JP5437537B1 - 低重合度プロアントシアニジンの製法 - Google Patents

Abstract

プロアントシアニジン原料の水系溶液を、スルホ基含有化合物の存在下で低温加熱して、天然型の低重合度プロアントシアニジンを生成する、低重合度プロアントシアニジンの製法である。これにより、簡易な手法で、目的とする天然型の低重合度プロアントシアニジンを生成し、増産することが可能となる。

Description

本発明は、高重合度プロアントシアニジンもしくはプロアントシアニジンの構成モノマーを含有するプロアントシアニジン原料から、低重合度プロアントシアニジンを効率よく増産することが可能な、低重合度プロアントシアニジンの製法に関するものである。

プロアントシアニジンは、従来より「縮合型タンニン」や「非加水分解性タンニン」と呼ばれている化合物であり、植物体に含まれるポリフェノールの一種として知られる。プロアントシアニジンの構造は、一般に、フラバン−３−オールを構成単位とし、４−６位または４−８位などで縮合もしくは重合する結合様式をとる。このように、プロアントシアニジンとは、上記結合様式に従い縮合もしくは重合した、２量体以上の重合体の総称である。

近年、プロアントシアニジンのなかには、動脈硬化症予防、心血管疾患予防、抗糖尿病、抗肥満、内臓脂肪蓄積抑制、抗腫瘍、抗炎症、抗老化、抗酸化、坑糖化、抗アレルギー、抗菌、育毛、美白作用、血流改善作用等の生理活性を示すものがあるとの報告がなされている。これらの生理活性とプロアントシアニジンの重合度数との構造活性相関に関しては、未だ充分に解明されていないのが現状であるが、例えば、育毛活性については、低重合度（２〜５量体）のプロアントシアニジンが最も高い活性を示すことが報告されている（特許文献１参照）。また、上記のように低重合度のものは、体内に吸収されやすい特性を示すことから、育毛活性以外の生理活性においても有効であると考えられている。

そして、上記のような低重合度プロアントシアニジンを得る手法としては、従来、それを多く含む植物体をプロアントシアニジン原料とし、下記の（１）〜（５）に示す精製方法で分離・精製を行うといった手法がとられている。
（１）向流クロマトグラフィーによる精製方法（特許文献２参照）。
（２）酢酸エチル、ジクロロメタンを用いた固液抽出方法（特許文献３参照）。
（３）セファデックスＬＨ−２０カラムを用いた精製方法（特許文献４参照）。
（４）ポリスチレン系吸着樹脂を用いた精製方法（特許文献５参照）。
（５）順相シリカゲルクロマトグラフィーを用いた精製方法（特許文献６，７参照）。

ＷＯ９６／００５６１公報 特開昭６１−１６９８２号公報 特開平８−１７６１３７号公報 特開平３−２００７８１号公報 特公平７−６２０１４号公報 特開２００６−３８７６３公報 ＷＯ００／６４８８３公報

しかしながら、上記のように分離・精製のみで所望の低重合度プロアントシアニジンを得るには、上記のように低重合度プロアントシアニジンを多く含む植物体をプロアントシアニジン原料として用いないと、生産性が悪く、効率的でないといった問題がある。

そこで、低重合度プロアントシアニジンを多く含まなくとも、高重合度プロアントシアニジンを低分子に断片化することにより低重合度プロアントシアニジンを増産する方法が検討されている。例えば、原料中の高重合度プロアントシアニジンを、塩酸や硝酸や水素の存在下で高温加熱して分解するといった手法や、チオール化合物と反応させて分解するといった手法により、低分子化する方法である。

ところが、塩酸や硝酸や水素の存在下で高重合度プロアントシアニジンを低分子に断片化する手法は、上記のように高温で、かつ長時間にわたり反応させることを要するため、簡易な手法とは言えない。しかも、高温によりラセミ化（構造変態）も起こりやすいことから、所望の天然型低重合度プロアントシアニジンを効率的に生産することが難しいといった問題もある。また、チオール化合物と反応させる手法では、産物が硫黄を含有する非天然物となり、食用への適用に際し安全性が懸念されるといった問題や、風味に劣るといった問題がある。さらに、これらの手法では、反応が進行し過ぎて単量体（カテキンやエピカテキン）になるまで断片化される割合が高く、低重合度（２〜５量体）のプロアントシアニジンを効率良く得ようとしても、その反応制御が困難であるといった問題もある。

本発明は、このような事情に鑑みなされたもので、簡易な手法により、目的とする天然型の低重合度プロアントシアニジンを増産することが可能な、低重合度プロアントシアニジンの製法の提供をその目的とする。

上記の目的を達成するために、本発明は、プロアントシアニジン原料の水系溶液を、下記（ａ）に示すスルホ基含有化合物の存在下で、５０〜８０℃の温度条件で低温加熱して、下記（α）に示す天然型の低重合度プロアントシアニジンを増産する低重合度プロアントシアニジンの製法を、その要旨とする。
（ａ）硫酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、１０−カンファースルホン酸、およびスルホ基含有イオン交換樹脂からなる群から選ばれた少なくとも一つのスルホ基含有化合物。
（α）プロシアニジンＢ１、プロシアニジンＢ２、プロシアニジンＣ１、およびシナムタンニンＡ２からなる群から選ばれた少なくとも一つの低重合度プロアントシアニジン。

すなわち、本発明者は、簡易な手法により、目的とする天然型の低重合度プロアントシアニジンを増産する製法について、鋭意研究を重ねた。そして、各種実験の結果、植物体等のプロアントシアニジン原料（プロアントシアニジンの高分子体や、カテキン，エピカテキンといったプロアントシアニジンの単量体を含有する原料）の水系溶液を、スルホ基含有化合物の存在下で低温加熱すると、ラセミ化を生じさせることなく、目的とする天然型の低重合度プロアントシアニジンを効率的に生産することができることを見いだし、本発明に到達した。

上記のようにスルホ基含有化合物の存在下で低温加熱すると、高重合度のプロアントシアニジンはその分解が促進され、カテキン，エピカテキンといった単量体はその重合が促進され、結果的に、目的とする天然型の低重合度プロアントシアニジンが生成され、増産されるようになる。このようになる理由に関しては未だ充分に解明されていないが、不均化反応によるものと考えられる。また、上記製法における反応制御は、比較的容易であり、加熱温度を低温にして行うことができ、しかも短時間の加熱処理で済むことから、従来の製法に比べ、効率良く行うことができる。さらに、従来の製法では、高重合度プロアントシアニジンの分解による低重合度プロアントシアニジンの生成は可能であったが、本発明の製法のように単量体や２単量体等からの低重合度プロアントシアニジンの合成は不可能であった。つまり、本発明の製法では、このような単量体や２単量体等からの低重合度プロアントシアニジンの合成も行われることから、従来の製法よりも、より効率良く、目的とする天然型の低重合度プロアントシアニジンを増産することができるようになる。

以上のように、本発明の低重合度プロアントシアニジンの製法は、プロアントシアニジン原料の水系溶液を、スルホ基含有化合物の存在下で低温加熱して、天然型の低重合度プロアントシアニジンを増産するものである。これにより、簡易な手法により、目的とする天然型の低重合度プロアントシアニジンを増産することが可能となる。そして、本発明の製法により得られた低重合度プロアントシアニジンは、天然型プロアントシアニジンであるため、食用等の、人体への適用に際しても安全である。そのため、上記のようにして増産した低重合度プロアントシアニジンを分離・精製し、目的とする生理活性（動脈硬化症予防、心血管疾患予防、抗糖尿病、抗肥満、内臓脂肪蓄積抑制、抗腫瘍、抗炎症、抗老化、抗酸化、坑糖化、抗アレルギー、抗菌、育毛、美白作用、血流改善作用等）を示す重合度数のものを、医薬品，飲食品，化粧品等の材料として安心して適用することができる。

特に、上記プロアントシアニジン原料が、増産する低重合度プロアントシアニジンよりも低重合度のプロアントシアニジンもしくはプロアントシアニジンの構成モノマーと、増産する低重合度プロアントシアニジンよりも高重合度のプロアントシアニジンとが混在したものであると、目的とする天然型の低重合度プロアントシアニジンをより効率的に生産することができる。

また、上記スルホ基含有化合物が、硫酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、１０−カンファースルホン酸、スルホ基含有イオン交換樹脂からなる群から選ばれた少なくとも一つであるため、目的とする天然型の低重合度プロアントシアニジンをより効率的に生産することができる。

また、上記スルホ基含有化合物の存在下での低温加熱を、特定の温度条件で行っているため、ラセミ化を生じさせることなく、目的とする天然型の低重合度プロアントシアニジンをより効率的に生産することができる。

また、上記スルホ基含有化合物の存在下での低温加熱を、１０〜２４０分間行うと、目的とする天然型の低重合度プロアントシアニジンをより効率的に生産することができる。

また、上記スルホ基含有化合物の存在下での低温加熱を特定のｐＨ条件で行うと、目的とする天然型の低重合度プロアントシアニジンをより効率的に生産することができる。

また、上記プロアントシアニジン原料の水系溶液が、メタノールおよびエタノールの少なくとも一つと水との混合水を溶媒とすると、より多く、目的とする天然型の低重合度プロアントシアニジンを増産することができる。

実験１における低分子量体の定量分析結果を示すグラフである。 実施例４の液体クロマトグラフィーの結果を示すクロマトグラムである。 比較例４の液体クロマトグラフィーの結果を示すクロマトグラムである。 比較例５の液体クロマトグラフィーの結果を示すクロマトグラムである。 比較例６の液体クロマトグラフィーの結果を示すクロマトグラムである。 比較例７の液体クロマトグラフィーの結果を示すクロマトグラムである。 実施例４での反応時間毎の低分子量体の定量分析結果を示すグラフである。 実施例５の液体クロマトグラフィーの結果を示すクロマトグラムである。 実施例６の液体クロマトグラフィーの結果を示すクロマトグラムである。 実施例５での反応時間毎の低分子量体の定量分析結果を示すグラフである。 実施例６での反応時間毎の低分子量体の定量分析結果を示すグラフである。 実施例７での反応時間毎の低分子量体の定量分析結果を示すグラフである。 実施例８での反応時間毎の低分子量体の定量分析結果を示すグラフである。 実験５における低分子量体の定量分析結果を示すグラフである。 実験６における低分子量体の定量分析結果を示すグラフである。 実験７における低分子量体の定量分析結果を示すグラフである。 実験８における低分子量体の定量分析結果を示すグラフである。 実験９における低分子量体の定量分析結果を示すグラフである。

つぎに、本発明の実施の形態を詳しく説明する。

本発明の低重合度プロアントシアニジンの製法は、プロアントシアニジン原料の水系溶液を、スルホ基含有化合物の存在下で低温加熱して、目的とする天然型の低重合度プロアントシアニジンを増産するという構成をとる。なお、本発明において「プロアントシアニジン原料」とは、増産する低重合度プロアントシアニジンとは異なる重合度のプロアントシアニジン（プロアントシアニジンの高分子体等）や、プロアントシアニジンの構成モノマー（カテキンやエピカテキン）を含有する原料を示す。また、低重合度プロアントシアニジンとは、通常、プロアントシアニジンの２〜５量体を示すものである。本発明の製法により得られる低重合度プロアントシアニジンは、天然型であることから、プロシアニジンＢ１（２量体），Ｂ２（２量体），Ｃ１（３量体），シナムタンニン(cinnamtannin)Ａ２（４量体）といったものがあげられる。

上記プロアントシアニジン原料としては、植物原料では、例えば、ブドウ，カキ，リンゴ，マツ，栗，落花生，アズキ，クランベリー，黒大豆，カカオ，シナモン，ムタンバ，サンザシ，ブニノキ，ゴレンシ，マザーワート，ケクロピア，コーラ（コーラナッツ），ライチ、イチョウ等の植物の、果実、果皮、種子、渋皮、殻、葉、樹皮等があげられる。これらの植物原料は、通常、空気乾燥等の乾燥工程に付した後、抽出原料とするが、そのまま抽出原料とすることもできる。

また、上記原料は、予め粗精製した後、本発明の製法に適用してもよい。ここで、上記粗精製は、例えば、固液抽出法，液液分配法，吸着クロマトグラフィー，分配クロマトグラフィー，疎水性相互作用クロマトグラフィー，イオン交換クロマトグラフィー，サイズ排除クロマトグラフィー，向流液液分配法、吸着剤処理法といった処理法を適用することにより行われる。

なお、上記プロアントシアニジン原料中には、低重合度プロアントシアニジンを多く含むものもあるが、本発明の製法では、これに加え、高重合度プロアントシアニジンや、カテキン，エピカテキンといった単量体を原料とし、その分解・合成により、低重合度プロアントシアニジンが増産される。したがって、上記プロアントシアニジン原料が高重合度プロアントシアニジンや単量体を含んでいれば、本発明の製法を適用することによって、より多くの低重合度プロアントシアニジンを得ることができる。

また、本発明の製法では、上記のように植物原料を材料として用いなくとも、例えば、市販の試薬として入手可能な、高重合度プロアントシアニジンや、カテキン，エピカテキンといった単量体を、上記プロアントシアニジン原料として用いてもよい。

本発明の製法では、上記プロアントシアニジン原料が、増産する低重合度プロアントシアニジンよりも高重合度のプロアントシアニジンを含有するものであれば、その分解により目的とする低重合度プロアントシアニジンを増産することができ、増産する低重合度プロアントシアニジンよりも低重合度のプロアントシアニジンを含有するものであれば、その合成により目的とする低重合度プロアントシアニジンを増産することができる。特に、上記プロアントシアニジン原料が、増産する低重合度プロアントシアニジンよりも低重合度のプロアントシアニジンもしくはプロアントシアニジンの構成モノマーと、増産する低重合度プロアントシアニジンよりも高重合度のプロアントシアニジンとが混在したものであると、目的とする天然型の低重合度プロアントシアニジンをより効率的に生産することができるようになるため、好ましい。なお、本発明の製法において、単量体のみをプロアントシアニジン原料とした場合、低重合度プロアントシアニジンを合成することができなかったことから、単量体を使用する場合は、２単量体以上のプロアントシアニジンと併用する必要がある。

つぎに、上記プロアントシアニジン原料を、水、メタノール、エタノールといった水系溶媒に添加し、プロアントシアニジン原料の水系溶液を調製する。特に、上記溶液が、メタノールやエタノールと水との混合水を溶媒とすることが、より多く、目的とする天然型の低重合度プロアントシアニジンを増産することができるようになるため好ましい。また、上記混合水におけるメタノールやエタノールの濃度は、上記観点から、８０％以下とすることが好ましい。

このようにして得られたプロアントシアニジン原料の水系溶液を、先に述べたように、スルホ基含有化合物の存在下で低温加熱する。上記スルホ基含有化合物としては、硫酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、１０−カンファースルホン酸、およびスルホ基含有イオン交換樹脂からなる群から選ばれた少なくとも一つが用いられ、これにより目的とする天然型の低重合度プロアントシアニジンをより効率的に生産することができる。

そして、上記水系溶液における酸の規定度は、その反応性の観点から、０．０１〜０．５Ｎの範囲が好ましく、より好ましくは０．０３〜０．５Ｎの範囲である。

上記スルホ基含有化合物の存在下での低温加熱は、５０〜８０℃、好ましくは６０〜７０℃の温度条件で行われる。すなわち、このような低温加熱により、ラセミ化を生じさせることなく、目的とする天然型の低重合度プロアントシアニジンをより効率的に生産することができるからである。

そして、低温加熱は、好ましくは１０〜２４０分間、より好ましくは３０〜１２０分間行われる。すなわち、このように短時間であっても、本発明の低重合度プロアントシアニジンの製法では、目的とする天然型の低重合度プロアントシアニジンをより効率的に生産することができるようになるからである。

さらに、上記スルホ基含有化合物の存在下での低温加熱は、通常はｐＨ４．０以下、好ましくはｐＨ２．０以下、より好ましくはｐＨ０．３〜１．５の条件で行われる。すなわち、このような条件で行うと、目的とする天然型の低重合度プロアントシアニジンをより効率的に生産することができるようになるからである。

なお、本発明の製法において、上記のように低温加熱を続けると、反応が進行しすぎ（高重合化あるいは単量体化が進行する）、目的とする天然型の低重合度プロアントシアニジンの収量が減少することから、適切なところで中和して反応を止める必要がある。上記中和には、例えば、苛性ソーダ（水酸化ナトリウム）、水酸化カリウム、生石灰（ＣａＯ）、消石灰（水酸化カルシウム）、石灰石、水酸化マグネシウム等が用いられる。または、２０℃以下、好ましくは０〜２０℃に冷却し、反応を止める。

上記のようにして反応を終えた後、重合度別に分離精製する必要があれば、例えば、ポリエチレングリコール基で化学修飾されたシリカゲル逆相液体クロマトグラフィーを用いた精製方法（特開２０１０−２６０８２３公報）、向流クロマトグラフィーによる精製方法（特開昭６１−１６９８２号公報）、酢酸エチルやジクロロメタンを用いた固液抽出方法（特開平８−１７６１３７号公報）、セファデックスＬＨ−２０カラムを用いた精製方法（特開平３−２００７８１号公報）、ポリスチレン系吸着樹脂を用いた精製方法（特公平７−６２０１４号公報）、順相シリカゲルクロマトグラフィーを用いた精製方法（特開２００６−３８７６３公報）等の、従来公知の分離精製方法により、目的とする天然型の低重合度プロアントシアニジンを得ることができる。

なお、上記分離精製後のプロアントシアニジンは、研究用試薬等の各種用途に用いることが可能であるが、例えば、医薬品や飲食品等の材料に用いる場合、健康被害を生じるおそれがないよう、安全性が確保されるレベルまで脱硫することが好ましい。すなわち、上記分離精製時に脱硫が行われない場合、別途、脱硫工程を設け、上記分離精製物の脱硫を行うことが好ましい。上記脱硫は、例えば、各種陰イオン交換樹脂、イオン交換膜、吸着樹脂等により行う。

このようにして分離・精製された低重合度プロアントシアニジンは、研究用試薬、医薬品、飲食品、化粧品等の材料として有用である。そして、上記プロアントシアニジンは天然型であることから、目的とする生理活性（動脈硬化症予防、心血管疾患予防、抗糖尿病、抗肥満、内臓脂肪蓄積抑制、抗腫瘍、抗炎症、抗老化、抗酸化、坑糖化、抗アレルギー、抗菌、育毛、美白作用、血流改善作用、等）を示す重合度数のものを、医薬品，飲食品，化粧品等の材料として安心して適用することができる。

つぎに、実施例について比較例と併せて説明する。ただし、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。

＜実験１：ブドウ種子中の高分子プロアントシアニジンの低分子化実験＞
まず、硫酸濃度（０Ｎ、０．２Ｎの２条件）とエタノール濃度（０％、５０％、７５％ＥｔＯＨの３条件）との違いにより、６種類の抽出溶媒を調製した。これらの抽出溶媒５ｍｌに、甲州ブドウの種子約０．５ｇを加え、７０℃にて撹拌しながら３時間抽出を行った。そして、上記抽出に際し、１時間毎に抽出液のサンプリングを実施し、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）にて抽出液を分析した。なお、０．２Ｎ硫酸水溶液を使用したものを実施例（エタノール濃度０％が実施例１、エタノール濃度５０％が実施例２、エタノール濃度７５％が実施例３）とし、硫酸濃度０Ｎの抽出溶媒を使用したものを比較例（エタノール濃度０％が比較例１、エタノール濃度５０％が比較例２、エタノール濃度７５％が比較例３）とする。

抽出溶媒の違いによる１時間毎の低重合度プロアントシアニジンの抽出量は、図１のグラフに示す通りであった。すなわち、図１より、０．２Ｎ硫酸溶液を抽出溶媒として用いたもの（実施例１〜３）は、硫酸を含まない抽出溶媒を用いたもの（比較例１〜３）に比べ、プロシアニジンＢ１（２量体），Ｂ２（２量体），Ｃ１（３量体），Ｘ（未同定のプロアントシアニジン３量体），ＣＴ（シナムタンニンＡ２、４量体）といった低分子プロアントシアニジンの抽出効率が高いことが確認できる。

＜実験２：酸の違いによる低重合度プロアントシアニジンの合成実験＞
まず、硫酸，塩酸，リン酸，硝酸，ギ酸のいずれかを用いた、０．２Ｎの酸水溶液を調製した（５種類）。これら酸水溶液に、プロシアニジンＢ２（２量体）を１００μｇ／ｍｌとなるよう加え、７０℃にて６０分間加熱した。その後、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）にて溶液を分析した。なお、硫酸水溶液を使用したものを実施例４、塩酸水溶液を使用したものを比較例４、リン酸水溶液を使用したものを比較例５、硝酸水溶液を使用したものを比較例６、ギ酸水溶液を使用したものを比較例７とする。そして、実施例４の分析結果を図２のクロマトグラムに示し、比較例４の分析結果を図３のクロマトグラムに示し、比較例５の分析結果を図４のクロマトグラムに示し、比較例６の分析結果を図５のクロマトグラムに示し、比較例７の分析結果を図６のクロマトグラムに示す。

図２〜図６に示す、酸水溶液の違いによるプロアントシアニジンの分析結果より、硫酸水溶液を用いた実施例４では、出発物質であるプロシアニジンＢ２や、その分解物である、単量体のエピカテキン（ＥＣ）の他、プロシアニジンＣ１（３量体）や、４量体であるＣＴ（シナムタンニンＡ２）といった重合体も検出されているのに対し、塩酸，リン酸，硝酸，ギ酸の水溶液を用いた比較例４〜７では、単量体であるエピカテキン（ＥＣ）のみが検出されていることがわかる。すなわち、硫酸水溶液を用いた実施例４では、その他の酸水溶液を用いた比較例４〜７にみられなかった低分子プロアントシアニジン（３量体や４量体）の合成が確認できる。

なお、実施例４において、プロシアニジンＢ２を添加して所定時間経過後（０分、１５分、３０分、６０分経過後）の溶液中の低重合度プロアントシアニジンの割合を、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）にて測定したところ、図７のグラフに示す結果となった。すなわち、図７より、実施例４では、プロシアニジンＢ２が、経時により減少し、それとともにプロシアニジンＣ１（３量体）や、４量体であるＣＴ（シナムタンニンＡ２）の割合が増加していることがわかる。

＜実験３：出発物質の違いによる低重合度プロアントシアニジンの生成実験＞
まず、０．２Ｎの硫酸水溶液を調製し、これに、出発物質であるプロシアニジンＣ１（３量体）またはＣＴ（シナムタンニンＡ２、４量体）を１００μｇ／ｍｌとなるよう加え、７０℃にて３０分間加熱した。その後、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）にて溶液を分析した。なお、プロシアニジンＣ１（３量体）を添加したものを実施例５、ＣＴ（４量体）を添加したものを実施例６とする。そして、実施例５の分析結果を図８のクロマトグラムに示し、実施例６の分析結果を図９のクロマトグラムに示す。

図８および図９に示す、出発物質の違いによるプロアントシアニジンの分析結果より、出発物質としてプロシアニジンＣ１（３量体）を用いた実施例５では、出発物質であるプロシアニジンＣ１や、その分解物である、単量体のエピカテキン（ＥＣ）の他、４量体であるＣＴ（シナムタンニンＡ２）やプロシアニジンＢ２（２量体）といった重合体も検出された。また、出発物質としてＣＴ（４量体）を用いた実施例６では、出発物質であるＣＴや、その分解物である、単量体のエピカテキン（ＥＣ）の他、プロシアニジンＣ１（３量体）やプロシアニジンＢ２（２量体）、さらにはプロアントシアニジンの５〜７量体のピークも検出された。

また、実施例５，６において、出発物質を添加して所定時間経過後（０分、１０分、２０分、３０分経過後）の溶液中の低重合度プロアントシアニジンの割合を、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）にて測定したところ、図１０および図１１のグラフに示す結果となった。すなわち、図１０より、実施例５では、プロシアニジンＣ１が、経時により減少し、それとともにＣＴ（４量体）やプロシアニジンＢ２（２量体）の割合が増加していることがわかる。また、図１１より、実施例６では、ＣＴ（４量体）が、経時により減少し、それとともにプロシアニジンＣ１（３量体）やプロシアニジンＢ２（２量体）の割合が増加していることがわかる。

＜実験４：高重合プロアントシアニジンからの低重合体の生成実験＞
まず、０．２Ｎの硫酸水溶液を調製した。そして、実施例７では上記硫酸水溶液に高重合プロアントシアニジンを高含有するブドウ種子エキス（製品名：グラビノール、キッコーマン社製）を１ｍｇ／ｍｌとなるよう加え、実施例８では上記硫酸水溶液に同ブドウ種子エキス（製品名：グラビノール、キッコーマン社製）を１ｍｇ／ｍｌ，エピカテキン（ＥＣ）を１００μｇ／ｍｌとなるよう加え、それぞれ、７０℃にて３０分間加熱した。その後、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）にて溶液を分析した。なお、実施例７の分析結果を図１２のグラフに示し、実施例８の分析結果を図１３のグラフに示す。

図１２に示す分析結果より、ブドウ種子エキスのみを加えた実施例７では、ブドウ種子プロアントシアニジン中のエピカテキン（ＥＣ）が、経時により減少し、それとともにプロアントシアニジンの２〜４量体の割合が約２倍に増加していることがわかる。また、図１３に示す分析結果より、ブドウ種子エキスとともにエピカテキン（ＥＣ）を加えた実施例８では、大量のエピカテキンが経時により減少し、それとともにプロアントシアニジンの２〜４量体の割合が約８倍に増加していることがわかる。このことから、単量体と高重合体との反応により、効率よく低重合体を生成できることがわかる。

＜実験５：溶媒条件（エタノール、メタノール、水）の検討実験＞
まず、水１００％，メタノール１００％，メタノール５０％＋水５０％，エタノール１００％，エタノール５０％＋水５０％のいずれかを溶媒として用いた、０．２Ｎの硫酸溶液を調製した（５種類）。これら硫酸溶液に、プロシアニジンＢ２（２量体）を１００μｇ／ｍｌとなるよう加え、７０℃にて３０分間加熱した。その後、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）にて溶液を分析した。なお、水１００％を溶媒に使用したものを実施例９、メタノール１００％を溶媒に使用したものを実施例１０、メタノール５０％＋水５０％を溶媒に使用したものを実施例１１、エタノール１００％を溶媒に使用したものを実施例１２、エタノール５０％＋水５０％を溶媒に使用したものを実施例１３とする。そして、これら実施例の分析結果を図１４のグラフに示す。

図１４の分析結果より、実施例９〜１３では、総じてプロシアニジンＣ１（３量体）やＣＴ（４量体）といった重合体が検出されたが、なかでも、メタノールやエタノールの混合水を抽出溶媒として用いた実施例１１，１３においては、水のみやエタノールのみといった純粋溶媒を用いたものに比べ、上記重合体の増加量が多いことがわかる。

＜実験６：硫酸濃度の検討実験＞
まず、硫酸濃度の違いにより、０．０１Ｎ，０．０５Ｎ，０．１Ｎ，０．２Ｎ，０．５Ｎ，１Ｎの硫酸水溶液を調製した（６種類）。これら硫酸水溶液に、プロシアニジンＢ２（２量体）を１００μｇ／ｍｌとなるよう加え、７０℃にて３０分間加熱した。その後、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）にて溶液を分析した。なお、０．０１Ｎの硫酸水溶液を溶媒に使用したものを実施例１４、０．０５Ｎの硫酸水溶液を溶媒に使用したものを実施例１５、０．１Ｎの硫酸水溶液を溶媒に使用したものを実施例１６、０．２Ｎの硫酸水溶液を溶媒に使用したものを実施例１７、０．５Ｎの硫酸水溶液を溶媒に使用したものを実施例１８、１Ｎの硫酸水溶液を溶媒に使用したものを実施例１９とする。そして、これら実施例の分析結果を図１５のグラフに示す。

図１５の分析結果より、実施例１４〜１９では、プロシアニジンＣ１（３量体）やＣＴ（４量体）といった重合体が検出された。そして、図１５における上記重合体の増加量から、硫酸濃度が０．０１〜１Ｎの範囲内で適応範囲を設定できることがわかる。

＜実験７：反応温度の検討実験＞
まず、０．２Ｎの硫酸水溶液を調製し、上記硫酸水溶液に、プロシアニジンＢ２（２量体）を１００μｇ／ｍｌとなるよう加えた。そして、この溶液を、所定温度（３０℃，４０℃，５０℃，６０℃，７０℃，８０℃のいずれか）にて３０分間加熱した。その後、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）にて溶液を分析した。なお、温度設定を５０℃にしたものを実施例２０、６０℃にしたものを実施例２１、７０℃にしたものを実施例２２、８０℃にしたものを実施例２３とする。そして、これらの分析結果を図１６のグラフに示す。

図１６の分析結果より、実施例２０〜２３では、プロシアニジンＣ１（３量体）やＣＴ（４量体）といった重合体が検出された。この結果より、５０〜８０℃の温度帯が適温となることがわかる。なお、８０℃を超えると、エピカテキンからカテキンへの異性化が起こる現象が確認されている。

＜実験８：各種スルホ基含有化合物による重合化反応実験＞
まず、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、１０−カンファースルホン酸のいずれかのスルホ基含有化合物を用いた、０．２Ｎの酸水溶液を調製した（４種類）。これら酸水溶液に、プロシアニジンＢ２（２量体）を１００μｇ／ｍｌとなるよう加え、７０℃にて３０分間加熱した。その後、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）にて溶液を分析した。なお、メタンスルホン酸水溶液を使用したものを実施例２４、ベンゼンスルホン酸水溶液を使用したものを実施例２５、ｐ−トルエンスルホン酸水溶液を使用したものを実施例２６、１０−カンファースルホン酸水溶液を使用したものを実施例２７とする。そして、これら実施例の分析結果を図１７のグラフに示す。

図１７の分析結果より、実施例２４〜２７のいずれのスルホ基含有化合物を用いた場合であっても、プロシアニジンＢ２が減少し、一方でプロシアニジンＣ１（３量体）やシナムタンニンＡ２（４量体）が合成された。

＜実験９：黒大豆種皮からの低重合プロアントシアニジン抽出実験＞
まず、水、０．２Ｎ硫酸水溶液、０．２Ｎ塩酸水溶液を抽出溶媒として準備した。そして、黒大豆種皮に、上記各抽出溶媒を２０倍量加え、７０℃にて１時間加熱した。このようにして得られた抽出液を、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）にて分析した。なお、０．２Ｎ硫酸水溶液で抽出したものを実施例２８とし、水で抽出したものを比較例８とし、０．２Ｎ塩酸水溶液で抽出したものを比較例９とする。そして、これらの分析結果を図１８のグラフに示す。

図１８の分析結果より、実施例２８における低重合プロアントシアニジン抽出量は、水や希塩酸を用いた比較例における低重合プロアントシアニジンの抽出量よりも多く、黒大豆種皮からの低重合プロアントシアニジンの効率的な抽出法となることがわかる。

＜実験１０：ブドウ種子からの、低重合度プロアントシアニジン高含有抽出物作成実験＞
〔実施例２９〕
生のデラウエア種のブドウ種子５０ｇを０．５％（ｖ／ｖ）硫酸水溶液５００ｍｌ中で、６０〜６５℃で２時間撹拌しながら抽出を行い、その後濾過により固形物を除去し抽出液を得た。この抽出液を、ポリスチレン系樹脂セパビーズＳＰ７００（三菱化学社製）５０ｍｌを充填した内径３０ｍｍのカラムに、ＳＶ５の流速で通液させ、樹脂にプロアントシアニジンを吸着させた。その後、４００ｍｌの精製水をカラムに流しカラムを洗浄した。更に、６０％エタノール水溶液２００ｍｌをＳＶ５の流速でカラムに流し、カラム樹脂よりプロアントシアニジンを溶出させ、溶出液を回収した。この溶出液をエバポレータにて濃縮し３．１ｇの抽出物を得た。

〔比較例１０〕
上記実施例２９に対し、従来の抽出方法である含水エタノールを用いた抽出方法を行った。すなわち、硫酸を加えないエタノール５０％＋水５０％を抽出溶媒として用いる以外は、上記実施例２９と同様の条件で抽出し、得られた抽出液からエバポレータにてエタノールを除去した後に水を加えて５００ｍｌの水溶液を得た。この溶液を、上記実施例２９と同様の条件で、ポリスチレン系樹脂セパビーズＳＰ７００（三菱化学製）５０ｍｌを充填した内径３０ｍｍのカラムを用いて、精製・濃縮し２．９ｇの抽出物を得た。

このようにして得られた実施例２９および比較例１０の抽出物の組成を、各種分析方法で分析した結果を、下記の表１に示す。

従来のプロアントシアニジン抽出方法で得られるブドウ種子抽出物の低重合度プロアントシアニジン（２〜４量体）含有率は、比較例１０にみられるように、３重量％にも満たないものであるが、実施例２９における本発明の抽出方法を行ったところ、表１の結果より、これを遥かに上回る低重合プロアントシアニジン（２〜４量体）含有率の抽出物が得られることが認められた。なお、表に記載していないが、構造が同定できなかった低重合プロアントシアニジン（２〜５量体）が、約１５重量％程度含有されていることも確認しており、上記抽出法により低重合プロアントシアニジンが２０〜３０％程度含有される抽出物を得ることができた。

なお、上記実施例においては、本発明における具体的な形態について示したが、上記実施例は単なる例示にすぎず、限定的に解釈されるものではない。さらに、請求の範囲の均等範囲に属する変更は、全て本発明の範囲内である。

本発明の低重合度プロアントシアニジンの製法により、植物体をはじめとする各種のプロアントシアニジン原料から、簡易な手法で、目的とする天然型の低重合度プロアントシアニジンを生成し、増産することが可能となる。そして、本発明の製法により得られた低重合度プロアントシアニジンは、天然型プロアントシアニジンであるため、食用等の、人体への適用に際しても安全である。そのため、上記のようにして生成した低重合度プロアントシアニジンを分離・精製し、目的とする生理活性（動脈硬化症予防、心血管疾患予防、抗糖尿病、抗肥満、内臓脂肪蓄積抑制、抗腫瘍、抗炎症、抗老化、抗酸化、坑糖化、抗アレルギー、抗菌、育毛、美白作用、血流改善作用等）を示す重合度数のものを、医薬品，飲食品，化粧品等の材料として安心して適用することができる。

Claims (7)

1. プロアントシアニジン原料の水系溶液を、下記（ａ）に示すスルホ基含有化合物の存在下で、５０〜８０℃の温度条件で低温加熱して、下記（α）に示す天然型の低重合度プロアントシアニジンを増産することを特徴とする低重合度プロアントシアニジンの製法。
   （ａ）硫酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、１０−カンファースルホン酸、およびスルホ基含有イオン交換樹脂からなる群から選ばれた少なくとも一つのスルホ基含有化合物。
   （α）プロシアニジンＢ１、プロシアニジンＢ２、プロシアニジンＣ１、およびシナムタンニンＡ２からなる群から選ばれた少なくとも一つの低重合度プロアントシアニジン。
2. 上記プロアントシアニジン原料が、増産する低重合度プロアントシアニジンよりも高重合度のプロアントシアニジンを含有するものであり、その分解により上記低重合度プロアントシアニジンを増産する、請求項１記載の低重合度プロアントシアニジンの製法。
3. 上記プロアントシアニジン原料が、増産する低重合度プロアントシアニジンよりも低重合度のプロアントシアニジンを含有するものであり、その合成により上記低重合度プロアントシアニジンを増産する、請求項１記載の低重合度プロアントシアニジンの製法。
4. 上記プロアントシアニジン原料が、増産する低重合度プロアントシアニジンよりも低重合度のプロアントシアニジンもしくはプロアントシアニジンの構成モノマーと、増産する低重合度プロアントシアニジンよりも高重合度のプロアントシアニジンとが混在したものである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の低重合度プロアントシアニジンの製法。
5. 上記スルホ基含有化合物の存在下での低温加熱を、１０〜２４０分間行う、請求項１〜４のいずれか一項に記載の低重合度プロアントシアニジンの製法。
6. 上記スルホ基含有化合物の存在下での低温加熱を、ｐＨ４．０以下の条件で行う、請求項１〜５のいずれか一項に記載の低重合度プロアントシアニジンの製法。
7. 上記プロアントシアニジン原料の水系溶液が、メタノールおよびエタノールの少なくとも一つと水との混合水を溶媒とする、請求項１〜６のいずれか一項に記載の低重合度プロアントシアニジンの製法。

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