그산 함유 진주초 추출물 또는 엘라그산을 유효성분으로 함유하는 간 기능 개선, B형 간염 예방 및 치료용 조성물을 목적하는 바에 따라 비경구 투여하거나 경구 투여할 수 있으며, 하루에 체중 1 ㎏당 0.1~500 mg, 바람직하게는 1~100 mg의 양으로 투여되도록 1 내지 수회에 나누어 투여할 수 있다. 특정 환자에 대한 투여용량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강 상태, 식이, 투여 시간, 투여 방법, 배설율, 질환의 중증도 등에 따라 변화될 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 약학 조성물과 동일한 목적으로 엘라그산 함유 진주초 추출물 또는 엘라그산은 식품 또는 음료에 첨가될 수 있다. 이 경우, 엘라그산 함유 진주초 추출물 또는 엘라그산은 식품 또는 음료의 제조시에 원료에 대하여 0.01~20 중량%, 바람직하게는 0.1~5 중량%의 양으로 첨가될 수 있다. 건강보조 식품용 개발을 위하여 상기 화합물을 첨가할 수 있는 식품으로는, 예를 들어, 육류, 음료수, 초코렛, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 수프, 토마토 페이스트, 차, 알콜 음료류, 비타민 복합제 등이 있다.

이하 실시예, 실험예 및 도면을 통해 본 발명을 상세히 설명한다. 단, 하기의 실시예, 실험예 및 도면은 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기의 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 진주초로부터의 진주초 추출물 및 엘라그산의 분리

도 1의 개략도에 나타난 바와 같이, 진주초 건조물을 pH 8.0의 0.9% 염화나트륨 수용액에 침적하여 추출하고 여과한 후 진주초 추출액을 얻었다. 상기 추출액을 1/2로 농축하여 실리카겔 컬럼 크로마토그래피에 로딩하고 클로로포름:메탄올 혼합용매를 전개용매로 사용하여 용출시켜 진주초 분획물들을 얻었다. 상기 전개용매는 처음에는 클로로포름만을 사용하였고 이후 메탄올을 농도 구배시켜 사용하였다. 상기 분획물들을 TLC 패턴에 따라 확인하고 진주초 분획물을 얻었다. 확인된 진주초 분획물을 클로로포름:메탄올:물(70:10:1) 혼합용매를 전개용매로 사용하여 시간당 100 ml의 속도로 실리카겔 컬럼 크로마토그래피를 재수행하여 TLC로 확인하면서 용출시켜 엘라그산 함유 진주초 분획물을 얻었다. 이후, 상기 엘라그산 함유 진주초 분획물을 분취용 액체크로마토그래피를 수행하여 엘라그산 존재 구간의 피크를 분취한 후 엘라그산을 분리하였다.

<실시예 2> 엘라그산의 단순 대량 추출, 정제

도 4의 개략도에 나타난 바와 같이, 고수율로 엘라그산을 분리하기 위하여 진주초 건조물을 pH 8.0의 0.9% 염화나트륨 수용액에 침적하여 추출하고 여과한 후 진주초 추출물을 얻었다. 상기 추출물을 농축하여 40% 에틸알콜에 녹인 후 2가 음이온 HP-20 컬럼에 로딩하고 에틸알콜 농도를 높여 70% 이상 99% 이하 농도의 에틸알콜로 추출하여 분획물들을 얻었다. 상기 70~99% 에틸알콜로 용출시킨 분획물들을 TLC 패턴에 따라 확인하고, 분취용 액체 크로마토그래피를 수행하여 엘라그산 존재 구간의 피크를 분취한 후 엘라그산을 분리하였다.

<실험예 1> 엘라그산의 분석 실험

실시예 1에서 얻은 진주초 추출물, 진주초 분획물 및 엘라그산에 대하여 물 리·화학적 성질, UV, IR, NMR 및 FAB-MS 측정을 수행하였다. 상기 측정 결과를 표 1, 표 2 및 표 3에 나타내었다.

성상	노란색 분말
녹는점(℃)	300~360
분자식	C₁₄H₆O₈
FAB-MS(m/z)	301[M-H]^-
UV(λ_max _nm)	302.92, 364.91
IR(V_max _nm)	3380, 1720, 1690, 1610
용해성	DMSO, EtOAc, MeOH

표 1은 본 발명에 따라 분리한 화학식 1 엘라그산의 물리·화학적 성질을 ㄴ나타낸다. 엘라그산은 300~360 ℃의 녹는점 및 노란색 분말의 성상을 갖는 페놀성 화합물로, FAB-MS 분석 결과로부터 302의 분자량을 갖음을 알 수 있다. 또한, 흡광도 확인 결과 자외선 영역에서 302.92 및 364.91 nm의 파장에 대해, 적외선 영역에서는 3380, 1720, 1690 및 1610 nm의 파장에 대해 흡수 스펙트럼을 나타내었다. 용해도 확인 결과, 디메틸설폭시드, 에틸아세테이트 및 메탄올의 극성 용매에 용해됨을 알 수 있었다.

위치	¹³C-화학이동	¹H-화학이동
1	121.790	-
2	145.867	-
3	149.015	7.47(s)
3'	-	7.47(s)
4	157.58	-
5	119.734	-
6	117.161	-
7	168.601	-

표 2는 ¹H-NMR 및 ¹³C-NMR 확인 결과를 나타낸 것이다. ¹H-NMR 확인 결과에서 7.47의 단일 피크를 확인하였으며, ¹³C-NMR 확인 결과에서 168.601, 157.58, 149.015, 145.867, 121.790, 119.734 및 117.161 ppm의 피크를 확인하였다.

또한, 도 3에 나타난 바와 같이, 여러 용매(증류수, 50% 에틸알콜, pH 7.2의 0.9% 염화나트륨 수용액, pH 8.0의 0.9% 염화나트륨 수용액, pH 9.0의 0.9% 염화나트륨 수용액 및 pH 10.0의 0.9% 염화나트륨 수용액)에 대하여 흡광도를 확인할 수 있었다. 이때, 250nm 피크에 대한 흡광도를 표 3에 나타내었다.

UV= 250 nm		흡광도
ⓐ 증류수		0.3391
ⓑ 50% 에틸알콜		0.6169
0.9% 염화나트륨 수용액	ⓒ pH 7.2	0.3251
	ⓓ pH 8.0	0.8826
	ⓔ pH 9.0	0.549
	ⓕ pH 10.0	0.3153

표 3에 나타난 바와 같이, 엘라그산은 물이나 에틸알콜보다도 pH 8.0의 0.9% 염화나트륨 용액에 대하여 가장 높은 흡광도를 갖음을 알 수 있다(도 3 참조). 이는 상기 용액에 가장 많은 엘라그산이 녹아 있음을 의미한다. 따라서, 진주초로부터 보다 고수율로 엘라그산을 분리하기 위해서는 pH 8.0의 0.9% 염화나트륨 수용액으로 추출하는 것이 효율적임을 알 수 있었다.

<실험예 2> 여러 추출용매 사용시의 진주초로부터 엘라그산 수획률 조사

진주초 건조물을 증류수, 100% 에틸알콜, 50% 에틸알콜, pH 7.2 0.9% 염화나트륨 수용액, pH 8.0 0.9% 염화나트륨 수용액, pH 9.0 0.9% 염화나트륨 수용액 및 1 N 수산화나트륨 수용액에 각각 100 mg/ml이 되도록 침적한 후 침출액을 여과한 후 고성능 액체크로마토그래피를 사용하여 엘라그산의 함유율을 측정하였고, 그 결과를 표 4에 나타내었다.

추출용매		엘라그산 수획률(%/mg)
증류수		0.341
100% 에틸알콜		0.069
50% 에틸알콜		0.346
0.9% 염화나트륨 수용액	pH 7.2	0.455
	pH 8.0	0.540
	pH 9.0	0.412
1 N 수산화나트륨 수용액		0.066

표 4에 나타난 바와 같이, 증류수, 100% 에틸알콜, 50% 에틸알콜, pH 7.2의 0.9% 염화나트륨 수용액, pH 8.0의 0.9% 염화나트륨 수용액 및 pH 9.0의 0.9% 염화나트륨 수용액 이용시에 1 N 수산화나트륨 수용액 이용시보다 엘라그산의 수획률이 높게 나타남을 확인할 수 있었다. 따라서, 진주초로부터 엘라그산을 추출하기 위하여 증류수, 100% 에틸알콜, 50% 에틸알콜, pH 7.2의 0.9% 염화나트륨 수용액, pH 8.0의 0.9% 염화나트륨 수용액 및 pH 9.0의 0.9% 염화나트륨 수용액을 이용할 수 있고, 보다 고수율로 엘가르산을 분리하기 위해서는 pH 8.0의 0.9% 염화나트륨 용액의 사용이 효율적임을 알 수 있었다.

<실험예 3> 바이러스 복제 간암 세포에서 e항원 분비 억제율 측정

1-1. HepG2 2.2.15 세포의 배양

본 발명의 실시예 1의 엘라그산 및 실시예 2의 엘라그산 또는 엘라그산 함유 진주초 추출물의 항 간염 바이러스 활성을 측정하기에 앞서, 인간의 간 조직에서 유래된 HepG2 세포(human hepatoblastoma cell)에 B형 간염 바이러스의 유전자가 삽입되어 있어 B형 간염 바이러스의 e항원(HBeAg)을 배지로 배출하는 2.2.15 세포주(Keui Ueda et al., Virology 169, 213-21, 1989)를 배양하였다. 구체적으로, 상기 2.2.15 세포를 지름 10 cm 페트리디쉬에 4 ㎍/㎖의 겐타마이신(Gm; 시그마사)과 10%의 열처리된 우태아 혈청(Fetal bovine serum, FBS; 깁코)이 첨가된 MEM 배지(깁코)에서 37 ℃, 5% CO₂조건으로 배양하고 세포 단층이 형성되면 3~4일 간격으로 트립신을 처리하여 계대하였다.

1-2. 엘라그산이 B형 간염 바이러스 e항원의 생성에 미치는 효과 측정

본 발명의 실시예 1의 엘라그산 및 실시예 2의 엘라그산 또는 엘라그산 함유 진주초 추출물이 B형 간염 바이러스 e항원의 생성에 미치는 효과를 측정하기 위하여, B형 간염 항원 진단용 시약(Enzygnost HBeAg monoclonal; 베링)을 이용하여 효소면역측정법을 수행하였다. 구체적으로, 상기 실험예 1-1에서 배양된 2.2.15 세포를 24-웰 플레이트에 웰당 2 × 10⁴ 개의 농도로 FBS가 포함되지 않은 MEM 배지 배양액 100 ㎕와 함께 첨가하고 37 ℃, 5% CO₂ 배양기에서 24시간 동안 배양한 다음, 본 발명의 엘라그산 또는 엘라그산 함유 진주초 추출물을 농도별로 처리하였다. 엘라그산 또는 엘라그산 함유 진주초 추출물을 처리한 지 48시간 후 배양액만을 취하여 이 배양액을 1500 rpm으로 5분 동안 원심분리하여 세포 분리물을 제거하였다. 이때 얻어진 상층 배양액만을 B형 간염 바이러스 e항원(HBeAg)에 대한 모노클로날 항체(HBeAb)가 도말되어 있는 진단시약 플레이트에 일정량씩 분주하고 37 ℃ 배양기에 1시간 동안 둔 후, 상기 진단시약 플레이트를 인산 완충용액으로 3 회 세척하고 퍼록시다아제(peroxidase)가 표지되어 있는 HBeAb를 일정량씩 각 웰에 분주하여 37 ℃ 배양기에서 1시간 동안 HBeAg와의 2차 결합이 이루어지도록 하였다. 결합되지 않은 잉여분의 항체는 인산 완충용액으로 3 회 세척하여 제거한 후 퍼옥시다아제에 의해 발색반응을 일으키는 TMB(tetramethyl benzidine dihydrochloride) 기질이 포함된 용액을 첨가하여 발색반응을 유도하였다. 반응이 완료된 진단시약 플레이트는 450 nm에서 흡광도를 측정하여 흡광도의 변화로서 e항원의 변화를 평가하였다.

도 2에 나타난 바와 같이, 본 발명의 실시예 1의 엘라그산에 대해 억제도를 측정한 결과, 그 농도에 따라 바이러스 복제 간암 세포인 HepG2 2.2.15 세포에서 e항원 분비 억제 효과가 증가함을 알 수 있었다.

또한, 도 5a 및 도 5b에서 보는 바와 같이, 본 발명의 실시예 2의 엘라그산 또는 엘라그산 함유 진주초 추출물의 농도에 따라 세포 외부로 분비되는 e항원, HBeAg 양은 현저하게 감소되었다.

이상에서 살펴본 바와 같이, 본 발명에 의하면 진주초(필란두스 우리나리아)로부터 엘라그산을 함유하는 진주초 추출물 및 엘라그산을 분리·정제하는데 최적의 조건을 확립함으로써, 추출물의 항 B형 간염 바이러스에 대한 활성을 극대화하였다. 특히, 본 발명의 엘라그산을 함유한 진주초 추출물 및 이로부터 분리된 엘라그산은 B형 간염 바이러스 e항원 분비를 억제하면서 세포독성이 낮으므로 간기능 개선, B형 간염 바이러스에 관련된 질환 및 이로 인한 간염 예방 및 치료에 효과적으로 사용될 수 있을 것으로 기대된다.

Claims

pH는 7.2 ~ 9.0 이고, 농도는 0.85 ~ 0.95%인 염화나트륨 수용액을 추출용매로 하여 상기 추출용매에 진주초 건조물을 침적하여 얻어지는 것을 특징으로 하는 진주초로부터 엘라그산을 함유하는 진주초 추출물의 제조방법.
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진주초 건조물을 pH는 4~11 및 0.85~0.95% 염화나트륨 수용액으로 추출하여 엘라그산 함유 진주초 추출물을 얻는 단계(단계 1);

상기 단계 1에서 얻은 진주초 추출물을 클로로포름과 메탄올 혼합용매를 전개용매로 사용하여 실리카겔 컬럼 크로마토그래피를 수행하고 분획시키는 단계(단계 2);

상기 단계 2에서 얻은 엘라그산 함유 진주초 분획물을 클로로포름:메탄올:물 혼합용매를 전개용매로 사용하여 실라카겔 컬럼 크로마토그래피를 재수행하고 재분획시키는 단계(단계 3); 및

상기 단계 3에서 얻은 엘라그산 함유 진주초 분획물을 아세토니트릴:포름산 혼합용매를 전개용매로 사용하여 분취용 액체크로마토그래피를 수행하고 엘라그산을 함유하는 구간만을 분취하는 단계(단계 4)를 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 엘라그산 분리방법.
제6항에 있어서, 상기 단계 2의 전개용매인 클로로포름:메탄올 혼합용매의 혼합비는 90 부피% 메탄올에서 10 부피% 메탄올로 농도 구배되는 것을 특징으로 하는 엘라그산 분리방법.
제6항에 있어서, 상기 단계 2의 컬럼의 용출속도는 시간당 475~525 ml로 수행됨은 특징으로 하는 엘라그산 분리방법.
제6항에 있어서, 상기 단계 3의 전개용매인 클로로포름:메탄올:물 혼합용매의 혼합비는 부피비로 70:10:1인 것을 특징으로 하는 엘라그산 분리방법.
제6항에 있어서, 상기 단계 3의 컬럼의 용출속도는 시간당 95~105 ml로 수행됨은 특징으로 하는 엘라그산 분리방법.
제6항에 있어서, 상기 단계 4의 전개용매인 아세토니트릴:포름산 혼합용매의 혼합비는 부피비로 10:90에서 45:55로 구배되는 것을 특징으로 하는 엘라그산 분리방법.
제6항에 있어서, 상기 단계 4의 컬럼의 용출속도는 분당 9.5~10.5 ml로 수행 됨은 특징으로 하는 엘라그산 분리방법.
진주초 건조물을 pH는 4~11 및 0.85~0.95% 염화나트륨 수용액으로 추출하여 엘라그산 함유 진주초 추출물을 얻는 단계(단계 1);

상기 단계 1에서 얻은 진주초 추출물을 40% 에틸알콜에 용해시킨 후, 2가 음이온 HP-20 컬럼에 로딩하고 에틸알콜의 농도를 99% 이상까지 증가시키면서 용출시키는 단계(단계 2); 및

상기 단계 2에서 얻은 70~99% 에틸알콜로 용출시킨 추출물을 분취용 액체 크로마토그래피를 수행하여 엘라그산을 함유하는 구간만을 분취하는 단계(단계 3)를 포함하여 이루어지는 엘라그산 분리방법.
제6항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 1의 pH는 7.2 ~ 9.0인 것을 특징으로 하는 엘라그산 분리방법.
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