CN102647992A

CN102647992A - 配混多酚而制成的口服或外用组合物及其用途

Info

Publication number: CN102647992A
Application number: CN2010800421246A
Authority: CN
Inventors: 太田富久
Original assignee: BIOTHERAPY DEVELOPMENT RESEARCH CENTER Co Ltd
Current assignee: BIOTHERAPY DEVELOPMENT RESEARCH CENTER Co Ltd
Priority date: 2009-07-21
Filing date: 2010-07-21
Publication date: 2012-08-22
Anticipated expiration: 2030-07-21
Also published as: US8673376B2; CN102647992B; JP5856728B2; JP2011026207A; US20120189724A1; WO2011010678A1

Abstract

本发明提供一种使用草莓源性多酚而显示出优异效果的口服或外用组合物。该口服或外用组合物含有经如下处理而得到的级分，即将草莓的热水提取物负载于使用芳香族系合成吸附剂的吸附色谱，去除通过了柱的级分和用水洗脱掉的级分，然后用5～60％乙醇水溶液洗脱而得到的级分。

Description

配混多酚而制成的口服或外用组合物及其用途

技术领域

本发明涉及配混草莓源性多酚而制成的口服或外用组合物，尤其涉及食品组合物、医药组合物和化妆品组合物。

背景技术

草莓中含有维他命C、鞣花酸、花青素、槲皮素(quercetin)、山奈酚(kaempferol)、柠檬酸、苹果酸等，专利文献1中记载了含有草莓源性花青素的用于预防/改善肥胖的组合物，并就提取物的制备方法记载了以下方法：用4℃的水对草莓进行提取，将所得的提取物通液至填充有作为芳香族系合成吸附剂的合成吸附树脂(HP20)的柱中，使色素成分吸附到柱上，接着将水通入该柱，洗涤后，通入70％乙醇水溶液，将吸附到柱上的色素成分洗脱，从所得的溶液中去除溶剂，从而可以得到以90％以上的高纯度含有花青素系化合物(色素成分)的提取物。

另外，已知果胶作为食物纤维成分被配混在健康食品中(专利文献2)。

专利文献1：日本特开2002-153240号公报、权利要求1、2和段落0033～0037

专利文献2：日本特开2007-330124号公报、权利要求9

发明内容

发明要解决的问题

本发明人就从草莓的热水提取物中得到多酚的方法进行了反复深入研究，结果发现：多酚吸附于芳香族系合成吸附剂，从利用5～60％乙醇水溶液洗脱的级分获得，进而所得到的成分的组成和活性根据乙醇浓度的不同而异。

本发明的课题在于使用草莓源性多酚提供安全性高且显示出优异效果的组合物。

用于解决问题的方案

本发明的要旨如下所述。

(1)一种口服或外用组合物，其含有经如下处理而得到的级分，即将草莓的热水提取物负载于使用芳香族系合成吸附剂的吸附色谱，去除通过了柱的级分和用水洗脱掉的级分，然后用5～60％乙醇水溶液洗脱而得到的级分。

(2)根据上述(1)所述的组合物，其含有经如下处理而得到的级分，即去除通过了柱的级分和用水洗脱掉的级分，然后用5～15％乙醇水溶液洗脱而得到的级分。

(3)根据上述(1)所述的组合物，其含有经如下处理而得到的级分，即去除通过了柱的级分、用水洗脱掉的级分和用低于40％的乙醇水溶液洗脱掉的级分，然后用40～60％乙醇水溶液洗脱而得到的级分。

(4)根据上述(1)～(3)中任一项所述的组合物，其进一步含有增稠多糖类。

(5)一种组合物，其配混源自草莓的多酚和增稠多糖类而形成。

(6)根据上述(1)～(5)中任一项所述的组合物，其为食品组合物、医药组合物或化妆品组合物。

(7)根据上述(6)所述的组合物，其为抗肥胖用组合物。

(8)根据上述(6)所述的组合物，其为抗炎症用组合物。

(9)根据上述(6)所述的组合物，其为抑制黑色素生成用组合物。

(10)根据上述(4)～(9)中任一项所述的组合物，其中，增稠多糖类为草莓源性果胶。

发明的效果

本发明的组合物安全性高且显示出优异效果。

附图说明

图1为示出检体开始给药后的增加体重随时间变化的图。

图2为示出肝脏重量的测定结果的图。

图3为示出脾脏重量的测定结果的图。

图4为示出OVA-IgE的测定结果的图。

图5为示出OVA-IgG1的测定结果的图。

图6为示出IL-6生成量的图。

图7为示出IL-8生成量的图。

图8为示出使用HMVII细胞的抑制黑色素生成试验的结果的图。

图9为示出使用B16F1细胞的抑制黑色素生成试验的结果的图。

图10为示出抑制酪氨酸酶活性试验的结果的图。

图11为示出体重增加的图。

图12为示出肝脏重量的测定结果的图。

图13为示出副睾丸周围脂肪组织的重量的测定结果的图。

图14为示出基因表达的图。

附图标记说明

PP：多酚

PC：果胶

具体实施方式

本发明中，作为成为多酚原料的草莓(学名：Fragaria L.)的种类，没有特别限制。可优选列举为荷兰草莓(学名：Fragariaananassa、英文名：garden strawberry)，作为其品种，可列举出例如枥乙女(Tochiotome)、达娜(donner)、爱蓓丽(Aiberi)、福冈S6号、桃莓、章姬、佐贺清香、明日香红宝石、丰香、宝交早生、福羽、女蜂、久留米49号、枥峰，可优选列举为枥乙女。作为草莓的部分，可列举出例如果实、叶、茎、根，可优选列举为果实。

本发明中，作为草莓源性多酚，优选使用经以下处理而得到的级分，即将草莓的热水提取物负载于使用芳香族系合成吸附剂的吸附色谱，去除通过了柱的级分和用水洗脱掉的级分，然后用5～60％乙醇水溶液洗脱而得到的级分。

在使用本发明的组合物作为化妆品组合物等外用组合物时，从抑制黑色素生成活性、抑制酪氨酸酶活性的角度出发，作为上述级分，优选使用经以下处理而得到的级分，即去除通过了柱的级分和用水洗脱掉的级分，然后用5～15％乙醇水溶液洗脱而得到的级分。另一方面，在使用本发明的组合物作为口服组合物时，从活性的角度出发，一般而言，作为上述级分，优选使用经以下处理而得到的级分，即去除通过了柱的级分、用水洗脱掉的级分和用低于40％的乙醇水溶液洗脱掉的级分，然后用40～60％乙醇水溶液洗脱而得到的级分。

上述级分可以直接作为草莓源性多酚使用或者进一步纯化后作为草莓源性多酚使用。

作为用于从草莓中提取多酚的提取溶剂，以提高多酚和果胶的产量的角度来看，优选使用热水(90～100℃的水)。

本发明中使用的芳香族系合成吸附剂是不具有离子交换基且具有多孔性结构的合成物质，是通过疏水性相互作用而主要用于有机物的分离纯化的物质，已知的有各种芳香族系合成吸附剂，例如可以列举日本专利第2784627号公报、日本专利第3527661号公报、日本专利第3891746号公报中所记载了的物质。具体而言，可以列举将苯乙烯和二乙烯苯聚合而制造出的芳香族系合成吸附剂，作为市售产品，可以例举ダイヤイオン^TMHP20、ダイヤイオン^TMHP21、セパビ一ズ^TMSP825L、セパビ一ズ^TMSP850、セパビ一ズ^TMSP700、セパビ一ズ^TMSP70(以上，三菱化学(株)制或日本鍊水(株)制)、アンバ一ライト^TMXAD2、アンバ一ライト^TMXAD4、アンバ一ライト^TMXAD16(美国，ロ一ムアンドハ一ス公司制)。

在本发明的组合物中，通过在草莓源性多酚的基础上进一步并用增稠多糖类，可以增强抗肥胖作用等的效果。

作为增稠多糖类，没有特别限制。可以列举例如果胶、阿拉伯胶、瓜尔豆胶、普鲁兰多糖、海藻酸钠，可优选列举为果胶、阿拉伯胶。

作为果胶，没有特别限制。优选为草莓源性果胶。

另外，将草莓的热水提取物负载于使用芳香族系合成吸附剂的吸附色谱，将通过了柱的级分和用水洗脱掉的级分溶解于乙醇水溶液优选60～80％乙醇水溶液，将析出的不溶物用60～80％乙醇水溶液过滤洗涤后，可以直接作为草莓源性果胶使用或者进一步纯化后作为草莓源性果胶使用。

在本发明的组合物中，并用草莓源性多酚和增稠多糖类时，草莓源性多酚和增稠多糖类的质量比通常期望为1∶0.6～1∶2。

本发明的组合物具有抗肥胖作用、抑制白介素8生成作用和抑制黑色素生成作用，可以作为抗肥胖用、抗炎症用或抑制黑色素生成用的食品组合物、医药组合物或化妆品组合物使用。

本发明的组合物可以将草莓源性多酚、以及根据需要的增稠多糖类与公知的食品用载体、医药用载体或化妆品用载体组合而制成制剂。本发明的组合物在用于口服用途时，一般而言，可以作为片剂、胶囊、颗粒剂、微粒剂、散剂、液剂、糖浆、悬浮剂、乳剂、酏剂(elixir)等的医药组合物使用，另外也可以添加到食品、口香糖、饮料等中作为一般食品或者常说的特定保健用食品使用。

本发明的组合物的给药量根据患者年龄、体重、病患的程度、给药途径而异，作为草莓源性多酚通常为1天50～500mg，作为增稠多糖类通常为1天50～500mg，给药次数通常为1天1～3次。

按照常规方法，使用例如淀粉、乳糖、白糖、甘露糖醇、羧甲基纤维素、玉米淀粉、无机盐类等赋形剂而制造本发明的组合物。本发明的组合物中，除适当使用上述赋形剂外，还可使用粘结剂、崩解剂、表面活性剂、润滑剂、助流剂、调味剂、着色剂、香料等。

作为粘结剂的具体例，可以例举结晶纤维素、结晶纤维素-羧甲纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基纤维素、低取代羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯、醋酸羟丙基甲基纤维素琥珀酸酯、羧甲基纤维素钠、乙基纤维素、羧甲基乙基纤维素、羟乙基纤维素、小麦淀粉、水稻淀粉、玉米淀粉、土豆淀粉、糊精、预胶化淀粉、部分预胶化淀粉、羟丙基淀粉、普鲁兰多糖、聚乙烯吡咯烷酮、氨基烷基甲基丙烯酸酯共聚物E、氨基烷基甲基丙烯酸酯共聚物RS、甲基丙烯酸共聚物L、甲基丙烯酸共聚物、聚乙烯醇缩乙醛二乙氨基乙酸酯、聚乙烯醇、琼脂、明胶、白虫胶、黄蓍胶、精制白糖、聚乙二醇。

作为崩解剂的具体例，可以列举结晶纤维素、甲基纤维素、低取代羟丙基纤维素、羧甲基纤维素、羧甲基纤维素钙、羧甲基纤维素钠、交联羧甲基纤维素钠、小麦淀粉、水稻淀粉、玉米淀粉、土豆淀粉、部分预胶化淀粉、羟丙基淀粉、羧甲基淀粉钠、黄蓍胶。

作为表面活性剂的具体例，可以列举大豆卵磷脂、蔗糖脂肪酸酯、聚乙二醇硬脂酸酯(polyoxyl stearate)、聚氧乙烯氢化蓖麻油、聚氧乙烯聚氧丙烯二醇、倍半油酸山梨坦、三油酸山梨坦、山梨醇酐单硬脂酸酯、山梨醇酐单棕榈酸酯、山梨醇酐单月桂酸酯、聚山梨醇酯(polysorbate)、单硬脂酸甘油酯、月桂基硫酸钠、聚桂醇。

作为润滑剂的具体例，可以列举小麦淀粉、水稻淀粉、玉米淀粉、硬脂酸、硬脂酸钙、硬脂酸镁、水合二氧化硅、轻质无水硅酸、合成硅酸铝、干燥氢氧化铝凝胶、滑石、偏硅酸铝镁、磷酸氢钙、无水磷酸氢钙、蔗糖脂肪酸酯、石蜡类、氢化植物油、聚乙二醇。

作为助流剂的具体例，可以列举水合二氧化硅、轻质无水硅酸、干燥氢氧化铝凝胶、合成硅酸铝、硅酸镁。

另外，本发明的组合物在作为液剂、糖浆、悬浮剂、乳剂、酏剂给药时，也可以含有矫味矫臭剂、着色剂。

实施例

以下，通过实施例具体说明本发明，但是本发明并不限于这些实施例。

(制造例1)草莓热水提取物的制备和分级

(1)提取液的制备

在草莓(枥乙女，下同)的果实的果渣1.4kg中加入蒸馏水2.7L，通过在高压釜中在90℃处理60分钟来进行提取。冷却后，分离为滤液和残渣并进行减压过滤，得到包括洗涤过残渣、容器的蒸馏水在内的4.7L的提取液。

(2)分级

将上述(1)中所得到的热水提取液4.7L供于ダイヤイオン^TMHP20(日本鍊水(株))柱色谱(直径9.0cm×长度19cm)，按照水6.0L、10％乙醇水溶液3.6L、50％乙醇水溶液3.6L、100％乙醇3.6L的顺序洗脱并进行减压浓缩，从而得到以下的极性级分(水洗脱～乙醇洗脱级分)。水洗脱级分80.7g、10％乙醇水溶液洗脱级分1.92g、50％乙醇水溶液洗脱级分3.83g、100％乙醇洗脱级分0.18g。

将上述50％乙醇水溶液洗脱级分或10％乙醇水溶液洗脱级分的冷冻干燥品作为草莓多酚使用。

另一方面，将上述水洗脱级分的冷冻干燥品80.7g溶解于70％乙醇水溶液中，将析出的不溶物用70％乙醇水溶液过滤洗涤并冷冻干燥后，作为草莓果胶使用。

(制造例2)草莓热水提取物的制备

在草莓的果实的果渣304g中加入蒸馏水1.8L，通过在高压釜中在90℃处理60分钟来进行提取。冷却后，分离为滤液和残渣并进行减压过滤，得到包括洗涤过残渣、容器的蒸馏水在内的提取液。将得到的提取液冷冻干燥。

草莓果渣的含水率和提取效率(相对于100g草莓果渣加入600mL的蒸馏水进行一次提取时的值)示出在表1中。

表1

(制造例3)草莓热水提取物的制备

在草莓的果实的果渣0.8kg中加入1％柠檬酸水溶液2.4L，通过在高压釜中在90℃处理60分钟来进行提取。冷却后，分离为滤液和残渣并进行减压过滤，得到提取液。

(试验例1)多酚的定量

使用Folin-Denis法对被检样品中的多酚进行定量。将被检样品溶于水或加入有少量乙醇的水中，热水提取物(制造例2中得到的冷冻干燥品)和制造例1中得到的水洗脱级分制备为200μg/mL，制造例1中得到的10％乙醇水溶液洗脱级分和50％乙醇水溶液洗脱级分制备为50μg/mL。在制备液1.0mL中加入福林氏试剂1.0mL进行混和，经3分钟以上后，加入10％碳酸钠水溶液1.0mL，充分混和。在遮光状态下静置1小时后，测定760nm的吸光度。与此另行使用水代替福林氏试剂进行同样的操作，作为各被检样品的空白，从测定值中减去。

另外，由于多酚浓度为过高或者过低均存在较大误差，因此将吸光度不在0.3～0.5范围内的水洗脱级分和50％乙醇水溶液洗脱级分分别调整为1500μg/mL、20μg/mL后进行再度测定。

另外，数值根据将绿原酸作为标准物质预先制作的标准曲线计算得到。

多酚含量(％)＝[从标准曲线得到的计算值(μg/mL)/被检样品浓度(μg/mL)]×100

结果示出在表2中。

表2

(实施例1)抗肥胖试验

(目的)

(1)草莓多酚和果胶等增稠多糖类对抗肥胖效果的相互作用的验证

(2)草莓热水提取物有无抗肥胖效果的验证

(方法)

(1)被检样品

(a)草莓热水提取物

(i)将无酶处理草莓悬浮于0.5％柠檬酸水溶液中，在90℃加热60分钟后过滤。

(ii)将酶处理草莓在90℃加热60分钟后过滤。

(b)草莓多酚

使用制造例1(2)中得到的50％乙醇水溶液洗脱级分。

(c)草莓果胶

使用制造例1(2)中得到的果胶。

(d)苹果果胶和阿拉伯胶

购买苹果源性果胶(和光纯药工业)和阿拉伯胶(ナカライテスク)使用。

(2)动物和饲养

用高脂肪-高热量饲料(日本クレア公司制Quick Fat)饲养ICR/Kwl小鼠(雄性、5周龄)。

(3)给药方法

饲养到第8天开始给药。连续实施14次灌胃给药。

(4)试验区

对以下的6组，各组使用10个个体。

(a)对照组：水

(b)无酶处理草莓热水提取物：1000mg/kg

(c)酶处理草莓热水提取物：1000mg/kg

(d)草莓多酚+苹果果胶：各100mg/kg

(e)草莓多酚+阿拉伯胶：100mg/kg、800mg/kg

(f)草莓多酚+草莓果胶：各100mg/kg

(5)测定

每天测定摄食量、摄水量和体重。

(6)解剖和生化试验

从解剖前一天使小鼠不进食。在乙醚麻醉状态下从心脏采集全身血，离心后在-80℃下保存血清。另外，摘除肝脏，测定重量。作为血液成分，测定总胆固醇、HDL-胆固醇、甘油三酯和血糖值。

(7)统计处理

实施方差分析(ANOVA)后，根据事后比较检验，以p＜0.05为具有显著性差异。

(结论)

通过给药草莓多酚和增稠多糖类(果胶和阿拉伯胶)，可以确认有非常强的抗肥胖作用。

(1)体重随时间的变化

草莓多酚+增稠多糖类给药组中，显著地抑制了体重增加。草莓多酚+增稠多糖类给药组中，在给药开始4～5天后，与对照相比显著地抑制了体重增加。可以看出无酶处理草莓热水提取物也有抑制体重增加的倾向。酶处理草莓中，没有抑制体重增加的倾向。结果示出在图1中。

(2)肥胖参数

草莓多酚+增稠多糖类给药组中，肝脏重量显著地降低。结果示出在图2中。

(考察)

明确了如果使小鼠同时摄入草莓多酚和增稠多糖类，则有抗肥胖效果。有关其机理，认为是增稠多糖类使草莓多酚在体内更多地被吸收，显示出抗肥胖效果的可能性高。

(实施例2)抗过敏试验

(目的)

研究草莓多酚是否有抗过敏作用

(方法)

(1)被检样品

(a)草莓多酚

使用制造例1(2)中得到的50％乙醇水溶液洗脱级分。

(b)草莓果胶

使用制造例1(2)中得到的果胶。

(2)动物和饲养

用大鼠-小鼠-仓鼠用饲料CRF-1饲养BALB/c小鼠(雄性、5周龄)。

(3)分组、早期免疫和二次致敏

(a)从饲养开始6天后和10天后，每1个个体腹腔内给药0.2mL的0.1mg/mL OVA-明矾溶液(0.2mg/mL的OVA和明矾凝胶等量混合的溶液)(OVA20μg/小鼠)。

(b)在从饲养开始18天后的7天内，在被检样品给药的1小时后和2小时后，平均1个个体鼻内致敏34mg/mL的OVA 10μL。

(c)实验组

(i)无致敏对照

(ii)对照(口服给药蒸馏水)

(iii)草莓多酚100mg/kg+草莓果胶60mg/kg

(iv)草莓多酚200mg/kg+草莓果胶60mg/kg

从饲养开始第6天每天实施(ii)、(iii)、(iv)的口服给药。

(4)解剖和生化试验

从饲养开始27天后，在乙醚麻醉状态下从心脏采血(使用EDTA)。测定血清的OVA特异性IgE和IgG1。摘除脾脏测定重量。

(5)统计处理

数据全部用平均值±标准误差表示。根据Thompson检验，当显著性水平不足5％时，不采纳数据。对于根据Thompson检验而不采纳的个体，也不再分析其它项目。在无致敏对照和对照之间实施t检验。显著性水平不足5％。在对照和样品之间实施了方差分析(ANOVA)，显著性水平不足5％。在ANOVA中出现显著性差异时，实施Dunnett检验。

(结果)

草莓多酚给药组中，可以确认脾脏重量明显有变为低值的倾向。

草莓多酚100mg/kg给药组中，可以确认OVA-IgE略微有变为低值的倾向。草莓多酚100mg/kg给药组中，可以确认OVA-IgG1有明显地变为低值的倾向。

另一方面，在草莓多酚200mg/kg给药组中，OVA-IgE有略微地变为高值的倾向，且关于OVA-IgG1，也可以确认有比100mg/kg给药组更高值的倾向。

脾脏重量的测定结果示出在图3中，OVA-IgE的测定结果示出在图4中，OVA-IgG1的测定结果示出在图5中。

(结论)

虽然推定草莓多酚有可能有抗过敏作用，但是认为其效果存在最佳剂量。

(实施例3)细胞因子生成试验

(概要)

使作为刺激物质的佛波醇-12-肉豆蔻酯-13-乙酯(Phorbol12-myristate 13-acetate；PMA)和草莓源性分级物作用于正常人表皮角质细胞(normal human epidermal keratinocyte)，测定白细胞介素1β、白细胞介素6、白细胞介素8(IL-1β、L-6、IL-8)三种细胞因子的生成量，评价被检样品的抗炎症效果等。

(材料和方法)

(1)细胞

亚洲人源性正常人表皮角质细胞(NHEK DSフア一マバイオメデイカル(株))使用的是用正常人表皮角质细胞用无血清培养基(DSフア一マバイオメデイカル(株))传代培养3代以上而得到的细胞。

(2)被检样品和试剂

被检样品：将制造例1(2)中得到的10％乙醇水溶液洗脱级分冷冻干燥后使用。

作为细胞刺激物质，使用佛波醇-12-肉豆蔻酯-13-乙酯(Phorbol 12-myristate 13-acetate；PMA；Sigma-Aldrich)，在存活率的评价中，使用MTT试剂(ナカライテスク(株))和SDS-HCl试剂。另外，细胞因子的生成能力的评价使用READY-SET-GO！Human Interleukin-1beta(eBioscience)、READ Y-SET-GO！Human Interleukin-6(eBioscience)、IL-8/NAP-1Immunoassay Kit(Biosource)。

(3)方法

(a)细胞生存试验(毒性试验)

将烧瓶中培养的NHEK调制为5.0×10⁴个细胞/mL，在96孔板(well plate)上接种200μL(最终浓度1.0×10⁴个细胞/孔)。在37℃培养24小时，添加调制为100ng/mL的PMA25μL(最终浓度10ng/mL)和调制为100μg/mL、1000μg/mL的被检样品25μL(最终浓度10μg/mL、100μg/mL)。培养48小时后，回收培养基，为了用于Enzyme Linked-Immuno-Sorbent Assay(ELISA)而在-80℃下保存。在细胞中加入新的培养基80μL和MTT试剂20μL，培养3～5小时，加入SDS-HCl试剂150μL。培养18～20小时后测定570nm的吸光度。

(b)细胞因子生成量的测定Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay(ELISA)

采用ELISA法测定在-80℃下保存的培养基的细胞因子量。

(i)Biosource(IL-8)pre-coated type

将解冻的培养基用Standard Diluent Buffer稀释3倍，与标准液一起添加50μL到经IL-8抗体加工了的96孔板(wellplate)中，再添加50μL Biotin Conjugate在室温下反应90分钟。去除孔的溶液，用Wash Buffer洗涤4次后，添加100μLStreptavidin-HRP Working Solution，反应30分钟。去除孔的溶液，用Wash Buffer洗涤5次后，添加100μL StabilizedChromogen，反应10～15分钟。添加100μL Stop Solution使反应停止，测定450nm的吸光度。由标准液的吸光度制作标准曲线，计算出IL-8生成量。

(ii)eBioscience(IL-1β，IL-6)non-coated type

在96well maxisorp plate中，添加100μL用CoatingBuffer稀释了的Capture Antibody，在4℃培养1晚。去除孔的溶液，用Wash Buffer洗涤5次后，添加200μL Assay Diluent，在室温下反应1小时。去除孔的溶液，用Wash Buffer洗涤5次后，将解冻并稀释为10倍、5倍的培养基与标准液一起添加100μL，在室温下反应2小时。去除孔的溶液，用Wash Buffer洗涤5次后，添加100μL Detection Antibody，在室温下反应1小时。去除孔的溶液，用Wash Buffer洗涤5次后，添加100μLAvidin-HRP，在室温下反应30分钟。去除孔的溶液，用WashBuffer洗涤7次后，添加100μL Substrate Solution，反应10～15分钟。添加100μL Stop Solution使反应停止，测定450nm、570nm的吸光度。由标准液的吸光度制作标准曲线，分别计算出1L-1β、1L-6的生成量。

(结果)

(1)细胞因子生成量

测定的细胞因子生成量是乘以细胞上清的稀释率而以生成量(pg/mL)来记载的，为了以相同细胞数进行比较，在其值中算入了细胞生存试验的结果，并将对照值记为100。用此研究PMA和被检样品二者对细胞因子生成的影响。

(a)白细胞介素1β

1L-1β的生成量少，在将细胞上清稀释10倍的此这次方法中未能检出。

(b)白细胞介素6

如果以相同细胞数进行比较，则在PMA(+)条件下，可见微量的IL-6的生成(表3和图6)。另外，在PMA(-)、(+)二者的条件下，可见基于被检样品而生成的IL-6。

表3

(c)白细胞介素8

与IL-1β、IL-6相比，可见20倍以上的IL-8的生成量(表4和图7)。

另外，可见由于添加PMA而有显著的IL-8的生成。被检样品显示出浓度依赖性的生成抑制。

表4

(考察)

对于此次研究的三种细胞因子，虽然由于添加被检样品而生成少量的IL-6，但是其与IL-8生成量相比微乎其微，从而认为是炎症作用弱的细胞因子。相反，由于添加被检样品而显著抑制IL-8的生成。该活性在PMA(-)、(+)任一条件下均可见，因此认为抗炎症或消炎作用高。

(实施例4)抑制黑色素生成试验

(概要)

使草莓源性物质作用于人源黑色素瘤细胞HMVII细胞，将黑色素的生成量与阴性对照进行比较，研究了黑色素生成的抑制性(美白效果)。

(材料和方法)

(1)细胞

人源黑色素瘤细胞HMVII使用的是用在含有10％FBS的Ham F-12培养基(日水制药)中添加0.5％青霉素-链霉素(Gibco)的培养液传代培养3代以上而得到的细胞。

(2)被检样品

被检样品：将制造例1(1)中得到的热水提取物和制造例1(2)中得到的10％乙醇水溶液洗脱级分和50％乙醇水溶液洗脱级分冷冻干燥后使用。

(3)方法

(a)黑色素生成量

在24孔板(well plate)上接种960μL最终浓度1.0×10⁵个细胞/孔(接种浓度1.04×10⁵个细胞/mL)的用加入有10％FBS的Ham F-12培养基培养的人源细胞HMVII，用CO₂孵化器培养24小时。分别添加20μL调制为最终浓度100ng/mL(添加浓度5.0μg/mL)的黑色素生成激素(α-MSH)和调制为10μg/mL(500μg/mL)或100μg/mL(5000μg/mL)的被检样品，培养72小时。去除培养基，用PBS洗涤后，加入胰蛋白酶EDTA溶液100μL，从孔板剥离细胞，加入1N氢氧化钠水溶液900μL。在室温下静置20～24小时溶解细胞后，以475nm的吸光度测定黑色素。

(b)细胞存活率

为了修正被检样品对细胞存活率(增殖率)的影响，用MTT法计算出以对照实验为基准的存活率，计入黑色素测定值中。在96孔板上接种160μL 2.0×10⁴个细胞/孔(1.25×10⁵个细胞/mL)，培养24小时。添加各20μL调制为最终浓度100ng/mL(1.0μg/mL)的黑色素生成激素(α-MSH)和调制为10μg/mL(100μg/mL)或100μg/mL(1000μg/mL)的被检样品，培养72小时。去除旧的培养基，加入新的培养基80μL和MTT试剂20μL，培养3～5小时。加入SDS-HCl试剂150μL，进一步培养18～20小时后，测定570nm的吸光度。

(结果)

由MTT试验结果可知，如果在HMVII细胞中添加草莓热水提取物和其分级物，则其大部分的存活率升高，具有增殖活性。由此可见，即使在用实测值比较黑色素生成量时样品值高于对照值，若以存活率进行修正的话也会低于对照值，具有黑色素生成抑制活性(表5和图8)。

表5

(实施例5)黑色素生成抑制试验

(概要)

使草莓源性物质作用于小鼠源黑色素瘤细胞B16F1细胞，将黑色素的生成量与阴性对照相比，研究其生成抑制性(美白效果)。

(材料和方法)

(1)细胞

小鼠源黑色素瘤细胞B16F1使用的是用在含有10％FBS的Dulbecco改良Eagle(D-MEM)培养基(日水制药)中添加有0.5％青霉素-链霉素(Gibco)的培养液传代培养3代以上而得到的细胞。

(2)被检样品

(3)方法

(a)黑色素生成量

在24孔板上接种960μL最终浓度1.0×10⁵个细胞/孔(接种浓度1.04×10⁵个细胞/mL)的用加入有10％FBS的D-MEM培养基培养的小鼠源细胞B16F1，在CO₂孵化器内培养24小时。分别添加20μL调制为最终浓度100ng/mL(添加浓度5.0μg/mL)的黑色素生成激素(α-MSH)和调制为10μg/mL(500μg/mL)或100μg/mL(5000μg/mL)的被检样品，培养72小时。去除培养基，用PBS洗涤后，加入胰蛋白酶EDTA溶液100μL，从孔板剥离细胞，加入1N氢氧化钠水溶液900μL。在室温下静置20～24小时溶解细胞后，以475nm的吸光度测定黑色素含量。

(b)细胞存活率

为了修正被检样品对细胞存活率(增殖率)的影响，用MTT法计算出以对照为基准的存活率，计入黑色素测定值中。在96孔板上接种160μL 2.0×10⁴个细胞/孔(1.25×10⁵个细胞/mL)，培养24小时。添加各20μL调制为最终浓度100ng/mL(1.0μg/mL)的黑色素生成激素(α-MSH)和调制为10μg/mL(100μg/mL)或100μg/mL(1000μg/mL)的被检样品，培养72小时。去除旧的培养基，加入新的培养基80μL和MTT试剂20μL，培养3～5小时。加入SDS-HCl试剂150μL，进一步培养18～20小时后，测定570nm的吸光度。

(结果)

由MTT试验结果可知，如果在B16F1细胞中添加草莓热水提取物和其分级物，则可以确认到任一样品中均具有与阳性对照相同程度的黑色素生成抑制活性(表6和图9)。

表6

(实施例6)酪氨酸酶活性抑制试验

(概要)

在试管内对于在细胞内生成黑色素时被检样品是否会抑制酪氨酸酶介导的生化反应进行了评价。

(材料和方法)

(1)被检样品

(2)方法

在用磷酸盐缓冲液调整为最终浓度0.03％的底物多巴(dopa)溶液0.5mL中，加入用磷酸盐缓冲液调制的被检样品溶液0.5mL，冰冷备用。加入0.5mL用磷酸盐缓冲液调整为最终浓度45U/mL的酪氨酸酶溶液，在25℃孵育5分钟后，测定475nm的吸光度。从吸光度之差计算出酪氨酸酶的反应率(活性)。另外，为了规避被检样品的颜色的影响，代替酪氨酸酶溶液加入磷酸盐缓冲液并对其吸光度进行测定，从而修正吸光度。

(结果)

热水提取物和50％乙醇水溶液洗脱级分在实施例5中表现出黑色素生成的抑制作用，与此相对，二者均未表现出酪氨酸酶的抑制作用。该事实推翻了一般因酪氨酸酶的抑制作用使黑色素的生成被抑制这一认识，暗示了基于新的作用机制而产生的美白剂的可能性。另一方面，10％乙醇溶液洗脱级分表现出弱的酪氨酸酶抑制活性(表7和图10)。如实施例5中所述，由于该级分还表现出黑色素生成抑制作用，因此暗示了该级分具有弱的酪氨酸酶的抑制作用的同时，还兼具基于酪氨酸酶的抑制以外的作用机制而产生的黑色素生成抑制作用。

表7

(实施例7)第2抗肥胖试验

(目的)

(1)抗肥胖作用的重现性的验证

(2)在mRNA水平上的机理阐明的研究

(方法)

(1)被检样品

(a)草莓热水提取物(草莓多酚-L FD)

(ii)将酶处理草莓在90℃加热60分钟后过滤。

(b)草莓多酚(草莓PP)

使用制造例1(2)中得到的50％乙醇水溶液洗脱级分。

(c)苹果果胶

购买苹果源性果胶(和光纯药工业)使用。

(2)动物和饲养

(3)给药方法

饲养到第8天开始给药。连续实施14次(实施两周1天1次的给药)灌胃给药。

(4)试验区

对以下的4组，各组使用10个个体。

(a)对照组：水

(b)无酶处理草莓热水提取物(草莓多酚-L FD)：1000mg/kg

(c)草莓多酚(草莓PP)：100mg/kg

(d)草莓多酚+苹果果胶：各100mg/kg

(5)测定

每天测定摄食量、摄水量和体重。另外，由于在对照组中，有两只体重明显未增加的个体，因此将它们从数据分析中除外(其它的个体的体重增加了6.5g左右，被除外的2个个体的体重只增加了3.4g)。

(6)解剖和生化试验

从解剖前一天不给小鼠进食。在乙醚麻醉状态下从心脏采集全身血，离心后在-80℃下保存血清。另外，摘除肝脏和副睾丸周围脂肪组织，测定重量。从肝脏提取mRNA，制作cDNA。

(7)基因分析

以β肌纤蛋白作为内标，用半定量法测定肝脏的ACO基因(β氧化相关基因)。

(8)统计处理

实施ANOVA和Dannett检验。

(结论)

通过草莓多酚的给药，可以确认到非常强的抗肥胖作用。

(1)体重随时间的变化

在草莓多酚-L FD给药组和草莓PP+果胶给药组中，显著地抑制了体重增加。在仅给药草莓PP的组中，也有抑制体重增加的倾向。结果示出在图11中。

(2)肝脏的重量

任一组与对照相比均为较低的值，在草莓PP给药组中为显著的低值。结果示出在图12中。

(3)副睾丸周围脂肪组织的重量

任一组与对照相比，副睾丸周围脂肪组织的重量为显著的低值。结果示出在图13中。

(4)肝脏中的ACO基因的表达

在对照和草莓PP+果胶给药试验区中进行了半定量性的比较，但未发现差异。

(考察)

可以认为草莓的多酚级分具有抗肥胖作用。

(实施例8)第3抗肥胖试验

(目的)

对上述第2抗肥胖试验进行的追加研究。有报道显示通过敲除抑制PPARγ活化的基因，在骨髓上蓄积脂肪；以及通过对糖尿病模型小鼠给药PPARγ的拮抗剂，从而使骨髓的PPARγ的活化受到抑制。由这些可以认为利用骨髓细胞能够对PPARγ的活化抑制进行评价。

(方法)

(1)被检样品

使用与上述第2抗肥胖试验相同的被检样品。

(2)动物和饲养

在自由摄取普通饲料或者高脂肪-高蔗糖饲料和水的情况下饲养ICR/Kwl小鼠(雄性、5周龄)。

(3)给药方法

饲养到第24天开始给药。连续实施3天灌胃给药。

(4)试验区

对以下的3组，各组使用4个个体。

(a)普通饲料

(b)高脂肪-高蔗糖饲料(对照)

(c)高脂肪-高蔗糖饲料+草莓PP：200mg/kg+果胶：100mg/kg

(5)基因分析

采取骨髓细胞，半定量地测定aP2基因(PPARγ的下游基因)。

(结论)

在草莓PP+果胶给药区，与对照相比，aP2基因的表达未变高。结果示出在图14中。暗示出通过抑制PPARγ的活化而抑制了脂肪细胞的分化和脂肪的蓄积的可能性。

(考察)

暗示出草莓的抗肥胖作用的机理有可能是因抑制脂肪细胞的分化和脂肪蓄积而产生的。

有报道显示如果敲除PPARγ基因，则肝脏重量增加。虽然在第2抗肥胖试验中不能在基因水平上掌控肝脏中的β氧化，但是从肝脏重量降低来看，β氧化可能也与抗肥胖效果有关。

Claims

1.一种口服或外用组合物，其含有经如下处理而得到的级分，即将草莓的热水提取物负载于使用芳香族系合成吸附剂的吸附色谱，去除通过了柱的级分和用水洗脱掉的级分，然后用5～60％乙醇水溶液洗脱而得到的级分。

2.根据权利要求1所述的组合物，其含有经如下处理而得到的级分，即去除通过了柱的级分和用水洗脱掉的级分，然后用5～15％乙醇水溶液洗脱而得到的级分。

3.根据权利要求1所述的组合物，其含有经如下处理而得到的级分，即去除通过了柱的级分、用水洗脱掉的级分和用低于40％的乙醇水溶液洗脱掉的级分，然后用40～60％乙醇水溶液洗脱而得到的级分。

4.根据权利要求1～3中任一项所述的组合物，其进一步含有增稠多糖类。

5.一种组合物，其配混草莓源性多酚和增稠多糖类而形成。

6.根据权利要求1～5中任一项所述的组合物，其为食品组合物、医药组合物或化妆品组合物。

7.根据权利要求6所述的组合物，其为抗肥胖用组合物。

8.根据权利要求6所述的组合物，其为抗炎症用组合物。

9.根据权利要求6所述的组合物，其为抑制黑色素生成用组合物。

10.根据权利要求4～9中任一项所述的组合物，其中，增稠多糖类为草莓源性果胶。