KR101366187B1

KR101366187B1 - 프로안토시아니딘 올리고머의 제조방법

Info

Publication number: KR101366187B1
Application number: KR1020077019349A
Authority: KR
Inventors: 타카시 다나카; 겐이치로 노나카; 이사오 코노; 하지메 후지이; 타카시 나카가와; 히로시 니시오카
Original assignee: 고쿠리츠다이가쿠호진 나가사키다이가쿠; 가부시키가이샤 아미노 압 가가쿠; 우사이엔 세이야꾸 가부시키가이샤
Priority date: 2005-02-25
Filing date: 2006-02-24
Publication date: 2014-02-21
Also published as: RU2435579C2; JP4941991B2; US20160151329A1; NZ560436A; JPWO2006090830A1; US20090047305A1; KR20070110040A; CA2599295A1; CN101133043A; DK1852430T3; CN101133043B; RU2007135274A; BRPI0607773A2; KR20130128017A; EP1852430A4; US10183007B2; CA2599295C; AU2006216182A1; PL1852430T3; EP1852430A1

Abstract

본 발명은 프로안토시아니딘 폴리머를 함유하는 식물원료 또는 그 추출물과, 플로로글루시놀 고리 또는 레조르시놀 고리구조를 가진 물질을 산성용액 속에서 가열하여 얻어지는 플로로/레조르시놀 고리구조를 가진 물질이 결합하여 저분자화된 프로안토시아니딘 올리고머를 주성분으로서 함유하는 조성물, 그 제조방법 및 그 조성물의 건강식품 및 의약품 등에 대한 용도에 관한 것이다. 본 발명에 의하면 식물원료로부터 고수량(高收量)으로 얻는 것이 곤란했던 생물활성을 가지며, 말단에 플로로글루시놀 고리 또는 레조르시놀 고리구조를 가진 물질이 결합한 생체에 흡수되는 정도까지 저분자화된 프로안토시아니딘 올리고머를 효율적으로 간단히 얻을 수 있다.

프로안토시아니딘 올리고머, 플로로글루시놀, 레조르시놀, 플로로/레조르시놀, 생물활성

Description

프로안토시아니딘 올리고머의 제조방법{METHOD OF PRODUCING PROANTHOCYANID IN OLIGOMER}

본 발명은 식물 속의 프로안토시아니딘 폴리머를 생체(의 장관(腸管)으로부터 용이)하게 흡수할 수 있을 정도까지 용이하게 저분자화 할 수 있는 프로안토시아니딘 올리고머의 제조방법에 관한 것이다.

더욱 상세하게는 프로안토시아니딘 폴리머를 함유하는 원료를 플로로글루시놀 고리 또는 레조르시놀 고리구조를 가진 물질과 산성용액 속에서 가열하여 얻어지는, 말단에 플로로글루시놀 고리 또는 레조르시놀 고리구조가 결합한 중합도가 2 내지 4인 프로안토시아니딘 올리고머를 함유하는 조성물, 그 제조방법, 그 조성물의 용도 및 플로로글루시놀 고리 또는 레조르시놀 고리가 결합한 신규 프로안토시아니딘 올리고머에 관한 것이다.

본 발명에 의하여 얻어지는 프로안토시아니딘 올리고머를 함유하는 조성물은 식품, 건강식품, 특정 보건용 식품, 화장품, 의약품에 사용할 수 있으며, 특히 활성산소종의 생성이 원인이 되는 생활습관병, 뇌질환의 치료 또는 예방 또는 노화예방을 위한 건강식품용 조성물 및 의약품 조성물로서 유용하다.

식생활의 변화에 의한 지방의 과다섭취나 환경의 변화, 오존층 파괴 등으로 인한 자외선에 대한 노출량의 증가, 환경오염물질의 증가 등에 의하여 고지혈증, 고콜레스테롤혈증, 고혈압, 당뇨병, 암 등의 이른바 생활습관병이 증가하고, 또한 알레르기, 치매 등의 뇌질환 환자도 증가하고 있다. 향후 고령화 사회의 진전과 함께 치매, 알츠하이머 증후군 등의 환자의 증가도 염려되지만 이들의 요인에 생체 내에서 생성되는 활성산소종의 관여가 지적되고 있다(Bioorganic & Medicinal Chemistry, 10(2002),2497-2509). 그러나 활성산소종의 완전한 생성억제 내지 제어기술은 개발되어 있지 않기 때문에 현재 상황으로는 생활습관병이나 뇌질환 등에 유효하고 확실한 예방·치료기술은 충분히 확립되어 있지 않다.

식물에 존재하여 생리활성을 나타내는 천연물질, 특히 폴리페놀류의 화합물에 최근 관심이 집중되고 있다. 폴리페놀류는 일반적으로 차, 야채, 과실, 허브류 등에 함유되어 식품 또는 기호품으로서 장기간 섭취경험이 있는, 부작용이 없는 치료·예방제로서 기대할 수 있는 것이다.

폴리페놀 화합물은 식물의 2차 대사산물이며, 식물계에 보편적이고 다량으로 존재하며, 다채로운 생리활성을 나타내는 것이 알려져 있으며, 예로부터는 약학, 식물화학 등의 분야에서, 최근에도 건강식품 분야에서 주목을 모으고 있다. 예를 들면 차의 폴리페놀, 특히 카테킨류는 항균, 항바이러스, 항돌연변이, 항산화, 혈압상승억제, 혈중 콜레스테롤 저하, 항우식증, 항알레르기, 장내 식물상 개선, 악취 제거 등 광범위한 생리활성을 가지고 있는 것이 알려져 있다.

폴리페놀 중에서도 프로안토시아니딘류는 폭넓은 식물에 함유되는 폴리페놀이다. 프로안토시아니딘류가 다채로운 생리활성을 나타내기 위해서는 프로안토시아니딘 화합물이 장관(腸管)을 통하여 생체 내에 흡수될 필요가 있다. 그러나 프로안토시아니딘류의 분자량은 일반적으로 수천 내지 수만의 배열이라고 일컬어지고 있다. 이와 같은 분자가 큰 물질은 장관을 통한 흡수는 곤란하며, 섭취하여도 생체에 흡수되지 않고 이용되지 않는 경우가 많다.

프로안토시아니딘은 플라반-3-올(카테킨이라고도 한다) 및 그들에게 갈산이 에스테르 결합한 것을 구성단위로 하는 2량체, 3량체, 4량체 또한 10량체 이상의 고분자 프로안토시아니딘, 프로델피니딘, 프로페랄고니딘 등 이들의 입체이성체의 총칭이며, 산처리에 의하여 안토시아니딘을 생성하는 폴리페놀 화합물군이다. 각 구성단위는 탄소골격의 4위와 8위 또는 4위와 6위 사이의 탄소탄소결합, 때로는 그 결합에 더하여 2위와 7위 산소와의 사이의 에테르 결합에 의하여 결합하고 있다.

프로안토시아니딘은 뛰어난 항산화작용(Arch. Biochem. Biophys., 374권, 347-355페이지, 2000년)을 가지며, 그 외에도 혈류개선, 항스트레스, 항고혈압, 항균, 항종양, 항백내장, 설사치료 등의 작용이 있어서 건강유지효과가 있는 천연유래물질로서 응용되고 있다.

프로안토시아니딘은 소나무 껍질, 미숙 사과 과실, 포도씨 등으로부터 혼합물로서 분리되어 음료, 과자류, 건강식품, 화장품, 육모제 등에 배합되어 시판되기에 이르고 있다.

프로안토시아니딘을 함유하는 많은 식물에서는 중합도가 큰 것에서부터 작은 것까지 다양한 프로안토시아니딘이 혼합물로서 함유되어 있으며, 감, 바나나, 모과 등과 같이 특히 중합도가 큰 것을 주성분으로 하는 식물이 많다. 그러나 프로안토시아니딘 중에서도 중합도가 큰 프로안토시아니딘 폴리머는 장으로부터의 흡수가 나쁘기 때문에 약리활성의 점에서 중합도 2 내지 4의 프로안토시아니딘 올리고머에 뒤지고, 또한 떫은 맛이 강하고, 수용성이 부족하므로 식품 등에 응용할 때에는 제거하는 것이 바람직하다(Free Radical Res., 29권, 351-358페이지, 1998년). 이와 같은 점에서 중합도가 2 내지 4인 프로안토시아니딘 올리고머에 특히 뛰어난 건강유지효과가 있다고 주목되어 소나무 껍질로부터 유래된 음료, 건강식품으로서 사용되고 있다.

식물 엑기스로부터 프로안토시아니딘만을 얻기 위해서는 흡착법(예를 들면 일본국 특허문헌 특개평6-49053호 공보) 등이 사용되지만, 중합도가 다른 것을 분리하는 것은 곤란하다. 중합도가 2 내지 4의 프로안토시아니딘 올리고머만을 얻기 위해서는 아세트산에틸 용매 분배법, 아세트산메틸 고상추출법이나 크로마토그래피법(국제공개 제00/64883호 팜플렛), 키친흡착법(국제공개 제03/091237호 팜플렛) 등에 의하여 저분자 프로안토시아니딘만을 추출분리하는 방법이 채택되고 있다. 그러나 이들 방법으로는 다량의 고분자 프로안토시아니딘 폴리머가 폐기되므로 수확량이 적다.

프로안토시아니딘 폴리머를 함유하는 식물원료로부터 중합도 2 내지 4의 프로안토시아니딘 올리고머를 분리하는 방식을 대신하는 방법으로서 본 발명자들은 먼저 프로안토시아니딘 폴리머 함유 원료를 시스테인 등의 SH 함유 화합물과 산성용액 속에서 반응시켜서 프로안토시아니딘 올리고머를 저분자량화하는 방법을 제안하고 있다(국제공개 제2004/103988호 팜플렛). 이 방법에 의하면 시스테인이 결합하여 저분자량화한 체내흡수성이 뛰어난 프로안토시아니딘 올리고머가 얻어진다. 이 시스테인이 결합한 프로안토시아니딘 올리고머는 독성이 없으며, 안전하게 사용할 수 있음이 확인되고 있으나 현재 국가(일본을 포함한다)에 따라서는 천연화학물질이 아닌 시스테인 등이 결합된 프로안토시아니딘의 건강식품 등에의 이용에 대하여는 당국의 허가·인가를 받기 위한 엄격한 절차를 요한다는 문제가 있다.

발명의 개시

발명이 해결하려고 하는 과제

본 발명은 프로안토시아니딘 폴리머로서 널리 천연적으로 분포되어 있으나 그 올리고머로서는 천연유래원료가 한정되어 있던 프로안토시아니딘 올리고머를 프로안토시아니딘 폴리머, 이들을 함유하는 식물 또는 그 추출물을 원료로 하여 플로로글루시놀 고리 또는 레조르시놀 고리구조를 가진 물질과 결합시켜서 저분자화하는 간편하고 효율적인 방법을 제공하는 것을 과제로 한다.

과제를 해결하기 위한 수단

본 발명자들은 상기 과제를 감안하여 예의연구한 결과 감(떫은감), 바나나, 포도, 소나무, 노송나무, 녹나무, 소귀나무, 모과, 레이시, 양매피, 계피 등의 프로안토시아니딘 폴리머를 함유하는 과실, 과피, 수피, 잎 등 또는 그 추출물(엑기스)을 저분자량의 카테킨을 다량으로 함유하는 녹차 또는 신선차 잎과 함께 산성 수용액 속에서 은근하게 2~3시간 끓임으로써 프로안토시아니딘이 단편화되고 저분자화함과 동시에 말단에 카테킨이 결합한 프로안토시아니딘 올리고머로 변환되는 것을 발견하였다. 또한 본 발명자들은 녹차 또는 신선차 잎을 대신하여 플로로글루시놀 고리 또는 레조르시놀 고리구조를 가진 물질 및 그 물질을 함유하는 다른 식물원료(포도씨, 포도 과피 등) 또는 그 추출물을 사용함으로써 마찬가지로 프로안토시아니딘이 단편화되고 저분자화하여 플로로글루시놀 고리 또는 레조르시놀 고리구조를 가진 물질이 결합한 프로안토시아니딘 올리고머로 변환되는 것을 발견하고 이들의 식견을 토대로 하여 본 발명에 도달하였다.

즉 본 발명은 아래의 1 내지 14에 기재한 바와 같이 프로안토시아니딘 폴리머를 함유하는 식물 또는 그 엑기스를 녹차 또는 신선차 잎과 산성 수용액 속에서 가열함으로써 말단에 플로로글루시놀 고리 또는 레조르시놀 고리구조를 가진 물질이 결합한 프로안토시아니딘 올리고머를 주성분으로서 함유하는 조성물(1 내지 5), 그 제조방법(6 내지 9), 그 조성물의 용도(10 내지 12) 및 신규의 프로안토시아니딘 올리고머(13 내지 14)에 관한 것이다.

1. 프로안토시아니딘 폴리머를 함유하는 식물원료 또는 그 추출물과, 플로로글루시놀 고리 또는 레조르시놀 고리구조를 가진 물질, 이들을 함유하는 식물 또는 그 추출물을 산성용액 속에서 가열하여 얻어지는, 말단에 플로로글루시놀 고리 또는 레조르시놀 고리구조를 가진 물질이 결합하여 저분자화된 프로안토시아니딘 올리고머를 주성분으로서 함유하는 조성물.

2. 제1항에 있어서, 프로안토시아니딘 폴리머를 함유하는 식물이 포도, 소나무, 노송나무, 녹나무, 소귀나무, 카카오, 감, 바나나, 모과, 사과, 산사나무, 레이시, 양매피 및 계피로부터 선택되는 적어도 1종류인 것을 특징으로 하는 프로안토시아니딘 올리고머를 주성분으로서 함유하는 조성물.

3. 제1항에 있어서, 플로로글루시놀 고리 또는 레조르시놀 고리구조를 가진 물질이 레스베라토롤, 플로로글루시놀, 플라보노이드 및 플라바노이드(카테킨의 카로일에스테르)로부터 선택되는 적어도 1종류인 것을 특징으로 하는 프로안토시아니딘 올리고머를 주성분으로서 함유하는 조성물.

4. 제1항에 있어서, 플로로글루시놀 고리 또는 레조르시놀 고리구조를 가진 물질을 함유하는 식물이 녹차, 신선차(新鮮茶) 잎, 포도씨, 포도 종피(種皮), 아선약, 홍조류 및 이들의 추출물로부터 선택되는 적어도 1종류인 것을 특징으로 하는 프로안토시아니딘 올리고머를 주성분으로서 함유하는 조성물.

5. 제1항에 있어서, 중합도가 2 내지 4인 프로안토시아니딘 올리고머를 주성분으로서 함유하는 것을 특징으로 하는 조성물.

6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 프로안토시아니딘 폴리머를 함유하는 식물원료 또는 그 추출물과, 플로로글루시놀 고리 또는 레조르시놀 고리구조를 가진 물질, 이들을 함유하는 식물 또는 그 추출물을 산성용액 속에서 가열하고, 말단에 플로로글루시놀 고리 또는 레조르시놀 고리구조를 가진 물질이 결합하여 저분자화된 프로안토시아니딘 올리고머를 함유하는 반응액을 농축, 건조시키는 것을 특징으로 하는 프로안토시아니딘 올리고머를 주성분으로서 함유하는 조성물의 제조방법.

7. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 프로안토시아니딘 폴리머를 함유하는 식물원료 또는 그 추출물과, 플로로글루시놀 고리 또는 레조르시놀 고리구조를 가진 물질, 이들을 함유하는 식물 또는 그 추출물을 산성용액 속에서 가열하여 얻어지는, 말단에 플로로글루시놀 고리 또는 레조르시놀 고리구조를 가진 물질이 결합하여 저분자화된 프로안토시아니딘 올리고머를 함유하는 반응액을 농축하여 분획(分畵)처리하는 것을 특징으로 하는 프로안토시아니딘 올리고머를 주성분으로서 함유하는 조성물의 제조방법.

8. 제6항 또는 제7항에 있어서, 무기산, 유기산 또는 이들 모두를 이용하여 산성조건으로 하는 것을 특징으로 하는 프로안토시아니딘 올리고머를 주요성분으로서 함유하는 조성물의 제조방법.

9. 제8항에 있어서, 염산, 황산, 질산, 아세트산, 구연산, 아스코르빈산 및 사과산으로부터 선택되는 적어도 1종류를 사용하는 것을 특징으로 하는 프로안토시아니딘 올리고머를 주요성분으로서 함유하는 조성물의 제조방법.

10. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 활성산소종의 생성이 원인이 되는 생활습관병, 뇌질환의 치료 또는 예방 또는 노화예방을 위한 건강식품용인 것을 특징으로 하는 프로안토시아니딘 올리고머를 함유하는 조성물.

11. 제10항에 있어서, 활성산소종의 생성이 원인이 되는 생활습관병, 뇌질환의 치료 또는 예방 또는 노화예방을 위한 의약품용인 것을 특징으로 하는 프로안토시아니딘 올리고머를 함유하는 조성물.

12. 제10항에 있어서, 활성산소종의 생성이 원인이 되는 노화예방을 위한 화장품용인 것을 특징으로 하는 프로안토시아니딘 올리고머를 함유하는 조성물.

13. 하기의 식(1)

(식 중에서 n은 0 또는 1 내지 2의 정수(整數)이다)

로 표시되는 프로안토시아니딘 올리고머.

14. 하기의 식(2)

(식 중에서 n은 0 또는 1 내지 2의 정수(整數)이다)

로 표시되는 프로안토시아니딘 올리고머.

발명의 효과

본 발명은 프로안토시아니딘 폴리머를 함유하는 식물원료 또는 그 추출물과, 플로로글루시놀 고리 또는 레조르시놀 고리구조를 가진 물질, 이것을 함유하는 식물 또는 그 추출물을 산성용액 속에서 가열한 반응액을 농축, 건조시켜 얻어지는, 말단에 플로로글루시놀 고리 또는 레조르시놀 고리구조를 가진 물질이 결합하여 저분자화된 프로안토시아니딘 올리고머를 주성분으로서 함유하는 조성물 및 그 제조방법을 제공한 것이다. 본 발명에 의하면 프로안토시아니딘 폴리머 함유원료로부터 활성산소종의 생성이 원료가 되는 생활습관병, 뇌질환의 치료 또는 예방, 또는 노화예방을 위한 건강식품용 조성물 및 의약품 조성물 등으로서 유용한 말단에 플로 로글루시놀 고리 또는 레조르시놀 고리구조를 가진 물질이 결합하여 저분자화된 프로안토시아니딘 올리고머를 효율적으로 제조할 수 있다.

발명을 실시하기 위한 최선의 형태

아래에 본 발명을 상세하게 설명한다.

본 발명의 방법으로 프로안토시아니딘 올리고머를 제조하는 원료는 프로안토시아니딘 폴리머를 함유하는 식물(과실, 과피, 수피, 잎 등) 또는 그 추출물이다.

여기서 프로안토시아니딘 폴리머를 함유하는 식물로서는 떫은감, 바나나, 사과, 배, 포도, 딸기, 아보카도, 월귤, 산사나무, 연근, 모밀, 레이시, 양매피 등의 과채류, 허브·스파이스류, 목재, 계피, 소나무 수피 등을 들 수 있다. 이들 중에서도 떫은감, 바나나, 포도, 소나무, 노송나무, 녹나무, 소귀나무, 모과, 레이시 및 양매피가 바람직하게 이용된다.

본 발명에서는 이들의 프로안토시아니딘 폴리머를 함유하는 식물을 얇게 썰기(裁斷)를 한 것, 파쇄한 것이 사용되는 외에 이들을 수계용매 속에서 가열하여 농축/건조시킨 추출물이 이용된다.

본 발명의 반응에서 이용되는 플로로글루시놀 고리 또는 레조르시놀 고리구조를 가진 물질로서는 레스베라토롤, 플로로글루시놀, 플라보노이드 및 플라바노이드(카테킨의 갈로일에스테르 등) 또는 이들을 함유하는 식물, 추출물을 함유하는 것이면 특별히 한정되지 않는다. 구체적인 예로서는 녹차, 신선차 잎, 포도씨, 포도 종피, 아선약, 홍조류 및 이들의 추출물을 들 수 있다. 이들 중에서도 본 발명 으로 제조하는 프로안토시아니딘 올리고머의 주된 용도가 건강식품, 특정보건용 식품소재, 화장품, 의약품인 것, 특히 건강식품 및 의약품에 사용하는 것임을 고려하면 예로부터 음용으로 제공되어 안전하다는 것이 확인되어 있는 포도씨, 포도 종피, 녹차 또는 신선차 잎, 및 그 추출물이 바람직하다.

반응에서 사용하는 프로안토시아니딘 폴리머 함유 식물원료와 플로로글루시놀 고리 또는 레조르시놀 고리구조를 가진 물질의 비율은 임의이지만, 저분자량화한 프로안토시아니딘 폴리머 단편에 결합하기에 충분한 양이 바람직하다. 플로로글루시놀 고리 또는 레조르시놀 고리구조를 가진 물질의 양을 적게 한 경우, 고분자량의 프로안토시아니딘이 잔류할 가능성이 있으나 그 경우는 컬럼 크로마토그래피에 의하여 잔류 고분자량 프로안토시아니딘을 용이하게 제거하는 것이 가능하다.

프로안토시아니딘류를 함유하는 식물 또는 그 추출물에 함유되는 프로안토시아니딘과, 플로로글루시놀 고리 또는 레조르시놀 고리구조를 가진 물질(이하 단순히 「플로로/레조르시놀 고리 함유물질」이라고 하는 경우도 있다)과의 반응은 용매 속에서 가열하여 이루어진다.

반응용매로서는 물, 메탄올, 에탄올 등의 1종류 또는 2종류 이상의 혼합물이 이용되지만, 식품, 의약품 등의 용도를 고려하면 물, 에탄올이 바람직하다.

반응은 산성조건에서 실시하는 것이 바람직하다. 산으로서는 염산, 황산, 질산 등의 무기산류 또는 아세트산, 구연산, 아스코르빈산, 사과산 등의 유기산류로부터 선택되는 적당한 산이 0.1N 내지 1.0N 정도, 바람직하게는 0.5N 정도의 농 도에서 이용된다.

프로안토시아니딘류를 함유하는 식물 또는 식물추출물과 플로로/레조르시놀 고리 함유물질과의 반응은 실온 내지 100℃에서 0.5시간 내지 1주간, 바람직하게는 90 내지 100℃에서 1 내지 4시간 실시한다.

반응 후의 반응액은 여과 등의 방법에 의하여 고형분을 제거분액하고, 프로안토시아니딘 올리고머를 함유하는 추출액(액체)을 농축건조시킨 농축액, 건조분말, 겔 형상물, 고형성형물 등 다양한 형상으로 사용가능하지만, 반응 후의 반응액을 농축, 건조시키거나 또는 반응액을 농축하여 분획처리해도 되며, 이들 방법에 의하여 목적물을 반응액으로부터 분리농축하고, 상법(常法)에 의하여 정제해도 된다. 예를 들면 반응액으로부터 잔사(殘渣)를 여과분리하고, 여과액을 농축한 후 그 추출 엑기스를 막처리(한외여과(限外濾過), 역침투 등), 흡착제를 처리하는 등에 의하여 목적물을 분리농축하여 농축액의 정제를 실시할 수 있다.

흡착제로서는 스틸렌-디비닐벤젠계 흡착제, 메타크릴산계 흡착제, 친수성 비닐폴리머, 수식(修飾) 덱스트랑겔, 폴리아크릴아미드겔, 역상계(逆相系) 실리카겔, 이온교환수지 등이 사용된다. 이들 흡착제를 사용할 경우에는 이것에 흡착되는 획분(畵分, 이하 흡착획분이라 한다))에 플로로/레조르시놀 고리 함유물질과 반응하여 저분자량화된 프로안토시아니딘 올리고머가 함유되어 있다. 이 흡착획분을 함수 알콜, 알콜, 아세톤 등으로 용출시킴으로써 다양한 분자량의 성분을 얻을 수 있다. 이 때 방향족계 합성흡착제를 사용하는 컬럼 크로마토그래피에 의하여 목적한 중합도 2 내지 4의 프로안토시아니딘 올리고머를 반응액으로부터 분리하면 분자량이 큰 프로안토시아니딘을 가려낼 수 있으며, 용출액의 농축도 용이하므로 바람직하다. 방향족계 합성흡착제로서는 세퍼비즈 등의 가교 스틸렌계의 다공질 중합체가 바람직하다.

이와 같이 하여 얻어지는 프로안토시아니딘 올리고머는 ¹H-NMR, UV, HPLC, GPC 및 TLC를 사용한 측정결과로부터 전형적인 프로안토시아니딘 올리고머의 화학구조식이 아래의 일반식 (1) 및 (2)로 표시되는 프로안토시아니딘의 2량체 내지 4량체를 포함하는 것이 확인되어 있다.

(식 중에서 R₁은 수소원자 또는 수산기를 나타내며, R₂는 수소원자 또는 갈로일기

를 나타내며, n은 0 또는 1 내지 2의 정수(整數)를 나타낸다).

상기 일반식 (1) 및 (2)에서는 4위와 8위 사이에서 결합하는 구조의 것만을 도시하였으나, 4위와 6위 사이에서 결합하는 것, 2-O-7결합하는 것도 존재한다.

본 발명에 관한 프로안토시아니딘 폴리머와 플로로/레조르시놀 고리 함유물질과의 반응에 의하여 생체 내에 흡수할 수 없는 고분자량(중합도로 5정도 이상)의 프로안토시아니딘 폴리머를 용이하게 단편화하고, 흡수가능한 저분자량체로 하는 동시에 플로로/레조르시놀 고리와 결합한 분자량이 약 1200 이하의 2량체로부터 4량체 정도의 프로안토시아니딘 올리고머를 주요 성분으로 하는 조성물이 얻어진다.

본 발명에서 얻어지는 말단에 플로로/레조르시놀 고리구조를 가진 물질이 결합한 프로안토시아니딘 올리고머는 DPPH, TEAC, FRAP의 각 항산화 시험에서 강한 항산화활성을 나타내며, 다른 폴리페놀 소재와 비교하여 높은 항산화능을 가진다. 또한 생활습관병의 동물 모델실험이나 사람에 대한 항산화 지표의 모니터 시험에서 항산화 효과에 의한다고 판단되는 데이터도 얻어지고 있다.

따라서 본 발명의 프로안토시아니딘 올리고머를 유효성분으로 하는 제품은 생체의 과산화지질 생성억제작용을 가질 뿐만 아니라 활성산소에 의하여 일어나는 산화장해로 인한 질병에 효과가 있으므로 과산화지질 또는 활성산소생성으로 인한 각종 장기의 장애, 노화방지효과를 가지며, 그것에 의하여 발생하는 각종 질병의 치료 및 방지에 유효하다. 또한 뇌의 노화가 원인이라고 생각되는 치매 등의 뇌기능 장애의 억제·방지·치료에도 유효하다고 생각된다. 동시에 뇌기능 개선에 의하여 학습기능의 향상, 초조감 감소, 불면증 해소, 침착성 회복 등의 효과도 기대할 수 있다. 그러므로 본 발명의 프로안토시아니딘 올리고머를 유효성분으로 하는 제품은 건강식품, 의약 및 화장품 등으로서 이용할 수 있다.

본 발명의 프로안토시아니딘 올리고머를 유효성분으로 하는 제품에는 독성은 전혀 확인되지 않았으며, 충분히 안전하게 사용할 수 있다. 이들 제품은 경구 또는 비경구로 사용되나 경구적으로 사용될 경우의 투여량은 연령, 체중, 증상, 목적하는 치료효과, 투여방법 등에 따라 다르지만 통상적으로 성인 한 사람당 1회에 50 내지 1000㎎의 범위이다. 본 발명의 제품을 경구투여할 때에는 경구투여로서 일반적으로 정제, 환제, 캡슐제, 산제(散劑), 과립제, 시럽제 등, 비경구투여로서 주사제, 도포제 등으로서 이용된다. 조립(造粒), 정제화 또는 시럽제로 할 때에는 필요에 따라 적당한 보조자재(전분류, 덱스트린, 감미제류, 색소, 향료 등)를 사용할 수도 있다.

도1은 실시예3에서 노송나무 수피와 녹차를 산성조건 하에서 가열처리한 것에 대한 HPLC 크로마토그램 도(A), 노송나무 수피 및 녹차를 각각 단독으로 마찬가지로 가열처리한 것에 대한 HPLC 크로마토그램 도(B) 및 (C)이다.

도2는 실시예3에서 노송나무 수피와 녹차를 산성조건 하 가열처리함으로써 원료의 녹차나 노송나무 수피에 없는 새로운 프로안토시아니딘류가 생성되고 있는 것을 도시하는 실시예4의 TLC 사진이다. 도면 중 A는 녹차처리 후의 아세트산에틸층, B는 노송나무 수피처리 후의 아세트산에틸층, C는 노송나무 수피와 녹차처리 아세트산에틸층에 대한 결과이며, 스포트(M)는 갈로일화 되어있지 않은 단량체 유래, MG는 갈로일화된 단량체 유래, D는 주로 갈로일화된 프로안토시아니딘 2량체 유래, T는 주로 갈로일화된 프로안토시아니딘 3량체 유래의 것이다.

도3은 바나나 과피 추출물과 녹차를 산성조건 하에서 가열처리함으로써 원료녹차나 바나나 과피에 없는 새로운 프로안토시아니딘류가 생성되고 있는 것을 도시하는 실시예6의 TLC 사진이다. 도면 중 A는 녹차 단독, B는 바나나 과피 추출물 단독, C는 바나나 과피 추출액과 녹차를 처리한 것이다.

도4는 감 미숙과실과 녹차를 산성조건 하에서 가열처리함으로써 원료의 녹차나 감에 없는 새로운 프로안토시아니딘류가 생성되고 있는 것을 도시하는 실시예5의 TLC 사진이다. 도면 중 A는 녹차 단독, B는 감 미숙과실 단독, C는 감 미숙과실과 녹차를 처리한 것, D는 감 미숙과실과 녹차와의 처리물(추출물)을 세퍼비즈 SP825를 거친 흡착부를 물 에탄올로 용출한 것에 대한 결과이며, 스포트M, MG, D 및 T는 도2와 마찬가지이다.

도5는 실시예5의 감 미숙과실과 녹차와의 처리물(추출액)을 세퍼비즈 SP825를 거친 흡착부를 물 에탄올로 용출한 것에 대한 것의 순상(順相) HPLC의 분석결과(도5(A)) 및 그 비교예인 노송나무 프로안토시아니딘 노송나무 프로안토시아니딘의 순상 HPLC의 분석결과(도5(B))이다.

도6은 실시예6에서 감 미숙과실과 녹차를 산성조건 하에서 가열처리하여 얻어진 카테킨류와 프로안토시아니딘류를 세퍼덱스 LH-20 컬럼 크로마토로 분리하여 얻어진 각 분류(分溜, Fr1 내지 Fr8) 및 분리 전의 혼합물(E)의 TLC의 도면이다.

도7은 실시예7에서 얻은 발명물질A에 대하여 DPPH의 라디칼의 소거작용을 도시한다.

도8은 실시예8에서 얻은 발명물질B에 대하여 DPPH의 라디칼의 소거작용을 도시한다.

도9는 실시예9 내지 11에서 얻은 발명물질C 내지 E에 대하여 DPPH의 라디칼의 소거작용을 도시한다.

도10은 실시예7에서 얻은 발명물질A에 대한 TEAC법에 의한 항산화능 평가시험 결과를 도시한다.

도11은 실시예8에서 얻은 발명물질B에 대한 TEAC법에 의한 항산화능 평가시험 결과를 도시한다.

도12는 실시예9 내지 11에서 얻은 발명물질C 내지 E에 대한 TEAC법에 의한 항산화능 평가시험 결과를 도시한다.

도13은 실시예12에서 얻은 발명물질F에 대하여 UV 보호효과시험 결과를 도시한다.

도14는 실시예12에서 얻은 발명물질F에 대하여 TEAC법에 의한 항산화능 평가시험 결과를 도시한다.

도15는 실시예12에서 얻은 발명물질F에 대하여 항산화능 평가시험에 있어서 의 혈청 속 LPO의 측정결과를 도시한다.

도16은 실시예12에서 얻은 발명물질F에 대하여 항산화능 평가시험에 있어서의 혈청 속 GOT 및 GPT의 측정결과를 도시한다.

도17은 실시예12에서 얻은 발명물질F에 대하여 항산화능 평가시험에 있어서의 간장(肝臟) 속 LPO의 측정결과를 도시한다.

이하 실시예를 들어서 본 발명을 구체적으로 설명하겠으나 본 발명은 이들 실시예에 의하여 어떠한 한정을 받는 것은 아니다.

실시예1

프로안토시아니딘 B4(100㎎)와 에피갈로카테킨3-O-갈레이트(100㎎)를 2% 구 연산 수용액 40mL에 용해시키고 100℃에서 2시간 가열하였다. 방랭(放冷) 후 반응액을 MCI-gel CHP20P(함수 메탄올) 컬럼 크로마토, 이어서 세퍼덱스 LH-20(60% 메탄올) 컬럼 크로마토로 분리하고, 원료의 프로시아니딘 B4(10㎎), 에피갈로카테킨3-O-갈레이트(59.2㎎)를 회수하는 동시에 새로 생성된 (-)-에피카테킨(25.4㎎), 및 (+)-카테킨-(4β→8)-(-)-에피갈로카테킨-3-O-갈레이트를 17.3㎎ 얻었다. 생성된 카테킨과 프로안토시아니딘은 ¹H-NMR 스펙트럼을 문헌에 기재한 것과 비교함으로써 동정하였다(상기 구조식 참조).

실시예2

빈랑자로부터 추출한 프로안토시아니딘 폴리머 0.5g과 (-)-에피갈로카테킨-3-O-갈레이트(0.5g)를 2% 구연산 수용액 200mL에 용해시키고, 3시간 95℃로 가열하였다. 반응액은 실시예1과 동일한 컬럼 크로마토에 의하여 분리하고, 에피갈로카테킨-3-O-갈레이트(403㎎), 및 새로 생성된 (+)-카테킨(48.6㎎)과 프로안토시아니딘인 (-)-에피카테킨-(4β→8)-(-)-에피갈로카테킨-3-O-갈레이트(148.3㎎)를 얻었다(상기 구조식 참조).

실시예3

카테킨·프로안토시아니딘 혼합물을 함유하는 노송나무 수피 5g과 녹차 1g을 2% 구연산 수용액 100mL에 용해시키고 3시간 95℃로 가열하였다. 식힌 후 에탄올을 100mL 첨가하여 흡인여과하였다. 여과액을 HPLC로 분석하였다. HPLC 조건은 아래와 같다.

컬럼:Cosmosil 5C18 ARII(4.6×250㎚),

컬럼 온도:35℃,

이동상: A:50mM 인산, B:CH₃CN,

B4%로부터 30%(39분간), 30%로부터 75%(15분간),

유속:0.8mL/min,

검출:포토 다이오드 어레이 검출.

노송나무 수피 5g과 녹차 1g을 각각 따로 같은 조건에서 구연산 수용액 속에 서 가열처리 후 추출하고, 마찬가지로 HPLC 분석하였다(도1의 HPLC 참조). 노송나무 수피와 녹차를 구연산 수용액 처리한 추출액에는 노송나무 수피나 녹차에는 없는 수많은 새로운 화합물에서 유래된 피크가 검출되었다. 이들 화합물이 모두 프로안토시아니딘류라는 것은 각 피크의 자외흡수 스펙트럼을 실시예1 및 2에서 얻어진 것과 비교함으로써 측정하였다.

실시예3에서 얻은 노송나무 수피와 녹차를 구연산 수용액으로 가열하여 얻은 추출액을 농축하고, 물 50mL와 아세트산에틸 50mL로 용매분배를 5회 반복하였다. 얻어진 아세트산에틸층은 모두 농축하고, 아세트산에틸 추출물 0.67g을 얻었다. 노송나무 수피와 녹차 각각 따로 처리하여 얻은 추출액에 대하여도 마찬가지로 용매분배하여 노송나무 수피로부터 아세트산에틸 추출물을 0.30g, 녹차로부터 아세트산에틸 추출물을 0.37g 얻었다. 3개의 아세트산에틸 추출물에 대하여 TLC로 분석하였다. TLC의 조건은 아래와 같다.

실리카겔(Silica gel) 60,

전개용매:벤젠-포름산에틸-포름산(1:7:1, v:v),

발색:바닐린염산 시약(도2의 TLC 참조).

바닐린염산 시약은 카테킨 및 프로안토시아니딘류의 검출시약이며, 이들이 존재하면 특유의 적색을 띤다. 노송나무 수피와 녹차를 구연산 수용액 처리한 것에는 새로 프로안토시아니딘 2량체, 3량체로부터 유래된 스포트가 확인되었다.

실시예3에서 아세트산에틸 분배한 후에 남은 수층(水層)에는 아세트산에틸층으로 이행하는 것에 비하여 분자량이 큰 프로안토시아니딘이 잔류해 있다. 그래서 수층에 함유되는 프로안토시아니딘류의 아세틸화물에 대하여 겔퍼미에이션 크로마토그래피 분석에 의한 분자량의 비교를 하였다. 노송나무 수피와 녹차를 구연산 처리한 후의 수층과, 노송나무 수피의 수층을 농축건고(濃縮乾固)하고, 무수아세트산-피리딘에 용해 후 실온에서 8시간 방치하였다. 반응액은 각각 얼음물 속에 붓고, 석출(析出)된 불용물을 걸러서 진공건조시켰다. 얻어진 아세틸화체에 대하여 TSK-GEL G4000H6 컬럼, 용매 테트라하이드로푸란, 검출 254㎚ 자외흡수의 조건으로 분석하고, 벤젠 및 분자량 4000, 25000, 50000의 폴리스틸렌을 이용하여 작성한 교정곡선을 바탕으로 하여 분자량을 측정한 바 노송나무 수피와 녹차를 구연산 처리한 후의 수층에 함유되는 프로안토시아니딘의 최정점 분자량은 약 1300, 노송나무 수피의 수층에 함유되는 프로안토시아니딘의 최정점 분자량은 약 2000으로 되었다. 녹차를 첨가하여 구연산 처리함으로써 분자량이 작아지고 있는 것을 알 수 있었다.

실시예4

신선한 바나나 과피 100g을 아세톤 물혼합액(4:1, v:v) 300mL와 함께 웨어링 블랜더로 파쇄하고, 흡인여과하였다. 여과액은 증발기(evaporator)로 아세톤을 유거(留去)하여 수용액으로 만들고, 불용액을 걸러내어, 여과액은 물을 첨가하여 전량을 200mL로 만들었다. 따로 녹차 3g을 물 300mL로 자비(煮沸)추출하고, 흡인여과한 후 여과액은 물을 첨가하여 300mL로 만들었다. 바나나 추출액 100mL(바나나 과피 50g에 상당)와 녹차 추출액 100mL(녹차 1g에 상당)를 혼합하여, 구연산 2g을 용해한 후 3시간 95℃로 가열하였다. 식힌 후 아세트산에틸로 3회 추출하여 아세트산 에틸 추출물 0.312g을 얻었다. 마찬가지로 바나나 추출액과 녹차 추출액을 각각 아세트산에틸로 분배하여 각각 아세트산에틸 추출물 0.015g 및 0.18g을 얻었다. 얻어진 아세트산에틸 추출물은 TLC로 분석하였다(도3의 TLC 참조). 바나나 과피 추출물의 프로안토시아니딘은 고분자량이므로 TLC 상에서는 원점만이 바닐린염산 시약에 양성이지만, 바나나 과피 추출액과 녹차 추출액을 구연산 처리한 것에는 원래의 추출액에는 없는 새로운 프로안토시아니딘 2량체, 3량체로부터 유래된 스포트가 확인되었다.

실시예5

떫은감에 대량으로 함유되는 떫은맛 성분은 차의 4종류의 카테킨류를 구성성분으로 하는 분자량이 매우 큰 프로안토시아니딘이다(Tanaka et al., J. Chem. Soc. Perkin Trans 1, 1013-1022, 1994). 신선한 감 미숙과실 100g을 1% 구연산 수용액 500mL와 함께 웨어링 블랜더로 파쇄하고, 다시 1% 구연산 수용액 500mL와 녹차 20g을 합쳐서 3시간 동안 은근하게 끓였다. 반응액은 식기 전에 흡인여과하고, 여과액 950mL을 얻었다. 여과액의 절반 475mL은 아세트산에틸로 4회 분배하고, 아세트산에틸층 2.56g을 얻었다. 나머지 절반 475mL는 세퍼비즈 SP850(200mL)의 컬럼에 넣고, 물로 세정하여 당분을 씻어낸 후 흡착된 폴리페놀류를 40% 내지 60% 에탄올로 용출하였다. 용출액을 농축함으로써 카테킨 및 프로안토시아니딘 함유 획분 3.26g을 얻었다. 한편 감 미숙과실 200g을 아세톤과 물의 혼합액(4:1, v:v) 900mL와 함께 파쇄하여 추출하고, 여과액인 아세톤을 완전히 유거하여 얻은 추출수용액을 세퍼비즈 SP850(200mL)의 컬럼에 넣은 바 대부분의 감 프로안토시아니딘(감 탄닌)은 흡착되지 않고 물만으로 용출되었다. 컬럼에 흡착되어 함수 알콜로 용출된 폴리페놀 획분은 겨우 0.76g이었다. 감의 프로안토시아니딘은 분자량이 크며, 대략 1.38×10⁴로 추정되고 있으며(Mastuo, T. et al., Agric. Biol. Chem., 42, 1637-1643, 1978), 세퍼비즈의 작은 구멍(細孔)에 들어갈 수 없다. 한편 녹차로 처리한 감 프로안토시아니딘은 단편화되어 분자량이 적어져 있으므로 세퍼비즈의 작은 구멍에 들어가서 흡착된다. 본 실험에 의하여 세퍼비즈에 따라 분자량이 큰 프로안토시아니딘을 가려낼 수 있음을 알 수 있었다. 본 실험에서 얻어진 녹차와 구연산으로 처리한 감의 아세트산에틸 추출물과 세퍼비즈 SP825 흡착부를 녹차 추출액 아세트산에틸 추출물 및, 감 미숙과실 함수 아세톤 추출물과 TLC에 의하여 비교하였다(도4의 TLC 참조). 세퍼비즈 SP825 흡착부에 대하여는 순상(順相) HPLC에서의 분석을 하지 않는, 노송나무 열수추출물을 다이아이온 HP20SS 컬럼 크로마토로 분리하여 얻은 폴리페놀 획분(카테킨 단량체, 프로안토시아니딘 2량체, 3량체, 4량체 및 또한 고분자량의 프로안토시아니딘을 포함한다)과 비교하였다(도5의 HPLC 참조). 순층(順層) HPLC의 조건은 아래와 같다.

컬럼:LiChroCART Superspher Si 60(4.6×250㎚),

컬럼 온도:28℃,

이동상:헥산:메탄올:테트라하이드로푸란:트리플루오로아세트산(45:40:13.5:1.5),

유속:1.0mL/min,

검출:254㎚.

표본품으로서는 (-)-에피카테킨(단량체), 프로안토시아니딘 B4(2량체), 프로안토시아니딘 C1(3량체), 신남탄닌(cinnamtannin) A2(4량체)를 사용하였다. 이들 표본품은 비파씨로부터 분리하고, ¹H-NMR 스펙트럼을 문헌에 기재된 값과 비교하여 동정한 것이다. HPLC에서는 카페인의 피크가 확인되지만, 그 이외에는 4량체 정도까지 존재하는 것을 알 수 있으며, 노송나무 프로안토시아니딘에 비하여 그 이후의 테일링(Tailing)이 적다.

실시예6

신선한 감 미숙과실 1㎏을 물 2리터와 함께 파쇄하고, 녹차 200g 및 구연산 80g과 합친 후 물을 첨가하여 총량 8리터로 하여 3시간 은근하게 끓였다. 가열 후 식기 전에 여과하고, 여과액은 식은 후 세퍼비즈 SP825의 컬럼에 넣어 수세하고, 흡착부는 함수 에탄올로 용출, 농축 후 동결건조시켜 카테킨·프로안토시아니딘 혼합물 59.0g을 얻었다. 얻어진 혼합물의 6g을 세퍼덱스 LH-20 컬럼에 에탄올로 넣어서 8개의 분류(分溜, Fr.)로 분획하였다(도6 참조). Fr.1은 주로 에피카테킨과 에피갈로카테킨을 함유하며, 0.79g을 얻었다. Fr.2는 주로 에피카테킨-3-O-갈레이트를 함유하며, 0.15g을 얻었다. Fr.3은 주로 에피갈로카테킨-3-O-갈레이트를 함유하며, 0.87g을 얻었다. Fr.4는 에피갈로카테킨-3-O-갈레이트와 프로안토시아니딘 2량 체의 혼합물로 0.2g을 얻었다. Fr.5와 Fr.6은 모두 프로안토시아니딘 2량체를 함유하며, 각각 0.25g과 0.51g을 얻었다. Fr.7은 주로 프로안토시아니딘 3량체를 함유하며, 0.88g을 얻었다. Fr.8은 Fr.7과 같거나 그것보다도 큰 분자량의 프로안토시아니딘을 함유하며, 1.63g을 얻었다. 이들의 분류(分溜) 중 Fr.5와 Fr.6은 다시 MCI-gel CHP20P 컬럼 크로마토와 Chromatorex ODS 컬럼 크로마토(어느 쪽도 용매는 함수 메탄올)로 정제하여, (-)-에피갈로카테킨-(4β→8)-(-)-에피갈로카테킨-3-O-갈레이트를 101.6㎎, (-)-에피갈로카테킨-(4β→8)-(-)-에피갈로카테킨-3-O-갈레이트를 121.1㎎, (-)-에피갈로카테킨-3-O-갈레이트-(4β→8)-(-)-에피갈로카테킨-3-O-갈레이트를 24.3㎎을 얻었다(하기 구조식 참조). 그 외에도 다양한 프로안토시아니딘 2량체류가 존재하지만, 이상 3종류에 대하여 순수분리에 성공하여, ¹H-NMR 스펙트럼의 비교에 의하여 구조를 확정하였다.

실시예7 : 레스베라트롤 결합체의 제조예

포도씨 폴리페놀 분말(Grape Seed P.E. LAYN사 제조, 프로안토시아니딘 함량 95% 이상) 100㎎ 및 레스베라트롤 20㎎을 100㎎의 구연산과 함께 10mL의 물에 용해하여 3시간 중탕(87 내지 93℃)하여 반응시킨 후 실온까지 방랭(放冷)하였다. 이 액을 세퍼덱스 LH-20으로 조제한 컬럼(내경(內徑) 2㎝, 길이 15㎝, 약 50mL, 70% 메탄올)에 충전하였다. 70% 메탄올을 50mL, 이어서 100% 메탄올 50mL를 통하여 목적물의 획분을 농축, 동결건조시켜 분말(이하 발명물질A라고 약칭한다) 6.0㎎을 얻었다.

이 건조분말을 1mL의 70% 메탄올에 용해하고, MCI-gel CHP-20으로 조제한 컬 럼(내경 2㎝, 길이 15㎝, 약 50mL)에 충전하였다. 같은 용매 50mL를 통하여 목적물의 획분을 농축, 동결건조시켜 분말 2.4㎎을 얻었다. 얻어진 분말을 HR-FAB-MS(고분해능 고속원자 충격법 질량 스펙트럼) 및 ¹H-NMR(수소핵 자기공명 스펙트럼, 표1 참조)에 제공하였다. 얻어진 획분에 주로 함유되는 화합물은 HR-FAB-MS에서 [M]⁺가 m/z:516.1404로 관측되며, 분자식 C₂₉H₂₅O₉에 상당하는 계산값 516.1420과 3.1ppm의 오차로 일치하였다. 따라서 분자식 C₂₉H₂₅O₉를 가진다고 추정되며, 카테킨 또는 에피카테킨에 레스베라트롤이 탄소-탄소결합한 화학구조가 고려되었다.

해당 화합물의 ¹H-NMR(표1 참조)에서 카테킨 및 에피카테킨에 공통되는 방향고리 상의 5개의 프로톤시그널 외에 산소원자를 밑동 부분에 가진 시그널군이 δ5.04(1H, br.s, 2-H) 및 δ4.01(1H, br.s, 3-H)로 확인되어, 에피카테킨의 입체배치를 가지는 것을 시사하고 있다. δ4.64(1H, br.s)의 시그널은 에피카테킨 부분의 4a위에 귀속되며, 레스베라트롤 부분이 4b위에 배치되어 있다고 생각되었다. 별도로 δ6.55에 1의 플로로글루시놀 부분에서 확인된 시그널과 동형의 2H분의 envelope이 0.56ppm 저자장 이동하여 확인되며, 마찬가지로 새로 형성된 C-C결합이 유사한 입체환경인 것을 시사하고 있다. 그 외에 레스베라트롤의 트랜스 스틸벤 구조에 유래된 E형 공역 2중결합 상의 AB 시스템(δ6.79, 6.97, each 1H, J=16.5Hz), 및 다른 쪽의 방향고리 상의 A2B2 시그널(δ6.80, 7.36, each 2H, J=8.6Hz)이 확인되었다. 이들 정보에 따라 해당 화합물의 화학구조를 하기 식으로 도시하는 바와 같이 4b-(4-레스베라트로일)-(-)-에피카테킨으로 추정하였다.

발명물질A의 ¹H-NMR 시그널 귀속(δ in ppm)

H No.

2-H 5.01(br.s)
3-H 3.96(br.s)
4-H 4.53(br.s)
6-H 6.01(d, J=2.2 Hz)
8-H 5.98(d, J=2.2 Hz)
2’-H 6.96(d, J=1.7 Hz)
5’-H 6.74(d, J=8.3 Hz)
6’-H 6.67(dd, J=8.3,1.7 Hz)
Ph 4-H 5.99(envelope)
6-H 5.99(envelope)

주1) 발명물질A는 acetone-d ₆-D₂O 중에서 측정하였다.

실시예8 : 플로로글루시놀 결합체의 제조예

포도씨 폴리페놀 및 플로로글루시놀의 각 1.00g을 500㎎의 구연산과 함께 50mL의 물에 용해하여 3시간 중탕(87 내지 93℃)하여 반응시킨 후 실온까지 방랭하였다. 이 액을 다이아이온 HP20으로 조제한 컬럼(내경 3㎝, 길이 14㎝, 약 100mL)에 충전한 후 약 300mL의 물로 세정 후 약 200mL의 메탄올로 용출하여 목적물의 획분을 농축, 동결건조시켜 분말(발명물질B라 약칭한다) 1.24g을 얻었다.

발명물질B를 5mL의 70% 메탄올에 용해하고, 세퍼덱스 LH-20으로 조제한 컬럼(내경 3㎝, 길이 25㎝, 약 180mL)에 충전하였다. 같은 용매 500mL를 통하여 목적물의 획분을 농축, 동결건조시켜 분말 62.2㎎을 얻었다. 얻어진 분말을 HR-FAB-MS 및 ¹H-NMR에 제공하였다. 얻어진 획분(畵分)에 주로 함유되는 화합물은 HR-FAB-MS에서 [M]⁺가 m/z:414.0941로 관측되어, 분자식 C₂₁H₁₈O₉에 상당하는 계산값 414.0950과 2.2ppm(10ppm 이내는 허용)의 오차로 일치하였다. 따라서 분자식 C₂₁H₁₈O₉를 가진다고 추정되며, 카테킨 또는 에피카테킨에 플로로글루시놀이 탄소-탄소결합한 화학구조가 고려되었다. 해당 화합물의 ¹H-NMR(표2 참조)에서 카테킨 및 에피카테킨에 공통되는 방향고리 상의 5개의 프로톤시그널 외에 산소원자를 밑동 부분에 가진 시그널군이 5.01(1H, br.s, 2-H) 및 3.96(1H, br.s, 3-H)로 확인되어, 에피카테킨의 입체배치를 가지는 것을 시사하고 있다. δ4.53(1H, br.s)의 프로톤시그널은 에피카테킨 부분의 4위에 귀속되며, 플로로글루시놀 부분이 4위에 배치되어 있다고 생각되었다. 별도로 δ5.99에 플로로글루시놀 유래의 C-4 및 -6에 귀속되는 2H분의 시그널이 등가(等價)인 envelope으로서 확인되며, 새로 형성한 C-C결합이 회전장애를 일으키고 있는 것을 시사하고 있다. 이들 정보에 따라 해당 화합물의 화학구조를 하기 식으로 표시하는 바와 같이 4-(2-플로로글루시놀)-(-)-에피카테킨으로 추정하였다. 화합물인 ¹³C-NMR(탄소-13핵 자기공명 스펙트럼, 표3 참조)은 이 화학구조를 지지하고 있다.

발명물질B의 ¹H-NMR 시그널 귀속(δ in ppm)

H No.

2-H 5.04(br.s)
3-H 4.01(br.s)
4-H 4.64(br.s)
6-H 6.00(d, J=2.2 Hz)
8-H 6.02(d, J=2.2 Hz)
2’-H 6.97(d, J=1.7 Hz)
5’-H 6.74(d, J=8.3 Hz)
6’-H 6.67(dd, J=8.3,1.7 Hz)
Res 2 and 6-H 6.55(envelope)
α-H 6.79(d, J=16.5 Hz)^a)
β-H 6.97(d, J=16.5 Hz)^a)
2’ and 6’-H 6.80(d, J=8.6 Hz)^c)
3’ and 5’-H 7.36(d, J=8.6 Hz)^c)

주1) 발명물질B는 acetone-d ₆-D₂O 중에서 측정하였다.

주2) 오른쪽 위에 붙인 동기호의 귀속은 서로 교환할 수 있다.

발명물질B의 ¹³C-NMR 시그널 귀속(δ in ppm)

C No.

C - 2 76.8
- 3 72.3
- 4 36.7
- 5 157.7 ^a)
- 6 95.4
- 7 158.4 ^b)
- 8 96
- 9 158.5 ^b)
-10 100.3
- 1’ 132.2
- 2’ 115
- 3’ 145.0 ^c)
- 4’ 145.3 ^c)
- 5’ 115.1
- 6’ 119
Ph - 1 157.7 ^a)
- 2 100.3
- 3 157.5 ^a)
- 4 106.6
- 5 157.7 ^a)
- 6 106.6

주1) 발명물질B는 acetone-d ₆-D₂O 중에서 측정하였다.

실시예9 :포도씨 유래 에피갈로카테킨갈레이트 ( EGCG ) 결합체의 제조예

포도씨 폴리페놀 분말(Grape Seed P.E. LAYN사 제조, 프로안토시아니딘 함량 95% 이상) 5.00g을 약 100mL의 물에 분산·용해 후 세퍼비즈 SP850으로 조제한 컬럼(내경 3.8㎝, 길이 20㎝, 약 230mL)에 넣어서 물로 용출하여 얻은 획분을 농축, 동결건조시켜 폴리머 분말 2.44g(48.8%)을 얻었다.

얻어진 포도씨 폴리페놀 폴리머 분말 및 EGCG의 각 1.00g을 500㎎의 구연산과 함께 50mL의 물에 용해하여 3시간 중탕(87 내지 93℃)하여 반응시킨 후 실온까지 방랭하였다. 이 액을 다이아이온 HP20으로 조제한 컬럼(내경 3㎝, 길이 14㎝, 약 100mL)에 충전한 후 약 300mL의 물로 세정 후 약 200mL의 메탄올로 용출하여 얻은 획분을 농축, 동결건조시켜 분말(발명물질C라 약칭한다) 1.85g을 얻었다.

실시예10 : 양매피 폴리페놀( EGCG 폴리머 ) EGCG 결합체의 제조예

소귀나무(소귀나무과), Myrica rubra(Myricaceae) 수피 조각, 즉 생약「양매피」를 5 내지 10배량(W/V)의 50% 아세톤에 3 내지 7일간 냉침(冷浸)하여 얻은 암갈색 추출액을 농축 후 석출하는 미리시트린(myricitrin)(myricetin 3-O-α-L-rhamnopyranoside)의 황색 결정을 반복하여 여과지로 걸렀다. 얻어진 여과액을 다시 농축 후 동결건조시켜 농갈색 분말을 수지 조각으로부터 14%의 수율로 얻었다. 이 분말 14.0g을 약 70mL의 50% 메탄올에 용해하여, 세퍼덱스 LH-20으로 조제한 컬럼(내경 5㎝, 길이 20㎝, 약 400mL)에 충전하였다. 같은 용매를 1.5L, 이어서 70% 메탄올 0.7L를 통과한 후에 70% 아세톤 1L를 통과하여 EGCG 폴리머 획분을 회수하고, 농축 후 동결건조시켜 EGCG 폴리머 분말을 9.37g(66.9%) 얻었다. 양매피 유래의 EGCG 폴리머 및 EGCG의 각 1.00g을 500㎎의 구연산과 함께 50mL의 물에 용해하여 3시간 중탕(87 내지 93℃)하여 반응시킨 후 실온까지 방랭하였다. 이 액을 DIAION HP20으로 조제한 컬럼(내경 3㎝, 길이 14㎝, 약 100mL)에 충전한 후 약 300mL의 물로 세정 후 약 200mL의 메탄올로 용출하여 얻은 획분을 농축, 동결건조시켜 분말(발명물질D라 약칭한다)을 1.85g 얻었다.

실시예11 :감 껍질로부터 유래된 차 폴리페놀 결합체의 제조예

감 껍질 건조분말 1.00g 및 차 추출물(PF-TP90, 주식회사 파머 푸드 연구소 제조, 차 폴리페놀 함유량 90% 이상, 총 카테킨 함유량 80% 이상 중 EGCG 함량 50% 이상) 300㎎을 500㎎의 구연산과 함께 50mL의 물에 용해하여 3시간 중탕(87 내지 93℃)하여 반응시킨 후 실온까지 방랭하였다. 이 액을 세퍼비즈 SP850으로 조제한 컬럼(내경 3㎝, 길이 14㎝, 약 100mL)에 충전한 후 약 300mL의 물로 세정 후 약 200mL의 메탄올로 용출하였다. 이 획분을 다이아이온 HP20으로 조제한 컬럼(내경 3㎝, 길이 14㎝, 약 100mL)에 충전한 후 약 300mL의 물로 세정 후 약 200mL의 메탄올로 용출하여 얻은 획분을 농축, 동결건조시켜 분말(발명물질E라 약칭한다) 464㎎을 얻었다.

실시예12 : 레이시로부터 유래된 폴리페놀에피갈로카테킨갈레이트( EGCG )결합체의 제조예

레이시 과실 폴리페놀 분말(Litchi P.E. LAYN사 제조, 프로안토시아니딘 함량 90% 이상) 5.00g을 약 100mL의 물에 분산·용해 후 세퍼비즈 SP850으로 조제한 컬럼(내경 3.8㎝, 길이 20㎝, 약 230mL)에 넣어서 물로 용출하여 얻은 획분을 농축, 동결건조시켜 폴리머 분말 3.02g(60.4%)을 얻었다.

얻어진 레이시 과실 폴리페놀 폴리머 분말 및 EGCG의 각 1.00g을 500㎎의 구연산과 함께 50mL의 물에 용해하여 3시간 중탕(87 내지 93℃)하여 반응시킨 후 실온까지 방랭하였다. 이 액을 다이아이온 HP20으로 조제한 컬럼(내경 3㎝, 길이 14㎝, 약 100mL)에 충전한 후 약 300mL의 물로 세정 후 약 200mL의 메탄올로 용출하여 얻은 획분을 농축, 동결건조시켜 분말(발명물질F라 약칭한다) 1.80g을 얻었다.

시험예1 :

실시예7 내지 11에서 얻은 발명물질A 내지 E에 대하여 1,1-디페닐-2-피크릴히드라질(DPPH)의 라디칼의 소거작용, 및 TEAC(Trolox Equivalent Antioxidant Capacity)법에 의한 항산화능 평가시험을 실시하였다.

[DPPH 어세이]

방법:

샘플에 대하여 1,1-디페닐-2-피크릴히드라질(DPPH) 라디칼의 소거작용을 아래의 방법으로 측정하였다. 96구멍의 마이크로플레이트에 100μL의 DPPH 용액(60μM 에탄올 용액)을 넣고 시험시료의 에탄올 용액 100μL 또는 컨트롤로서 에탄올을 100μL 각각 첨가하고, 조용히 혼합하여 실온에서 30분간 방치한 후 520㎚의 흡광도를 측정하였다. DPPH 라디칼 소거능을 하기의 식으로 산출하고, 단계적으로 희석한 시험시료의 DPPH 라디칼 소거능과 농도로부터 50% 유효농도(EC50)를 산출하였다.

DPPH 라디칼 소거능(%)=(1-시험시료의 흡광도)/컨트롤의 흡광도×100

발명물질A에 대해서는 비교물질로서 에피카테킨(EP) 및 레스베라트롤(RS)을 사용하였으며, 발명물질B에 대해서는 비교물질로서 에피카테킨 및 플로로글루시놀(PL)을 사용하였으며, 발명물질C 내지 E에 대해서는 비교물질로서 포도씨 폴리페놀 폴리머(GP)를 사용하였다. 비교물질에 대한 데이터와 함께 결과를 도7 내지 9에 도시한다.

에피카테킨에서는 48.7%의 DPPH 활성이 확인되었으나, 레스베라트롤에서는 23.1%로 약간의 활성밖에 확인되지 않았다. 에피카테킨에 레스베라트롤이 결합한 발명물질A에서는 76.1%로 유의하게 뛰어난 활성을 나타냈다(도7). 또한 에피카테킨에는 43.0%의 DPPH 활성이 확인되었으나, 플로로글루시놀에는 활성이 거의 확인되지 않았다. 에피카테킨에 플로로글루시놀이 결합된 발명물질B에서는 양자보다 우위로 높은 소거(Scavening) 활성을 나타내었다(도8).

또한 발명물질C(41.3%) 및 D(35.1%)는 비교물질(26.9%)에 비하여 높은 소거활성을 나타내었다. 발명물질E(26.8%)는 비교물질과 동등한 활성을 나타내었다(도9 참조).

[TEAC]

방법:TEAC(Trolox Equivalent Antioxidant Capacity)법은 어떤 화합물이 가진 항산화활성을 α-토코페롤 유도체인 Trolox의 항산화능으로 환산하여 항산화강도를 상대평가하는 방법이며, 항산화지표로서 일반적으로 널리 사용되고 있다.

70μM의 메트미오글로빈 용액 36μL에 ABTS 용액 300μL 및 5mM 인산 완충 생리식염수를 487μM 첨가하고, 이어서 샘플용액 또는 1.25mM의 Trolox 용액을 첨가하여 0℃에서 5분간 조용히 섞었다. 450μM의 과산화수소수를 167μL 첨가하여 10초간 섞은 후 실온에서 5분간 반응시켰다. 734㎚의 흡광도를 측정하고 샘플의 흡광도를 Trolox 용액의 흡광도의 비를 산출하여 1.00mM의 Trolox에 대한 샘플의 TEAC값으로 하였다.

상기 DPPH 어세이와 마찬가지로 발명물질A에 대해서는 비교물질로서 에피카테킨 및 레스베라트롤을 사용하고, 발명물질B에 대해서는 비교물질로서 에피카테킨 및 플로로글루시놀을 사용하고, 발명물질C 내지 E에 대해서는 비교물질로서 포도씨 폴리페놀 폴리머를 사용하였다. 비교물질에 대한 데이터와 함께 결과를 도10 내지 12에 도시한다.

에피카테킨에는 1.2mM의 TEAC 활성이 확인되었으나, 레스베라트롤에서는 1.11mM로 낮았다. 에피카테킨에 레스베라트롤이 결합한 발명물질A에서는 1.33mM로 유의하게 높은 활성을 나타내었다(도10). 플로로글루시놀에서는 0.52mM로 낮은 활성이었던 점에 대하여 에피카테킨에 플로로글루시놀이 결합한 발명물질B에서는 1.44mM로 양자보다 우위의 높은 활성을 나타내었다(도11).

또한 발명물질C(1.11), D(1.11), E(0.97)는 비교물질(0.73)에 비하여 높은 TEAC값을 나타내었다(도12).

시험예2 :

실시예12에서 얻은 발명물질F에 대해서는 레이시 과실 폴리페놀(LP) 및 차 추출물(TE)을 비교물질로서 비교시험을 실시하였다.

[생체 외(in vitro) 시험]

시험방법:NIH3T3 세포를 96 구멍 플레이트에 파종하고, 37℃에서 하룻밤 배양하였다. 다음날 무혈청 배지로 교환하고, 피험물질을 첨가하여 1시간 배양 후 20분간 UV 조사(照射)하였다. 혈청이 든 배지로 교환하여 37℃에서 하룻밤 배양하고, MTT법에 의하여 세포생존율을 측정하였다. 무첨가를 대조군(C)으로 하였다.

결과를 도13에 도시한다. 대조군에서는 UV 조사에 대한 세포의 생존율은 20% 정도인 데 대하여 발명물질F에서는 생존율이 가장 높으며, 비교물질과 비교하여 유의하게 세포사(死)가 억제되어, 발명물질F의 UV 보호작용이 도시되었다.

[생체 내(in vivo) 시험]

시험방법:9주령(週齡)의 수컷 Slc:ddY 마우스에 발명물질F, LP, TE를 각각 50㎎/㎏체중의 용량으로 3주간 매일 강제 경구투여하였다. 대조군(C)에게는 같은 용량의 수돗물을 투여하였다. 최종일의 피검물질투여로부터 2시간 후에 에테르 마취 하에서 심장채혈을 실시하여, 혈청의 TEAC에 의한 항산화활성과 과산화지질량을 측정하였다. TEAC는 전술한 바와 같이 측정하였다. 과산화지질은 시판되는 키트(과산화지질-테스트 와코, 와코 준야쿠 가부시키가이샤 제조)를 사용하여 황산산성화에서의 인텅스텐산 용액 속에서의 과산화지질의 침전과 2-TBA(티오바르비투루산) 시약과의 반응을 여기(勵起)파장 515㎚, 형광파장 553㎚의 형광을 측정함으로써 측정하였다.

결과를 도14, 도15에 도시한다. 발명물질F는 대조군, 비교물질에 비하여 유의하게 높은 항산화활성을 나타내었다. 또한 혈청 속의 과산화지질도 비교물질에 비하여 유의의 낮은 값을 나타내었다.

[생체 내(in vivo) 시험]

시험방법:6주령(週齡)의 수컷 Slc:ddY 마우스에 발명물질F, LP, TE를 각각 50㎎/㎏체중의 용량으로 3일간 매일 강제 경구투여하였다. 대조군(C)에게는 같은 용량의 수돗물을 투여하였다. 해부 전날에 2-NP(70㎎/㎏)을 복강 내 투여하고, 24시간 후에 에테르 마취 하에서 심장채혈을 실시하여, 혈청의 GOT 및 GPT를 측정하였다. 또한 간장을 적출하여 장기 속의 과산화지질량을 측정하였다.

결과를 도16, 도17에 도시한다. 2-NP 투여에 의하여 간장이 장애를 받아 혈청 속의 GOT 및 GPT 농도가 상승하였으나, 발명물질F는 대조군, 비교물질에 비하여 유의하게 그 상승을 억제하였다. 또한 간장 속의 과산화지질도 비교물질에 비하여 유의한 낮은 값을 나타내었다.

Claims

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프로안토시아니딘 폴리머를 함유하는 식물원료 또는 그 추출물과, 녹차, 녹차 추출물 및 에피갈로카테킨갈레이트(EGCG)로 이루어진 군에서 선택된 물질을 염산, 황산, 질산, 아세트산, 구연산, 아스코르빈산 및 사과산으로부터 선택되는 적어도 1종류의 산성용액 속에서 가열하고, 말단에 카테킨류 또는 에피갈로카테킨갈레이트(EGCG)가 결합하여 저분자화된 프로안토시아니딘 올리고머를 함유하는 반응액을 농축, 건조시키는 것을 특징으로 하는 프로안토시아니딘 올리고머를 주성분으로서 함유하는 조성물의 제조방법.
프로안토시아니딘 폴리머를 함유하는 식물원료 또는 그 추출물과, 녹차, 녹차 추출물 및 에피갈로카테킨갈레이트(EGCG)로 이루어진 군에서 선택된 물질을 염산, 황산, 질산, 아세트산, 구연산, 아스코르빈산 및 사과산으로부터 선택되는 적어도 1종류의 산성용액 속에서 가열하여 얻어지는, 말단에 카테킨류 또는 에피갈로카테킨갈레이트(EGCG)가 결합하여 저분자화된 프로안토시아니딘 올리고머를 함유하는 반응액을 농축하여 분획처리하는 것을 특징으로 하는 프로안토시아니딘 올리고머를 주성분으로서 함유하는 조성물의 제조방법.
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