KR101756358B1 - 방사무늬김 추출물을 포함하는 알코올성 간질환 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

방사무늬김 추출물을 포함하는 알코올성 간질환 예방 또는 치료용 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 방사무늬김(Pyropia yezoensis) 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는, 알코올성 간질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것으로서, 방사무늬김의 다양한 분획물 중에서, 지용성 부분에 해당하는 헥산 분획물이 알코올에 의해 유도된 간세포 보호활성이 현저함을 확인하였다. 또한, 상기 방사무늬김의 헥산 분획물이 마우스의 생존율을 증가시켰으며, 산화스트레스에 대한 보호효과를 가져 항산화 활성이 있음을 확인하였다. 또한, 알코올에 의해 유도된 간조직 손상에 대해서는 현저한 간조직 보호효과를 가지는 것을 확인하여 알코올성 간질환 치료제로 사용할 수 있음을 확인하였다.

Description

방사무늬김 추출물을 포함하는 알코올성 간질환 예방 또는 치료용 조성물{Compositions for preventing or improving alcoholic liver disease comprising Pyropia yezoensis extracts}
본 발명은 방사무늬김(Pyropia yezoensis) 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는, 알코올성 간질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
간은 인체에서 혈액 저장 및 순환, 혈액량 조절과 방어해독작용을 하며 정신적 활동과도 밀접하게 관련되어 있다고 알려져 있는 장기이다. 구체적으로, 상기 간은 음식물에서 흡수된 모든 영양소들을 에너지를 생산할 수 있는 물질로 대사되어 전신에 공급하거나 저장하며, 약 2,000여종의 효소, 알부민, 혈청단백, 인지질, 콜레스테롤 등의 지방 등이 간에서 합성되고 저장 및 분비된다. 또한, 각종 대사산물들을 담관을 통해 십이지장으로 배설하는 기능, 해독, 분해 및 면역기능도 있어 인체에서 중요한 역할을 하고 있다.
그러나, 최근 사회의 다양화 및 경제성장과 더불어 현대인의 알코올 섭취량이 증가하고 있어 과음과 관련된 숙취나 알코올 중독 및 간 기능 저하 등과 같은 질병의 원인이 되고 있다.
구체적으로, 알코올의 섭취는 위나 장에서 흡수되어 간에서 알코올 가수분해효소(alcohol dehydrogenase, ADH), 카탈라아제(catalase) 또는 알코올 대사에 의해 유도되는 알데히드 산화효소(aldehyde oxidase) 등에 의하여 산화성 대사가 이루어져 아세트알데히드와 함께 활성산소종(reactive oxygen species, ROS)을 생산하는데, 장기적으로 과도한 알코올 섭취는 아세트알데히드와 ROS의 생성량이 증가하며, 순차적으로 대사되는 과정에서 세포막 지질의 과산화를 일으키고 DNA, 단백질 등 유전자 산물에 손상을 일으켜 간세포를 손상시켜 지방간, 알코올성 간염, 간경화 등을 유발한다.
한편, 음주 후 숙취해소 또는 간질환 치료를 위하여 아스파라긴산 또는 페놀계 합성 항산화제인 BHA(butylated hydroxyanisole), BHT(butylated hydroxy toluene) 등의 인공제제를 단독 또는 혼합제제로 사용하여 왔으며, 최근에는 간염, 간경화, 간지방증, 약품에 의한 간 손상과 같은 간질병의 치료제로써 효능이 입증된 약용식물로부터 추출된 생약제의 수요가 증가하는 경향을 보이고 있다. 그 한 예로, 밀크티슬(Silybum marianum)에서 추출된 실리빈(silybin), 실리디아민(silydiamine), 실리크리스틴(silycristine) 등의 이성체로 구성된 실리마린 (silymarin) 제제가 임상에서 응용되고 있으나, 이외에 현재 치료제로 사용 중이거나 임상시험 중인 약용식물은 소수에 불과하다.
따라서, 간 기능 예방과 관련하여, 항산화 효과를 가지고 산화적 스트레스에 의한 간 손상 또는 간세포를 보호할 수 있으며, 내성이나 안정성에 대한 문제가 되지 않는 천연물질 유래 간 보호 또는 간 손상 예방용 조성물의 개발이 시급한 실정이다.
한국등록특허 10-1649830호
본 발명의 목적은 방사무늬김(Pyropia yezoensis) 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는, 알코올성 간질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 방사무늬김(Pyropia yezoensis) 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는, 알코올성 간질환의 예방 또는 개선용 식품조성물을 제공하는 것이다.
이에, 본 발명자는 천연물을 이용한 알코올성 간질환 치료제를 찾고자 예의 노력한 결과, 방사무늬김의 다양한 분획물 중에서, 지용성 부분(liposoluble portion)에 해당하는 헥산 분획물이 알코올에 의해 유도된 간세포 보호활성이 현저함을 확인하였다. 또한, 상기 방사무늬김의 헥산 분획물이 마우스의 생존율을 증가시켰으며, 산화스트레스에 대한 보호효과를 가져 항산화 활성이 있음을 확인하였다. 또한, 알코올에 의해 유도된 간조직 손상에 대해서 현저한 간조직 보호효과를 가지는 것을 확인하여 알코올성 간질환 치료제로 사용할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 방사무늬김(Pyropia yezoensis) 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는, 알코올성 간질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 알코올성 간질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 방사무늬김(Pyropia yezoensis)을 유효성분으로 포함한다.
본 발명에서, 상기 방사무늬김(Pyropia yezoensis)은 홍조류 김파랫과의 해조(海藻)로, 길이는 5 내지 20cm, 나비는 2 내지 8cm이고, 몸은 한 층의 세포로 된 잎 모양이며, 성숙 초기에는 무성 생식을 하다가 나중에는 유성 생식을 하는 특징을 가진다. 국내에서 10월에 어린 엽체가 나타나고 12월 초까지 성숙한 개체로 자라나며, 12월에서 이듬해 5월까지 번성하는 종이다.
본 발명에서 용어, "방사무늬김(Pyropia yezoensis) 추출물"은 방사무늬김(Pyropia yezoensis)을 추출하여 수득한 추출물을 의미한다. 상기 방사무늬김 추출물은 방사무늬김 분쇄물을 건조 중량의 약 2 내지 20배, 바람직하게는 약 8 내지 10배에 달하는 부피의 물, 메탄올, 에탄올 및 부탄올 등과 같은 탄소수 1(C1) 내지 4(C4)의 알코올 또는 이들의 혼합용매를 용출 용매로써 사용하고, 추출 온도는 20 내지 100℃, 바람직하게는 60 내지 90℃에서, 추출 기간은 약 2시간 내지 4일, 바람직하게는 2 내지 6시간 동안 열수 추출, 냉침 추출, 환류 냉각 추출 또는 초음파 추출 등의 추출방법을 사용하여 추출할 수 있으나, 알코올성 간질환의 예방 또는 치료 활성이 있는 물질을 추출하는 방법이라면 제한없이 이용될 수 있다.
구체적으로는 열수추출로 1회 내지 5회 연속 추출하여 감압여과하고, 그 여과추출물을 진공회전농축기로 20 내지 100℃에서 감압 농축하여 물, 저급 알콜 또는 이들의 혼합용매에 가용한 방사무늬김 조추출물을 수득한 결과물이 될 수 있으나, 본 발명의 간질환의 예방 또는 치료 활성을 나타낼 수 있는 한, 이에 제한되지는 않고, 추출액, 추출액의 희석액 또는 농축액, 추출액을 건조하여 얻어지는 건조물, 또는 이들 조정제물 또는 정제물을 모두 포함할 수 있다.
본 발명에서 용어, "분획물"은 다양한 구성성분을 포함하는 혼합물로부터 특정 성분 또는 특정 그룹을 분리하는 분획방법에 의하여 얻어진 결과물을 의미한다. 본 발명의 방사무늬김 분획물은 방사무늬김 추출물을 현탁한 후, 물, 탄소수 1(C1) 내지 4(C4)의 알코올, 염화 메틸렌, 클로로포름, 에틸아세테이트, 헥산, 부탄올 또는 이들의 혼합용매를 사용하여 분획함으로써 분획물을 수득할 수 있다. 구체적으로, 방사무늬김 조추출물을 증류수 등에 현탁한 후, 현탁액의 약 1 내지 100배, 바람직하게는 약 1 내지 5배 부피의 물, 탄소수 1(C1) 내지 4(C4)의 알코올, 염화 메틸렌, 클로로포름, 에틸 아세테이트, 헥산, 부탄올 또는 이들의 혼합용매를 가하여 1회 내지 10회, 바람직하게는 2회 내지 5회에 걸쳐 극성 또는 비극성 용매 가용층을 추출, 분리하여 수득할 수 있다.
본 발명의 일실시예에서는 방사무늬김의 지용성 분획물(PYLP, liposoluble portion from P. yezoensis)를 제조하기 위해서 먼저 건조된 Pyropia yezoensis (600g)을 이용하여 70 % 에탄올 추출물을 제조하였으며, 이를 건조하여 사용하였다. 또한, 건조된 방사무늬김 추출물을 n-헥산과 증류수(1:1, v/v)를 사용하여 현탁액 분획으로부터 헥산 분획물을 얻어, 지용성 분획물을 제조하였다.
본 발명의 일실시예에서 상기 헥산 분획물의 화학조성을 분석한 결과 총 지방산, β-카로틴 및 총 스테롤은 각각 84.52 %, 10.01 % 및 2.30 %였으며, 이 중에서 상기 총 지방산은 54.12 %의 에이코사펜타엔산(EPA, C20:5), 21.07 %의 팔미트산 (PA, C16:0), 6.43 %의 트리코산산 (TA, C23:0) 및 4.99 % 리놀레산 (LA, C18:2) 같은 여러 주요 지방산을 포함하였다.
이에 따라 본 발명의 상기 분획물은 총 지방산, β-카로틴, 및 총 스테롤을 포함할 수 있으며, 상기 총 지방산은 에이코사펜타엔산(EPA), 팔미트산(PA), 리코산산(TA) 및 리놀레산(LA)을 포함할 수 있다.
또한, 상기 방사무늬김의 에탄올 추출물을 헥산(n-hexane) 이외에도 클로로포름(chloroform), 에틸아세테이트(ethyl acetate), 물(water)을 이용하여 이들 용매의 분획물을 제조하였다.
본 발명의 일실시예에서 방사무늬김 추출물과 여러가지 분획물을 이용하여, 알코올 처리에 따른 간세포 보호 활성을 평가한 결과, 방사무늬김 추출물의 헥산 분획물이 간세포 보호 활성이 가장 높은 것을 확인하였다.
이에 따라, 본 발명에서 상기 분획물은 방사무늬김 추출물의 헥산 분획물 일수 있다.
본 발명에서 용어 "간질환"은 간에 영향을 주는 임의의 질환, 특히 간 세포의 병리학적 붕괴, 염증, 변성 및/또는 증식을 포함하는 임의의 급성 또는 만성 간질환을 포함한다. 특히, 간질환은 간세포 손상, 변형 또는 괴사의 일부 마커들의 혈장내 수준이 정상 혈장 수준에 비해 증대되어 있는 간 섬유증, 간 경화증 또는 임의의 기타 간질환이다. 간 활성 및 상태와 연관되는 지표는 glutamate oxaloacetate transaminase(GOT; aspartate aminotransferase, AST로 알려짐), glutamate pyruvate transaminase (GPT, alanine aminotransferase, ALT로 알려짐), total cholesterol, 및 malondialdehyde (MDA) 등이 있다.
본 발명에서 용어 "알코올성 간질환"은 알코올에 의해 유발된 간질환으로 과다한 음주로 인해 발생하는 알코올성 간질환을 포함한다.
본 발명에서 사용되는 용어, "예방"이란, 본 발명에 따른 조성물을 개체에 투여하여 간질환의 발병을 억제하거나 지연시키는 모든 행위를 의미할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 방사무늬김 추출물의 분획물 처리에 의해 알코올에 의해 유발된 간 손상이 감소하는 것을 확인하였으므로(도 5), 본 발명의 약학적 조성물은 간질환 예방에 우수한 효과가 있다. 특히, 간질환 중에서 알코올에 의해 유도된 간질환에 대해 우수한 예방 효과가 있다.
본 발명에서 사용되는 용어, "치료"란, 본 발명의 상기 조성물을 간질환 발병 의심 개체에 투여하여 간질환 증세가 호전되도록 하거나 이롭게 되도록 하는 모든 행위를 의미할 수 있다.
또한 본 발명의 일실시예에서는 상기 방사무늬김 추출물의 분획물에 대해, 알코올 유발된 산화 스트레스뿐만 아니라 SOD, CAT 및 GPx 효소의 활성화에 대한 효과를 평가한 결과, 상기 SOD, CAT 및 GPx 효소의 활성을 증가시킴으로써 산화적 스트레스에 대한 보호 효과가 있음을 확인하였다. 또한, 상기 방사무늬김은 알코올 처리에 의해 증가된 TBARS의 수준을 유의하게 감소시켰는 바, 콜레스테롤 과산화를 억제한 것을 확인하였다. 이에 따라, 상기 방사무늬김은 항산화 활성을 가진다.
본 발명에서, 용어, "항산화"는 산화를 억제하는 작용을 의미하는 것으로, 인체는 산화촉진물질(prooxidant)과 산화억제물질(antioxidant)이 균형을 이루고 있으나 여러 가지 요인들에 의하여 이런 균형상태가 불균형을 이루게 되고 산화촉진 쪽으로 기울게 되면, 산화적 스트레스(oxidative stress)가 유발되어 잠재적인 세포손상 및 병리적 질환을 일으키게 된다. 이러한 산화적 스트레스의 직접적 원인이 되는 활성 산소종(reactive oxygen species, ROS)은 불안정하고 반응성이 높아 여러 생체물질과 쉽게 반응하고, 체내 고분자들을 공격하여 세포와 조직에 비가역적인 손상을 일으키거나 돌연변이, 세포독성 및 발암 등을 초래하게 된다. NO, HNO2, ONOO-와 같은 활성 질소종(reactive nitrogen species, RNS), ROS와 같은 활성산소는 체내에서 세포를 산화시켜 파괴시키며, 그에 따라 각종 질환에 노출되게 된다. 또한, 상기 항산화는 세포 내 대사 또는 자외선의 영향으로 인한 산화적 스트레스에 따라 반응성이 높은 자유 라디칼(free radical) 또는 활성 산소종 (Reactive oxygen species, ROS)에 의한 세포의 산화를 억제하는 기능을 의미하며, 자유 라디칼 또는 활성 산소종을 제거하여 이로 인한 세포의 손상이 감소되는 것을 포함한다.
본 발명의 방사무늬김 추출물, 또는 이의 분획물을 포함하는 약학적 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형체 또는 희석제를 추가로 포함할 수 있다. 이때, 상기 조성물에 포함되는 방사무늬김 추출물, 또는 이의 분획물은 특별히 이에 제한되지 않으나, 조성물 총 중량에 대하여 0.001 중량% 내지 99 중량%로, 바람직하게는 0.01 중량% 내지 50 중량%를 포함할 수 있다.
상기 약학적 조성물은 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제, 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제, 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결 건조제 및 좌제로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 제형을 가질 수 있으며, 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형일 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다.
경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로오스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 스테아린산 마그네슘, 탈크 등과 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여할 수 있다. 본 발명에서 용어, "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 개체 종류 및 중증도, 연령, 성별, 질병의 종류, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 그리고 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 간질환을 목적으로 하는 개체이면 특별히 한정되지 않고, 어떠한 것이든 적용가능하다. 예를 들면, 원숭이, 개, 고양이, 토끼, 모르모트, 랫트, 마우스, 소, 양, 돼지, 염소 등과 같은 비인간동물, 인간, 조류 및 어류 등 어느 것이나 사용할 수 있으며, 상기 약학적 조성물은 비 경구, 피하, 복강 내, 폐 내 및 비강 내로 투여될 수 있고, 국부적 치료를 위해, 필요하다면 병변 내 투여를 포함하는 적합한 방법에 의하여 투여될 수 있다. 본 발명의 상기 약학적 조성물의 바람직한 투여량은 개체의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 예를 들어, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관 내 주사에 의해 투여될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
적합한 총 1일 사용량은 올바른 의학적 판단범위 내에서 처치의에 의해 결정될 수 있으며, 일반적으로 0.001 내지 1000 mg/kg의 양, 바람직하게는 0.05 내지 200 mg/kg, 보다 바람직하게는 0.1 내지 100 mg/kg의 양을 일일 1회 내지 수회로 나누어 투여할 수 있다.
상기 목적을 달성하기 위한 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 방사무늬김(Pyropia yezoensis) 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는, 알코올성 간질환의 예방 또는 개선용 식품조성물을 제공한다.
상기 방사무늬김(Pyropia yezoensis), 이의 추출물, 및 이의 분획물 및 간질환에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같다.
본 발명에서의 용어, "개선"은 방사무늬김(Pyropia yezoensis) 추출물, 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 조성물을 이용하여 예방 또는 치료되는 간질환과 같은 질환의 의심 및 발병 개체의 증상이 호전되거나 이롭게 되는 모든 행위를 말한다.
구체적으로, 본 발명의 방사무늬김(Pyropia yezoensis) 추출물, 또는 이의 분획물을 간질환의 예방 또는 개선을 목적으로 식품 조성물에 첨가할 수 있다.
본 발명의 식품 조성물은 환제, 분말, 과립, 침제, 정제, 캡슐 또는 액제 등의 형태를 포함할 수 있으며, 본 발명의 방사무늬김(Pyropia yezoensis) 추출물, 또는 이의 분획물을 첨가할 수 있는 식품의 종류에는 별다른 제한이 없으며, 예를 들어 각종 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강보조 식품류 등이 있다.
상기 식품 조성물에는 방사무늬김(Pyropia yezoensis) 추출물, 또는 이의 분획물 이외에도 다른 성분을 추가할 수 있으며, 그 종류는 특별히 제한되지 않는다. 예를 들어, 통상의 식품과 같이 여러 가지 생약 추출물, 식품학적으로 허용가능한 식품보조첨가제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 용어, "식품보조첨가제"란 식품에 보조적으로 첨가될 수 있는 구성요소를 의미하며, 각 제형의 건강기능식품을 제조하는데 첨가되는 것으로서 당업자가 적절히 선택하여 사용할 수 있다. 식품보조첨가제의 예로는 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 충진제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등이 포함되지만, 상기 예들에 의해 본 발명의 식품보조첨가제의 종류가 제한되는 것은 아니다.
상기 천연 탄수화물의 예는 포도당, 과당 등의 단당류; 말토스, 수크로스 등의 이당류; 및 덱스트린, 시클로덱스트린 등의 다당류와, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이 있으며, 상기한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴 등), 스테비아 추출물(레바우디오시드 Ａ, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다.
본 발명의 식품 조성물에는 건강기능성 식품이 포함될 수 있다. 본 발명에서 사용된 용어 "건강기능성 식품"이란 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상 및 환 등의 형태로 제조 및 가공한 식품을 말한다. 여기서 기능성이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건 용도에 유용한 효과를 얻는 것을 의미한다. 본 발명의 건강기능성 식품은 당업계에서 통상적으로 사용되는 방법에 의하여 제조가능하며, 상기 제조시에는 당업계에서 통상적으로 첨가하는 원료 및 성분을 첨가하여 제조할 수 있다. 또한 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하여 약품의 장기 복용 시 발생할 수 있는 부작용 등이 없는 장점이 있고, 휴대성이 뛰어날 수 있다.
유효성분의 혼합양은 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품의 제조 시에 본 발명의 방사무늬김(Pyropia yezoensis) 추출물, 또는 이의 분획물은 원료 조성물 중 1 내지 50 중량%, 바람직하게는 5 내지 10 중량%의 양으로 첨가될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하로도 사용될 수 있다.
상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강기능성 식품을 모두 포함한다.
방사무늬김의 다양한 분획물 중에서, 지용성 부분에 해당하는 헥산 분획물이 알코올에 의해 유도된 간세포 보호활성이 현저함을 확인하였다. 또한, 상기 방사무늬김의 헥산 분획물이 마우스의 생존율을 증가시켰으며, 산화스트레스에 대한 보호효과를 가져 항산화 활성이 있음을 확인하였다. 또한, 알코올에 의해 유도된 간조직 손상에 대해서는 현저한 간조직 보호효과를 가지는 것을 확인하여 알코올성 간질환 치료제로 사용할 수 있다.
도 1은 방사무늬김의 추출물 및 분획물의 종류에 따른 간세포 보호 활성을 나타낸 것이다.
도 2는 PYLP의 HPLC 크로마토 그램을 나타낸 것이다. 피크 : desmosterol, 콜레스테롤, stigmasterol + campesterol.
도 3은 마우스에서 알코올로 유발된 독성에 대한 PYLP의 보호 효과를 나타낸 것이다. (A) 체중, (B) 생존율.
도 4는 간에서 알코올 유발 산화 스트레스에 미치는 PYLP의 보호 효과를 나타낸 것이다. (A) SOD 활성, (B) CAT 활성, (C) GPx, 활성, (D) TBARS (MDA). 데이터는 평균 ± SE (n = 3)로 표시하였다. 칼럼 내에 윗첨자는 유의한 차이를 의미한다 (p < 0.05).
도 5는 알코올 유도된 마우스의 조직학적 결과를 나타낸 것이다.
간 조직 절편을 hematoxylin과 eosin (H & E 염색, 100 배)로 염색하였다. (A) 대조군, (B) 알코올 군 (EtOH), (C) 알코올 + PYLP 군, (D) 알코올 + Silymarin 군, Bar = 10㎛이다.
도 6은 PYLP처리에 따른 proapoptotic 단백질인, p53 및 Bax, antiapoptotic 단백질인 Bcl-xL의 발현 양상을 나타낸 것이다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 보다 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기의 실시예에 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 >
1. 방사무늬 김( P. yezoensis )의 추출물과 분획물의 제조
1-1. 방사무늬 김( Pyropia yezoensis )의 지용성 분획물 제조
PYLP(liposoluble portion from P. yezoensis)를 제조하기 위해서는 먼저 건조된 P. yezoensis (600g)을 이용하여 70 % 에탄올 추출물을 제조하였다. 건조 추출 분말은 로터리 증발기(N-1000, TOKYO RIKIKAI CO., LTD.) 및 동결 건조기 SFDSM06, SAMWON FREEZING EXGINEERING CO., Korea)를 사용하여 얻었다. 마지막으로 PYLP (12.56 g)은 n-헥산과 증류수(1:1, v/v)를 사용하여 현탁액 분획으로부터 얻었으며, 건조 후 -20℃ 냉장고에 보관 하였다.
1-2. 방사무늬 김( P. yezoensis )의 다양한 분획물 제조
상기 방사무늬김의 에탄올 추출물을 헥산(n-hexane) 이외에도 클로로포름(chloroform), 에틸아세테이트(ethyl acetate), 물(water)을 이용하여 이들 용매의 분획물을 제조하였으며, 이를 건조 후 -20℃ 냉장고에 보관 하였다.
방사무늬김의 에탄올 추출물의 분획물로, 헥산 분획물, 클로로포름 분획물, 에틸아세테이트 분획물, 그리고 물 분획물은 각각 PYH(n-Hexane), PYC(chloroform), PYE(ethyl acetate), PYW(물)로 이후 약칭하며, 도면에도 동일한 약칭을 적용하였다.
2. PYLP의 생물학적 성분분석
2-1. 지방산
PYLP를 n-헥산에 용해시키고 0.2 mL의 2 M 메탄올성-NaOH를 첨가 하였다. 이어서, 상기 혼합물을 진탕시키고 50℃에서 30 초 동안 유지시킨 다음, 2 M HCl 0.2 mL를 포함하는 메탄올을 첨가하고 진탕하여 중화시켰다. 상기 혼합물을 700 × g에서 5 분간 원심분리하여 분리 하였다. 상단의 n-헥산층을 모으고 농축한 후, 0.5m의 PEG-20M 액상 코팅된 40m × 1.2mm 직경 G-300 칼럼(0.5 m thickness PEG-20M liquid phase-coated 40 m × 1.2 mm diameter G-300 column) (Chemicals Evaluation and Research Institute, Saitama, Japan)을 화염 이온화 검출기가 장착된 Hitachi 263 gas chromatograph (Hitachi Co. Ltd., Ibaraki, Japan)에 연결하여 기체 크로마토 그래피 분석을 수행하였다. 상기 컬럼, 검출기 및 주입 포트의 온도는 각각 190, 240 및 250 ℃ 였다.
2-2. 총 스테롤
비누화(saponification) 및 추출에 사용되는 조건은 Sanchez-Machado et al.(2004)에 기재된 조건을 변형하였다. 샘플 1.00 ± 0.01g을 삼각 플라스크에 넣고, 에탄올성 KOH (8:1, 에탄올:KOH) 27mL를 가하여 80 ℃에서 일정하게 흔들어 주면서 30 분간 환류하여 비누화하였다. 주위 온도로 냉각시킨 후, 상기 혼합물을 분액 깔대기로 옮겨 20 mL의 DW + 혼합물 및 20 mL의 헥산을 포함하는 총 40 mL로 비누화할 수 없는 분획물을 추출하였다 (매시간 3 분 동안 교반 세척). 스테롤을 함유하는 헥산을 40 ℃의 회전 증발기에서 증발 건조시켰다. 총 스테롤의 정량은 Livermann-burchard test로 평가 하였다. 잔류물을 3 mL의 이동상 (30:70 v/v 메탄올:아세토니트릴)에 용해시킨 후, 0.45 ㎛ 막을 통해 여과 하였다. 이 추출물 10 μL를 HPLC 컬럼에 주입 하였다. HPLC-UV 시스템은 Empower 소프트웨어 (Waters cooperation, MA)에 의해 제어되는 515 HPLC 펌프(Waters cooperation, Ireland) 및 photo diode array detector (2998 PDA detector, Waters cooperation, MA, USA)가 장착된 액체 크래마토그래프를 포함한다. 온도는 컬럼 히터 (Waters cooperation, MA, USA)로 50 ± 0.1 ℃로 조절 하였다. 분리는 이동상으로서 1.0 mL/min에서 30:70(v/v)의 메탄올:아세토니트릴과 함께 SunFireTM C18 5 ㎛ 컬럼 (4.6 × 250 mm i.d.; Waters cooperation, MA, USA)에서 수행 하였다. 용리된 용액은 200 nm 파장에서 검출되었다.
2-3. β-카로틴
β-카로틴의 정량 분석은 Nauman Ahamad(2007)가 제안한 분석법을 수정하여 사용하였다. β-카로틴(1g이 동봉된 바이알)의 표준 물질을 Merck에서 구입하였다. β-카로틴의 스탁용액(Stock solution)은 100ml의 n-헥산에 10mg을 취하여 제조하였다. 상기 스탁 용액의 농도는 100 ppm이었다. HPLC 시스템 및 크로마토 그래피 조건은 C18 컬럼 및 LC 250 UV/VIS 검출기가 장착된 LC-1000 펌프 (Isocratic)를 함유하는 Perkin Elmer HPLC 프로그램이었다. HPLC는 분당 1 mL의 속도로 이동상(아세토니트릴, 디클로로메탄 및 메탄올을 각각 70:20:10의 비)을 실행하여 보정하였다. 파장은 452 nm로 고정되었다. 10 μL의 β-carotene 또는 PYLP를 HPLC 컬럼에 주입하였다. PYLP에서 β-카로틴의 농도는 β-카로틴 표준 곡선을 사용하여 계산하였다.
3. 알코올에 대한 간세포 보호 효능 평가
Chang 세포주를 10% 소태아혈청(Fetal bovine serum)과 L-글루타민을 포함하는 DMEM (Dulbeccos’ modified Eagle’s medium) 배지를 이용하여 37℃, 5% CO2 배양기에서 배양하였다. 96 well plate에 1×105 cells/ml로 분주한 후, 16 시간이 지난 후 샘플을 농도별(50 ~ 200 μg/ml)로 처리하고, 샘플 처리 2시간 후에 ethanol이 4%가 되게 첨가한 후 24시간동안 배양하였다. Ethanol 보호효과를 측정하기 위하여 MTT assay를 이용하여 실험하였으며, 원리는 생존하면서 대사가 왕성한 세포 내 mitochondria의 탈수소효소 작용에 의하여 수용성의 노란색 MTT [3-(4,5-dimethylthiaxol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide]를 환원시켜 자주색을 띠는 비 수용성의 formazan을 측정하는 것이다. 24시간이 지난 후, MTT 용액 50 μl (2 mg/ml)을 첨가하여 2시간 동안 반응시켰다. 상층액을 완전히 제거하고 dimethylsulfoxide (DMSO)를 가하여 침전물을 완전히 용해시킨 후 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.
4. 혈액 속의 생화학 지표의 검출
최종 수유 후, 각 군의 마우스를 12 시간 동안 금식시켰다. 복강 대동맥에서 혈액을 수집하기 위해 각각 정상 군, 에탄올 군, 에탄올 + PYLP 군, 에탄올 + 실리마린 군으로부터 총 15 마리의 실험 동물을 취하였다. 마우스의 혈청에서 glutamic oxaloacetic transaminase(GOT), glutamate pyruvate transaminase(GPT), 총 콜레스테롤 및 malondialdehyde (MDA)의 수준을 측정하였다.
5. 조직학적 분석
간 조직을 hematoxylin-eosin(HE)으로 염색하고 일반 조직 병리학 검사를 위해 광학 현미경(Olympus, PA, USA) 하에서 검사하였다. 조직학적 평가는 Guo et al.(2007)에 따라 평가하였다.
6. 마우스 간에서의 항산화 효소 활성
간 조직을 1 mM 에틸렌디아민테트라 아세트산 (EDTA) 및 3 mM DL-디티오 트레이톨을 함유하는 100 mM 칼륨 포스페이트 완충액(pH 7.5)으로 막자(pestle)가 구비된 막자사발(mortar)에서 균질화시켰다(5:1, 완충액:간). 균질액을 12,100 x g에서 30 분 동안 원심분리하고 상층액을 80 ℃에서 별도의 분취량(aliquots)으로 보관하였으며, 단백질 농도, superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT), glutathione peroxidase (GSH-Px) 및 glutathione reductase (GR) 활성 측정에 사용하였다. 모든 샘플의 단백질 농도는 소 혈청 알부민을 표준 물질로 사용하여 Bradford의 방법으로 측정 하였다. SOD 활성은 Giannopolitis & Reis(1977)에 기술 된 바와 같이 결정되었고, SOD 동종형은 native polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) 후에, Azevedo et al.(1998)에 따라 결정하였다. CAT 및 GR 활성은 Cia et al.(2012), GSH-Px는 Flohe & Gunzler(1984)에 의해 기술 된 바와 같이 결정되었다.
7. 웨스턴 블랏 시험
조직 용해물(lysates)은 용해 완충액(50 mmol/ℓ Tris-HCl (pH 7.4), 150 mmol/ℓ NaCl, 1 % Triton X-100, 0.1 % SDS 및 1 mmol/ℓ EDTA)으로 제조하였다. 조직 용해물을 원심 분리를 통해 세척하고, 용해물의 단백질 농도를 BCA ™ 단백질 분석 키트를 사용하여 측정하였다. 30 μg의 단백질을 포함하는 용해물을 10 % 또는 12 % 소디움 도데실 설페이트-폴리아크릴아미드 겔에서 전기 영동하고, 겔을 니트로셀룰로스 막(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)에 옮겼다. 상기 막을 0.5 % non-fat dry milk를 함유하는 TTBS (25 mmol/ℓ Tris-HCl, 137 mmol/ℓ NaCl, 0.1 % Tween 20, pH 7.4)에서 Bax, p53, Bcl-x1 및 β-액틴에 대한 1차 항체와 함께 1시간 동안 항온 배양 하였다. 이어서, 막을 TTBS로 세척하고 2차 항체로 배양 하였다. 신호는 ECL Western blotting 검출 키트를 사용하여 개발되었으며 X선 필름에 노출되었다.
8. 통계 분석
모든 데이터는 평균 ± 표준 편차로 나타내었고 ANOVA는 두 마리의 마우스 그룹의 평균을 비교하기 위해 사용되었다. 95 % 및 99 % 확률 수준에서의 통계적 유의성은 각각 p <0.005 및 p <0.01로 설정되었다
< 실험예 >
1. 추출물과 분획물에 따른 간세포 보호 활성 비교
앞서 실시예 1-1과 1-2에서 제조한 방사무늬김 추출물과 여러가지 분획물을 이용하여, 알코올 처리에 따른 간세포 보호 활성을 평가하였다.
그 결과, 도 1에 도시된 바와 같이, 방사무늬김 추출물의 헥산 분획물이 다른 추출물이나 분획물에 비해 간세포 보호 활성이 현저히 높은 것을 확인하였다.
이하에서는 간세포 보호 활성이 가장 우수한 방사무늬김의 지용성 부분의 분획물인 헥산 분획물을 이용하여 실험을 실시하였다.
2. PYLP의 화학 조성
PYLP(liposoluble portion from P. yezoensis)는 총 지방산, 총 스테롤 및 β-카로틴과 같은 다양한 화학 성분에 대해 분석되었다(표 1). P.yezoensis의 수불용성 추출물의 지방산 조성을 표 2에 나타내었다. PYLP의 총 지방산, β-카로틴 및 총 스테롤은 각각 84.52 %, 10.01 % 및 2.30 %로 얻어졌다.
Figure 112016123815999-pat00001
PYLP는 54.12 %의 에이코사펜타엔산(EPA, C20:5), 21.07 %의 팔미트산 (PA, C16:0), 6.43 %의 트리코산산 (TA, C23:0) 및 4.99 % 리놀레산 (LA, C18:2) 같은 여러 주요 지방산을 포함하였다.
Figure 112016123815999-pat00002
총 sterols은 72.10 % desmosterol, 10.01% 콜레스테롤 및 stigmasterol과 campesterol의 혼합물 17.31 % 로 구성되었다(도 2).
3. 생쥐의 체중과 생존율에 미치는 알코올의 영향
PYLP의 알코올에 대한 보호 효과를 평가하기 위해 마우스의 체중 및 생존율을 측정하고 결과를 도 3에 나타냈다. 알코올, PYLP 또는 실리마린 처리는 마우스의 평균 체중에 영향을 미치지 않는 것으로 나타났다. 그러나 알코올은 치료 후 3 일째 생존율을 현저하게 감소시켰으나, PYLP는 9 일까지 100 % 생존율을 유지시켰다. 9 일까지 알코올 + PYLP 군에서 생존율이 20 % 감소했다. 그러나 silymarin (양성 대조군) 처리는 실험 중 어느 단계에서도 마우스 죽음을 초래하지 않았다. Silymarin은 간 손상의 치료 및 만성 간염과 간경변의 보조 요법으로 사용되고 있다.
4. 간 손상 매개 변수에 대한 PYLP의 효과
표 3은 마우스에서 알코올 단독, PYLP + 알코올 및 silymarin + 알코올 처리에 따른 glutamate oxaloacetate transaminase (GOT; aspartate aminotransferase, AST로 알려짐), glutamate pyruvate transaminase (GPT, alanine aminotransferase, ALT로 알려짐), total cholesterol, 및 malondialdehyde (MDA) 수준을 나타낸 것이다. 상기 GOT와 GPT는 주로 간에서 발견되지만 혈액, 심장, 근육, 췌장 및 신장 세포의 미토콘드리아와 세포질에서도 발견된다. GOT와 GPT는 장기 손상과 간질환의 지표로 사용된다 (Ren et al., 2009; Lin et al., 2010). 이 연구에서, GOT와 GPT의 수치는 알코올 처리 마우스에서 대조군보다 유의하게 높았다. 알코올 처리에 의해 증가된 GOT와 GPT의 수준은 PYLP 처리에 의해 감소하였다. PYLP 처리에 의해 실리마린 처리와 유사한 간 보호 효과를 나타내는 것으로 관찰되었다.
Figure 112016123815999-pat00003
혈청 총 콜레스테롤은 알코올성 간 손상에 대한 PYLP의 보호 효과를 나타내는 지표이다. 혈청 총 콜레스테롤이 PYLP 처리 군과 알코올 동시 투여군에서 알코올 단독 군보다 유의하게 감소하는 것을 관찰하였다 (p <0.01). 반대로, PYLP 처리 군은 실리마린 군과 유사한 혈청 총 콜레스테롤 수치를 보였다.
에탄올에 의해 생성되는 다량의 ROS는 LDL-콜레스테롤의 과산화를 자극하여 MDA 형성을 현저히 증가시킨다. 그러므로 MDA는 종종 산화 상태의 지표로 사용된다 (Harris et al., 2015; Macan et al., 2015). 알코올 처리된 마우스에서 PYLP의 혈청 MDA에 대한 보호 효과를 측정하였다. 그 결과 알코올은 혈청 MDA를 약 230 % 증가시켰으며 PYLP 처리는 혈청에서 MDA 형성을 정상군 수준으로 감소시켰다.
5. 마우스의 간에서의 알코올 유발 산화 스트레스에 대한 PYLP의 보호 효과
만성적인 에탄올 노출은 산화적 손상으로부터 간세포를 보호하는 내인성 비 효소적 (예: 글루타티온 (GSH)) 및 효소적 (예: 슈퍼옥사이드 디스뮤타아제 (SOD) 및 글루타티온 퍼옥시다아제 (GPx)) 항산화 시스템을 손상시킨다 (Cao et al., 2015). PYLP의 보호 효과는 알코올 유발 산화 스트레스뿐만 아니라 SOD, CAT 및 GPx 효소의 활성화에 대한 PYLP의 효과에 대해 평가되었다. 도 4 A~C에 나타낸 바와 같이, 알코올을 투여한 마우스에서 효소의 활성이 유의하게 감소되었다. 그러나 PYLP 처리에 의해 이들 효소의 활성을 유의하게 증가시켰다(p <0.01). 또한 알코올 처리는 TBARS의 수준을 유의하게 증가시켰으나, PYLP가 알코올 투여된 마우스에서 콜레스테롤 과산화를 억제하였다 (도 4D). 따라서, Silymarin과 PYLP는 알코올 유발 산화 스트레스에 대해 유사한 보호 효과를 나타냈다.
6. 간 조직 병리학에 PYLP의 효력
일반적으로 알코올은 간 조직에 악영향을 미친다(Matsumoto et al., 2016). 그러므로 알코올 유발 간 손상에 대한 PYLP의 간 조직의 조직 병리학적 변화에 보호 효과를 평가하는 것이 중요하다. 도 5에서 알 수 있는 바와 같이, 정상 마우스의 간은 간세포, 담즙 로브 및 주변 부위의 정상적인 구조를 보였다. 알코올 단독 군의 간 조직은 액포화 현상 및 출혈성 병변으로 나타난 간세포 변성을 보였다. 그러나 silymarin과 알코올 공동 투여 군의 간 조직은 간세포 변성으로 덜 손상되었다. 또한, PYLP 처리 군은 알코올 단독 군과 달리 손상된 간세포 및 문맥의 맥관구조(portal vasculature) 없이 손상되지 않은 간 조직을 나타냈다.
7. PYLP가 알코올 유발 성 세포 사멸에 미치는 영향
에탄올이나 다른 자극에 의해 유도된 산화 스트레스는 p53과 Bcl-2 계열 단백질의 발현을 통해 세포 사멸을 일으킨다 (Liu et al., 2008; Behera et al., 2014; Chen et al., 2016). proapoptotic 단백질인, p53 및 Bax, antiapoptotic 단백질인 Bcl-xL의 발현에 대한 PYLP의 영향을 평가하였다. 그 결과 도 6에서 에탄올이 p53 및 Bax 단백질의 발현을 증가시키는 반면, PYLP는 이들 단백질의 발현을 억제하였다. Antiapoptotic 단백질인 Bcl-xL의 발현은 PYLP 처리 마우스에서 알코올 단독 군보다 다소 증가했다. 결론적으로, 알코올 처리된 마우스에서 PYLP는 p53 및 Bax 단백질의 발현 감소 및 Bcl-xL 단백질의 발현 증가를 통해 간세포의 세포 자멸을 억제하였다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (8)

  1. 총 지방산, β-카로틴, 및 총 스테롤을 함유하는 방사무늬김(Pyropia yezoensis) 추출물의 헥산 분획물을 유효성분으로 포함하는, 알코올성 간질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서, 상기 분획물은 항산화 활성을 가지는 것인, 알코올성 간질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  4. 삭제
  5. 제1항에 있어서, 상기 총 지방산은 에이코사펜타엔산(EPA), 팔미트산(PA), 트리코산산(TA) 및 리놀레산(LA)을 포함하는 것인, 알코올성 간질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  6. 총 지방산, β-카로틴, 및 총 스테롤을 함유하는 방사무늬김(Pyropia yezoensis) 추출물의 헥산 분획물을 유효성분으로 포함하는, 알코올성 간질환의 예방 또는 개선용 식품조성물.
  7. 삭제
  8. 제6항에 있어서, 상기 분획물은 항산화 활성을 가지는 것인, 알코올성 간질환의 예방 또는 개선용 식품조성물.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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Molecular Medicine Reports, 2016.11., 제14권, 제5호, 페이지 4881-4886*

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