KR102559627B1 - 유산균발효호박손추출물을 이용한 골질환 예방 및 뼈 기능 개선 조성물 및 그 제조방법 - Google Patents

유산균발효호박손추출물을 이용한 골질환 예방 및 뼈 기능 개선 조성물 및 그 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 명세서에서는 골질환, 특히 골다공증의 치료, 예방, 및/또는 개선 효과가 있는 유산균발효호박손추출물 및 그 제조방법을 제공한다. 상기 유산균발효호박손추출물은 지표성분으로 1-데하이드로디코니페릴 알코올(1-dehydrodiconiferyl alcohol) 및 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) CVL-001 균주의 배양 산물을 포함한다. 상기 유산균발효호박손추출물의 제조 방법은 크게 1) 용매를 이용하여 호박손에 포함된 당분 및 1-데하이드로디코니페릴 알코올을 추출하는 과정, 2) 상기 1) 과정에서 얻어진 호박손추출물에 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) CVL-001 균주를 접종하여 배양하는 과정, 3) 상기 2) 과정에서 얻어진 배양물을 적절하게 후처리하여 유산균발효호박손추출물을 수득하는 과정으로 나눌 수 있다.

Description

유산균발효호박손추출물을 이용한 골질환 예방 및 뼈 기능 개선 조성물 및 그 제조방법{A composition for preventing bone disease and improving bone function, using Lactobacillus fermented pumpkin tendril extract and manufacturing method thereof}
본 명세서에 개시된 기술은 골질환, 특히 골다공증 치료, 예방, 및/또는 개선에 효과가 있는 천연물 추출물과 관련된 기술이며, 구체적으로는 천연물 추출물을 유산균으로 발효시킨 발효 산물 및 그 제조공정에 대한 기술이다.
우리나라는 고령 인구가 지속적으로 증가하고 있으며, 최근 들어 높은 삶의 질을 추구하는 경향 등으로 골다공증의 치료, 예방, 및/또는 개선이 가능한 건강기능식품 등에 대한 수요가 늘어나고 있다. 따라서, 독성이 없어 안정하면서도 골질환, 특히 골다공증의 치료, 예방, 및/또는 개선 효과가 월등한 소재에 대한 개발이 요구되는 실정이다. 또한, 천연물 원료 소재 및 제품에 대해서는 종래 많은 연구 및 제품 개발이 이뤄지고 있었으나, 유산균을 기반으로 하는 기능성 소재에 대한 연구는 미흡한 실정이었다.
본 명세서에서는 골질환, 특히 골다공증 치료, 예방, 및/또는 개선에 효과가 있는 유산균발효호박손추출물을 제공하고자 한다.
본 명세서에서는 상기 유산균발효호박손추출물의 제조방법을 제공하고자 한다.
본 명세서에서는 상기 유산균발효호박손추출물의 용도를 제공하고자 한다.
일 실시예로, 본 명세서에서는 다음을 포함하는 유산균발효호박손추출물 제조 방법을 제공한다:
호박손을 용매로 추출하여 당 및 1-데하이드로디코니페릴 알코올(1-dehydrodiconiferyl alcohol)을 포함하는 제1 조성물을 수득하는 과정;
상기 제1 조성물 내에 락토바실러스 사케이 CVL-001 균주를 배양하여 제2 조성물을 수득하는 과정; 및
상기 제2 조성물로부터 락토바실러스 사케이 CVL-001 균주 균체를 제거하여, 락토바실러스 사케이 CVL-001 균주 발효 산물 및 1-데하이드로디코니페릴 알코올(1-dehydrodiconiferyl alcohol)을 포함하는 유산균발효호박손추출물을 수득하는 과정,
이때, 상기 유산균발효호박손추출물은 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) CVL-001 균주 균체를 포함하지 않음.
일 실시예로, 상기 용매는 증류수, 헥세인(hexane), EtOAc, 및 EtOH로 이뤄진 군에서 선택된 것일 수 있다.
일 실시예로, 상기 제1 조성물은 당을 12 내지 16 질량%로 포함하고 있을 수 있다.
일 실시예로, 상기 유산균발효호박손추출물은 1-데하이드로디코니페릴 알코올(1-dehydrodiconiferyl alcohol)을 32 내지 36 mg/kg으로 포함할 수 있다.
일 실시예로, 상기 제1 조성물 내에 락토바실러스 사케이 CVL-001 균주를 배양하여 제2 조성물을 수득하는 과정은 다음을 포함할 수 있다:
a) 락토바실러스 사케이 CVL-001 균주 2.5% 내지 7.5%를 상기 제1 조성물에 접종하는 과정; 및
b) 상기 a) 과정의 결과로 얻어진 제1 조성물을 32℃내지 42℃온도에서 12시간 내지 36시간 배양하는 과정.
일 실시예로, 상기 제2 조성물로부터 락토바실러스 사케이 CVL-001 균주 균체를 제거하는 과정은 다음을 포함할 수 있다:
a) 상기 제2 조성물을 원심분리하는 과정; 및
b) 상기 a) 과정의 결과로 얻어진 제2 조성물에서 상기 유산균발효호박손추출물을 분리하는 과정, 이때, 상기 유산균발효호박손추출물은 락토바실러스 사케이 CVL-001 균주 균체를 포함하지 않음.
일 실시예로, 본 명세서에서는 상기 유산균발효호박손추출물 제조 방법으로 제조된 유산균발효호박손 추출물로, 상기 유산균발효호박손추출물은 32 내지 36 mg/kg의 1-데하이드로디코니페릴 알코올(1-dehydrodiconiferyl alcohol)을 포함하는 유산균발효호박손추출물을 제공한다.
본 발명에서 제공하는 제조방법으로 유산균발효호박손추출물을 수득할 수 있다. 상기 유산균발효호박손추출물은 독성이 없어 인간을 포함한 동물이 섭취할 수 있는 것으로, 골질환, 특히 골다공증 치료, 예방, 및/또는 개선에 효과를 보인다.
도 1은 본 명세서에서 개시하는 유산균발효호박손추출물 제조 방법을 나타낸 순서도이다.
도 2는 유산균발효호박손추출물 제조 후, 지표성분인 1-데하이드로디코니페릴 알코올(1-dehydrodiconiferyl alcohol, DCA)의 함량을 분석한 결과를 나타낸다.
도 3은 대식세포에 유산균발효호박손추출물을 0.1, 1, 10, 100, 1000 μg/ml의 농도로 첨가하고, RANKL을 처리한 후 파골세포분화억제 활성을 분석한 결과를 나타낸다. A. 분화시킨 대식세포를 TRAP 염색하고, 광학 현미경으로 관찰한 결과. B. TRAP 염색 후, 핵이 3개 이상으로 다핵화된 세포를 계수하여 정량화한 결과.
도 4는 대식세포에 유산균발효호박손추출물을 0.1, 1, 10, 100, 1000 μg/ml의 농도로 처리하여 세포 독성을 나타내는지 분석한 결과를 나타낸다.
도 5는 골다공증 마우스 모델에 유산균발효호박손추출물을 경구 투여한 후, 체중감소효과를 측정한 결과를 나타낸다.
도 6은 골다공증 마우스 모델에 유산균발효호박손추출물을 경구 투여한 후, 골밀도(BMD), 골 체적(Bone Volume; BV), 골 두께(Trabecular Thickness; Tb.Th), 골 분리 정도(Trabecular Separation; Tb.Sp), 골의 개수(Trabecular Number; Tb.N), 총 부피당 골 부피(Trabecular Volume per Total Volume; Tb.V/TV)를 측정한 결과를 각각 나타낸다.
이하, 첨부된 도면을 참조하여, 발명의 내용을 특정한 구현예와 예시들을 통해 더욱 상세하게 설명한다. 상기 첨부된 도면은 발명의 일부 구현예를 포함하지만, 모든 구현예를 포함하고 있지는 않다는 점에 유의해야 한다. 본 명세서에 의해 개시되는 발명의 내용은 다양하게 구현될 수 있으며, 여기에 설명되는 특정 구현예로 제한되지 않는다. 이러한 구현예들은 본 명세서에 적용되는 법적 요건을 만족시키기 위해 제공되는 것으로 보아야 한다. 본 명세서에 개시된 발명이 속한 기술분야에 있어 통상의 기술자라면, 본 명세서에 개시된 발명의 내용에 대한 많은 변형 및 다른 구현예들을 떠올릴 수 있을 것이다. 따라서, 본 명세서에서 개시된 발명의 내용은 여기에 기재된 특정 구현예로 제한되지 않으며, 이에 대한 변형 및 다른 구현예들도 청구범위 내에 포함되는 것으로 이해되어야 한다.
용어의 정의
약
본 명세서에서 사용되는 "약"이라는 용어는 참조 양, 수준, 값, 수, 빈도, 퍼센트, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이에 대해 30, 25, 20, 25, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1% 정도로 변하는 양, 수준, 값, 수, 빈도, 퍼센트, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이를 의미한다.
유산균발효추출물
본 명세서에서 사용하는 "유산균발효A추출물"이라는 용어는, 달리 명시되지 않는 한, A라는 재료를 추출(예를 들어, 열수추출)하여 얻은 산물을 유산균으로 발효시켜 얻은 결과물을 의미한다. 예를 들어, 유산균발효호박손추출물은 호박손을 추출하여 얻은 산물을 유산균으로 발효시켜 수득한 산물을 의미한다. 상기 용어는 이 외에도 통상의 기술자가 생각할 수 있는 의미를 모두 포함하며, 문맥에 따라 적절하게 해석되어야 한다.
제1 조성물, 제2 조성물 등
달리 명시되지 않는 한, 본 명세서에서 제공하는 유산균발효호박손추출물 제조 공정의 중간 부산물은 제1 조성물, 제2 조성물 등으로 번호를 붙여 지칭될 수 있다. 이때, 조성물의 번호는 편의상 쓰는 표현으로, 번호 자체가 고유한 의미를 가지는 것이 아니며, 문맥 상 적절하게 해석되어야 한다.
유산균발효호박손추출물
개괄
본 명세서에서는 유산균발효호박손추출물(Lactobacillus fermented pumpkin tendrill extract)을 제공한다. 이는 천연물인 호박손추출물에 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) CVL-001 균주(기탁번호 KCTC13816BP)를 주입하여 발효시킨 후, 적절한 후처리를 거친 것이다. 상기 유산균발효호박손추출물은 천연물 유래의 물질을 유산균으로 발효시킨 것으로, 독성이 없어 섭취가 가능한 것을 특징으로 한다. 상기 유산균발효호박손추출물은, 섭취 시 골질환, 특히 골다공증 예방에 효과가 있는 것으로 나타난다.
지표성분
본 명세서에서 제공하는 유산균발효호박손추출물에는 1-데하이드로디코니페릴 알코올(1-dehydrodiconiferyl alcohol)이 포함되어 있다. 선행문헌(논문)에 따르면, 상기 1-데하이드로디코니페릴 알코올(1-dehydrodiconiferyl alcohol)은 골질환, 특히 골다공증 치료, 예방, 및 개선에 효과가 있는 것으로 알려져있다. 이하 본 명세서에서 "지표성분"이라고 쓰는 경우, 달리 서술하지 않는 한 1-데하이드로디코니페릴 알코올(1-dehydrodiconiferyl alcohol)을 지칭하는 것으로 해석한다.
지표성분 함량
일 구현예로, 상기 유산균발효호박손추출물에는 1-데하이드로디코니페릴 알코올(1-dehydrodiconiferyl alcohol)이 상기 유산균발효호박손추출물의 질량 기준, 약 25 mg/kg, 약 26 mg/kg, 약 27 mg/kg, 약 28 mg/kg, 약 29 mg/kg, 약 30 mg/kg, 약 31 mg/kg, 약 32 mg/kg, 약 33 mg/kg, 약 34 mg/kg, 약 35 mg/kg, 약 36 mg/kg, 약 37 mg/kg, 약 38 mg/kg, 약 39 mg/kg, 약 40 mg/kg, 약 41 mg/kg, 약 42 mg/kg, 약 43 mg/kg, 약 44 mg/kg, 약 45 mg/kg, 약 46 mg/kg, 약 47 mg/kg, 약 48 mg/kg, 약 49 mg/kg, 약 50 mg/kg, 약 51 mg/kg, 약 52 mg/kg, 약 53 mg/kg, 약 54 mg/kg, 약 55 mg/kg, 약 56 mg/kg, 약 57 mg/kg, 약 58 mg/kg, 약 59 mg/kg, 약 60 mg/kg 포함되어 있을 수 있다.
일 구현예로, 상기 유산균발효호박손추출물에는 바로 이전 문장에서 선택된 수치 범위 내의 1-데하이드로디코니페릴 알코올(1-dehydrodiconiferyl alcohol)이 포함되어 있을 수 있다. 예를 들어, 상기 유산균발효호박손추출물에는 약 30 mg/kg 내지 40 mg/kg의 1-데하이드로디코니페릴 알코올(1-dehydrodiconiferyl alcohol)이 포함되어 있을 수 있다.
기타 성분
상기 유산균발효호박손추출물에는 상기 1-데하이드로디코니페릴 알코올 외에도 골질환의 치료, 예방, 및 개선에 효과가 있는 것으로 알려진 기타 성분이 포함되어 있을 수 있다. 일 구현예로, 상기 유산균발효호박손추출물에는 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei)의 배양 산물이 포함되어 있을 수 있다. 이때, 상기 락토바실러스 사케이는 CVL-001 균주일 수 있다. 일 구현예로, 상기 유산균발효호박손추출물에는 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) 균주가 포함되어 있을 수 있다. 이때, 상기 락토바실러스 사케이는 CVL-001 균주일 수 있다.
유산균발효호박손추출물의 용도
상기 유산균발효호박손추출물은 천연물 유래의 유산균 발효 물질로, 독성이 없어 인체에 무해하며, 따라서, 식용으로 사용될 수 있다. 일 구현예로, 상기 유산균발효호박손추출물은 건강 기능 식품 용도로 제공될 수 있다. 일 구현예로, 상기 유산균발효호박손추출물은 식품 첨가 용도로 제공될 수 있다. 일 구현예로, 상기 유산균발효호박손추출물은 건강 보조 식품 용도로 제공될 수 있다.
유산균발효호박손추출물의 제공 형태
상기 유산균발효호박손추출물은 그 목적에 따라 다양한 형태로 제공된다. 이때, 상기 제공 형태는 식품, 또는 식품 첨가물 용도로 사용될 수 있는 형태라면 특별히 제한되지 않는다. 일 구현예로, 상기 유산균발효호박손추출물은 액상, 호상, 분말, 및/또는 젤리 형태로 제공될 수 있다.
유산균발효호박손추출물의 장점
본 명세서에서 제공하는 유산균발효호박손추출물은 골질환, 특히 골다공증의 예방, 치료, 경감, 및/또는 개선 효과를 보이는 물질을 포함하고 있는 것을 특징으로 한다. 또한, 전술한 바 상기 유산균발효호박손추출물은 독성이 없어 인체에 무해한 것을 또 다른 특징으로 한다. 본 발명의 발명자들은 본 명세서에서 제공하는 상기 유산균발효호박손추출물을 섭취하는 경우, 골질환, 특히 골다공증의 예방, 치료, 경감, 및/또는 개선 효과가 나타남을 실험을 통해 밝혀냈다. 따라서, 본 유산균발효호박손추출물은 그 자체를 식용으로 사용하거나, 다양한 식품의 첨가물 형태로 사용하여 골질환의 예방, 치료, 경감, 및/또는 개선에 사용할 수 있는 것이 장점이다.
유산균발효호박손추출물 제조 방법 - 개괄
본 명세서에서는 유산균발효호박손추출물의 제조 방법을 제공한다. 상기 유산균발효호박손추출물의 제조 방법은 크게 1) 용매를 이용하여 호박손에 포함된 당분 및 1-데하이드로디코니페릴 알코올을 추출하는 과정, 2) 상기 1) 과정에서 얻어진 호박손추출물에 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) CVL-001 균주를 접종하여 배양하는 과정, 3) 상기 2) 과정에서 얻어진 배양물을 적절하게 후처리하여 유산균발효호박손추출물을 수득하는 과정으로 나눌 수 있다. 각 과정을 수행한 결과 얻어지는 부산물은 제1 조성물, 제2 조성물 등 숫자를 붙여 지칭될 수 있으며, 이는 맥락에 따라 적절하게 해석되어야 한다. 이하 각 제조 과정에 대해 더 자세히 설명한다.
호박손 추출
개괄
본 명세서에서 제공하는 유산균발효호박손추출물의 제조 방법은 호박손 추출 과정을 포함한다. 이는, 호박손에 적절한 용매를 첨가하고, 적절한 방법을 사용하여 호박손에 포함된 지표물질 및 당을 추출하는 과정이다. 일 구현예로, 상기 호박손 추출 과정은 호박손을 열수 추출하는 과정일 수 있다.
추출 용매
상기 호박손 추출 과정에서 사용하는 용매는 호박손에 포함된 지표성분 및 당분을 추출해낼 수 있는 용매라면 특별히 제한되지 않는다. 예를 들어, 상기 추출 용매는 증류수, Hexane, EtOAc, 및/또는 EtOH 일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 일 구현예로, 상기 추출 용매는 증류수일 수 있다.
열 추출 방법
상기 호박손 추출 과정은 호박손에 뜨거운 용매를 첨가하여 추출하는 과정일 수 있다. 더 구체적으로, 상기 호박손 추출 과정은 호박손에 뜨거운 용매를 첨가하여 지표성분 및 당분을 추출한 후, 잔여물을 제거하는 것일 수 있다. 이때, 호박손에 "특정 온도의 용매를 첨가하는 것"은 호박손에 상기 특정 온도로 가열된 용매를 첨가하는 것, 및 호박손에 상기 특정 온도 이하의 용매를 첨가하고, 이를 상기 특정 온도가 되도록 가열하는 것을 모두 포함하는 개념이다. 일 구현예로, 상기 호박손 추출 과정은 호박손을 열수 추출하여 추출물을 수득하는 과정일 수 있다.
일 구현예로, 상기 호박손 추출 과정은 호박손에 약 50℃, 약 51℃, 약 52℃, 약 53℃, 약 54℃, 약 55℃, 약 56℃, 약 57℃, 약 58℃, 약 59℃, 약 60℃, 약 61℃, 약 62℃, 약 63℃, 약 64℃, 약 65℃, 약 66℃, 약 67℃, 약 68℃, 약 69℃, 약 70℃, 약 71℃, 약 72℃, 약 73℃, 약 74℃, 약 75℃, 약 76℃, 약 77℃, 약 78℃, 약 79℃, 약 80℃, 약 81℃, 약 82℃, 약 83℃, 약 84℃, 약 85℃, 약 86℃, 약 87℃, 약 88℃, 약 89℃, 약 90℃, 약 91℃, 약 92℃, 약 93℃, 약 94℃, 약 95℃, 약 96℃, 약 97℃, 약 98℃, 약 99℃, 약 100℃, 약 101℃, 약 102℃, 약 103℃, 약 104℃, 약 105℃, 약 106℃, 약 107℃, 약 108℃, 약 109℃, 약 110℃, 약 111℃, 약 112℃, 약 113℃, 약 114℃, 약 115℃, 약 116℃, 약 117℃, 약 118℃, 약 119℃, 약 120℃, 약 121℃, 약 122℃, 약 123℃, 약 124℃, 약 125℃, 약 126℃, 약 127℃, 약 128℃, 약 129℃, 약 130℃, 약 131℃, 약 132℃, 약 133℃, 약 134℃, 약 135℃, 약 136℃, 약 137℃, 약 138℃, 약 139℃, 약 140℃, 약 141℃, 약 142℃, 약 143℃, 약 144℃, 약 145℃, 약 146℃, 약 147℃, 약 148℃, 약 149℃, 또는 약 150℃의 용매를 첨가하여 호박손추출물을 수득하는 과정일 수 있다.
일 구현예로, 상기 호박손 추출 과정은 바로 이전 문장에서 선택된 두 수치범위 내로 가열된 용매를 첨가하여 호박손추출물을 수득하는 과정일 수 있다. 예를 들어, 90℃ 내지 100℃의 용매를 첨가하는 것일 수 있다.
일 구현예로, 상기 호박손 추출 과정은 90℃ 내지 100℃의 증류수를 첨가하여 호박손추출물을 수득하는 과정일 수 있다.
일 구현예로, 상기 호박손 추출 과정은 호박손에 특정 온도의 용매를 첨가하여 약 5분, 약 10분, 약 15분, 약 20분, 약 25분, 약 30분, 약 1시간, 약 1.5시간, 약 2시간, 약 2.5시간, 약 3시간동안 추출하는 것일 수 있다.
일 구현예로, 상기 호박손 추출 과정은 바로 이전 문장에서 선택된 두 수치범위 내 시간으로 추출하는 것일 수 있다. 예를 들어, 1시간 내지 3시간동안 추출하는 것일 수 있다.
일 구현예로, 상기 호박손 추출 과정은 90℃ 내지 100℃의 증류수를 첨가하여 1시간 내지 3시간 추출하여 호박손추출물을 수득하는 과정일 수 있다.
이때, 상기 호박손추출물은 제1 조성물로 지칭될 수 있다.
기타 추출 방법
상기 호박손 추출 과정에 사용되는 방법은 전술한 열 추출 방법 외에도, 호박손으로부터 지표성분 및 당분을 추출해낼 수 있는 방법이라면 특별히 제한되지 않는다. 일 구현예로, 상기 호박손 추출 과정은 호박손에 용매를 첨가하고, 소니케이션(sonication)하여 호박손추출물을 수득하는 것일 수 있다. 일 구현예로, 상기 호박손 추출 과정은 호박손에 용매를 첨가하고, 기타 공지된 방법을 사용하여 호박손추출물을 수득하는 것일 수 있다.
일 구현예로, 상기 호박손 추출 과정은 호박손에 특정 온도의 용매를 첨가하여 약 5분, 약 10분, 약 15분, 약 20분, 약 25분, 약 30분, 약 1시간, 약 1.5시간, 약 2시간, 약 2.5시간, 약 3시간동안 추출하는 것일 수 있다. 일 구현예로, 상기 호박손 추출 과정은 바로 이전 문장에서 선택된 두 수치범위 내 시간으로 추출하는 것일 수 있다. 예를 들어, 1시간 내지 3시간동안 추출하는 것일 수 있다. 일 구현예로, 상기 호박손 추출 과정은 호박손에 Hexane, EtOAc, 및/또는 EtOH를 첨가한 후, 30분 내지 1시간동안 소니케이션하여 호박손추출물을 수득하는 것일 수 있다. 이때, 상기 호박손추출물은 제1 조성물로 지칭될 수 있다.
반복 추출 및 조합 가능
상기 호박손 추출 과정에서, 추출 횟수 및 방법은 특별히 제한되지 않는다. 상기 호박손 추출 과정은 복수의 추출 과정을 포함할 수 있으며, 서로 다른 추출 방법을 포함할 수 있고, 각 과정에서 얻어진 추출물을 혼합하여 유산균 배양 과정에 사용할 수 있다. 일 구현예로, 상기 호박손 추출 과정은 호박손을 2회 이상 추출하는 과정을 포함한다. 일 구현예로, 상기 호박손 추출 과정은 호박손에 증류수를 첨가하여 열수 추출하여 제1 호박손추출물을 수득하고, 상기 제1 호박손추출물을 수득하고 남은 부산물에 증류수를 첨가하여 열수 추출하여 제2 호박손추출물을 수득하는 것을 포함한다. 이때, 상기 제1 호박손추출물 및 제2 호박손추출물을 혼합하여 유산균 배양 과정에 사용할 수 있다. 이때, 상기 제1 호박손추출물 및 제2 호박손추출물이 혼합된 것은 제1 조성물로 지칭될 수 있다.
일 구현예로, 상기 호박손 추출 과정은 서로 다른 추출 방법을 조합하여 추출하는 것일 수 있다. 일 구현예로, 상기 호박손 추출 과정은 호박손에 증류수를 첨가하여 열수 추출하는 방법, 및 호박손에 Hexane, EtOAc, 및/또는 EtOH를 첨가하여 소니케이션(sonication)하여 추출하는 방법을 혼합한 것일 수 있다.
호박손 추출 후처리
상기 호박손 추출 과정은 호박손에 용매를 첨가, 추출하는 과정 외 상기 호박손추출물을 후처리하는 과정을 추가로 더 포함할 수 있다. 이때, 후처리 과정은, 이후 유산균 배양 과정을 수행하기 적합한 상태가 되도록 하기 위해 필요한 것이면 특별히 제한되지 않는다. 일 구현예로, 상기 후처리 과정은 상기 호박손에 용매를 첨가, 추출하여 얻은 산물을 필터링하는 과정을 포함할 수 있다. 일 구현예로, 상기 후처리 과정은 상기 호박손에 용매를 첨가, 추출하여 얻은 산물을 증발시키는 과정을 포함할 수 있다.
추출 결과 - 호박손추출물
상기 호박손 추출 결과 수득된 호박손추출물 내에는 지표성분 및 당이 포함되어 있는 것을 특징으로 한다. 이때, 상기 호박손추출물 내에 포함된 당의 농도는 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) CVL-001 균주를 배양하기에 충분한 농도일 수 있다. 이때, 상기 호박손추출물은 상기 호박손 추출 과정을 모두 마친 후 얻어지는 부산물을 의미하며, 이는 제1 조성물로 지칭될 수 있다.
유산균 배양
개괄
본 명세서에서 제공하는 유산균발효호박손추출물 제조 방법은 호박손 추출 과정의 결과 얻어진 호박손추출물에 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) CVL-001 균주를 배양하는 과정(이하, "유산균 배양 과정")을 포함한다. 이는 상기 호박손추출물을 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) CVL-001 균주로 발효시켜 골질환 치료, 예방, 및/또는 개선에 효과가 있는 배양 산물을 생성하기 위한 과정이다. 상기 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) CVL-001 균주(기탁번호 00)는 선행문헌(특허)를 통해 골질환, 특히 골다공증의 치료, 예방, 및/또는 개선에 효과가 있는 배양 산물을 생산한다고 알려져 있다. 본 명세서에서 제공하는 유산균발효호박손추출물은 상기 호박손 추출 과정을 거쳐 수득된 호박손추출물에 상기 락토바실러스 사케이 CVL-001 균주를 배양하여, 상기 호박손추출물에 포함된 지표물질과 락토바실러스 사케이 CVL-001 균주의 배양 산물이 복합적으로 작용하여 골질환의 치료, 예방, 및/또는 개선에 효과를 보이도록 한 것이 특징이다. 상기 유산균 배양 과정은 상기 락토바실러스 사케이 CVL-001 균주의 배양 효과를 극대화하기 위해, 상기 호박손추출물을 적절히 전처리하는 과정을 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 전처리 과정은 상기 호박손추출물을 멸균하는 과정일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 일 구현예로, 상기 유산균발효호박손추출물 제조 방법은 호박손에 용매를 가하여 추출한 제1 조성물 내에 락토바실러스 사케이 CVL-001 균주를 배양하여 제2 조성물을 수득하는 과정을 포함한다.
유산균 균주
본 명세서에서 제공하는 유산균발효호박손추출물 제조 방법에는, 유산균의 일종인 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) CVL-001 균주(기탁번호 KCTC13816BP)가 사용된다. 상기 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) CVL-001 균주(기탁번호 KCTC13816BP)는 선행문헌에 공지된 방법으로 수득하거나, 기 기탁된 균주를 수득하여 사용할 수 있다.
유산균 배양 전처리 1 - 멸균 과정
상기 유산균 배양 과정은, 상기 호박손추출물을 멸균하는 과정을 포함할 수 있다. 이는, 상기 호박손추출물에 상기 락토바실러스 사케이 CVL-001 균주만을 선택적으로 배양하기 위해 포함될 수 있는 과정이다. 상기 멸균 과정은 상기 호박손추출물에 락토바실러스 사용하기 CVL-001 균주를 선택적으로 배양하도록 하기 위해 필요한 과정이면 특별히 제한되지 않는다.
일 구현예로, 상기 멸균 과정은 상기 호박손추출물을 약 50℃, 약 51℃, 약 52℃, 약 53℃, 약 54℃, 약 55℃, 약 56℃, 약 57℃, 약 58℃, 약 59℃, 약 60℃, 약 61℃, 약 62℃, 약 63℃, 약 64℃, 약 65℃, 약 66℃, 약 67℃, 약 68℃, 약 69℃, 약 70℃, 약 71℃, 약 72℃, 약 73℃, 약 74℃, 약 75℃, 약 76℃, 약 77℃, 약 78℃, 약 79℃, 약 80℃, 약 81℃, 약 82℃, 약 83℃, 약 84℃, 약 85℃, 약 86℃, 약 87℃, 약 88℃, 약 89℃, 약 90℃, 약 91℃, 약 92℃, 약 93℃, 약 94℃, 약 95℃, 약 96℃, 약 97℃, 약 98℃, 약 99℃, 약 100℃, 약 101℃, 약 102℃, 약 103℃, 약 104℃, 약 105℃, 약 106℃, 약 107℃, 약 108℃, 약 109℃, 약 110℃, 약 111℃, 약 112℃, 약 113℃, 약 114℃, 약 115℃, 약 116℃, 약 117℃, 약 118℃, 약 119℃, 약 120℃, 약 121℃, 약 122℃, 약 123℃, 약 124℃, 약 125℃, 약 126℃, 약 127℃, 약 128℃, 약 129℃, 약 130℃, 약 131℃, 약 132℃, 약 133℃, 약 134℃, 약 135℃, 약 136℃, 약 137℃, 약 138℃, 약 139℃, 약 140℃, 약 141℃, 약 142℃, 약 143℃, 약 144℃, 약 145℃, 약 146℃, 약 147℃, 약 148℃, 약 149℃, 또는 약 150℃로 가열하여 멸균하는 과정일 수 있다.
일 구현예로, 상기 멸균 과정은 상기 호박손추출물을 바로 이전 문장에서 선택된 두 수치범위 내 온도로 가열하여 멸균하는 과정일 수 있다.
예를 들어, 약 120℃ 내지 130℃로 가열하여 멸균하는 과정일 수 있다.
일 구현예로, 상기 멸균 과정은 상기 호박손추출물을 특정 온도에서 약 1초, 약 2초, 약 3초, 약 4초, 약 5초, 약 6초, 약 7초, 약 8초, 약 9초, 약 10초, 약 30초, 약 1분, 약 2분, 약 3분, 약 4분, 약 5분, 약 10분, 약 15분, 약 20분, 약 25분, 약 30분, 약 35분, 약 40분, 약 45분, 약 50분, 약 55분, 약 60분, 약 1시간, 약 1.5시간, 약 2시간동안 멸균하는 과정일 수 있다.
일 구현예로, 상기 멸균 과정은 상기 호박손추출물을 바로 이전 문장에서 선택된 두 수치범위 내 시간동안 멸균하는 과정일 수 있다.
예를 들어, 약 10분 내지 약 20분간 멸균하는 과정일 수 있다.
일 구현예로, 상기 멸균 과정은 상기 호박손추출물을 약 120℃ 내지 약 130℃ 온도로 가열하여 약 10분 내지 약 20분 멸균하는 과정일 수 있다.
유산균 배양 전처리 2 - 기타
상기 유산균 배양 과정은, 상기 호박손추출물을 전처리하는 과정을 포함할 수 있다. 상기 전처리하는 과정은 상기 호박손추출물에 락토바실러스 사케이 CVL-001 균주를 배양하기 위해 필요한 과정이면 특별히 제한되지 않는다. 일 구현예로, 상기 전처리 과정은 상기 호박손추출물에 당을 추가하는 과정일 수 있다. 일 구현예로, 상기 전처리 과정은 상기 호박손추출물을 적절한 농도로 희석하는 과정일 수 있다.
유산균 접종 및 배양
상기 유산균 배양 과정은, 상기 호박손추출물, 또는 전처리한 호박손추출물 내에 락토바실러스 사케이 CVL-001 균주를 배양하는 과정을 포함한다. 일 구현예로, 상기 유산균 배양 과정은 상기 호박손추출물에 락토바실러스 사케이 CVL-001 균주를 접종하여 배양하는 과정을 포함한다.
일 구현예로, 상기 유산균 배양 과정은 상기 호박손추출물에 락토바실러스 사케이 CVL-001 균주를 약 0.1%, 약 0.2%, 약 0.3%, 약 0.4%, 약 0.5%, 약 0.6%, 약 0.7%, 약 0.8%, 약 0.9%, 약 1.0%, 약 1.1%, 약 1.2%, 약 1.3%, 약 1.4%, 약 1.5%, 약 1.6%, 약 1.7%, 약 1.8%, 약 1.9%, 약 2.0%, 약 2.1%, 약 2.2%, 약 2.3%, 약 2.4%, 약 2.5%, 약 2.6%, 약 2.7%, 약 2.8%, 약 2.9%, 약 3.0%, 약 3.1%, 약 3.2%, 약 3.3%, 약 3.4%, 약 3.5%, 약 3.6%, 약 3.7%, 약 3.8%, 약 3.9%, 약 4.0%, 약 4.1%, 약 4.2%, 약 4.3%, 약 4.4%, 약 4.5%, 약 4.6%, 약 4.7%, 약 4.8%, 약 4.9%, 약 5.0%, 약 6.0%, 약 7.0%, 약 8.0%, 약 9.0%, 약 10.0%, 약 15.0%, 또는 약 20.0% 이상 부피비로 접종하여 배양하는 과정을 포함한다. 일 구현예로, 상기 유산균 배양 과정은 상기 호박손추출물에 바로 이전 문장에서 선택된 두 수치범위 내 부피비로 락토바실러스 사케이 CVL-001 균주를 접종하여 배양하는 과정을 포함한다. 예를 들어, 상기 락토바실러스 사케이 CVL-001 균주의 부피비는 약 4.0% 내지 약 6.0%일 수 있다.
일 구현예로, 상기 유산균 배양 과정은 상기 호박손추출물에 락토바실러스 사케이 CVL-001 균주를 특정 부피비로 접종한 후, 약 10℃, 약 11℃, 약 12℃, 약 13℃, 약 14℃, 약 15℃, 약 16℃, 약 17℃, 약 18℃, 약 19℃, 약 20℃, 약 21℃, 약 22℃, 약 23℃, 약 24℃, 약 25℃, 약 26℃, 약 27℃, 약 28℃, 약 29℃, 약 30℃, 약 31℃, 약 32℃, 약 33℃, 약 34℃, 약 35℃, 약 36℃, 약 37℃, 약 38℃, 약 39℃, 또는 약 40℃ 이상에서 배양하는 과정을 포함한다.
일 구현예로, 상기 유산균 배양 과정은 바로 이전 문장에서 선택된 두 수치범위 내 온도에서 배양하는 과정을 포함한다.
예를 들어, 상기 락토바실러스 사케이 CVL-001 균주를 약 35℃ 내지 약 40℃에서 배양하는 과정을 포함할 수 있다.
일 구현예로, 상기 유산균 배양 과정은 상기 호박손추출물에 락토바실러스 사케이 CVL-001 균주를 특정 부피비로 접종한 후, 특정 온도에서, 약 1시간, 약 2시간, 약 3시간, 약 4시간, 약 5시간, 약 6시간, 약 12시간, 약 24시간, 약 36시간, 약 48시간, 약 3일, 약 4일, 또는 약 5일 이상 배양하는 과정을 포함한다.
일 구현예로, 상기 유산균 배양 과정은 상기 호박손추출물에 락토바실러스 사케이 CVL-001 균주를 특정 부피비로 접종한 후, 바로 이전 문장에서 선택된 두 수치범위 내 시간으로 배양하는 과정을 포함한다.
예를 들어, 상기 락토바실러스 사케이 CVL-001 균주를 약 12시간 내지 약 24시간 배양하는 과정을 포함할 수 있다.
일 구현예로, 상기 유산균 배양 과정은 상기 호박손추출물에 락토바실러스 사케이 CVL-001 균주를 특정 부피비로 접종한 후, 특정 온도에서, 특정 시간 배양하는 과정을 포함한다.
일 구현예로, 상기 유산균 배양 과정은 상기 호박손추출물에 락토바실러스 사케이 CVL-001 균주를 약 4.0% 내지 약 6.0% 부피비로 접종한 후, 약 35℃ 내지 약 40℃ 온도에서, 약 12시간 내지 약 36시간 배양하는 과정을 포함한다.
유산균 배양 결과 - 유산균배양액 수득
상기 유산균 배양 과정 후 얻어지는 산물을 유산균배양액이라 지칭할 수 있다. 상기 유산균 배양액은 상기 호박손추출물에 락토바실러스 사케이 CVL-001 균주가 배양된 것이며, 상기 유산균 배양 산물 및 상기 유산균 균체를 모두 포함한다. 상기 유산균배양액은 제2 조성물로 지칭될 수 있다.
후처리
개괄
본 명세서에서 제공하는 유산균발효호박손추출물은 상기 유산균배양액을 후처리하여 최종 산물인 유산균발효호박손추출물을 수득하는 과정을 포함할 수 있다. 상기 후처리 과정은 최종 산물인 유산균발효호박손추출물을 목적에 맞게 이용하기 위해 필요한 과정이라면 특별히 제한되지 않는다. 일 구현예로, 상기 후처리 과정은 상기 유산균배양액에서 상기 락토바실러스 사케이 CVL-001 균체를 제거하는 과정을 포함할 수 있다. 일 구현예로, 상기 후처리 과정은 상기 유산균배양액을 분무건조하는 과정을 포함할 수 있다. 일 구현예로, 상기 후처리 과정은 상기 유산균배양액을 동결건조하는 과정을 포함할 수 있다. 일 구현예로, 상기 후처리 과정은 상기 유산균배양액을 건조하여 분말을 제조하는 과정을 포함할 수 있다. 상기 후처리 과정은 생략될 수 있으며, 이 경우 상기 유산균배양액과 상기 유산균발효호박손추출물은 동일한 것을 지칭할 수 있다.
유산균 균체 제거
상기 후처리 과정은 상기 유산균배양액에서 락토바실러스 사케이 CVL-001 균체를 제거하는 과정을 포함할 수 있다. 이때, 상기 유산균 균체 제거 결과로 수득된 유산균발효호박손추출물은 상기 락토바실러스 사케이 CVL-001의 배양 산물은 포함하되, 상기 락토바실러스 사케이 CVL-001 균체는 포함하지 않는다. 상기 균체를 제거하는 과정은 공지된 방법을 사용할 수 있으며, 특별히 제한되지 않는다. 일 구현예로, 상기 후처리 과정은 상기 유산균배양액을 멸균한 후, 원심분리하여 균체를 제거하는 과정을 포함할 수 있다.
일 구현예로, 상기 후처리 과정은 상기 유산균배양액을 "유산균 배양 전처리 1 - 멸균 과정" 단락에서 설명된 방법으로 멸균하고, 원심분리하여 균체를 제거하는 과정을 포함할 수 있다. 일 구현예로, 상기 후처리 과정은 상기 유산균배양액을 원심분리하여 균체를 제거하고, "유산균 배양 전처리 1 - 멸균 과정" 단락에서 설명된 방법으로 멸균하는 과정을 포함할 수 있다. 일 구현예로, 상기 후처리 과정은 상기 유산균배양액을 멸균하는 과정, 원심분리하는 과정 및 필터 과정을 포함할 수 있다.
기타 후처리
상기 후처리 과정은 "유산균발효호박손추출물의 제공 형태" 단락에 기재된 형태로 유산균발효호박손추출물을 제조하기 위해 필요한 후처리 과정일 수 있다. 이는 공지된 방법을 사용할 수 있으며, 상기 목적을 달성하기 위한 것이라면 특별히 제한되지 않는다.
일 구현예로, 상기 후처리 과정은 상기 유산균배양액에 보호제를 처리하고, 동결건조하는 과정을 포함할 수 있다. 이때, 상기 보호제는 락토오스(lactose), 덱스트린(dextrin), 소르비톨(sorbitol), 프롤린(proline), 말토오스(maltose), 효소 추출물(yeast extract)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 일 구현예로, 상기 후처리 과정은 상기 유산균배양액을 동결건조하여 분말을 제조하는 과정을 포함할 수 있다.
일 구현예로, 상기 후처리 과정은 상기 유산균배양액에서 락토바실러스 사케이 CVL-001 균체를 제거한 후, 분무건조하는 과정을 포함할 수 있다. 일 구현예로, 상기 후처리 과정은 상기 유산균배양액에서 락토바실러스 사케이 CVL-001 균체를 제거한 후, 분무건조하여 분말을 제조하는 과정을 포함할 수 있다.
제조 결과물
상기 유산균배양액을 후처리하여 최종 산물인 유산균발효호박손추출물을 수득한다. 이때, 상기 후처리 과정은 생략될 수 있으며, 이 경우 상기 유산균배양액이 최종 산물인 유산균발효호박손추출물이 된다. 상기 유산균발효호박손추출물은 "유산균발효호박손추출" 단락에서 설명된 특징을 가진다.
실험예
실험예 1 유산균발효호박손추출물 제조
실험예 1-1 호박손 추출물 준비
경남 진주산 건조 호박손 1kg과 증류수 30L를 고압추출기에 넣고 95℃에서 4시간 추출 후 추출액만 분리하여 1차 추출하였고, 증류수 30L를 추가하여 95℃에서 2시간 추출 후 추출액만 분리하여 2차 추출하였다.1차와 2차 추출액을 필터하고, 60℃에서 감압농축하여 14brix의 호박손 추출물을 3.4L 수득하였다.
실험예 1-2 유산균 종배양
락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) CVL-001 균주(기탁번호 KCTC13816BP)를 MRS 고체배지에 도말하여 37℃에서 24시간 배양한 후 단일 콜로니를 멸균된 식용배지에 접종하고 37℃에서 18시간 진탕 배양하였다. 식용배지 조성은 4% Yeast extract, 5% glucose, 0.2% K2HPO4, 0.01% MnSO4, 0.01% MgSO4이며, 모든 배지 성분은 식품첨가물 등급을 사용하였다.
실험예 1-3 호박손 추출물에 유산균 접종 배양
14 brix의 호박손 추출물을 10 brix로 희석하여 121℃ 15분 고압멸균하고, 유산균 종배양액 5%를 접종하여 37℃에서 24시간 진탕 배양하였다.
실험예 1-4 후처리 및 유산균발효호박손추출물 수득
24시간 배양 후 121℃에서 15분 고압멸균하여 균을 불활성화하고, 8000rpm에서 20분 원심분리하여 균체를 제거하였다.
이후 0.2um 필터하고 25% Dextrin을 첨가하여 완전히 녹인 후 분무건조하여 유산균발효호박손추출물을 수득하였으며, 분무건조 수율은 22%였다.
실험예 1-5 지표성분 분석
지표성분인 1-dehydrodiconiferyl alcohol (DCA)는 RP-HPLC(Prominence LC-20A, Shimadzu)을 이용하였으며, 컬럼은 5C18-MSII(4.6x250 mm, cosmosil)사용하였다. 이동상은 0.1% Phosphoric acid와 acetonitrile을 사용하여, 1.0 mL/min 유속으로 분리하여 UV 280nm에서 검출하였다.
지표성분인 DCA는 39.06 min에서 검출되었으며, 호박손추출물내 DCA 함량은 130.09 mg/kg이 함유됨을 확인하였다. 유산균발효호박손추출물의 DCA 함량은 3배치 평균 34.6 mg/kg으로 확인되었다 (도 2).
실험예 2 파골세포분화억제능 평가
실험예 2-1 대식세포 분리
8 내지 12 주령 사이의 C57BL/6 마우스의 대퇴골(femur)에서 골수를 분리하고, 대식세포(macrophage)로 분화시키기 위하여 10% FBS (Fetal bovine serum) 및 1% 페니실린과 M-CSF(Macrophage-colony stimulating factor) 25 ng/ml가 첨가된 MEM alpha 배지에 도말하였다. 3일 동안 37℃및 5% CO2 조건의 인큐베이터에서 배양하여 골수 유래 대식세포(bone marrow-derived macrophages; BMDMs)를 얻었다. 상기 골수 유래 대식세포를 2x10^5 cells/well의 밀도로 12 well-plate에서 24시간 동안 배양하였다.
실험예 2-2 유산균발효호박손추출물의 파골세포분화억제능 평가
마우스 대식세포를 12 well-plate에 2x10^5 cells/well의 밀도로 10% FBS, 1% PS 및 M-CSF (25 ng/ml)가 첨가된 배지에 24h 배양 후, 같은 조성의 배지로 교체해준 후 유산균발효호박손 추출물을 0.1, 1, 10, 100, 1000 μg/ml의 농도로 2h 동안 처리하였다. 이후 RANKL을 100 ng/ml 처리하여 24h 동안 반응시켰다. 위와 같은 방법으로 4일간 분화시켰다. 이후 파골세포의 세포 화학적 표지효소인 TRAP에 발색성 기질을 첨가하여 분화시킨 대식세포의 핵을 염색하였고, 핵이 3개 이상으로 다핵화된 세포를 관찰하고 이미지화 및 정량화하여 표 1로 나타내었다. 대식세포에 RANKL을 처리하면 RANK에 결합하며 TRAP(Tartrate resistance acid phosphatase) 양성 세포로 분화하게 되는데, 이 TRAP 양성 세포에 RANKL, TNF-α와 같은 염증인자로 자극하면 세포끼리 융합되어 다핵형 TRAP 양성 세포로 분화된다.
도 3과 표 1에서 확인할 수 있듯이, 대식세포에 RANKL을 처리했을 때 파골세포의 분화가 증가하였고, 유산균발효호박손 추출물을 1 mg/ml로 처리 하였을 때 파골세포의 수가 현저히 감소하였음을 확인하였다 (도 3).
유산균발효호박손 추출물
처리농도 RANKL 0.1 1 10 100 1000
파골세포 수 (평균) 3554 3377 3437 2927 1897 384
실험예 3 세포독성 평가
마우스 대식세포에서 유산균발효호박손 추출물의 독성 유무를 확인하기 위해서 MTT 평가를 실시했다. 마우스 대식세포를 96 well-plate에 2x104 cells/well의 밀도로 10% FBS, 1% PS 및 M-CSF (25 ng/ml)가 첨가된 배지에 24h 배양 후, 같은 조성의 배지로 교체해준 후 유산균발효호박손 추출물을 0.1, 1, 10, 100, 1000 μg/ml의 농도로 24h 동안 처리하였다. 이후 WST-1 용액을 넣고 37℃및 5% CO2 조건의 인큐베이터에서 2h 배양 후 450nm 파장에서 흡광도를 측정했으며, control의 상대적 정량값으로 그래프화하여 도 4에 나타내었다. 도 4에서 확인할 수 있듯이, 대식세포에 유산균발효호박손 추출물을 제시 된 농도로 처리 하였을 때 세포독성은 나타나지 않았다 (도 4). 따라서 유산균발효호박손의 독성으로 인한 파골세포 분화억제는 아닌 것을 확인하였다.
실험예 4 골다공증 모델 마우스에 대한 in vivo 골다공증 완화 효과 평가
실험예 4-1 OVX 모델 마우스 제작 및 유산균발효호박손추출물 경구투여
골다공증 마우스 모델은 5주령 ICR 암컷 마우스의 양측 난소를 결찰하고 절제하여 유도하였다 (Ovariectomized mice; OVX mice). 실험군은 각 군에 9마리씩 배정하였다. 난소절제를 하지 않은 Control 그룹은 Vehicle (PBS) 또는 유산균발효호박손 추출물을 800 mg/kg을 주 6회 경구투여 하였고, 난소를 절제한 OVX 그룹은 Vehicle (PBS) 또는 유산균발효호박손 추출물을 200 mg/kg, 400 mg/kg, 800 mg/kg을 주 6회 경구투여 하였다. 양성 대조군으로 Daidzein과 Estrodiol를 경구투여 하였다 (표 2).
그룹 분류 그룹 명 투여물질
Control 그룹 Group 1 (n=9) Vehicle; PBS
Control 그룹 Group 2 (n=9) 유산균발효호박손 추출물800 mg/kg
OVX 그룹 Group 3 (n=9) Vehicle; PBS
OVX 그룹 Group 4 (n=9) Daidzein
OVX 그룹 Group 5 (n=9) Estradiol
OVX 그룹 Group 6 (n=9) 유산균발효호박손 추출물 200 mg/kg
OVX 그룹 Group 7 (n=9) 유산균발효호박손 추출물 400 mg/kg
OVX 그룹 Group 8 (n=9) 유산균발효호박손 추출물 800 mg/kg
실험예 4-2 체중감소효과
여성 폐경기의 특징인 체중 증가는 체내 콜레스테롤이 Estrogen으로 전환율이 감소하면서 혈중 콜레스테롤이 증가하고, 지방조직의 증가로 인해 내장지방이 증가하게 된다. 골다공증 마우스 모델에서 몸무게를 비교 분석한 결과, 경구투여 3주째부터 Control 그룹에 비해서 OVX 그룹에서 통계적으로 유의적인 몸무게 증가가 나타났다. 도 5에서 확인할 수 있듯이, 경구투여 10주차에는 OVX 그룹에서 양성대조군인 Daidzein과 Estradiol, 유산균발효호박손 추출물을 경구투여한 모든 그룹에서 통계적으로 유의적인 몸무게 감소가 나타났다 (도 5). 이로부터 유산균발효호박손이 난소절제로 체중증가가 유도된 마우스에서 체중을 감소시킴을 확인할 수 있었다.
실험예 4-4 골밀도 분석
실험 종료 후, 각 실험군의 마우스 대퇴골을 적출하여 마이크로CT를 사용하여 골밀도(Bone Mineral Density; BMD), 골 체적(Bone Volume; BV), 골 두께(Trabecular Thickness; Tb.Th), 골 분리 정도(Trabecular Separation; Tb.Sp), 골의 개수(Trabecular Number; Tb.N), 총 부피당 골 부피(Trabecular Volume per Total Volume; Tb.V/TV)를 측정하였다. Control 그룹에 비해서 OVX 그룹에서 BMD, BV, Tb.N, Tb.V/TV 값이 통계적으로 유의적으로 감소했으며, Tb,Sp는 통계적으로 유의적으로 증가하였다. 반면에 Tb.Th는 두 그룹간 유의적인 차이는 없었다. 난소절제된 마우스에서 골다공증이 유도된 것을 확인하였다. 하지만 난소절제 그룹에서 Vehicle 그룹에 비해서 양성 대조군과 유산균발효호박손을 투여한 그룹에서 BMD와 BV, Tb.Th, Tb.Sp, Tb.N의 지표는 통계적인 유의성은 확인할 수 없었다. 하지만 Tb.V/TV은 Vehicle 그룹에 비해서 Daidzein과 유산균발효호박손 200 mg/kg, 400 mg/kg을 투여한 그룹에서 통계적으로 유의적인 증가를 확인하였다 (도 6).
실험예 5 SD-Rat을 이용한 단회 경구투여 독성시험
실험예 5-1 SD-Rat 준비
유산균발효호박손추출물을 Sprague-Dawley Rat(이하, SD-Rat)에 단회 경구투여 후 발현되는 급성독성을 조사하기 위해, 실험 대상이 될 SD-Rat을 다음과 같이 준비했다.
1) Sprague-Dawley/Crl:CD 약 5주령 Rat(오리엔트 바이오)를 스테인리스 사육 상자에 수용하여 사육했다.
2) 사육 환경은 온도 23±3℃, 상대습도 30 - 70%, 명암주기 12 hour light/12 hour dark cycle, 조도 150 - 300 Lux, 환기 시간당 10 - 20회로 자동으로 제어되는 환경에서 사육했다.
3) 이 중 질병이나 상처 등의 임상증상을 보이지 않고, 적절한 체중을 나타내는 동물을 선택하여 실험에 사용하였다.
실험예 5-2 유산균발효호박손추출물 단회 경구투여 독성 시험
실험예 5-1에서 준비한 SD-Rat을 각 실험군별로 나누어 유산균발효호박손추출물 단회 경구투여 독성 시험을 위한 시료를 경구 투여했다. 각 실험군별 조건은 표 3에 나타난 바와 같다.
Group Sex No. of Animals Volume
(mL/kg)		 Dose
(mg/kg)
Vehicle
Control		 Male
Female		 5
5		 10 0
T1 Male
Female		 5
5		 10 1000
T2 MaleFemale 5
5		 10 2000
T3 Male
Female		 5
5		 10 5000
별도의 조제 없이 0.9% 생리식염수를 부형제로 사용하였으며, 대조군은 생리식염수만 투여, 나머지 시료는 0.9% 생리식염수 및 유산균발효호박손추출물을 적정량 혼탁하여 투여하였다. 상기 조건으로 각 시료를 1회 투여한 후, 1) 사망률, 2) 빈사, 외관 및 행동 변화 등을 포함하는 일반증상, 3) 체중을 관찰했다. 상기 관찰 이후 SD-Rat을 희생시켜 부검하여 외관상 비정상 유무 및 두개강, 복강 및 흉강의 비정상 유무를 관찰했다.
실험 결과 1) 시험과정 중 사망 동물은 발생하지 않았으며, 2) 시료와 관련된 일반증상은 관찰되지 않았고, 3) 시료와 관련된 체중변화가 관찰되지 않았으며, 4) 부검 결과 시험물질과 관련된 육안적 소견을 관찰되지 않았다.

Claims (7)

  1. 다음을 포함하는 유산균발효호박손추출물 제조 방법:
    호박손을 용매로 추출하여 당 및 1-데하이드로디코니페릴 알코올(1-dehydrodiconiferyl alcohol)을 포함하는 제1 조성물을 수득하는 과정;
    상기 제1 조성물 내에 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) CVL-001 균주를 배양하여 제2 조성물을 수득하는 과정; 및
    상기 제2 조성물로부터 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) CVL-001 균체를 제거하여, 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) CVL-001 균의 발효 산물 및 1-데하이드로디코니페릴 알코올(1-dehydrodiconiferyl alcohol)을 포함하는 유산균발효호박손추출물을 수득하는 과정,
    이때, 상기 유산균발효호박손추출물은 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) CVL-001 균체를 포함하지 않음.
  2. 제1항에 있어서, 상기 용매는 증류수, 헥세인(hexane), EtOAc, 및 EtOH로 이뤄진 군에서 선택된 것인 유산균발효호박손추출물 제조 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 제1 조성물은 당을 12 내지 16 질량%로 포함하고 있는 유산균발효호박손추출물 제조 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 유산균발효호박손추출물은 1-데하이드로디코니페릴 알코올(1-dehydrodiconiferyl alcohol)을 32 내지 36 mg/kg으로 포함하는 유산균발효호박손추출물 제조 방법.
  5. 제1항의 유산균발효호박손추출물 제조 방법에 있어서, 상기 제1 조성물 내에 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) CVL-001 균주를 배양하여 제2 조성물을 수득하는 과정은 다음을 포함함:
    a) 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) CVL-001 균주 2.5% 내지 7.5%를 상기 제1 조성물에 접종하는 과정; 및
    b) 상기 a) 과정의 결과로 얻어진 제1 조성물을 32℃ 내지 42℃ 온도에서 12시간 내지 36시간 배양하는 과정.
  6. 제1항의 유산균발효호박손추출물 제조 방법에 있어서, 상기 제2 조성물로부터 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) CVL-001 균체를 제거하는 과정은 다음을 포함함:
    a) 상기 제2 조성물을 원심분리하는 과정; 및
    b) 상기 a) 과정의 결과로 얻어진 제2 조성물에서 상기 유산균발효호박손추출물을 분리하는 과정, 이때, 상기 유산균발효호박손추출물은 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) CVL-001 균체를 포함하지 않음.
  7. 제1항의 유산균발효호박손추출물 제조 방법으로 제조된 유산균발효호박손 추출물,
    이때, 상기 유산균발효호박손추출물은 32 내지 36 mg/kg의 1-데하이드로디코니페릴 알코올(1-dehydrodiconiferyl alcohol)을 포함함.

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