JP4977024B2 - プロアントシアニジン含有物の製造方法 - Google Patents

Description

本発明は、生理活性が高いＯＰＣを多く含むプロアントシアニジン含有物を、効率よく製造する方法に関する。

プロアントシアニジンは、各種植物中に存在する縮合または重合（以下、縮重合という）したタンニンであり、フラバン−３−オールまたはフラバン−３，４−ジオールを構成単位として縮重合した化合物群である。これらは、酸処理によりシアニジン、デルフィニジン、ペラルゴニジンなどのアントシアニジン類を生成することから、その名称が与えられている。
プロアントシアニジンは、ポリフェノール類の一種で、植物が作り出す強力な抗酸化物質であり、植物の葉、樹皮、果物の皮もしくは種の部分に集中的に含まれている。プロアントシアニジンは、具体的には、ブドウの種、松の樹皮、ピーナッツの皮、イチョウ葉、ニセアカシアの果実、コケモモの果実などに含まれている。また、西アフリカのコーラナッツ、ペルーのラタニアの根、日本の緑茶にも、プロアントシアニジンが含まれることが知られている。プロアントシアニジンは、ヒトの体内では、生成することのできない物質である。
近年、これらのプロアントシアニジンの中でも、重合度が低いプロアントシアニジン、特に重合度が２〜４の縮重合体（２〜４量体）が、優れた生理活性を有することが報告されている。この重合度が２〜４の縮重合体は、一般的に、オリゴメリック・プロアントシアニジン（ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｃ ｐｒｏａｎｔｈｏｃｙａｎｉｄｉｎ：ＯＰＣ）と呼ばれる。
このようなプロアントシアニジンは、一般的には、植物体から抽出することによって得られる。抽出溶媒としては、一般に、水；メタノール、エタノール、アセトン、ヘキサン、酢酸エチルなどの有機溶媒；またはこれらの混合物が用いられる（特開平１１−８０１４８号公報）。しかし、単に溶媒による抽出のみでは、プロアントシアニジンの回収量は低く、純度も低い。したがって、健康食品、化粧品および医薬品原料として使用するためには、純度を上げるために、さらなる濃縮、精製などの工程が必要であり、コストおよび時間がかかる。
プロアントシアニジンを含むポリフェノール類を回収する方法としては、以下の方法が提案されている。例えば、特開平５−２７９２６４号公報および特開平６−５６６８９号公報には、ポリフェノール類をキチンに吸着させ、ポリフェノール類が吸着したキチンをポリフェノール製品として利用することが記載されている。特開２００２−９７１８７号公報には、植物抽出液にアスコルビン酸およびアルカリ金属またはその塩を添加して、ｐＨを６〜１１としてポリフェノール類の金属塩を沈殿させ、この沈殿物をイオン交換樹脂などで脱塩することによって遊離ポリフェノールを回収する方法が記載されている。
しかし、上記の方法で回収されるプロアントシアニジンは、重合度が高いものがほとんどであり、優れた効果を有する２〜４量体のＯＰＣの含有量は極めて低い。
植物体からＯＰＣを抽出する方法および／またはＯＰＣを合成する方法としては、特開平４−１９０７７４号公報、特開平１０−２１８７６９号公報、特開２００１−１３１０２７号公報、およびＥｂｅｒｈａｒｄ Ｓｃｈｏｌｚら，Ｐｒｏａｎｔｈｏｃｙａｎｉｄｉｎｓ ｆｒｏｍ Ｋｒａｍｅｒｉａ ｔｒｉａｎｄｒａ Ｒｏｏｔ，Ｐｌａｎｔａ Ｍｅｄｉｃａ，５５（１９８９），３７９−３８４頁に開示されている。しかし、上記抽出方法においては、植物体の抽出液を吸着体に接触させて、吸着した成分を溶出させ、得られた画分を回収した後、この画分を用いてさらに同じ工程を繰り返さなければ、ＯＰＣ含有量を高めることができず、効率的ではない。合成方法についても、工程数が多く、コストおよび時間がかかる問題、廃液処理の問題などがある。
さらに、本出願人は、植物体の抽出物または搾汁を、キチン、キトサン、またはその誘導体と接触させ、非吸着物を回収し、この非吸着物を合成樹脂系吸着剤で処理することによってプロアントシアニジン含有物が得られること（国際公開第０３／０９０７７０号公報）、および松樹皮抽出物を吸着性の樹脂（ダイアイオンＨＰ−２０など）で処理することによってプロアントシアニジン含有量が高められた松樹皮抽出物が得られること（特開２００５−４７８１８号公報）を開示している。
しかし、これら以外にも、簡便で、ＯＰＣを多く含有するプロアントシアニジンの精製方法が求められている。

本発明者らは、優れた生理活性を有するＯＰＣを高い割合で含有するプロアントシアニジン含有物を効率よく得る方法について鋭意検討した。その結果、松樹皮１質量部に対して、５０〜８０容量％のエタノール水溶液１０容量部を加えて８０〜８５℃にて１時間抽出したときに、乾燥質量換算で７質量％以上の固形物が得られる松樹皮を出発原料として用い、この松樹皮を水および有機溶媒のうちの少なくとも１種で抽出し、そして得られる抽出物を合成樹脂系吸着剤で処理することによって、ＯＰＣを１０質量％以上含有するプロアントシアニジン含有物が簡便でかつ効率良く得られることを見出して、本発明を完成するに至った。
本発明は、松樹皮１質量部に対して、５０〜８０容量％のエタノール水溶液１０容量部を加えて８０〜８５℃にて１時間抽出したときに、乾燥質量換算で７質量％以上の固形物が得られる松樹皮を出発原料とし、該松樹皮を水および有機溶媒のうちの少なくとも１種で抽出する工程、および該抽出物を合成樹脂系吸着剤で処理する工程を包含する、ＯＰＣを１０質量％以上含有するプロアントシアニジン含有物の製造方法を提供する。
ある実施態様においては、上記合成樹脂系吸着剤は、芳香族系樹脂、（メタ）アクリル酸系樹脂、および（メタ）アクリレート系樹脂からなる群より選択される少なくとも１種である。
ある実施態様においては、上記抽出物を合成樹脂系吸着剤で処理する工程において、該抽出物と該合成樹脂系吸着剤とを接触させた後に、アルコールを１０〜３０容量％含有する水溶液で溶出させ、溶出液を回収する。

本発明のプロアントシアニジン含有物の製造方法は、松樹皮１質量部に対して、５０〜８０容量％のエタノール水溶液１０容量部を加えて８０〜８５℃にて１時間抽出したときに、乾燥質量換算で７質量％以上の固形物が得られる松樹皮を出発原料とし、該松樹皮を水および有機溶媒のうちの少なくとも１種で抽出する工程（以下、抽出工程という）、および該抽出物を合成樹脂系吸着剤で処理する工程（以下、合成樹脂系吸着剤処理工程という）を包含する。本明細書においては、まず、本発明に用いる松樹皮を説明した後、抽出工程および合成樹脂系吸着剤処理工程を説明する。そして得られるプロアントシアニジン含有物について説明する。
（本発明に用いる松樹皮）
本発明に用いる松樹皮は、松樹皮１質量部に対して、５０〜８０容量％のエタノール水溶液１０容量部を加えて８０〜８５℃にて１時間抽出したときに、乾燥質量換算で７質量％以上、好ましくは１３質量％以上、より好ましくは１３質量％〜３０質量％の固形物（以下、含水エタノール可溶成分という）が得られる。含水エタノール可溶成分を７質量％以上含有する松樹皮を用いることによって、１回のカラム法でＯＰＣを１０質量％以上含有するプロアントシアニジン含有物を効率的に得ることが可能となる。エタノール含量が５０〜８０容量％の範囲を外れる水溶液を用いる場合、可溶成分が７質量％以上であってもＯＰＣを１０質量％以上含有する所望のプロアントシアニジン含有物は得られない。本発明においては、上記の抽出条件を用いて、松樹皮を予め選別することによって、ＯＰＣを１０質量％以上含有するプロアントシアニジン含有物を簡便に得ることができる点を特徴の一つとする。
上記松樹皮中の含水エタノール可溶成分の含有量は、例えば、以下のようにして測定することができる。まず、乾燥質量１００ｇの松樹皮を、例えば、カッター、スライサー、ミルなど、あるいはミキサー、ジューサー、ブレンダー、マスコロイダーなどの破砕機を用いて粉末化し、この粉末１００ｇに、５０〜８０容量％の含水エタノール１Ｌを加えて、８０〜８５℃にて１時間加熱還流抽出する。抽出後、遠心分離、ろ過などの分離操作を行い、不溶成分を除去して、抽出液を得る。抽出残渣に対して、さらに上記抽出操作および分離操作を１回以上繰り返す再抽出工程を行うことが、松樹皮中の含水エタノール可溶成分を正確に測定する観点から好ましい。得られた抽出液を凍結乾燥又は減圧濃縮乾固して、乾燥物とし、乾燥物の質量を測定する。そして、抽出前の松樹皮の乾燥質量に対する上記乾燥物の質量の割合を算出して、含水エタノール可溶成分の含有量が求められる。
（抽出工程）
本発明の方法は、まず、上記含水エタノール可溶成分を７質量％以上含有する松樹皮を水および有機溶媒のうちの少なくとも１種で抽出して松樹皮抽出物を得る。
上記抽出は、必要に応じて所定温度で保持することによって行われる。抽出効率の点から、松樹皮の体積当たりの表面積を大きくすることが好ましく、特に破砕物が好適に用いられる。松樹皮の破砕処理は、特に制限されず、例えば、上述の松樹皮中の含水エタノール可溶成分の含有量を測定する際に採用した破砕機を用いることができる。破砕効率を上げるために、松樹皮に、水、あるいはエタノール、メタノール、酢酸エチルなどの有機溶媒を加えて破砕してもよい。破砕物の大きさは、好ましくは０．１〜１０ｍｍ、より好ましくは０．１〜５ｍｍの細片である。
抽出においては、上述のように、水および有機溶媒のうちの少なくとも１種、すなわち水、有機溶媒、または水と有機溶媒との混合溶媒（以下、これらをまとめて抽出溶媒という）が用いられる。抽出効率を高める点から、抽出温度は高い方が好ましい。例えば、水を用いる場合、５０〜１２０℃、好ましくは７０〜１００℃で熱水抽出することが好ましい。松樹皮に熱水を加えてもよく、松樹皮に水を加えた後、加熱してもよい。抽出時間は、抽出温度により適宜決定され得る。一般的には１０分〜２４時間である。
有機溶媒としては、例えば、メタノール、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノール、１−ブタノール、２−ブタノール、アセトン、プロピレングリコール、含水エタノール、含水プロピレングリコール、メチルエチルケトン、グリセリン、酢酸メチル、酢酸エチル、１，１，１，２−テトラフルオロエタン、および１，１，２−トリクロロエテンが挙げられる。これらの有機溶媒は単独で用いてもよいし、組合わせて用いてもよい。製造時の廃液処理の観点、あるいは後述する合成樹脂系吸着剤による処理を行う観点からは、水、エタノール、または水とエタノールとの混合溶媒（含水エタノール）が好適に用いられる。水よりも沸点の低いエタノールなどの有機溶媒、あるいはこれらの有機溶媒と水との混合溶媒は、得られる松樹皮抽出物をさらに濃縮する際に濃縮を比較的低温かつ短時間で行うことができる。
最終的に得られるプロアントシアニジン含有物を食品、医薬品などとして用いる場合の安全性を考慮すると、水、エタノールまたは含水エタノールが特に好適である。
抽出溶媒の量は、目的とするプロアントシアニジン濃度および抽出効率を考慮して設定し得る。例えば、水、エタノール、または含水エタノールを抽出溶媒として使用する場合、松樹皮の乾燥質量１質量部に対して、抽出溶媒が好ましくは３〜１００質量部、より好ましくは１０〜５０質量部、あるいは好ましくは３〜１００容量部、より好ましくは１０〜１００容量部となるように設定される。なお、水および／または有機溶媒を添加して破砕した場合は、破砕に使用した溶媒量を考慮し、添加する抽出溶媒の量を調整すればよい。
有機溶媒を用いる抽出方法としては、加温抽出法あるいは超臨界流体抽出法が好適である。
加温抽出法としては、松樹皮に加温した溶媒を加える方法、または松樹皮に溶媒を添加して加温する方法が用いられる。例えば、松樹皮の破砕物に対して、抽出溶媒として、水とエタノールとの比が、質量比で１：１〜１：９である水−エタノール混合溶媒（含水エタノール）を、松樹皮の１倍〜２０倍量使用して、７０〜８５℃で還流させながら、０．５時間〜６時間攪拌する方法が挙げられる。還流しない場合は、例えば、一度上記混合溶媒を用いて、加温抽出し、濾過などにより上清を回収し、残渣について、再度上記混合溶媒を加えて加温することによっても、抽出効率を上げることが可能である。
超臨界流体抽出法は、物質の気液の臨界点（臨界温度、臨界圧力）を超えた状態の流体である超臨界流体を用いて目的成分を抽出する方法である。超臨界流体としては、二酸化炭素、エチレン、プロパン、亜酸化窒素（笑気ガス）などが用いられ、二酸化炭素が好ましく用いられる。
超臨界流体抽出法は、目的成分を超臨界流体によって抽出する抽出工程および目的成分と超臨界流体とを分離する分離工程からなる。分離工程では、圧力変化による抽出分離、温度変化による抽出分離、または吸着剤・吸収剤を用いた抽出分離のいずれを行ってもよい。
また、エントレーナー添加法による超臨界流体抽出を行ってもよい。この方法は、超臨界流体に、例えば、エタノール、プロパノール、ｎ−ヘキサン、アセトン、トルエン、その他の脂肪族低級アルコール類、脂肪族炭化水素類、芳香族炭化水素類、またはケトン類を２〜２０Ｗ／Ｖ％程度添加し、得られた抽出流体で超臨界流体抽出を行うことによって、ＯＰＣ、カテキン類（後述）などの目的とする被抽出物の抽出流体に対する溶解度を飛躍的に上昇させる、あるいは分離の選択性を増強させる方法であり、プロアントシアニジンを効率的に抽出する方法である。
抽出には、例えば、回分式、半連続式、または連続式などのいずれの抽出装置を用いてもよい。
上記抽出処理によって得られた抽出物は、必要に応じて、遠心分離や濾過などを行い、固形分あるいは抽出溶媒に不要な成分を除去しておいてもよい。濾過については、濾過の処理を短時間で行うために、ろ過助剤、例えば珪藻土を抽出物に添加してから濾過することが好ましく、この場合、添加するろ過助剤の量は、特に制限はなく、例えば、抽出物中の珪藻土の量として、０．００１ｇ／ｍＬ〜０．１ｇ／ｍＬ程度となるようにして添加される。
このように前処理することによって得られる松樹皮抽出物は、次いで、合成樹脂系吸着剤処理に供される。本発明においては、合成樹脂系吸着剤で処理する工程の前に、松樹皮抽出物を予め濃縮処理しておいても良い。濃縮処理は、松樹皮抽出物に含有される有機溶媒を除去することができるため、有機溶媒によって、合成樹脂系吸着剤処理が阻害される可能性がある場合には、特に好適に用いられる。濃縮処理する場合、予め松樹皮抽出物中の不溶物を濾過などにより除去することが好ましい。これにより、濃縮を均一に行うことができ、濃縮物の濃縮率の調整が容易になる。
濃縮方法としては、加熱濃縮、減圧濃縮、凍結乾燥、限外濾過膜による濃縮、透析膜による濃縮などの当業者が通常用いる方法が挙げられる。プロアントシアニジンおよびＯＰＣの熱変性が少ない点から、好ましくは減圧濃縮、凍結乾燥、および限外濾過膜による濃縮であり、より好ましくは、減圧濃縮である。これらの濃縮方法は、単独で行ってもよいし、複数を組み合わせて行ってもよい。
加熱濃縮を行う場合は、加熱によるプロアントシアニジンおよびＯＰＣの熱変性を防ぐために、通常、４０℃〜１００℃の温度で行われる。また、減圧濃縮においても、より短時間に濃縮を行うために、上記温度範囲において、加熱しながら減圧濃縮を行っても良い。
得られた濃縮物の濃縮率に特に制限はない。濃縮物の体積が、濃縮前の抽出物等の体積に比べて、好ましくは１／２〜１／１００容量、より好ましくは１／５〜１／７０容量、さらに好ましくは１／１０〜１／５０容量となるように濃縮が行われる。特に、松樹皮抽出物中の有機溶媒（例えばエタノール）濃度を１０容量％未満となるまで濃縮することが、プロアントシアニジンが高い収量で得られる点で好ましい。
（合成樹脂系吸着剤処理工程）
上記前処理工程で得られた松樹皮抽出物は、さらに合成樹脂系吸着剤で処理することにより、糖類、有機酸などの夾雑物が除去される。具体的には、松樹皮抽出物と合成樹脂系吸着剤とを接触させて、プロアントシアニジンを合成樹脂系吸着剤に吸着させた後、必要に応じて水で洗浄し、そして所定の溶媒で溶出させ、溶出液を回収することにより行われる。なお、松樹皮抽出物中の不溶物を予め除去することが、効率的な合成樹脂系吸着剤処理を行う点から好ましい。
上記処理に用いられる合成樹脂系吸着剤としては、有機系樹脂、イオン交換樹脂、シリカゲル、逆相シリカゲルなどが挙げられる。合成樹脂系吸着剤は、単独で用いてもよいし、処理方法に応じて２以上の吸着剤を組み合わせて用いてもよい。
有機系樹脂としては、例えば、芳香族系樹脂、（メタ）アクリル酸系樹脂、（メタ）アクリレート系樹脂、アクリロニトリル脂肪族系樹脂などが挙げられる。好ましくは、芳香族系樹脂、（メタ）アクリル酸系樹脂、および（メタ）アクリレート系樹脂である。
芳香族系樹脂としては、例えば、スチレンとジビニルベンゼンとの共重合体からなる樹脂が挙げられる。具体的には、このようなスチレンとジビニルベンゼンとの共重合体からなる樹脂としては、ダイアイオン（登録商標）ＨＰ２０、ＨＰ２１、ＨＰ３０、ＨＰ４０、ＨＰ５０、セパビーズ（登録商標）ＳＰ８００、ＳＰ８２５、ＳＰ８５０、ＳＰ８７５、ＳＰ７０、ＳＰ７００（以上、三菱化学株式会社製）、アンバーライト（登録商標）ＸＡＤ−４、ＸＡＤ−１６ＨＰ、ＸＡＤ−１１８０、ＸＡＤ−２０００（以上、株式会社オルガノ製）等が挙げられる。
（メタ）アクリル酸系樹脂としては、例えば、アクリル酸の重合体からなる樹脂、メタクリル酸の重合体からなる樹脂などが挙げられる。
（メタ）アクリレート系樹脂としては、例えば、アクリル酸エステルの重合体からなる樹脂、メタクリル酸エステルの重合体からなる樹脂などが挙げられる。アクリル酸エステルの重合体からなる樹脂としては、具体的には、アンバーライト（登録商標）ＸＡＤ−７ＨＰ等が挙げられる。メタクリル酸エステルの重合体からなる樹脂としては、具体的には、ダイアイオン（登録商標）ＨＰ−２ＭＧ（三菱化学株式会社製）などが挙げられる。
これらの吸着剤の中でも、特にスチレンとジビニルベンゼンとの共重合体からなる樹脂が好ましく、ダイアイオン（登録商標）ＨＰ２０、ＸＡＤ−１１８０、ＸＡＤ−２０００がさらに好ましい。スチレンとジビニルベンゼンとの共重合体からなる樹脂で処理する場合、予め松樹皮抽出物中の有機溶媒の濃度が１０質量％未満となるように濃縮しておくことが好ましい。このような濃縮物を上記共重合体で処理することによって、プロアントシアニジンが高い収率で得られる。
合成樹脂系吸着剤の量は、溶媒の種類、合成樹脂系吸着剤の種類等によって適宜設定すればよい。例えば、松樹皮抽出物の乾燥質量に対して、０．０１〜５０倍質量、好ましくは０．１〜２０倍質量の合成樹脂系吸着剤を使用することが好ましい。合成樹脂系吸着剤の量が、松樹皮抽出物の乾燥質量に対して０．０１倍質量より少ないと、プロアントシアニジンの回収率が下がる場合があり、好ましくない。
合成樹脂系吸着剤の中でも、プロアントシアニジンの吸着効率が高い合成樹脂系吸着剤、例えば、ダイアイオン（登録商標）、アンバーライト（登録商標）などを用いる場合は、吸着効率がよい点から、上記の松樹皮抽出物の乾燥質量を基準とすることなく、原料の松樹皮の乾燥質量を基準に簡便に量を設定することができる。具体的には、松樹皮の乾燥質量１ｇあたりの合成樹脂系吸着剤が、水などの溶媒に膨潤させた場合の見かけの膨潤体積量で０．１ｍＬ〜５ｍＬ、好ましくは０．５〜３ｍＬとなるように設定する。この場合においても、松樹皮抽出物と合成樹脂系吸着剤との接触は十分であり、効率的な吸着が可能である。
松樹皮抽出物と合成樹脂系吸着剤との接触は、いかなる方法で行ってもよい。例えば、簡易な方法としては、合成樹脂系吸着剤をカラムに充填し、松樹皮抽出物を通過させるカラム法、合成樹脂系吸着剤を松樹皮抽出物に加え、一定時間後、合成樹脂系吸着剤を除去するバッチ法などが挙げられる。
カラム法を用いて処理するには、例えば、まず、合成樹脂系吸着剤をカラムに充填し、そのカラムに松樹皮抽出物を通液する。次いで合成樹脂系吸着剤の体積に対して、必要に応じて、０．５〜１０倍の体積の水を通液させる。これにより、不純物である糖類および有機酸が除去される。その後、溶媒によりプロアントシアニジンを溶出して、合成樹脂系吸着剤より溶出した液を回収することでＯＰＣをより多く含むプロアントシアニジン含有物を得ることができる。
溶出溶媒としては、水、メタノール、エタノール、酢酸エチル、およびこれらの混合溶媒が挙げられる。安全性の面から好ましくは水とアルコール（メタノール、エタノールなど）との混合溶媒、より好ましくは水とエタノールとの混合溶媒が用いられる。
上記溶出溶媒として、水とアルコールとの混合溶媒を用いる場合、水とエタノールとの混合比は、用いる合成樹脂系吸着剤に応じて適宜設定され得る。例えば、スチレンとジビニルベンゼンの共重合体を合成樹脂系吸着剤として用いる場合、好ましくは５〜３０容量％、より好ましくは１０〜３０容量％、さらに好ましくは１５〜３０容量％、最も好ましくは２０〜３０容量％のアルコール（特にエタノール）を含有する水溶液が用いられる。このように設定することによって、好ましくは、松樹皮の乾燥質量の０．０１質量％以上、好ましくは０．０５質量％以上、より好ましくは０．１質量％以上の収率でプロアントシアニジン含有物を得ることが可能となる。なお、アルコール濃度が低い場合、例えば、５質量％未満の場合、得られるプロアントシアニジン含有物中のＯＰＣの含有量は高くなるが、カラムから吸着物を十分回収できなくなるため、プロアントシアニジン含有物の収率が低くなる場合がある。アルコール濃度が高い場合、例えば、３０容量％を超える場合、プロアントシアニジン含有物の収率は高くなるが、該含有物中のＯＰＣ含有量は低くなる場合がある。
バッチ法を用いて処理するには、上記カラム法と同様の質量比の合成樹脂系吸着剤を松樹皮抽出物に加え、攪拌しながら１〜３時間接触させた後に、濾過または遠心分離により吸着剤を回収する。プロアントシアニジンが吸着された合成樹脂系吸着剤を、さらに上記カラム法の場合と同様な組成の溶媒に加えて１時間〜３時間攪拌し、プロアントシアニジンを溶出させ、次いで濾過または遠心分離して上清を回収することにより、ＯＰＣをより多く含むプロアントシアニジン含有物を得ることができる。
このように、出発原料を特定し、抽出後、合成樹脂系吸着剤で処理することのみでＯＰＣを１０質量％以上含有するプロアントシアニジン含有物が得られる。
（プロアントシアニジン含有物）
このようにして得られたプロアントシアニジン含有物は、プロアントシアニジンを高い割合で含有し、特にＯＰＣを１０質量％以上含有する。ここで、プロアントシアニジン含有物には、その後、当業者が通常用いる方法によって得られる濃縮物、希釈物、粉末なども含まれる。
プロアントシアニジンは、生理活性の点から重合度が低いプロアントシアニジンが好ましく、重合度の低い縮重合体としては、重合度が２〜３０の縮重合体（２〜３０量体）が好ましく、重合度が２〜１０の縮重合体（２〜１０量体）がより好ましく、重合度が２〜４の縮重合体（２〜４量体）がさらに好ましい。本発明の製造方法によって得られるプロアントシアニジン含有物は、特にこの２〜４量体（オリゴメリック・プロアントシアニジン；ＯＰＣ）を乾燥質量換算で１０質量％以上、より好ましくは２０質量％以上、さらに好ましくは３０質量％以上、さらに好ましくは３５質量％以上、最も好ましくは４０質量％以上含有する。
本発明で得られるプロアントシアニジン含有物は、さらに、乾燥質量換算でカテキン類を好ましくは１〜１５質量％含有し得る。
カテキン類は、ポリヒドロキシフラバン−３−オールの総称である。カテキン類としては、（＋）−カテキン、（−）−エピカテキン、（＋）−ガロカテキン、（−）−エピガロカテキン、エピガロカテキンガレート、エピカテキンガレートなどが挙げられる。
本発明のプロアントシアニジン含有物は、さらに濃縮して種々の用途に利用することもできる。濃縮には、膜濃縮、加熱濃縮、真空（減圧）濃縮、凍結濃縮などの種々の方法が用いられる。
さらに必要に応じて、これらのプロアントシアニジン含有物を殺菌処理して保存する。殺菌は、高圧殺菌、加熱殺菌、濾過殺菌、マイクロウェーブ殺菌などの当業者が通常用いる方法により行われる。
また、これらのプロアントシアニジン含有物は、殺菌後、さらに濃縮、乾燥、および粉末化してもよい。乾燥は、当業者が通常用いる方法によって行われる。中でも、凍結乾燥、真空乾燥、噴霧乾燥、ドラム式乾燥、棚式乾燥、およびマイクロウェーブによる乾燥が好ましく用いられる。
得られたプロアントシアニジン含有物は、例えば、ドリンク剤およびゲル化した飲食物などとして利用できる。さらに、プロアントシアニジン含有物は、そのまま飲食に供するだけでなく、賦形剤、増量剤、結合剤、増粘剤、乳化剤、香料、食品添加物、調味料などと混合し、用途に応じて、顆粒、錠剤などの形態に成形することもできる。例えば、ローヤルゼリー、ビタミン類、プロテイン、カルシウム、キトサン、レシチン、カフェインなどと混合し、さらに糖液および調味料により味が整えられる。さらにこれらは、ハードカプセルおよびソフトカプセルなどのカプセル剤、丸剤、またはティーバッグ状などにされる。これらは、これらの形状または好みに応じて、そのまま食してもよく、あるいは水、湯、牛乳などに溶いて飲んでもよい。またティーバッグ状などの場合、成分を浸出させてから飲んでもよい。
上述のように、本発明により得られたプロアントシアニジン含有物は、食品、化粧品、および医薬品の原料として広く使用することができる。

以下、実施例に基づいて本発明を説明するが、この実施例は本発明を制限するものではない。実施例に示す単位（Ｖ／Ｖ）は（容量／容量）を、（Ｗ／Ｗ）は（質量／質量）を、（Ｗ／Ｖ）は（質量／容量）を示す。
（参考例：松樹皮の準備）
６種類の松樹皮を用意し、これらを各々松樹皮Ａ、松樹皮Ｂ、松樹皮Ｃ、松樹皮Ｄ、松樹皮Ｅ、および松樹皮Ｆとした。まず、２ｋｇの乾燥した松樹皮Ａをミルで１〜５ｍｍの大きさに粉砕して粉砕物とし、この粉砕物から１０ｇを分取してサンプルとした。このサンプルに、１００ｍＬの８０容量（Ｖ／Ｖ）％のエタノールを含有する水溶液を加えて、８０℃にて１時間還流抽出を行った。次いで、濾過し、濾液１を回収した。濾過残渣については、さらに上記と同様にエタノール水溶液を用いて抽出および濾過を行って濾液を得る操作を２回繰り返した（それぞれ濾液２および３という）。得られた濾液１〜３を合わせて抽出液とし、減圧濃縮乾固して乾燥物を得た（以下、含水エタノール可溶成分という）。この乾燥物の質量を測定したところ、１．３２ｇであった。したがって、この松樹皮Ａには、含水エタノール可溶成分が１３．２質量％含まれることがわかった。
松樹皮Ｂおよび松樹皮Ｃについても上記と同様の操作を行い、サンプル１０ｇから得られる含水エタノール（８０容量（Ｖ／Ｖ）％）可溶成分の質量を測定したところ、松樹皮Ｂについては０．７１ｇ、松樹皮Ｃについては０．５３ｇであった。したがって、松樹皮Ｂには含水エタノール可溶成分が７．１質量％含まれ、松樹皮Ｃには含水エタノール可溶成分が５．３質量％含まれることがわかった。
松樹皮Ｄについては、サンプル１０ｇから得られる含水エタノール（４０容量（Ｖ／Ｖ）％）可溶成分の質量を上記と同様の操作により測定した。その結果、０．７０ｇであった。なお、松樹皮Ｄの含水エタノール（８０容量（Ｖ／Ｖ）％）可溶成分の質量は０．６６ｇであった。
松樹皮Ｅついては、サンプル１０ｇから得られる含水エタノール（３０容量（Ｖ／Ｖ）％）可溶成分の質量を上記と同様の操作により測定した。その結果、０．３５ｇであった。なお、松樹皮Ｅの含水エタノール（８０容量（Ｖ／Ｖ）％）可溶成分の質量は０．４７ｇであった。
松樹皮Ｆついては、サンプル１０ｇから得られるエタノール（１００容量（Ｖ／Ｖ）％）可溶成分の質量を上記と同様の操作により測定した。その結果、０．７２ｇであった。なお、松樹皮Ｆの含水エタノール（８０容量（Ｖ／Ｖ）％）可溶成分の質量は０．６７ｇであった。
［実施例１］
上記の松樹皮Ａを用いて、以下のようにしてプロアントシアニジン含有物を得た。
１．抽出工程
まず、松樹皮Ａ１００ｇに、水０．５Ｌを加えて、９５℃以上にて１時間還流抽出を行った。次いで、濾過して０．５Ｌの濾液を回収し（濾液１とする）、さらに、濾過後の不溶物に対して、上記と同様に、水０．５Ｌを加えて還流抽出を行い、濾過して０．５Ｌの濾液を得た（濾液２とする）。濾液１と濾液２とを合わせて、１Ｌの松樹皮抽出液を得た。
２．合成樹脂系吸着剤処理工程
次いで、水で膨潤させたスチレン−ジビニルベンゼンの共重合体からなる樹脂（ダイアイオン（登録商標）ＨＰ−２０：三菱化学株式会社製）を膨潤体積量で０．５Ｌとなるように充填したカラムを準備し、このカラムに、上記の抽出液を通液し、抽出液中のプロアントシアニジンをカラムに吸着させた。このカラムを２Ｌの精製水で洗浄して、カラムに残存する糖類、有機酸などを除去した。次いで、５％（Ｖ／Ｖ）のエタノールを含有する水溶液１Ｌを用いて、カラムからプロアントシアニジンを溶出し、１Ｌのプロアントシアニジン含有液Ａを得た。この含有液Ａを凍結乾燥して乾燥質量を測定したところ、１１ｍｇであった。
３．含有液中の成分の測定
まず、上記項目１の前処理工程および項目２の合成樹脂系吸着剤処理工程を１０回繰り返して含有液Ａの乾燥粉末約１２０ｍｇを得た。得られた乾燥粉末１００ｍｇを２ｍＬのエタノールに溶解し、試料とした。
次いで、この試料を、セファデックスＬＨ−２０（アマシャムバイオテック株式会社製）を用いて、以下のようにして、ＯＰＣ画分と、５量体以上のプロアントシアニジン画分と、カテキン類画分と、カテキン類以外の成分の画分とに分画して各成分の含有量を測定した。
まず、水で膨潤させたセファデックスＬＨ−２０（アマシャムバイオテック株式会社製）２５ｍＬを１５ｍｍ×３００ｍｍのカラムに充填し、５０ｍＬのエタノールで洗浄した。このカラムに試料を通液して吸着させた後、１００〜８０％（Ｖ／Ｖ）エタノール−水混合溶媒でグラジエント溶出し、１０ｍＬずつ分取した。分取すると同時に、２〜４量体のＯＰＣの標品（２量体：プロアントシアニジンＢ−２（Ｒｆ値：０．６）、３量体：プロアントシアニジンＣ−１（Ｒｆ値：０．４）、および４量体：シンナムタンニンＡ_２（Ｒｆ値：０．２））を指標として、各画分中のＯＰＣの有無をシリカゲル薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）により以下の条件で検出した。
ＴＬＣ：シリカゲルプレート（Ｍｅｒｃｋ ＆ ＣＯ．，Ｉｎｃ．製）
展開溶媒：ベンゼン／蟻酸エチル／蟻酸（２／７／１）
検出試薬：硫酸およびアニスアルデヒド硫酸
サンプル量：各１０μＬ
ＴＬＣによりＯＰＣが含まれることを確認した溶出画分を合わせて、ＯＰＣ画分を得た。
次いで、ＯＰＣが検出されなくなった時点で、３００ｍＬの５０％（Ｖ／Ｖ）水−アセトン混合溶媒を通液し、カラムに吸着した残りの吸着物を溶出させた。
回収した吸着物を含む画分について、カテキン（Ｒｆ値：０．８）を指標として、ＴＬＣを行い、カテキン類を含む画分と５量体以上のプロアントシアニジン画分とに分離した。ＴＬＣの展開条件および検出方法は上記と同様に行った。
カテキン類を含む画分については、さらに、以下のようにしてカテキン類とカテキン類以外の成分とに分離した。まず、カテキン類を含む画分を凍結乾燥し、粉末を得た。この粉末を３ｍＬの水に溶解させ、この溶液を水で膨潤させた２０ｍＬのＭＣＩゲル（三菱化学株式会社製）を１５×３００ｍｍのカラムに充填したカラムに通液して吸着させた。このカラムを水で洗浄した後、１０〜１００％（Ｖ／Ｖ）エタノール−水混合溶媒でグラジエント溶出し、７ｍＬずつ分取した。溶出終了後、カテキンを指標として、各画分中のカテキン類をＴＬＣにより検出し、カテキン類画分とカテキン類以外の成分の画分とに分離した。
上記のようにして得たＯＰＣ画分、５量体以上のプロアントシアニジン画分、カテキン類画分、およびカテキン類以外の成分の画分をそれぞれ凍結乾燥により粉末化し、乾燥質量を測定した。なお、ＯＰＣ画分、５量体以上のプロアントシアニジン画分、カテキン類画分、カテキン類以外の成分の画分、およびその他の成分の画分の総和は、プロアントシアニジン含有液Ａの乾燥粉末１００ｍｇに対して９９ｍｇ以上であり、ほぼ全量回収されていた。表１に、松樹皮Ａ１００ｇから得られるプロアントシアニジン含有液Ａの乾燥質量（固形物質量）、そしてプロアントシアニジン含有液Ａの乾燥粉末中に含まれるＯＰＣの含有量、５量体以上のプロアントシアニジンの含有量、全プロアントシアニジン（ＯＰＣおよび５量体以上のプロアントシアニジンの合計）の含有量、およびカテキン類の含有量、ならびに全プロアントシアニジン中のＯＰＣの割合を示す。
［実施例２］
合成樹脂系吸着剤処理工程において、５％（Ｖ／Ｖ）のエタノールを含有する水溶液の代わりに、１０％（Ｖ／Ｖ）のエタノールを含有する水溶液を用いたこと以外は、実施例１と同様にして、プロアントシアニジン含有液Ｂを得た。この含有液Ｂの乾燥質量は５５ｍｇであった。実施例１と同様に、１００ｍｇの乾燥粉末を確保した後、各成分の含有量を測定した。結果を表１に併せて示す。
［実施例３］
合成樹脂系吸着剤処理工程において、５％（Ｖ／Ｖ）のエタノールを含有する水溶液の代わりに、２０％（Ｖ／Ｖ）のエタノールを含有する水溶液を用いたこと以外は、実施例１と同様にして、プロアントシアニジン含有液Ｃを得た。この含有液Ｃの乾燥質量は１３１ｍｇであった。実施例１と同様に、各成分の含有量を測定した。結果を表１に併せて示す。
［実施例４］
合成樹脂系吸着剤処理工程において、５％（Ｖ／Ｖ）のエタノールを含有する水溶液の代わりに、３０％（Ｖ／Ｖ）のエタノールを含有する水溶液を用いたこと以外は、実施例１と同様にして、プロアントシアニジン含有液Ｄを得た。この含有液Ｄの乾燥質量は２９５ｍｇであった。実施例１と同様に、各成分の含有量を測定した。結果を表１に併せて示す。
［実施例５］
松樹皮Ａの代わりに、松樹皮Ｂ（含水エタノール（８０容量（Ｖ／Ｖ）％）可溶成分７．１質量％含有）を用いたこと以外は、実施例３と同様にして、プロアントシアニジン含有液Ｅを得た。この含有液Ｅの乾燥質量は８２ｍｇであった。実施例１と同様に、１００ｍｇの乾燥粉末を確保した後、各成分の含有量を測定した。結果を表１に併せて示す。
（比較例１）
松樹皮Ａの代わりに、松樹皮Ｃ（含水エタノール（８０容量（Ｖ／Ｖ）％）可溶成分５．３質量％含有）を用いたこと以外は、実施例３と同様にして、プロアントシアニジン含有液Ｆを得た。この含有液Ｆの乾燥質量は６４ｍｇであった。実施例１と同様に、１００ｍｇの乾燥粉末を確保した後、各成分の含有量を測定した。結果を表１に併せて示す。
（比較例２）
松樹皮Ａの代わりに、松樹皮Ｄ（含水エタノール（４０容量（Ｖ／Ｖ）％）可溶成分７．０質量％含有）を用いたこと以外は、実施例３と同様にして、プロアントシアニジン含有液Ｇを得た。この含有液Ｇの乾燥質量は５３ｍｇであった。実施例１と同様に、１００ｍｇの乾燥粉末を確保した後、各成分の含有量を測定した。結果を表１に併せて示す。
（比較例３）
松樹皮Ａの代わりに、松樹皮Ｅ（含水エタノール（３０容量（Ｖ／Ｖ）％）可溶成分３．５質量％含有）を用いたこと以外は、実施例３と同様にして、プロアントシアニジン含有液Ｈを得た。この含有液Ｈの乾燥質量は４５ｍｇであった。実施例１と同様に、１００ｍｇの乾燥粉末を確保した後、各成分の含有量を測定した。結果を表１に併せて示す。
（比較例４）
松樹皮Ａの代わりに、松樹皮Ｆ（エタノール（１００容量（Ｖ／Ｖ）％）可溶成分７．２質量％含有）を用いたこと以外は、実施例３と同様にして、プロアントシアニジン含有液１を得た。この含有液１の乾燥質量は５０ｍｇであった。実施例１と同様に、１００ｍｇの乾燥粉末を確保した後、各成分の含有量を測定した。結果を表１に併せて示す。
（比較例５）
実施例１と同様にして、松樹皮抽出液を得（これをプロアントシアニジン含有液Ｊとする）、この松樹皮抽出液中に含まれる各成分の量を実施例１と同様にして測定した。結果を表１に併せて示す。

表１の結果からわかるように、実施例１〜５の松樹皮Ａおよび松樹皮Ｂを熱水抽出処理および合成樹脂系吸着剤処理して得られたプロアントシアニジン含有液Ａ〜Ｅは、ＯＰＣを１０質量％以上含有することがわかる。これらのことは、松樹皮１質量部に対して、５０〜８０容量％のエタノール水溶液１０容量部を加えて８０〜８５℃にて１時間抽出したときに、乾燥質量換算で７質量％以上の固形物が得られる松樹皮を出発原料として用い、さらに抽出処理および合成樹脂系吸着剤処理を行うことによって、ＯＰＣを１０質量％以上含有するプロアントシアニジン含有物が簡便に得られることを示す。
なお、実施例１〜４から、合成樹脂系吸着剤で処理する工程において、溶出溶媒のエタノール濃度が低くなるほど、ＯＰＣの含有量が増加し、収率が低くなる傾向にあることがわかる。逆に、エタノール濃度が高くなると松樹皮から得られる収量が増加する傾向にあることもわかる。
他方、比較例１〜４の松樹皮Ｃ〜Ｆを用いて得られたプロアントシアニジン含有液Ｆ〜Ｉまたは比較例５の松樹皮Ａを抽出処理のみ行って得られたプロアントシアニジン含有液Ｊは、ＯＰＣ含有量が１０質量％未満であった。特に松樹皮Ｄおよび松樹皮Ｆについては、ＯＰＣを抽出することが可能な溶媒である４０容量％エタノール水溶液または１００容量％エタノールを用いた場合の可溶成分が７質量％以上であるにもかかわらず、ＯＰＣ含量が１０質量％以上のプロアントシアニジン含有物は得られなかった。
［実施例６］
参考例の松樹皮Ａ１００ｇに１Ｌの精製水を加え、破砕し、１００℃で１０分間加熱した。次いで、直ちに濾過し、濾過後の不溶物を精製水２００ｍＬで洗浄し、濾液と洗浄液とを合わせて１．２Ｌの抽出液を得た。
次いで、２５℃まで放冷し、１００ｇのダイアイオン（登録商標）ＨＰ−２０を加え、３時間攪拌した後に濾過し、プロアントシアニジンが吸着した固形分を回収した。この固形分を４００ｍＬの精製水で洗浄し、２００ｍＬの２０％（Ｖ／Ｖ）エタノール水溶液を加え、１時間攪拌した後に濾過し、濾液を回収して、プロアントシアニジン含有液Ｋを得た。このプロアントシアニジン含有液Ｋを減圧濃縮乾固して、０．１３ｇの乾燥粉末を得た。この含有液Ｈの乾燥粉末１００ｍｇを用いて、上記実施例１と同様にしてＯＰＣおよびカテキン類の含有量を測定したところ、乾燥質量換算でＯＰＣが４１．１質量％およびカテキン類が１０．１質量％であった。
［実施例７］
実施例１の合成樹脂系吸着剤（ダイアイオン（登録商標）ＨＰ−２０）の代わりに、アンバーライト（登録商標）ＸＡＤ１１８０を用いたこと以外は、実施例１と同様にして、プロアントシアニジン含有液Ｌを得た。このプロアントシアニジン含有液Ｌを減圧濃縮乾固して、０．０７ｇの乾燥粉末を得た。実施例１と同様に、１００ｍｇの乾燥粉末を確保した後、ＯＰＣおよびカテキン類の含有量を測定したところ、乾燥質量換算でＯＰＣが３８．２質量％およびカテキン類が９．２質量％であった。
［実施例８］
実施例１の合成樹脂系吸着剤（ダイアイオン（登録商標）ＨＰ−２０）の代わりに、アンバーライト（登録商標）ＸＡＤ２０００を用いたこと以外は、実施例１と同様にして、プロアントシアニジン含有液Ｍを得た。このプロアントシアニジン含有液Ｍを減圧濃縮乾固して、０．１３ｇの乾燥粉末を得た。この含有液Ｊの乾燥粉末１００ｍｇを用いて、上記実施例１と同様にしてＯＰＣおよびカテキン類の含有量を測定したところ、乾燥質量換算でＯＰＣが４０．２質量％およびカテキン類が１０．２質量％含有であった。

本発明の方法によれば、松樹皮１質量部に対して、５０〜８０容量％のエタノール水溶液１０容量部を加えて８０〜８５℃にて１時間抽出したときに、乾燥質量換算で７質量％以上の固形物が得られる松樹皮を出発原料とし、さらに該松樹皮を水および有機溶媒のうちの少なくとも１種で抽出し、該抽出物を合成樹脂系吸着剤で処理することによって、ＯＰＣを１０質量％以上含有するプロアントシアニジン含有物を簡便かつ効率良く得ることができる。この方法は、コストおよび環境保全の面から特に有用である。得られたＯＰＣ含量が１０質量％以上のプロアントシアニジン含有物中には、カテキン類も含有し得る。これらのプロアントシアニジン含有物は、食品、化粧品、医薬品の製造原料として非常に有用である。

Claims (3)

1. 松樹皮１質量部に対して、８０容量％のエタノール水溶液１０容量部を加えて８０〜８５℃にて１時間抽出したときに、乾燥質量換算で７質量％以上の固形物が得られる松樹皮を選別する工程、
   該松樹皮を水および有機溶媒のうちの少なくとも１種で抽出する工程、および
   該抽出物に対して一回の合成樹脂系吸着剤処理でオリゴメリック・プロアントシアニジンを１０質量％以上含有するプロアントシアニジン含有物を得る工程
   を包含する、プロアントシアニジン含有物の製造方法。
2. 前記合成樹脂系吸着剤が、芳香族系樹脂、（メタ）アクリル酸系樹脂、および（メタ）アクリレート系樹脂からなる群より選択される少なくとも１種である、請求項１に記載の製造方法。
3. 前記抽出物を合成樹脂系吸着剤で処理する工程において、該抽出物と該合成樹脂系吸着剤とを接触させた後に、アルコールを１０〜３０容量％含有する水溶液で溶出させ、溶出液を回収する、請求項１または２に記載の製造方法。