KR101786180B1

KR101786180B1 - 부평초 추출물을 유효성분으로 포함하는 간질환의 예방 또는 치료용 조성물

Info

Publication number: KR101786180B1
Application number: KR1020150088991A
Authority: KR
Inventors: 김상찬; 조일제; 구세광; 김영우; 박상미; 정지윤; 제갈경환; 김재광; 고해리
Original assignee: 대구한의대학교산학협력단
Priority date: 2015-06-23
Filing date: 2015-06-23
Publication date: 2017-10-17
Also published as: KR20170000151A; JP2022008715A

Abstract

본 발명은 부평초 추출물을 유효성분으로 함유하는 간질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 부평초 추출물은 미토콘드리아 보호작용을 통한 간세포보호효과가 우수하고, 간보호작용을 보이며 정상 세포에 독성을 유발하지 않는다는 것을 확인함으로써, 간질환 치료제 또는 간질환 예방을 위한 건강기능성 식품의 유효성분으로 사용할 수 있다.

Description

부평초 추출물을 유효성분으로 포함하는 간질환의 예방 또는 치료용 조성물{Composition comprising Spirodela polyrhiza extracts for preventing or treating nonalcoholic fatty liver disease}

본 발명은 부평초 추출물을 유효성분으로 포함하는 간질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

간은 인간의 신체장기 중 생체 내 대사가 가장 활발하게 일어나는 장기로, 인체 내 소화기계와 전신순환계 사이에 위치하면서 외부에서 들어온 생체 외 물질로부터 전신을 방어하는 기능을 수행하고 있다. 생체 내로 들어온 생체 외 물질은 일단 간을 통과하게 되므로 간은 영양소 이외에도 많은 독성물질에 노출될 위험이 다른 장기보다 많아 그만큼 손상될 확률도 매우 높다. 그러나 간은 재생능력이 우수한 장기로 약간의 손상이 있을 경우에는 충분히 정상으로 회복되지만, 손상이 지속될 경우에는 간 조직의 일부가 완전히 파괴되고 간 기능도 저하되는 등 정상 간으로의 회복이 어려운 상태가 된다. 이러한 간 손상이 만성화되면 그 원인에 상관없이 간 섬유화 또는 간경화, 간암으로 진행된다.

한편, 간 손상을 유발하는 원인으로는 스트레스성 만성 피로 및 지방성분이 포함된 음식 또는 알콜의 과다 섭취, 바이러스의 감염, 각종 약품과 같은 유해물질, 영양부족 등 다양하다.

이러한 간 손상에 의한 간 질환을 치료하기 위한 방법으로는 크게 식이요법과 약제요법이 사용되고 있으며, 이 2가지 방법이 병용되고 있다. 또한, 대표적인 간 질환 치료제로는 실리마린(silymarin)과 비페닐디메칠디카르복실레이트(biphenyl dimethyl dicarboxylate, BDD)가 있으나, 이들 약물 역시 근본적인 치료제가 되지는 못하고 있으며, 이 외 개발된 화합물에 의한 치료제는 체내 다양한 부작용을 유발할 수 있어 제품화 되지 못하고 있는 실정이다.

따라서, 종래 치료제를 대체할 수 있을 만큼 치료효과가 우수하며, 대량 또는 장기간 투여 시에도 부작용이 없는 천연물을 이용한 새로운 간질환 치료제의 개발이 시급한 실정이다.

부평초(Spirodela polyrrhiza)는 천남성과의 다년생 초본으로서 수면에 뜨는 작은 풀로서 개구리밥의 전초를 부평초라고도 지칭하며, 산화칼륨 및 염화칼륨, 불소 등의 성분이 알려져 있고 강심작용, 해혈작용 등에 효과가 있는 것으로 알려진바 있다(정보섭 외 1인, 향약 대사전, 영림사, pp.277~278, 1998.).

이에 본 발명자들은 부평초 추출물의 in vitro 상에서 산화적 스트레스에 대한 간세포보호 효과를 평가하고, in vivo로 부평초 추출물의 간보호효과를 평가하여 간질환 치료 및 예방을 위한 소재로 사용할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

한국등록특허 제10-0864455호 한국공개특허 제10-1383146호

본 발명의 목적은 부평초 추출물을 유효성분으로 함유하는 간질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

또한 본 발명의 다른 목적은 부평초 추출물을 유효성분으로 함유하는 간질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공하는 것이다.

본 발명은 부평초 추출물을 유효성분으로 함유하는 간질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 추출물은 물, C1~C4의 알콜, 헥산, 에틸아세테이트, 부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 글리세린, 초산에칠, 에테르, 클로로포름 및 이들의 혼합용매로 이루어진 군으로부터 선택되는 용매를 이용하여 수득할 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 추출물은 조성물 총 중량%에 대해 0.1 내지 50 중량%로 함유될 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 간질환은 간경화, 간섬유증, 급성간염, 만성간염 또는 간암일 수 있다.

또한, 본 발명은 부평초 추출물을 유효성분으로 함유하는 간질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 추출물은 물, C1~C4 의 알콜, 헥산, 에틸아세테이트, 부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 글리세린, 초산에칠, 에테르, 클로로포름 및 이들의 혼합용매로 이루어진 군으로부터 선택되는 용매를 이용하여 수득한 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 건강기능식품은 정제, 캡슐제, 환제 또는 액제 형태의 식품일 수 있다.

본 발명은 부평초 추출물을 유효성분으로 함유하는 간질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 부평초 추출물은 미토콘드리아 보호작용을 통한 간세포보호효과가 우수하고, 간보호작용을 보이며 정상 세포에 독성을 유발하지 않는다는 것을 확인함으로써, 간질환 치료제 또는 간질환 예방을 위한 건강기능성 식품의 유효성분으로 사용할 수 있는 효과가 있다.

도 1은 본 발명의 부평초 추출물을 처리한 간 실질 세포주의 생존율을 측정한 결과이다.
A) 간 실질 세포주에 부평초 추출물만 처리한 세포생존율 MTT 결과
B) 부평초 추출물 처치 후, AA + iron을 처치한 간 실질 세포주의 세포생존율 MTT 결과
도 2는 본 발명의 부평초 추출물의 AA + iron로 유도된 세포사멸효과 측정을 위한 PARP 와 pro-caspase 3의 발현을 immunoblot analysis로 확인한 결과이다.
도 3은 본 발명의 부평초 추출물의 항산화 효과 측정 결과이다.
도 4는 본 발명의 부평초 추출물의 GSH량 측정 결과이다.
도 5는 본 발명의 부평초 추출물이 AA + iron로 유도된 미토콘드리아 기능 장애를 회복시키는 측정 결과이다.
도 6은 본 발명의 부평초 추출물이 CCl₄로 유도된 간손상 동물모델에 미치는 영향 측정 그래프이다.
A) 간손상 지표 ALT 측정 결과이다.
B) 간손상 지표 AST 측정 결과이다.
도 7은 본 발명의 부평초 추출물이 CCl₄로 유도된 손상 간의 조직학적 분석을 위한 H&E 염색 사진이다.
A) 정상 간조직 사진이다.
B) 100mg/kg의 부평초 추출물만 투여한 간조직 사진이다.
C) CCl₄로 간손상을 유도한 간조직 사진이다.
D) CCl₄+ 부평초 추출물 30mg/kg를 투여한 간조직 사진이다.
E) CCl₄ + 부평초 추출물 100mg/kg를 투여한 간조직 사진이다.
도 8은 본 발명의 부평초 추출물이 CCl₄로 유도된 손상간의 면역학적 분석 결과 중 NT 와 4-HNE 결과 사진이다.
A) 정상 간조직 사진이다.
B) 100mg/kg의 부평초 추출물만 투여한 간조직 사진이다.
C) CCl₄로 간손상을 유도한 간조직 사진이다.
D) CCl₄+ 부평초 추출물 30mg/kg를 투여한 간조직 사진이다.
E) CCl₄ + 부평초 추출물 100mg/kg를 투여한 간조직 사진이다.

본 발명은 간질환을 예방 또는 치료할 수 있는 유효성분으로 부평초 추출물을 사용할 수 있음을 최초로 규명한 점에 특징이 있다.

앞서 종래기술에서도 기술한 바와 같이, 현재 사용되고 있는 간질환 치료제들의 경우 근본적인 치료가 이루어지지 않아 약학적 효능이 미비하며 체내 부작용을 초래하기 때문에 천연물을 기반으로 한 새로운 간질환 치료제를 발굴하려고 노력하던 중, 본 발명자들은 부평초 추출물을 사용할 수 있음을 실험을 통해 확인하였다.

본 발명의 일실시예에 따르면, 본 발명의 부평초 추출물은 세포독성이 없으며, 산화적 스트레스에 대한 간세포보효 효과가 우수한 것으로 나타났다(실험예 1 내지 4 참조).

본 발명의 부평초 추출물의 산화적스트레스에 대한 간세포 보호효과를 확인하기 위해, 인체 유래 간 실질 세포주인 HepG2 cell을 열처리된 10% fetal bovine serum (FBS)과 100 units/ml penicillin 및 100 μg/ml streptomycin을 혼합한 Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) 배지를 사용하여 37℃, 5% CO₂ 조건이 유지되는 배양기에서 배양하였다. 세포는 100 mm dish에서 confluence가 80% 이상이 되도록 배양하였고, 일주일에 2회, 1:4의 비율로 계대 배양하였다. 12시간동안 serum-starvation한 후, 부평초 추출물을 0.01-0.30 mg/ml의 농도로 처치하고, 1시간 뒤에 10 μM AA를 12시간 처치한 후 5 μM iron을 처치하여 1시간 추가 배양하였고, control군은 부평초 추출물을 처치하지 않고 배양하였다. 상기 아라키돈산(arachidonic acid, AA) 처리한 후, iron을 처리하는 과정은 세포의 산화적 스트레스를 유도하기 위한 것으로, 본원발명에서는 이하 'AA + iron' 이라 명명하였다.

참고로, 인체는 활성산소(reactive oxygen species; ROS)에 지속적으로 노출되어 있으며, ROS가 과도하게 발생되거나, 산화제와 항산화제의 균형이 깨어질 때 세포나 조직이 손상을 받게 되고, 산화적 스트레스가 생기게 된다. 이러한 산화적 스트레스에 대하여, catalase, superoxide dismutase 등과 같은 내재적인 항산화 효소와 glutathione (GSH), carotenoids, flavonoids 등과 같은 비효소적 항산화 물질이 산화적 스트레스로부터 인체를 방어하고, 세포 내 여러 부분에 작용하여 조직의 과산화를 억제한다.

본 발명의 'GSH'는 살아있는 세포에서 ROS로부터 세포를 보호하는 중요한 역할을 담당한다. GSH는 직접적으로 ROS와 결합하거나, 비타민 C와 같은 항산화물질의 재생성(antioxidant recycling)에 관여함으로써 항산화 기능을 한다. 세포내에서 높은 농도의 GSH는 일차적으로 ROS를 방어함으로써 세포를 산화적 스트레스로부터 보호할 수 있으나 GSH가 억제된 경우는 ROS가 증가되고, 세포사멸(apoptosis)이 증가하며, 그리고 산화적 자극에 대해 민감하게 반응한다. 또한, 세포 내 활성산소의 증가는 GSH의 결핍을 유도하여 세포사멸을 유도하며, 항산화 효능을 가지는 많은 약물들은 세포 내 결핍된 GSH를 생성하기 위한 효소의 발현 및 활성 증가를 통하여 세포보호작용을 한다.

본 발명의 일실시예에 따르면, 본 발명의 부평초 추출물은 미토콘드리아 보호 작용을 통한 간세포보호효과가 우수하며, 동물모델에 있어서도 유의한 간 보호작용을 나타내었으며, 또한 염증반응도 억제하는 것으로 나타났다(실험예 5 참조).

참고로, 세포 내 아라키돈산(arachidonic acid, AA)의 증가는 미토콘드리아 투과성 전이 통로 (mitochondrial permeability transition pore, mPTP)를 개방하여 세포질로의 cytochrome-c의 유리를 증가시켜, apoptosis를 유도하고, 또한 ceramide의 농도를 높임으로써 아라키돈산(arachidonic acid, AA)의 세포독성이 일어난다는 것으로 알려져 있다. AA처리후, iron을 처리하면 산화를 촉매하여 세포의 산화적 스트레스를 증가시키고, 미토콘드리아의 기능 장애를 유발한다.

이러한 산화적 스트레스에 의해 유도되는 세포사멸에 대한 세포보호기전에 미토콘드리아 보호효과가 매개됨을 실험예 6에서 확인하였다.

본 발명의 일실시예에 따르면, 본 발명의 부평초 추출물은 CCl₄ 복강투여로 유도된 간독성에 효과가 있음을 간손상 평가지수 ALT, AST를 통해 확인하였고, 부평초 추출물 처리 농도에 따른 ALT, AST 값의 유의한 감소를 통해 간손상 보호효과가 있음을 확인하였다.

참고로, ALT는 장기들 중에서도 간세포변성과 괴사를 예민하게 반영하여, ALT의 상승이 간손상의 존재를 가장 의미있게 반영하므로, ALT는 간손상을 평가하는 이상적인 지표로서, 간손상에 대한 민감도, 특이성, 양성 및 음성예측치가 매우 높은 것으로 보고되고 있다.

AST는 ALT와 함께 심근, 간, 골격근 및 신 등에 많이 존재하고, 혈중에는 극히 미량이 존재한다. 따라서 혈중의 AST와 ALT가 상승하면 이들이 분포하고 있는 장기의 세포 변성 및 괴사를 반영하며, 특히 간과 심질환의 지표로 널리 이용되고 있다.

본 발명의 일실시예에 따르면, 본 발명의 부평초 추출물은 CCl₄로 유도된 간의 조직학적 변화에 대해 유의미한 변화가 있었으며, 이를 통해 부평초 추출물이 간세포 보호효과가 있음을 확인하였다(실험예 7 참조).

본 발명의 일실시예에 따르면, 본 발명의 부평초 추출물은 CCl₄로 유도된 간의 면역학적 변화를 NT와 4-HNE를 통해 유의미한 변화를 확인하였고, 이를 통해 부평초 추출물이 간세포 보호효과가 있음을 확인하였다(실험예 8 참조).

참고로, Nitrotyrosine (NT)의 형성에는 과산화질소(peroxy nitrite, ONOO-)가 중요한 역할을 한다. 일산화질소(nitric oxide; NO)와 oxidative stress에 의해서 발생하는 과산화물(O^-)이 반응하여 과산화질소를 형성하고, 형성된 과산화질소에 의하여 활성질소종(reactive nitrogen species, RNS)이 tyrosine과 반응하여 NT를 형성하게 된다. 과산화질소는 지질과산화뿐만 아니라, 세포자멸사를 유도하는 미토콘드리아에서의 cytochrome-c의 유출, apoptosis-inducing factor (AIF)의 유출을 통하여 세포자멸사를 유도하기도 한다. NT는 CCl₄로 유도된 간독성을 포함한 병리적 조건에서 다량 관찰되며, 이는 NO의존적이고, RNS로 유도되는 nitrate stress의 지표로 고려된다.

4-HNE는 α, β-unsaturated hydroxyalkenal로서 이는 세포에서 지질과산화에 의해 생성되며, 4-HNE는 만성염증, 퇴행성신경질환, 성인 호흡곤란증후군(Adult respiratory distress syndrome; ARDS), atherogenesis, 당뇨 및 종양을 포함하는 다양한 질병의 원인 인자로 고려되고 있다. CCl₄는 대사과정에서 4-HNE 및 malondialdehyde (MDA)를 형성한다.

그러므로 본 발명의 부평초 추출물은 미토콘드리아 보호 작용을 통한 간세포보호효과가 우수하므로 간질환 치료제의 주요 소재로 활용할 수 있으므로, 본 발명은 부평초 추출물을 유효성분으로 함유하는 간질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 상기 부평초 추출물은 당업계에 공지된 추출 및 분리하는 방법을 사용하여 부평초를 대상으로 추출물을 분리 및 수득한 것을 사용할 수 있으며, 본 발명에서 정의된 추출물은 적절한 용매를 이용하여 부평초로부터 추출할 수 있다. 이때 추출물을 수득하기 위해 사용할 수 있는 적절한 용매로는 당업계에서 허용되는 용매라면 어느 것을 사용해도 무방하며, 물 또는 유기용매를 사용할 수 있다. 예를 들어, 정제수, 메탄올(methanol), 에탄올(ethanol), 프로판올(propanol), 이소프로판올(isopropanol), 부탄올(butanol) 등을 포함하는 탄소수 1 내지 4의 알코올, 아세톤(acetone), 에테르(ether), 벤젠(benzene), 클로로포름(chloroform), 에틸아세테이트(ethyl acetate), 메틸렌클로라이드(methylene chloride), 헥산(hexane) 및 시클로헥산(cyclohexane) 등의 각종 용매를 단독으로 혹은 혼합하여 사용할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.

추출 방법으로는 열수추출법, 냉침추출법, 환류냉각추출법, 용매추출법, 수증기증류법, 초음파추출법, 용출법, 압착법 등의 방법 중 어느 하나를 선택하여 사용할 수 있다. 또한, 목적하는 추출물은 추가로 통상의 분획 공정을 수행할 수도 있으며, 통상의 정제 방법을 이용하여 정제될 수도 있다. 본 발명의 부평초 추출물의 제조방법에는 제한이 없으며, 공지되어 있는 어떠한 방법도 이용될 수 있다.

바람직하게는 용매로서 물을 이용하고 열수추출법으로 부평초 추출물을 수득할 수 있다.

또한 상기 본 발명의 약학적 조성물은 상기 유효성분 이외에 약제학적으로 적합하고 생리학적으로 허용되는 보조제를 사용하여 제조될 수 있으며, 상기 보조제로는 부형제, 붕해제, 감미제, 결합제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제 또는 향미제 등을 사용할 수 있다.

상기 약제학적 조성물은 투여를 위해서 상기 기재한 유효성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 약제학적 조성물로 바람직하게 제제화할 수 있다.

상기 약제학적 조성물의 제제 형태는 과립제, 산제, 정제, 피복정, 캡슐제, 좌제, 액제, 시럽, 즙, 현탁제, 유제, 점적제 또는 주사 가능한 액제 등이 될 수 있다. 예를 들어, 정제 또는 캡슐제의 형태로의 제제화를 위해, 유효 성분은 에탄올, 글리세롤, 물 등과 같은 경구, 무성의 약제학적으로 허용 가능한 불활성 담체와 결합될 수 있다. 또한, 원하거나 필요한 경우, 적합한 결합제, 윤활제, 붕해제 및 발색제 또한 혼합물로 포함될 수 있다. 적합한 결합제는 이에 제한되는 것은 아니나, 녹말, 젤라틴, 글루코스 또는 베타-락토오스와 같은 천연 당, 옥수수 감미제, 아카시아, 트래커캔스 또는 소듐올레이트와 같은 천연 및 합성 검, 소듐 스테아레이트, 마그네슘 스테아레이트, 소듐 벤조에이트, 소듐 아세테이트, 소듐 클로라이드 등을 포함한다. 붕해제는 이에 제한되는 것은 아니나, 녹말, 메틸 셀룰로스, 아가, 벤토니트, 잔탄 검 등을 포함한다. 액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용 가능한 약제학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 더 나아가 해당분야의 적절한 방법으로 Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton PA에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화 할 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 본 발명의 부평초 추출물은 조성물 총 중량에 대하여 0.1 ~ 50 중량%로 포함될 수 있다.

이러한 본 발명의 부평초 추출물이 치료, 예방, 개선할 수 있는 상기 간질환은 이에 제한되지는 않으나, 간경화, 간섬유증, 급성간염, 만성간염 또는 간암일 수 있다.

상기 기술된 간질환 중, 간경화는 만성적인 염증으로 인해 정상적인 간조직이 광범위하게 파괴된 결과로 섬유조직의 증식과 재생성 결절 형성의 형태학적 특징을 보이며, 2차적으로 간 내 혈관의 변형 및 간기능의 저하가 초래되는 질병이다(Bataller B, Brenner DA. Hepatic Fibrosis. In : Arias IM et al., The liver biology and pathobiology. 5th ed. Wiley-Blackwell, 2009, p.433-452). 간경화의 증상은 매우 다양하게 나타나는데 피부에 거미상 혈관이 나타나거나, 호르몬 대사의 이상으로 손바닥이 정상인보다 붉어지고, 남성에서는 여성호르몬이 파괴되지 않아 가슴이 커지며 성기능이 저하될 수 있다. 비장이 커지면서 왼쪽 옆구리에서 만져질 수 있고, 복수가 차고 양쪽 다리가 부을 수 있으며, 피부 바깥쪽까지 확장된 혈관이 튀어나올 수 있다. 또한 간기능의 저하로 황달이 나타날 수 있고, 간성혼수(hepatic coma)로 인해 인격이 변하거나 의식을 잃을 수도 있다. 식도정맥류 출혈 등이 발생하면 피를 토하거나 흑변, 혈변이 보일 수도 있다(Goldmann DR, Complete home medical guide, DK publishing, 2003, p.643-651).

이러한 간경화는 섬유조직의 증식 및 재생성 결절을 나타내는 질환으로 정상상태로 되돌리는 것은 불가능하며, 간경화에 대한 치료는 완치를 목적으로 하는 것이 아닌 현재의 간기능을 최대한 활용할 수 있도록 하는 것이다. 바이러스 성 간경화의 경우, 그 원인을 억제하기 위한 페그인터페론(Peginterferon)이나 항바이러스제 등의 약물을 사용할 수 있으나, 간경화를 적극적으로 치료하기 위한 치료제는 없는 실정이다.

또한, 간섬유화(간섬유증)는 결합조직의 합성 및 분해 과정의 균형이 상실된 상태로서, 간 조직 내에 결합조직이 과도하게 축적되어 발생되며 괴사나 염증이 동반된다. 특히 간에서 간기능이 정상적인 상태에서 비타민 A를 저장하는 역할을 하는 간성상세포(hepatic stellate cells : HSCs)는 급 만성 간 손상에 의해 근섬유아세포(myofibroblast) 형태로 전이되고 급속히 증식하여 콜라겐(collagen), 프로테오글리칸(proteoglycan), 히알유로난(hyaluronan) 등과 같은 세포외 기질의 생성을 증가시키고 이동시켜 과도한 결합조직을 생성함으로써 간의 섬유화 과정을 진행시키는 것으로 알려져 있다(Friedman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 82: 8681, 1985. and Gressner et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 151: 222, 1988. and Gressner et al., J. Hepatol., 22: 28, 1995.).

간암 역시 상기 기술된 간손상 질환인 간경화 및 간섬유화와 같은 증상이 악화되고 간 손상의 지속적인 원인 작용으로 발병될 수 있어, 본 발명의 부평초 추출물은 간암의 치료에도 효과적일 수 있다.

나아가 본 발명의 조성물은 간질환 치료 및 예방을 위한 약학적 조성물 이외에도 식품 조성물로 사용될 수 있는데, 이러한 식품 조성물은 유효성분인 부평초 추출물을 함유하는 것 외에 통상의 식품 조성물과 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다.

상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 향미제는 천연 향미제 (타우마틴), 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제 (사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다.

본 발명의 식품 조성물은 상기 약제학적 조성물과 동일한 방식으로 제제화되어 기능성 식품으로 이용하거나, 각종 식품에 첨가할 수 있다. 본 발명의 조성물을 첨가할 수 있는 식품으로는 예를 들어, 음료류, 육류, 초코렛, 식품류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 사탕류, 아이스크림류, 알코올 음료류, 비타민 복합제 및 건강보조식품류 등이 있다.

또한 상기 식품 조성물은 유효성분인 부평초 추출물 외에 여러 가지 영양제, 비타민, 광물 (전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제 (치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 식품 조성물은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다.

본 발명의 유효성분인 부평초 추출물은 천연물질로서 독성 및 부작용은 거의 없으므로 장기간 복용시에도 안심하고 사용할 수 있다.

본 발명의 건강기능식품은 간손상을 개선 및 예방하기 위한 목적으로, 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상, 환 등의 형태로 제조 및 가공할 수 있다.

본 발명에서 건강기능식품이라 함은 건강기능식품에 관한 법률 제6727호에 따른 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 및 가공한 식품을 말하며, 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건 용도에 유용한 효과를 얻을 목적으로 섭취하는 것을 의미한다.

본 발명의 건강기능식품은 통상의 식품 첨가물을 포함할 수 있으며, 식품 첨가물로서의 적합 여부는 다른 규정이 없는 한, 식품의약품안전청에 승인된 식품 첨가물 공전의 총칙 및 일반시험법 등에 따라 해당 품목에 관한 규격 및 기준에 의하여 판정한다.

상기 식품 첨가물 공전에 수재된 품목으로는 예를 들어, 케톤류, 글리신, 구연산칼슘, 니코틴산, 계피산 등의 화학적 합성물; 감색소, 감초추출물, 결정셀룰로오스, 고량색소, 구아검 등의 천연첨가물; L-글루타민산나트륨제제, 면류첨가알칼리제, 보존료제제, 타르색소제제 등의 혼합제제류 등을 들 수 있다.

예를 들어, 정제 형태의 건강기능식품은 본 발명의 유효성분인 부평초 추출물을 부형제, 결합제, 붕해제 및 다른 첨가제와 혼합한 혼합물을 통상의 방법으로 과립화한 다음, 활택제 등을 넣어 압축성형하거나, 상기 혼합물을 직접 압축 성형할 수 있다. 또한 상기 정제 형태의 건강기능식품은 필요에 따라 교미제 등을 함유할 수도 있다.

캅셀 형태의 건강기능식품 중 경질 캅셀제는 통상의 경질 캅셀에 본 발명의 유효성분인 부평초 추출물을 부형제 등의 첨가제와 혼합한 혼합물을 충진하여 제조할 수 있으며, 연질 캅셀제는 부평초 추출물을 부형제 등의 첨가제와 혼합한 혼합물을 젤라틴과 같은 캅셀기제에 충진하여 제조할 수 있다. 상기 연질 캅셀제는 필요에 따라 글리세린 또는 소르비톨 등의 가소제, 착색제, 보존제 등을 함유할 수 있다.

환 형태의 건강기능식품은 본 발명의 유효성분인 부평초 추출물과 부형제, 결합제, 붕해제 등을 혼합한 혼합물을 기존에 공지된 방법으로 성형하여 조제할 수 있으며, 필요에 따라 백당이나 다른 제피제로 제피할 수 있으며, 또는 전분, 탈크와 같은 물질로 표면을 코팅할 수도 있다.

과립 형태의 건강기능식품은 본 발명의 유효성분인 부평초 추출물과 부형제, 결합제, 붕해제 등을 혼합한 혼합물을 기존에 공지된 방법으로 입상으로 제조할 수 있으며, 필요에 따라 착향제, 교미제 등을 함유할 수 있다.

상기 건강기능식품은 정제, 캡슐제, 환제 또는 액제 형태로 제조될 수 있으며, 예로 음료류, 육류, 초코렛, 식품류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 사탕류, 아이스크림류, 알코올 음료류, 비타민 복합제 및 건강보조식품류 등일 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

<참고예 1>

재료 및 시약준비

Anti-poly(ADP-ribose) polymerase (PARP), anti-pro-caspase 3 및 horseradish peroxidase-conjugated goat anti-mouse IgG는 Cell Signaling Technology (Beverly, MA, USA)에서 구입하였다. Horseradish peroxidase-conjugated goat anti-rabbit IgG는 Thermo (Rockford, IL, USA)에서 구입하여 사용하였다. Arachidonic acid (AA) 및 rhodamine123 (Rh 123)는 Calbiochem (San Diego, CA, USA)에서 구입하였고, 2',7'-dichlorodihydrofluorescin diacetate (DCFH-DA), ferric nitrilotriacetic acid (Fe-NTA), anti-β-actin 항체와 다른 시약들은 Sigma (St. Louis, MO, USA)에서 구입하여 사용하였다.

<실시예 1>

1-1. 부평초 추출물의 제조

본 발명에 사용한 부평초는 대원약업사 (Daegu, Korea)에서 구입하여, 200 g을 물 2.4 L에 넣어 열수 추출하였다. 부평초 열수 추출물(Spirodela polyrhiza water extract; SPE)을 300 mm filter paper (Toyo Roshi Kaisha Ltd, Tokyo, Japan)로 여과하고, 여과액을 회전농축기 (EYELA, Tokyo, Japan)로 농축하고, 그 농축액을 Ultra-low temperature freezer (Operon, Korea)에 동결한 후 동결건조기 (LABCONCO, USA)로 동결건조물 25.41g을 수득하였다. 부평초 열수 추출물의 수율은 5.02%였으며, 부평초 추출물은 사용 때까지 -20℃에서 보관하였다. 실험직전 부평초 추출물을 물에 녹인 다음 0.22 μm filter (Millipore, USA)로 여과 후 사용하였다.

1-2. 세포배양 및 처리

인체 유래 간 실질 세포주인 HepG2 cell은 American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD, USA)에서 구입하였다. 열처리된 10% fetal bovine serum (FBS)과 100 units/ml penicillin 및 100 μg/ml streptomycin을 혼합한 Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) 배지를 사용하여 37℃, 5% CO₂ 조건이 유지되는 배양기에서 HepG2 cell을 배양하였다. Cell은 100 mm dish에서 confluence가 80% 이상이 되도록 배양하였고, 일주일에 2회, 1:4의 비율로 계대 배양하였다. 12시간동안 serum-starvation한 후, SPE를 0.01-0.30 mg/ml의 농도로 처치하고, 1시간 뒤에 10 μM AA를 12시간 처치한 후 5 μM iron을 처치하여 1시간 추가 배양하였다.

1-3. 실험동물의 사육℃

실험동물은 7주령의 Sprague-Dawley계 흰쥐 (150-170 g) 수컷을 Samtaco Bio Korea (오산, 한국)로부터 공급받아 1주일 동안 실험실환경에 적응시킨 후 실험에 사용하였으며, 사육실 환경은 온도 20-23℃, 습도 50%, 12시간 간격으로 light/dark cycle을 유지하고, 사료 (Nestle Purina Petcare Korea, Seoul, Korea)와 음용수는 자유롭게 섭취하도록 하였다. 본 연구는 대구한의대학교의 실험동물 윤리위원회 (DHU IACUC)의 승인을 거친 후 (승인번호; DHU2014-077) 제반 규정을 준수하면서 진행하였다.

1-4. 실험동물의 처치

실험은 아무런 처치를 하지 않은 군을 Control로 하고, 부평초 추출물만 100 mg/kg를 투여한 SPE군으로 하였다. Corn oil로 희석(1:1)한 CCl₄ 0.5 ml/kg을 복강주사(Intraperitoneal, IP)하여 간독성을 유발한 군은 CCl₄군으로 하였으며, CCl₄ 처치전 SPE를 30 또는 100 mg/kg로 4일간 투여하고 CCl₄를 처치한 군을 각각 SPE 30과 SPE 100군으로 하였다.

1-5. 통계처리

모든 평가의 분석 값들은 mean ± S.D.로 나타내었다. 서로 다른 농도군 간의 다중 비교를 수행하였으며, 등분산성 검정은 Levene test로 수행하였다. Levene test결과 등분산성에 유의한 차이가 없는 경우, 실험결과 값들을 one-way ANOVA test를 통해 분석한 후 LSD test로 사후검정하여 실험군 간에 유의한 차이가 있는지 분석하였다. Levene test를 통해 등분산성에 차이가 관찰된 경우에는 비모수검정, Kruskal-Wallis H test를 실시하였다. Kruskal-Wallis H test에서 유의한 차이가 관찰된 경우, 실험군 간의 비교를 위하여 Mann-Whitney U (MW) test를 수행하여 유의한 차이를 검정하였다. 통계학적 분석은 SPSS (Release 14.0K, SPSS Inc., USA)를 이용하여 수행하였으며, P값이 0.05 미만인 경우 유의한 차이가 있는 것으로 평가하였다.

<실험예 1>

부평초 추출물이 간 실질 세포주(HepG2 cell) 의 생존율에 미치는 영향 ( in vitro 시험)

상기 실시예 1에서 수득한 부평초 추출물이 간 실질 세포주(HepG2 cell)의 생존율에 미치는 영향을 확인하기 위해 MTT assay로 세포 생존율을 측정하였다.

MTT assay를 위한 HepG2 cell을 24 well plate에 1×10⁵cells/well의 농도로 0.5 mL/well을 분주한 뒤 24시간 동안 배양하였고, 이후 12시간 serum을 고갈시킨 후, SPE를 최종농도가 3-100 μg/ml이 되도록 한 시간 동안 처치하고, 이후 10 μM AA를 12시간 처치 후 5 μM iron을 첨가하여 1시간 배양하였다. 여기에 3-(4,5-dimethylthiazol)-2,5- diphenyltetrazolium bromide (MTT; 1 mg/ml)를 각 well당 300 μL씩 처리하고 37℃에서 2시간 반응시켰다. 배지를 조심스럽게 제거하고 MTT를 환원시켜 생성된 formazan 결정을 dimethylsulfoxide (DMSO)로 용해시킨 후, 570 nm 에서 microplate reader (Tecan, Infinite 200 PRO, Tecan Group Ltd, Mannedorf, Switzerland)를 이용하여 흡광도를 측정하였다.

부평초 추출물 (SPE)의 세포독성을 MTT assay로 확인한 결과, 간 실질 세포주인 HepG2 cell에 3-300 μg/ml의 농도로 SPE를 단독으로 24시간 처치한 결과 부평초 추출물은 어떠한 세포 독성도 나타내지 않음을 확인하였다(도 1A 참조).

또한, 부평초 추출물(SPE)의 간 실질 세포의 보호효과를 관찰하기 위하여, 이전의 연구방법에 따라 HepG2 cell에 SPE (3-100 μg/ml)를 한 시간 전 처치 후, AA (10 μM, 12시간)와 iron (5 μM, 1시간)을 순차적으로 처치하였다. Iron처치 후 1시간에 MTT assay로 생존율을 평가하였다. AA + iron는 Control에 비교하여 36.02 ± 2.65% 수준이었으나, SPE는 3, 10, 30, 100 μg/ml에서 각각 41.81 ± 2.86, 81.99 ± 1.27, 96.42 ± 0.87 (%)를 나타내어 농도 의존적으로 세포생존율을 증가시켰다(도 1B 참조).

결과적으로, 부평초 추출물은 10 내지 300 μg/ml의 농도로 24시간 처리시 세포독성이 없었으며, 이러한 결과를 통해 본 발명자들은 부평초 추출물이 체내에 안정하며, 정상적인 간세포에는 독성을 유발하지 않으므로 간 질환 치료 및 개선을 위한 치료제 또는 건강기능식품의 유효성분으로 안심하고 사용할 수 있음을 확인하였다. 또한, 부평초 추출물을 전처리한 후 산화스트레스를 유발한 경우 농도의존적으로 간세포의 보호효과가 있음을 확인하였다.

<실험예 2>

부평초 추출물의 AA+iron로 유도된 세포사멸 억제 효과

실시예 1-2에서 배양 및 처치된 HepG2 cell을 이용하여, phosphate buffered saline (PBS)로 2회 세척한 후, radio immno precipitation (RIPA) buffer (25 mM Tris-HCl pH 7.6, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 1% sodium deoxycholate, 0.1% SDS)와 Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail (Thermo, Rockford, IL, USA)을 혼합한 lysis buffer를 첨가하고, 4℃에서 10분간 반응시킨 후, 15,000 ×g에서 30분간 원심분리 하여 상층액을 취하여 전세포 추출액 (whole cell lysates)을 제조하였다. 전세포 추출액은 BCA protein assay kit (Thermo, Rockford, IL, USA)를 이용하여 단백질의 함량을 정량하였다. 추출한 단백질을 Laemli's sample buffer와 섞어 5분간 끓인 후, 8~12%의 polyacrylamide gel 상에서 전기영동하였다. 전기영동으로 분리된 단백질을 nitrocellulose membrane 또는 polyvinylidene fluoride membrane으로 전이하고, 항체의 비특이적 결합을 억제하기 위하여 5% skim milk (또는 5% BSA)로 1시간 이상 blocking하였다. 일차항체 및 이차항체와 반응시킨 후 enhanced chemiluminoscent solution (Amersham, Buckinghamshire, UK)을 사용하여 image analyzing system (Ultra-Violet Products Ltd., Upland, CA, USA), 또는 X-ray 필름에 감광하였다. 발색 후 각 단백질의 발현량을 정량하기 위하여 Image J를 이용하여 densitometric analysis를 실시하였다.

부평초 추출물이 AA + iron로 유도되는 세포자멸사를 억제할 수 있는지 평가하기 위해, 세포자멸사 관련 단백질 중 anti-apoptotic marker인 PARP와 pro-caspase 3의 발현을 immunoblot analysis로 확인한 결과, AA + iron은 PARP와 pro-caspase 3의 발현을 유의하게 억제하였고, SPE는 AA + iron로 억제된 단백질의 감소를 유의하게 증가시켰다(도 2 참조). 이러한 결과들은 HepG2 cell에서 SPE가 AA + iron에 의해 유도되는 세포독성의 보호에 있어 apoptosis의 억제가 매개됨을 의미한다.

<실험예 3>

부평초 추출물의 항산화 효과

아라키돈산(AA)과 iron의 처리는 산화를 촉매시켜 산화적 스트레스를 증가시키고, 미토콘드리아의 기능 장애를 유발시킨다. 부평초 추출물에 의한 항산화 효과를 확인하고자 세포내 활성산소의 양 측정을 위해 DCFH-DA를 이용하였다.

2'7'-dichlorofluorescein diacetate (DCFH-DA)는 cell-permeable non- fluorescent probe로서 intracellular esterases 및 H₂O₂에 의하여 2'7'-dichlorofluorescein (DCF)로 바뀌며, 이를 측정하여 H₂O₂의 량을 상대적으로 평가한다. 본 연구에서는 부평초 추출물과 AA + Iron처치 후, 10 μM DCFH-DA로 37℃에서 1시간 염색한 후, enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) 방법으로 측정하였다. DCF의 형광강도는 excitation (485nm)와 emission (530nm)로 microplate reader를 사용하여 측정하였다.

상기의 실험결과, HepG2 cell에 AA + iron을 12시간 처리하였을 경우, 세포내 H₂O₂양이 Control에 비교하여 유의적으로 증가하는 것을 관찰하였다. 그러나, SPE 30 μg/ml을 처리하였을 경우, 3.59 ± 0.27배 증가된 H₂O₂양이 1.74 ± 0.10배로 유의성있게 감소하였다(도 3 참조). 이러한 결과는 SPE가 AA + iron으로 유도된 ROS의 생성을 억제하여 HepG2 간세포의 자멸사를 억제함을 나타낸다.

따라서, AA + iron으로 유도된 H₂O₂가 부평초 추출물에 의하여 감소한 것을 확인하였고, 이를 통해 부평초 추출물의 항산화 효과를 확인할 수 있었다.

<실험예 4>

GSH의 함량 변화

생체 내 항산화 물질인 환원형 GSH는 세포의 과산화 지질을 낮추는 역할을 한다. 이때 산화된 GSH는 GSSG라고 하며 total GSH와 GSSG의 차이로, 환원된 GSH의 양을 GSH determination kit (Oxis International, Portland, OR, USA)로 측정하였다. 흡광도 405 nm에서 microplate reader를 이용하여 분석하였다.

AA + iron 유도 세포독성에 대한 부평초 추출물의 보호 효과에 GSH가 매개되는지 평가하기 위해 GSH 분석을 수행한 결과, AA + iron 처치에 의해 GSH는 54.83 ± 0.24% 감소하였고, 이러한 GSH의 감소는 SPE 30 μg/ml의 전처치에 의해 100.46 ± 0.89%로 유의하게 증가하였다(도 4 참조).

따라서, 부평초 추출물이 GSH 증가에 효과가 있으며 이로 인한 세포사멸, 세포보호 효과 및 항산화능이 있음을 확인하였다.

<실험예 5>

부평초 추출물의 미토콘드리아 장애(mitochondrial dysfuncion) 억제효과

상기 실시예 1에서 수득한 부평초 추출물의 미토콘드리아 보호효능을 확인하기 위해 유세포분석기(flow cytometry)로 MMP를 분석하였다.

MMP의 변화는 막 삼투 양이온 형광 dye인 Rh 123으로 염색 한 후, flow cytometry를 이용하여 분석하였다. HepG2 cell을 0.05 μg/ml Rh 123으로 30분간 염색한 후, trypsin을 처리하여 세포를 취하였고, 1% FBS를 첨가한 PBS에 재부유하여, Partec FACS flow cytometer (Goerlitz, DE)로 MMP를 확인하였다. 각 분석은, 한 샘플 당 10,000개 세포의 형광을 기록하였다.

본 연구에서도 control 3.76 ± 0.62%에 비해 AA + iron은 40.41 ± 4.45%로 유의하게 증가되었으며, 이러한 RN1 fraction의 증가는 SPE 30 μg/ml에 의해 11.89 ± 2.69%의 유의한 수준으로 감소하였다(도 5 참조). 이러한 결과는, 부평초 추출물이 간세포보호작용을 나타내는 데에는 미토콘드리아 보호효과가 매개됨을 나타내는 결과이다.

<실험예 6>

부평초 추출물이 CCl ₄ 로 유도된 간손상에 미치는 영향 ( in vivo )

상기 실시예 1에서 수득한 부평초 추출물이 CCl₄로 인한 손상에 대한 간 보호 효과를 확인하고자 간손상을 평가하는 이상적인 지표로 사용되는 ALT, AST 측정과 조직학적 변화에 미치는 영향을 확인하고자 hematoxylin-eosin(H&E)염색과 Massons trichome(MT)염색을 하기와 같이 실험 수행하였다.

실시예 1-4의 실험동물을 ethyl ether로 마취한 후, 복대정맥으로부터 혈액을 채취하고, 이를 3,000 ×g, 4℃에서 10 분간 원심분리하여 상등액의 혈청을 얻었다. 혈청중 alanine aminotransferase (ALT), aspartate aminotransferase (AST)는 Analysis kits (Pointe Scientific Inc., Canton, MI, USA)와 Automated blood chemistry analyzer (Photometer 5010, Robert Riele GmbH & Co KG, Berlin, Germany)를 사용하여 분석하였다.

본 연구에서 control군은 각각 5.20 ± 1.24 U/L를 나타내었으며, CCl₄ 투여군은 1882.80 ± 206.25 U/L을 나타내어 유의한 간독성이 유발되었다. 그러나, 이러한 ALT의 증가는 SPE 30과 100 mg/kg에서 각각 798.20 ± 74.71, 291.20 ± 38.00 U/L로 유의하게 감소하였다(도 6A 참조).

또한 AST control군은 10.40 ± 3.60 U/L를 나타내었으며, CCl₄ 투여군은 1002.20 ± 132.77 U/L을 나타내어 유의한 간독성이 유발되었다. 그러나, 이러한 AST의 증가는 SPE 30과 100 mg/kg에서 각각 362.40 ± 19.08, 125.80 ± 31.15 U/L로 유의하게 감소하였다(도 6B 참조).

SPE 100 mg/kg의 단독 처치시에는 ALT, AST가 각각 8.00 ± 1.38, 6.20 ± 1.53 U/L을 나타내어 별다른 간독성을 유발하지 않았다. 이러한 결과는 SPE 자체로는 300 mg/kg 용량까지 별다른 간독성을 유발하지 않으며, SPE는 in vitro에서 뿐만 아니라 in vivo에서도 간보호효과가 있음을 나타낸다.

상기 실험의 결과, 부평초 추출물이 CCl₄로 유도된 ALT, AST가 유의성 있게 감소한 것을 확인하였고, 단독으로 처리된 군에서는 간독성이 유발되지 않았음을 확인하였다(도 6 참조).

<실험예 7>

부평초 추출물이 CCl ₄ 로 유도된 간의 조직학적 변화에 미치는 영향

부평초 추출물이 CCl₄로 유도된 간의 조직학적 변화에 미치는 영향에 대해 알아보기 위해, 혈액을 채취한 후, 각 실험동물로부터 간실질조직의 동일 부위(left lateral lobes)를 일부 적출하여 50 mM의 phosphate buffer에 10% 중성포르말린으로 고정시킨 다음 일반적인 방법으로 탈수 및 파라핀 포매를 실시하고, 3~4m의 절편을 제작하였다. 일반적인 조직평가를 위하여 hematoxylin-eosin 염색을 실시하여 광학현미경하 (Nikon, Japan)에서 관찰하였다. 간실질조직 중 변성부위의 비율 (%/mm² of hepatic parenchyma) 및 변성 간세포의 수 (cells/1000 hepatocytes)를 자동영상분석장치 (iSolution FL ver 9.1, IMT i-solution Inc., Vancouver, Canada)를 이용하여 각각 평가하였다.

상기의 실험결과, 간 실질 중 변성부위의 비율 (%/mm² of hepatic parenchyma), 변성 간세포의 수 (cells/1000 hepatocytes) 및 침윤 염증세포의 수 (cells/mm²of hepatic parenchyma)는 control에 비해 CCl₄는 유의성 있는 증가를 나타내었으나, SPE 30과 100 mg/kg에서 유의한 감소를 나타내었다(표 1 및 도 7 참조).

부평초 추출물의 단독 처치는 간 실질 중 변성부위의 비율, 변성 간세포의 수, 침윤 염증세포의 수에서 유의한 변화를 나타내지 않았다.

Index Groups	Percentages of degenerative regions (%/mm²ofhepaticparenchyma)	Numbers of inflammatory cells infiltrated (cells/mm²ofhepaticparenchyma)	Numbers of degenerative hepatocytes (cells/1000 hepatocytes)
Controls
Intact	2.09 ± 1.55	12.30 ±4.60	6.60 ±2.37
SPE 100 mg/kg	1.96 ±1.34	12.00 ±4.74	6.50 ±3.31
CCl₄	44.86 ±11.87^d	169.10 ±26.37^d	497.10 ±107.84^d
CCl₄+SPE treated mice
30 mg/kg	31.99 ±6.14^de	92.20 ±18.81^de	322.30 ±58.62^de
100 mg/kg	17.05 ±3.81^de	34.50 ±12.76^de	143.00 ±51.87^de
Values are expressed as mean SD of 10 histological fields ^a p<0.01 and ^bp<0.05 as compared with intact control by LSD test ^dp<0.01 as compared with intact control by MW test ^c p<0.01 as compared with CCl₄ control by LSD test ^ep<0.01 as compared with CCl₄ control by MW test

<실험예 8>

부평초 추출물이 CCl ₄ 로 유도된 간의 면역조직화학적 변화에 미치는 영향

상기 실시예 1에서 수득한 부평초 추출물이 CCl₄로 유도된 세포 손상에 대한 면역조직학적 평가를 위해 Nitrotrysine(NT), 4-Hydroxynonenal(4-HNE)를 이용하여 평가하였다.

Nitrotrysine(NT), 4-Hydroxynonenal (4-HNE)는 각각의 항체 및 vectastain elite ABC kit, peroxidase substrate kit (Vector Labs, Burlingame, CA, USA)를 사용하여 평가하였다. 내인성 peroxidase활성은 메탄올과 0.3% H₂O₂에서 30분간 배양하여 차단하고, 또한 normal horse serum blocking solution으로 1시간 배양하여 면역글로불린의 비특이적결합을 억제하였다. 이후 4℃ 항온항습기에서 overnight로 1차 항체를 처치하고, 이를 다시 2차 항체 및 ABC reagent와 1시간동안 배양하였다. 이후 조직샘플을 peroxidase substrate kit로 실온에서 3분간 반응시켰다. 모든 조직샘플은 각 단계별로 0.01 M PBS로 3차례 세척하였다.

이전의 연구 방법들에 따라 NT, 4-HNE는 자동영상분석장치를 사용하여 분석하였으며, NT, 4-HNE는 각각 간실질세포, centrolobular 영역, central vein 영역에서 cells/1000 hepatocyte로 나타내었다.

CCl₄ 대조군에서는 정상 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01) NT 및 4-HNE 양성세포의 수적 증가가 각각 인정되었으나, SPE 30 및 100 mg/kg 투여군에서는 CCl₄ 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01) NT 및4-HNE 양성세포의 수적 감소가 인정되었다(표 2 및 도 8 참조). 한편 SPE 단독 투여군인 100 mg/kg에서는 정상 대조군에 비해 의미 있는 조직병리학적 및 면역조직화학적 변화는 인정되지 않았다.

Antibody Groups	4-Hydroxynonenal (cells/1000 hepatocytes)	Nitrotyrosine (cells/1000 hepatocytes)
Controls
Intact	6.10 ± 2.23	6.20 ±2.44
SPE 100 mg/kg	6.00 ±2.67	6.10 ±2.33
CCl₄	543.60 ±126.56^a	486.20 ±119.30^a
CCl₄+SPE treated mice
30 mg/kg	334.00 ±124.23^ab	324.40 ±83.69^ab
100 mg/kg	119.50 ±57.62^ab	218.40 ±91.85^ab
Values are expressed as mean SD of ten hepatic histological fields ^a p<0.01 as compared with intact control by MW test, ^b p<0.01 as compared with CCl₄ control by MW test

이러한 결과는 부평초 추출물이 지방과산화, 4-HNE의 형성억제를 통하여 CCl₄로 유도되는 간장손상을 억제할 수 있음을 의미한다.

결론적으로 상기 실시예들을 종합해보면, 본 발명의 부평초 추출물이 CCl₄ 간손상을 현저히 억제하는 것으로 관찰되었으며, 간보호 효과에도 우수함을 나타내었다. 이러한 결과는 부평초 추출물이 급만성 간손성에 대한 예방 및 치료에 응용될 수 있는 가능성을 제시한다.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims

부평초 열수 추출물을 유효성분으로 포함하는 간 보호용 건강기능식품 조성물.
삭제
제1항에 있어서,
상기 추출물은 조성물 총 중량%에 대해 0.1 내지 50 중량%로 함유되어 있는 것을 특징으로 하는 조성물.
삭제
삭제
삭제
삭제
제1항에 있어서,
상기 건강기능식품은 정제, 캡슐제, 환제 또는 액제 형태의 식품인 것을 특징으로 하는 조성물.