KR101281858B1

KR101281858B1 - 클로렐라 추출물을 함유한 간질환의 예방 또는 치료용 조성물

Info

Publication number: KR101281858B1
Application number: KR1020110111545A
Authority: KR
Inventors: 변희국; 전중균; 김세권; 이정권
Original assignee: 강릉원주대학교산학협력단
Priority date: 2011-10-28
Filing date: 2011-10-28
Publication date: 2013-07-03
Also published as: CN104093411B; CN104093411A; US10568918B2; KR20130046884A; WO2013062168A1; US20140308309A1

Abstract

본 발명은 클로렐라 추출물을 함유하는 간질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따른 클로렐라 추출물을 함유하는 조성물은 의약품 및 건강보조식품 등에 사용할 수 있으며, 간기능 손상 모델에서 간기능 손상 억제 효능을 나타내어, 본 발명의 클로렐라 추출물은 간질환 예방 및 치료 조성물로 유용하게 이용될 수 있다.

Description

클로렐라 추출물을 함유한 간질환의 예방 또는 치료용 조성물{A composition comprising chlorella extracts for preventing or treating liver disease}

본 발명은 클로렐라 추출물을 함유하는 간질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

간은 우리 몸에서 각종 대사 작용, 해독, 분해, 합성 및 분비를 담당하는 매우 중요한 장기로, 그 기능을 자세히 살펴보면 다음과 같다. 첫째, 간은 에너지 대사를 관리하는 기능이 있어 음식물에서 흡수된 모든 영양소들을 에너지를 생산할 수 있는 물질로 대사시켜 전신에 공급하거나 저장한다. 둘째, 간은 약 2,000 여종의 효소, 알부민, 응고인자들의 혈청단백, 담즙산, 인지질, 콜레스테롤 등의 지방을 합성하고 저장하며 분배하는 기능이 있다. 셋째, 간은 각종 대사산물을 담관을 통해 십이지장으로 배설하는 기능이 있으며, 면역기능이 있어서 우리의 생명유지에 중요한 역할을 한다. 마지막으로, 간은 해독 및 분해 기능이 있어 약물, 독성물질, 술 등을 해독시킨다. 하지만 이러한 간의 해독기능은 간세포를 손상시키기 쉬워 약물성, 독성, 알코올성 간질환 등을 유발시킬 수 있다.

알코올성 간질환은 임상증상에 따라 알코올성 지방간, 알코올성 간염, 알코올성 간경변증으로 크게 나눌 수 있고 대개 하루 60-80 g의 알코올을 10년 정도 마실 때 발생한다. 알코올성 지방간은 과다한 알코올 섭취로 인해 간세포 안에 콜레스테롤과 중성지방이 축적되어 발생하는 것으로 금주만 하게 되면 곧 회복할 수 있으나, 계속 음주하게 되면 간염으로 발전하게 된다. 알코올성 간염은 간세포의 괴사와 염증이 발생한 상태로, 피로감, 식욕부진, 체중감소, 황달, 발열, 우상복부통증 등의 다양한 증상을 보이며, 이를 앓는 환자 중 약 40%는 알코올성 간경변증으로 발전하게 된다. 알코올성 간경변증은 정상 간으로 회복이 불가능한 상태로, 전신 피로감, 식욕감퇴, 복수, 식도정맥류, 출혈, 간성뇌증, 혼수 등의 다양한 증상을 보이며, 간염 바이러스에 의한 간경변증보다 예후가 불량하여 구미(歐美)에서는 말기 간질환으로 인한 사망의 50%가 알코올에 의한 것으로 알려져 있다.

따라서 알코올성 간질환 사망률을 줄이기 위해서는 초기 알코올성 간질환인 알코올성 지방간을 적절히 치료해야 한다. 하지만 현재까지 상기 질환을 치료하기 위한 적절한 치료제가 개발되지 않은 실정이다.

한편, 미세조류는 담수 및 해수에서 서식하는 부유생물로써 남조류, 규조류, 와편모조류, 녹조류, 홍조류, 황갈색편모조류 및 은편모조류 등이 있으며, 전 세계적으로 약 35,000종이 보고되고 있으나, 잠재적으로 약 200,000종 이상이 존재한다고 추정하고 있다. 미세조류들은 일반적인 식물들과 마찬가지로 광합성을 하며 내부에서 당질 및 단백질을 합성하기 때문에 담수 및 해양에서 기초생산을 담당하고 있으며, 먹이사슬의 생산자로써 중요한 위치를 차지하고 있다.

클로렐라는 청태(靑苔) 등과 마찬가지로 녹조식물에 속하는 지름 8 μm 정도인 둥근모양의 단세포식물이다. 클로렐라의 특징으로는 무성생식에 의해서 증식하고 광합성에 의해서 몸의 구성물질이 증가하면 딸세포를 형성하는 등 유성생식에 비해서 고능률적이며, 광합성을 이루어 유기물을 만드는데, 광합성 때의 태양 에너지의 이용률이 높고, 단백질 함유량이 높다.

그러나, 클로렐라 추출물의 간질환 치료제로서의 의학적 효과에 대해 개시된 바는 없다.

국내 특허 공개번호 2001-0007649호

이에 본 발명자들은 클로렐라 추출물이 간 손상 지표를 개선시키는 것을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 클로렐라 추출물을 함유하는 간질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명은 클로렐라 추출물을 유효성분으로 포함하는 간질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 클로렐라 추출물을 유효성분으로 포함하는 간질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품에 관한 것이다.

본 발명에 따른 클로렐라 추출물을 함유하는 조성물은 의약품 및 건강보조식품 등에 사용할 수 있으며, 간 손상 모델에서 간 손상 억제 효능을 나타내어, 본 발명의 클로렐라 추출물은 간 손상의 치료 및 예방용 조성물로 유용하게 이용될 수 있다.

도 1는 TLC상에서 클로렐라 에탄올 추출물 및 클로로필 a의 분리정제에 관한 것이다(A: 클로렐라 에탄올 추출물, B: 클로로필 a).
도 2은 TLC상에서 퀴논 리덕타아제 활성 분획 및 클로로필 a의 분리정제에 관한 것이다(A: 퀴논 리덕타아제 활성 분획, B: 클로로필 b, C: 클로로필 a).
도 3는 가시광선 (400~800nm)상에서 퀴논 리덕타아제 활성 분획 (CH1) 및 클로로필 a의 최대흡수파장에 관한 것이다.
도 4는 HPLC 상에서 클로로필 a 및 클로렐라 에탄올 추출물의 분리에 관한 것이다.
도 5은 HPLC에서 검출된 클로로필 a의 농도별 표준곡선에 관한 것이다.
도 6은 간손상이 유발된 동물모델의 혈액에서의 ALT(U/L) 농도에 관한 것이다.
도 7은 간손상이 유발된 동물모델의 혈액에서의 AST(U/L) 농도에 관한 것이다.
도 8는 간손상이 유발된 동물모델의 혈액에서의 γ-GT (U/L) 농도에 관한 것이다.
도 9은 간손상이 유발된 동물모델의 혈액에서의 LDH (U/L) 농도에 관한 것이다.
도 10은 간손상이 유발된 동물모델의 간 시토졸에서 SOD의 활성에 관한 것이다.
도 11는 간손상이 유발된 동물모델의 간 시토졸에서 CAT의 활성에 관한 것이다.
도 12은 간손상이 유발된 동물모델의 간 시토졸에서 GPx의 활성에 관한 것이다.
도 13는 간손상이 유발된 동물모델의 간 시토졸에서 ADH의 활성에 관한 것이다.
도 14는 간손상이 유발된 동물모델의 간 시토졸에서 ALDH의 활성에 관한 것이다.
도 15은 간손상이 유발된 동물모델의 간의 조직학적인 분석 (Sul: 설포라판)에 관한 것이다.
도 16 은 간 해독 효소 및 항산화효소의 발현 유전자인 NQO-1, HO-1, GT 및 GSTP의 유전자 발현에 관한 것이다.

본 발명은 클로렐라 추출물을 유효성분으로 포함하는 간질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 보다 구체적으로,

본 발명의 클로렐라는 담수산 농축 클로렐라일 수 있고, 상기 담수산 농축 클로렐라 분말을 유기용매로 추출하여 클로렐라 추출물을 수득할 수 있다. 보다 구체적으로 상기 추출물은 탄소수 1~4의 알코올, 에틸아세테이트 또는 헥산 추출물일 수 있고, 특히 에탄올 추출물일 수 있다.

본 발명에 의한 상기 조성물은 퀴논 리덕타제의 활성을 유도하는 바, 간 기능 개선 효과를 나타낼 수 있다.

상기 간질환은 지방간, 간염, 간경변증을 포함할 수 있다. 본 발명에 따른 일실시예에서는 간 손상에 의해 증가된 간 손상 지표(ALT, AST, γ-GT 및 LDH)가 개선되는 것을 확인함으로써, 간기능 손상을 억제할 수 있음을 알 수 있었다.

상기 클로렐라 추출물은 클로로필 a를 함유할 수 있고, 클로로필 a는 간질환의 예방 또는 치료에 효능이 있다.

본 발명의 간질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물 총 조성물에 대하여 상기 클로렐라 추출물이 0.01mg 내지 10g이 포함될 수 있다.

그러나 상기와 같은 조성은 반드시 이에 한정되는 것은 아니고, 환자의 상태 및 질환의 종류 및 진행 정도에 따라 변할 수 있다.

본 발명의 추출물을 포함하는 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용되는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 추출물을 포함하는 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있으며, 또한 본 발명의 추출물을 포함하는 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는

락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜 (propyleneglycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈 (tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 추출물의 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 추출물은 1일 0.01 mg/kg 내지 10 g/kg으로, 바람직하게는 1 mg/kg 내지 1 g/kg으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수 있다. 따라서 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁 내 경막 또는 뇌혈관 내(intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 클로렐라 추출물을 유효성분으로 함유하는 간질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품에 관한 것이다.

상기 클로렐라 추출물은 클로로필 a를 함유할 수 있고, 상기 클로로필 a는 간질환의 예방 또는 개선에 효능이 있다.

또한, 본 발명은 간질환의 예방 또는 개선 효과를 갖는 상기 클로렐라 추출물을 유효성분으로 함유하는 식품 및 식품첨가제에 관한 것이다.

본 발명의 추출물을 포함하는 조성물은 간질환의 예방 또는 개선을 위한 약제, 식품 및 음료 등에 다양하게 이용될 수 있다. 본 발명의 추출물을 첨가할 수 있는 식품으로는, 예를 들어, 캔디류의 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강보조 식품류 등이 있고, 분말, 과립, 정제, 캡슐 또는 음료인 형태로 사용할 수 있다.

본 발명의 추출물은 독성 및 부작용은 거의 없으므로 예방 목적으로 장기간 복용 시에도 안심하고 사용할 수 있는 약제이다.

본 발명의 상기 추출물은 간질환의 예방 또는 개선을 목적으로 식품 또는 음료에 첨가될 수 있다. 이때, 식품 또는 음료 중의 상기 추출물의 양은 일반적으로 본 발명의 건강식품 조성물은 전체 식품 중량의 0.01 내지 15 중량%로 가할 수 있으며, 건강 음료 조성물은 100 ㎖를 기준으로 0.02 내지 10 g, 바람직하게는 0.3 내지 1 g의 비율로 가할 수 있다.

본 발명의 건강 음료 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 추출물을 함유하는 것 외에 액체성분에는 특별한 제한점은 없으며, 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등의 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등의 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 ㎖당 일반적으로 약 1 내지 20g, 바람직하게는 약 5 내지 12g이다.

상기 외에 본 발명의 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 조성물들은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.

< 실시예 >

실시예 1. 담수산 농축 클로렐라의 에탄올 추출

분말화된 담수산 농축 클로렐라 100g에 99.9% 에탄올 (Daejeong, Korea) 500 ㎖를 가한 후 암 조건에서 교반하여 12시간마다 2회 추출한 다음 여과 후 감압농축하여 에탄올 추출물을 얻었다. 농축된 에탄올 추출물은 일정량의 무게로 정평한 후에 퀴논 리덕타아제 활성을 측정하였다.

실시예 2. 클로렐라로부터 간질환 예방 및 치료 물질의 Thin layer chromatography 법을 이용한 분리정제

얇은층 크로마토그래피(Thin-Layer Chromatography(TLC)를 이용한 분획 성분을 확인하였다. 클로렐라 에탄올 추출물을 TLC상에서 분리하였다. TLC는 유기용매 추출물들을 비극성 및 극성물질로 분획할 수 있으며, 헥산, 에틸아세테이트 및 아세톤을 7:3:0.1 비율로 제조한 용리액으로 클로렐라 에탄올 추출물 및 클로로필 a를 분리하였다 (도1). 클로로필 a의 Rf 값은 0.8로 나타났다. 분리된 클로렐라 에탄올 추출물 분획물의 퀴논 리덕타아제 활성을 측정하여 표 2에 나타냈다. 활성을 측정한 결과, 클로렐라 에탄올 추출물의 분획물 중 Rf이 0.8인 분획의 활성이 가장 우수하였다. 클로렐라 에탄올 추출물의 분획 중 활성이 우수한 분획은 TLC상에서 동일한 조건 분리한 결과, 클로로필 a의 Rf값과 동일한 값을 갖는 분획 (CH1 와 CH2)를 분리하였으며, 각 분획의 활성을 측정하여 표3에 나타냈다. CH1 분획과 클로로필 a의 흡광도를 가시광선 영역대(400~800nm)에서 검출한 결과, 두 물질의 최대 흡수파장은 660nm으로 나타났다 (도3). 또한 클로렐라 에탄올 추출물과 클로로필 a를 HPLC 상에서 분리하여 검출 결과를 비교하였다. 검출조건은 C18 ODS 컬럼 (4.6 x 250mm, 5μm)상에서 유속 1.0㎖/min으로 분리용매 용액A (75:25(v/v) methanol/water)를 30분간 50%의 농도로 농도구배하여 용리하였다. 검출파장은 660nm에서 측정하여 나타냈다. 측정결과, 클로렐라 에탄올 추출물에서 클로로필 a와 동일한 분획을 확인할 수 있었다(도4). 또한 클로로필 a는 HPLC 상에서 표준물질로 하여 농도별로 측정하여 그 결과를 도5에 나타내었으며, 클로렐라 에탄올 추출물 중 클로로필 a의 함량을 계산한 결과, 추출물 1g를 기준으로 10.0 ± 2.0 %의 함량을 갖고 있었다. 이는 클로렐라 건조물 1g에 클로로필 a는 1.5 ± 2.0 %의 함량을 가지고 있는 것이며, 본 발명에서의 간질환 예방 및 치료물질은 클로로필 a 계열을 물질로 판단된다.

실시예 3. 추출물의 퀴논 리덕타아제 활성

에탄올 추출물 및 분리된 분획 성분을 대상으로 퀴논 리덕타아제 활성 유도를 측정하였다. 클로렐라에서 수득한 분획물의 퀴논 리덕타아제 활성 유도 효과를 측정하기 위하여 흰쥐의 간암세포주(Hepa1c1c7)를 대상으로 하는 실험을 수행하였다.

먼저, α-MEM(최소 필수 배지; minimum essential medium)/10% FBS(우태아혈청; fetal bovine serum) 용액을 간암세포배양액과 혼합하여 세포의 수를 1× 10⁵cells/㎖로 조제한 후에 96-웰 플레이트에 100 ㎕씩 처리하여 24시간 동안 5% 이산화탄소 및 37 ℃의 조건에서 배양하였다. 세포가 안정화 된 후에, 클로렐라에서 추출한 추출물과 추출물로부터 분획한 분획 성분의 화합물들을 2배 농도 구배로 3.125-200 ㎍/㎖의 7개의 농도로 처리하고 24시간 동안 5% 이산화탄소 및 37 ℃의 조건에서 배양하였다. 배양 종료 후 세포를 인산버퍼식염수(PBS; phosphate buffered saline) 용액으로 씻어낸 후 0.08% 디지토닌(digitonin)과 2 mM EDTA를 포함한 용액 80 ㎕로 세포막을 용해시키고 단백질 용액을 얻었다.

상기 단백질 용액 50 ㎕와, 반응용액A(49 ㎖의 25 mM Tris 버퍼, 34 ㎎의 BSA, 0.34 ㎖의 1.5% 트윈-20 용액, 0.34 ㎖의 조효소용액, 100 유닛의 글루코스-6-포스페이트 디하이드로게나아제, 15 ㎎ MTT, 50 ㎕의 50 mM 메나디온) 200 ㎕를 혼합하여 마이크로플레이트 리더로 610 ㎚에서 흡광도 증가율을 측정하였으며, 단백질의 양은 브래드포드(Bradford) 용액을 사용하여 595 ㎚에서 측정하여 구하였다. 상기의 반응용액A 중 조효소용액은 150 mM 글루코우즈-6-포스페이트(glucose-6- phosphate), 4.5 mM NADP, 0.75 mM FAD로 구성되었으며 상기의 MTT는 3-(4,5-dimethylthiazo-2-yl)-2,5- diphenyltetrazolium bromide의 약어이다. 상기 추출물과 분획물의 퀴논 리덕타아제 활성은 CD (시험시료를 처리한 세포의 퀴논 리덕타아제 활성이 두 배가 되는 시료의 농도)으로 나타내었다. 하기 표 1은 3종의 에탄올 추출물의 퀴논 리덕타아제에 관한 것이다.

Sample	Hepa1c1c7
Sample	CD　(μg/㎖)
클로렐라 에탄올	15.65
설포라판 (5μM)	1.94
5 X 10³ cell/wells. Treatment Concentration 200 ㎍/㎖.

상기 표 1에 나타낸 바와 같이, 에탄올 추출물에 대한 퀴논 리덕타아제의 활성을 CD　(μg/㎖)으로 나타내었을 때 15.65로 확인하였다. 활성물질을 확인하기 위하여 분리 정제과정을 수행하였다. 에탄올 추출물을 TLC에서 클로로필 a와 비교하여, 동일한 Rf값을 갖는 분획의 퀴논 리덕타아제 활성을 확인하였다. 각 분획물의 활성은 표 2 및 표 3에서 나타났다. 하기 표 2및 3는 에탄올 추출물을 TLC에서 분리된 분획의 퀴논 리덕타아제 활성에 관한 것이다.

Sample	Hepa1c1c7
Sample	CD(μg/㎖)
1	35.86
2	39.48
3	31.56
4	25.85
5	18.85
6	12.94
7	30.58
8	40.45
설포라판 (5μM)	2.48
클로렐라 에탄올	17.5
5 X 10³ cell/wells. Treatment Concentration 200 ㎍/㎖.

Sample	Hepa1c1c7
Sample	CD(μg/㎖ )
CH1	10.85
CH2	15.31
설포라판 (5μM)	2.07
획분 6	16.89
5 X 10³ cell/wells. Treatment Concentration 200 ㎍/㎖.

실시예 4. 간손상 동물모델에서 클로렐라 에탄올 추출물의 간질환 예방 및 치료 효과 평가

4.1. 시료

클로렐라 에탄올 추출물 (CH)를 사용하였다. CH는 에탄올에 녹여 AIN-76 diet에 하루 섭취량이 실험동물의 몸무게 kg당 50 mg 또는 100 mg이 되도록 혼합하여 공급하였다.

4.2. 실험동물 및 식이

특정병원체 (specific pathogen free)가 없는 5주령, 수컷 SD rat을 (주)오리엔트 (성남, 한국)에서 구입하여 사용하였다. 1주일간의 검역 및 적응과정을 거친 뒤 체중 감소 없는 건강한 동물을 선별하여 실험에 사용하였다. 실험동물은 온도 23 ± 3℃, 상대습도 50 ± 10%, 환기회수 10-15회/시간, 조명시간 12시간 (08:00 - 20:00), 조도 150 - 300 Lux로 설정된 사육환경에서 사육하였다. 1주간의 적응 기간 동안 실험동물은 실험동물용 고형사료 (수퍼피드주식회사, 원주, 한국)와 음수를 자유 섭취하도록 하였다. 1주간의 적응 기간을 거친 후 건강한 동물을 선별하여 난괴법에 의거하여 5개의 군으로 분류하였다. 즉 에탄올과 시험물질을 투여하지 않은 대조군, 에탄올 경구투여군, 에탄올 경구투여에 CH 50 mg/kg 섭취군, 에탄올 경구투여에 CH 100 mg/kg 섭취군, 에탄올 경구투여에 설포라판 10 mg/kg 섭취군으로 분류하여 실험을 진행하였다. 본 연구에서 사용한 기본 식이인 AIN-76 식이는 Research Diets, Inc. (New Brunswick, NJ, USA)에서 구입하였고, 그 식이 조성은 표 1에 나타내었다. 시험 식이는 앞서 언급한 것과 같이 각각의 시험물질을 하루 섭취량이 실험동물의 몸무게 kg당 50 또는 100 mg이 되도록 식이에 혼합하여 섭취시켰다. 에탄올에 의한 지방간을 유도하기 위해 20% 에틸 알코올을 몸무게 kg 당 5 g씩 매일 오전과 오후 2회로 나누어서 16일간 경구 투여하였다. 시험물질을 함유한 식이는 에탄올 투여 후 17일째부터 10일 동안 섭취시켰으며, 시료 섭취와 함께 계속적으로 에탄올도 경구 투여하였다. 실험기간 동안 음수는 자유로이 섭취하도록 하였다. 식이섭취량은 2일 간격으로 측정하였고, 체중은 에탄올 경구투여 시작일을 0 day로 하여 실험 종료일까지 1주일 간격으로 측정하였다. 본 연구에서의 모든 동물 실험은 한림대학교 동물실험윤리위원회의 승인 하에 수행되었다 (Hallym 2010-102).

4.3. 혈청 ALT , AST , γ- GT , LDH 함량

혈청 ALT, AST, γ-GT, LDH 함량분석은 부검 당일 채취된 혈액에서 분리한 혈청을 혈액생화학 분석기 (KoneLab 20, Thermo Fisher Scientific, Waltham, Finland)를 이용하여 알라닌 아미노기전달효소(alanine aminotransferase, ALT), 아스파르트산 아미노기전달효소(aspartate aminotransferase, AST), gamma-감마-글루타밀 트랜스페라제(glutamyl transferase, γ-GT), 젖산디하이드로게나제(lactic dehydrogenase, LDH)를 측정하였다.

혈청의 ALT, AST, γ-GT, LDH의 함량은 각각 도 6,7,8,9에 나타내었다. 혈청 ALT는 에탄올 경구 투여군에 비하여 모든 군에서 감소하는 경향을 보였다. 혈청 AST는 에탄올 경구 투여군에 비하여 모든 군에서 유의적으로 감소하였고, 특히 CH 50 mg/kg 군과 CH 100 mg/kg 군에서 큰 차이를 보였다. γ-GT는 대조군 보다 에탄올만 경구 투여한 군에서 유의적으로 증가하였고, 시험물질 CH 50 mg/kg군과 CH 100 mg/kg 군에서 에탄올만 경구 투여한 군보다 유의적으로 감소하였으나 설포라판10 mg/kg 군에서는 유의적인 차이를 보이지 않았다. LDH 함량은 에탄올 경구 투여군에 비하여 CH 50 mg/kg 군과 CH 100 mg/kg 군 및 설포라판10 mg/kg 군에서는 감소하였고 모두 유의적인 차이를 보였다.

4.4. 간 시토졸(cytosol)에서 SOD , CAT , GPx , ADH , ALDH 활성

1 g의 간 조직을 0.25 M sucrose (pH 7.0)를 넣고 homogenation하였다. Homogenate는 700 rpm에서 10분간, 4,000 rpm에서 10분간 원심분리하여 그 상등액을 취하였고, 다시 50,000 rpm에서 1시간 동안 원심분리하여 상등액을 cytosolic 효소원으로 사용하였다. 과산화물 제거효소(Superoxide Dismutase, SOD), 카탈라제(Catalase, CAT), 글루타티온과산화효소(Glutathione Peroxidase, GPx) 활성은 Cayman chemical company (Ann Arbor, Michigan, USA)의 kit을 이용하여 측정하였다. 알코올탈수소효소(Alcohol dehydrogenase, ADH)는 0.1 M Tris-HCl buffer (pH 8.5) 160 μl에 0.2 M 에탄올10 μl, 0.05 M 세미카바자이드(semicarbazide) HCl 10 μl, 0.1 M NAD (in 0.01 M HCl) 을 10 μl 넣고 cytosolic 효소원을 10 μl 넣어 340 nm에서 ADH 효소 활성을 측정하였다. 활성값은 에탄올 투여군을 100%으로 하여 비교수치로 나타내었다. 아세트알데하이드 분해효소(Acetaldehyde dehydrogenase, ALDH)활성 측정은 0.2 M Tris-HCl buffer (pH 8.3) 150 μl, 1 M KCl 10 μl, 0.1 M 피라졸10 μl, 1 M 2-메르캅토에탄올 10 μl, 0.1 M 프로피온알데히드10 μl, 0.1 M NAD (in 0.01 M HCl) 을 10 μl 넣고 cytosolic 효소원을 10 μl 넣어 340 nm에서 ALDH 효소 활성을 측정하였고 효소 단백질 정량은 Lowry 등 (Lowry OH et al., 1957, J Biol Chem 193: 265-276)의 방법으로 실시하였다.

간 시토졸의 SOD, CAT, GPx, ADH, ALDH 활성은 도 10,11,12,13,14에 나타내었다. 간 시토졸SOD 활성은 에탄올 투여군에 비하여 CH 100 mg/kg군과 설포라판 10 mg/kg 군에서 증가하였고 CAT 활성도 에탄올 경구 투여군에 비하여 CH 100 mg/kg 군과 설포라판 10 mg/kg 군에서 증가하였으나 유의적인 차이를 나타내지 않았다. 또한, GPx 활성도 에탄올 경구 투여군에 비하여 CH 100 mg/kg 군과 설포라판 10 mg/kg 군에서 증가하였으나 유의적인 차이를 보이지 않았다 (표 C-8). ADH는 에탄올 경구 투여군에 비하여 시료 처리군에서 유의적인 증가를 나타내었다 (표 C-8). ALDH는 에탄올 경구 투여군에 비하여 CH 100 mg/kg 군은 증가하는 경향을 보였다.

4.5. 간 조직에서 총지질량 , 트리글리세라이드( triglyceride ), 총 콜레스테롤 함량

간 조직에서 총지질량은 1 g의 간 조직을 saline 3 ml 넣고 균질화 시킨 다음 다시 CM solution (Chloroform : Methanol = 2:1)을 9 ml 넣고 homogenation하였다. Homogenate는 3,000 rpm에서 10분간 원심분리하여 아래층을 취하여 증발시킨 후 정밀저울로 사용하여 총지질량을 측정하였다. 측정된 총지질에 이소-프로판올(iso-prophanol)을 넣어 녹여준 후 중성지방, 총콜레스테롤은 효소법을 이용한 정량 측정 kit (아산제약, 화성, 한국)을 사용하여 측정하였다. 간의 총지질량, 트리글리세라이드, 총 콜레스테롤은 표 5에 나타내었다. 간의 총지질량은 모든 군에서 유의적인 차이를 나타내지 않았다 (표 5). 간에서 트리글리세라이드는 에탄올 경구 투여군에 비하여 시료 처리군에서 감소하였으나 모두 유의적인 차이를 보이지 않았다 (표 4). 간에서 총 콜레스테롤은 에탄올 경구 투여군에 비하여 CH 50 mg/kg 군과 설포라판(sulforaphane) 10 mg/kg 군에서 감소하였고 유의적인 차이를 보였다 (표 5).

4.6. 간 microsome 에서 지질과산화물 함량

1 g의 간 조직을 0.25 M sucrose (pH 7.0)를 넣고 homogenation하였다. Homogenate는 700 rpm에서 10분간, 4,000 rpm에서 10분간 원심분리하여 그 상등액을 취하였고, 다시 50,000 rpm에서 1시간 동안 원심분리하여 침전물을 10 ml 0.25 M sucrose으로 다시 현탁시키고 10,000 x g에서 15분간 원심분리하였고 그 상등액을 다시 50,000 rpm에서 1시간 동안 원심분리하여 침전물 얻었다. 이렇게 얻어진 침전물을 PBS로 현탁시킨 다음 지질과산화물 측정 kit (BioAssay Systems, Hayward, CA, USA)을 이용하여 측정하였고 단백질 정량은 Lowry 등 (Lowry OH et al., 1957, J Biol Chem 193: 265-276)의 방법으로 실시하였다. 간 microsome에서 지질과산화물 함량 측정은 표 4에 나타내었다. 지질과산화물은 에탄올 경구 투여군에 비해 CH 50 mg/kg 군과 CH 100 mg/kg 군에서 감소하는 경향을 보였으나 통계적으로 유의한 차이를 보이지 않았다 (표 4). 하기 표 4는 간에서 총지질량, Triglyceride, Total cholesterol 및 지질과산화물 함량을 나타낸다.

4.7. 혈청 triglyceride , total cholesterol , HDL - cholesterol 함량

혈청의 triglyceride, total cholesterol, HDL-cholesterol는 표 A-5에 나타내었다. Triglyceride는 에탄올 경구투여군에 비하여 모든 군에서 감소하는 경향을 보였으나 유의적인 차이를 보이지 않았다 (표 5). 혈청 총 콜레스테롤 함량은 대조군 보다 에탄올만 경구투여한 군에서 유의적으로 증가하였고, 시험물질 CH 100 mg/kg 군에서 에탄올만 경구투여한 군보다 유의적으로 감소하였다 (표 5). HDL-cholesterol은 대조군에 비해 에탄올 투여군에서 감소하였다. 또한 CH 투여시 에탄올 투여군에 비해 HDL-cholesterol이 유의적으로 증가하였다(표 5). 하기 표 6은 혈청 Triglyceride, Total cholesterol, HDL-cholesterol을 나타낸다.

4.8. 간의 조직학적인 분석

대조군 및 시험 물질 투여군을 해부 후, 간 (Liver)을 채취하여 phosphate buffered saline으로 간을 세척하고, 4% 파라포름알데하이드 (Sigma, USA)에 고정 후, 조직을 Histo Cassette (Hyunil, Korea)에 담아 자동조직처리기 (Leica, Germany)로 돌리고, 파라핀포매기 (Leica, Germany)로 파라핀 (Sigma, USA) 블록을 제조 한 후, 조직미세절편기 (Leica, Germany)로 조직을 절편 하였다. Hematoxyline and Eosin Staining Procedure (Sigma, USA)으로 염색 후, 조직학적 관찰을 광학현미경 (Zeiss, Germany)으로 분석하였다.

간의 Hematoxyline and Eosin Staining은 도 15에 나타내었다. 대조군에 비해 에탄올만 경구투여한 군에서 알코올에 의한 지방간 및 간 손상이 유도되었고, 알코올에 의해 손상된 간의 손상 정도가 CH 100 mg/kg 군에서 감소함을 보였다 (도 15).

실시예 5. NQO -1, HO -1, GT 및 GSTP 의 유전자 발현

클로렐라 에탄올 추출물의 간기능 개선에 작용하는 해독효소의 유전자 발현을 확인하기 위하여 hepa1c1c7세포에서 역전사 중합효소연쇄반응 (Reverse transcription polymerase chain reaction, RT-PCR)으로 유전자 발현량을 측정하였다. 먼저 실시예 3과 같이 hepa1c1c7세포는α-MEM(최소 필수 배지; minimum essential medium)/10% FBS(우태아혈청; fetal bovine serum) 용액을 간암세포배양액과 혼합하여 세포의 수를 5 × 10⁵cells/㎖로 조제한 후에 페트리디쉬에 처리하여 24시간 동안 5% 이산화탄소 및 37 ℃의 조건에서 배양하였다. Hepa1c1c7세포가 페트리디쉬에서 80% 이상 자란 다음, 클로렐라 에탄올 추출물을 200 ㎍/㎖ 농도로 첨가하였다. 추출물을 처리한 후 α-MEM(최소 필수 배지; minimum essential medium)/10% FBS(우태아혈청; fetal bovine serum)에서 24시간 동안 5% 이산화탄소 및 37 ℃의 조건에서 배양하였다. 24시간 후 세포에서 RNA 분리, cDNA 합성 및 RT-PCR은 Komoroski 등, (Drug Metab. Dispos. 32:512-518, 2004)이 기술한 방법에 따라 수행하였다. RT-PCR에서 측정한 유전자는 GAPDH (glyceraldehyde phosphate dehydrogenas), NQO-1 (NAD(P)H quinone oxidoreductase), HO-1 (heme oxygenase-1), GR(Glutathione reductase), GSTP(glutathione S-transferase Pi)을 선택하여 발현을 확인하였다.

각각의 유전자의 프라이머 서열은 표 6에 나타냈다. 추출된 RNA를 주형으로 올리고 dT-어댑터 프라이머(Oligo dT-adaptor primer)와 DEPC water를 이용하여 총량 15μL로 하고 70℃ 5분 변성후, Moloney murine leukemia virus(M-MLV) RNA의 역전사를 수행하여 42℃ 60분, 94℃ 5분 cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA는 PCR 반응을 통해 증폭하였으며, 총 반응액은25μL 로 하였다. 각 반응물의 최종 농도는 프라이머 100pmol, 1.0μM , dNTP 혼합액 0.2mM, 5x green or colorelss GoTaq Reaction buffer 1x1.5mM, MgCl2(PCR완충액 및 GoTaq DNA 폴리머라제 1.25 units이었다. 변성(Denaturation), 어닐링(annealing) 및 익스텐션(extension)에 대한 PCR 반응 조건은 다음과 같으며, 95℃ 2분, 95℃ 30초, 60℃ 30초, 72℃ 1분, 72℃ 5분, 30~40 사이클로 수행하였다. PCR 반응 후 생성물의 10 μL를 2% 아가로즈 겔(agarose gel)에서 전기영동 하였다. 전기 영동이 끝난 후, 겔은 EtBr로 염색하였으며, UV하에서 DC120 줌 디지털 카메라(Eastman Kodak, New Haven, CT, USA)를 이용하여 촬영하였다. 모든 기준은 GAPDH 발현으로 판단하였다. 하기 표6은 간 해독효소 발현 유전자 프라이머의 핵산서열을 나타낸다.

RT-PCR 수행결과, 도 16에 나타난 바와 같이, 처리 후 24시간 배양한 후 PCR을 수행하여 관찰하였을 때 해독효소 발현 유전자인 NQO-1, HO-1 및 항산화 효소 발현 유전자인 GSTP의 발현을 확인하였으나, 항산화 효소 발현 유전자인 GR의 발현은 나타나지 않았다.

이상의 실험예 1 내지 5의 결과로 보아 클로렐라 추출물은 간암세포인 hepa1c1c7에서 해독효소인 퀴논 리덕타아제의 활성을 증진시켰으며, 간 손상 동물 모델에서 간 손상 보호 효과 및 간해독 효소와 항산화효소의 활성을 증진시키는 효과를 확인하였다. 이는 향후 간기능 개선제 및 간질환 치료제 등의 예방제로서 우수한 효과를 나타낼 것으로 예상된다.

Claims

클로로필 a를 함유하는 클로렐라 에탄올 추출물을 유효성분으로 포함하는 알코올성 간질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
삭제
제 1항에 있어서, 상기 조성물은 퀴논 리덕타제의 활성을 유도하는 것을 특징으로 하는 간질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 총 조성물 중 클로렐라 에탄올 추출물이 0.01mg 내지 10g 포함되는 것을 특징으로 하는 알코올성 간질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
삭제
클로로필 a를 함유하는 클로렐라 에탄올 추출물을 유효성분으로 포함하는 알코올성 간질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품.
제 6항에 있어서, 분말, 과립, 정제, 캡슐 또는 음료인 형태인 간질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품.
삭제