WO2006112496A1

WO2006112496A1 - プロアントシアニジン含有物の製造方法

Info

Publication number: WO2006112496A1
Application number: PCT/JP2006/308265
Authority: WO
Inventors: Kinya Takagaki; Gotaro Yamaguchi
Original assignee: Toyo Shinyaku Co., Ltd.
Priority date: 2005-04-15
Filing date: 2006-04-13
Publication date: 2006-10-26
Also published as: US7863466B2; US20090124818A1

Abstract

本発明のプロアントシアニジン含有物の製造方法は、松樹皮１質量部に対して、５０～８０容量％のエタノール水溶液１０容量部を加えて８０～８５℃にて１時間抽出したときに、乾燥質量換算で７質量％以上の固形物が得られる松樹皮を出発原料とし、該松樹皮を水および有機溶媒のうちの少なくとも１種で抽出する工程、および該抽出物を合成樹脂系吸着剤で処理する工程を包含する。本発明の製造方法によって、ＯＰＣを１０質量％以上含有するプロアントシアニジン含有物が簡便かつ効率よく得られる。

Description

明細書プロアントシァニジン含有物の製造方法技術分野

本発明は、生理活性が高い O P Cを多く含むプロアントシァニジン含有物を、効率よく製造する方法に関する。背景技術

プロアントシァニジンは、各種植物中に存在する縮合または重合（以下、縮重合という）したタンニンであり、ブラパン一3—オールまたはフラバン一 3 , 4—ジオールを構成単位として縮重合した化合物群である。これらは、酸処理によりシァニジン、デルフィ二ジン、ペラルゴ二ジンなどのアントシァ-ジン類を生成することから、その名称が与えられている。

プロアントシァニジンは、ポリフエノール類の一種で、植物が作り出す強力な抗酸化物質であり、植物の葉、樹皮、果物の皮もしくは種の部分に集中的に含まれている。プロアントシァニジンは、具体的には、ブドウの種、松の樹皮、ピーナッツの皮、イチヨウ葉、ニセアカシアの果実、コケモモの果実などに含まれている。また、西アフリカのコーラナッツ、ペルーのラタ二ァの根、日本の緑茶にも、プロアントシァニジンが含まれることが知られている。プロアントシァニジンは、ヒトの体内では、生成することのできない物質である。

近年、これらのプロアントシァニジンの中でも、重合度が低いプロアントシァニジン、特に重合度が 2〜4の縮重合体（2〜4量体） 1 優れた生理 · 活性を有することが報告されている。この'重合度が 2〜4の縮重合体は、一般的に、オリゴメリック ·プロアントシァニジン (oligomeric proanthocya nidin : O P C ) と呼ばれる。

このようなプロアントシァニジンは、一般的には、植物体から抽出することによって得られる。抽出溶媒としては、一般に、水；メタノール、ェタノール、アセトン、へキサン、酢酸ェチルなどの有機溶媒；またはこれらの混合物が用いられる（特開平 1 1一 8 0 1 4 8号公報）。しかし、単に溶媒による抽出のみでは、プロアントシァニジンの回収量は低く、純度も低い。したがって、健康食品、化粧品および医薬品原料として使用するためには、純度を上げるために、さらなる濃縮、精製などの工程が必要であり、コストおよび時間がかかる。

プロアントシァニジンを含むポリフエノール類を回収する方法としては、以下の方法が提案されている。例えば、特開平 5— 2 7 9 2 6 4号公報およぴ特開平 6— 5 6 6 8 9号公報には、ポリフエノール類をキチンに吸着させ、ポリフエノーノレ類が吸着したキチンをポリフエノール製品として利用することが記載されている。特開 2 0 0 2— 9 7 1 8 7号公報には、植物抽出液にァスコルビン酸およびアルカリ金属またはその塩を添加して、 p Hを 6〜1 1としてポリフエノール類の金属塩を沈殿させ、この沈殿物をイオン交換樹脂などで脱塩することによつて遊離ポリフエノールを回収する方法が記載されている。

しかし、上記の方法で回収されるプロアントシァニジンは、重合度が高いものがほとんどであり、優れた効果を有する 2〜4量体の O P Cの含有量は極めて低い。

植物体から O P Cを抽出する方法および Zまたは O P Cを合成する方法としては、特開平 4 _ 1 9 0 7 7 4号公報、特開平 1 0— 2 1 8 7 6 9号公報、特開 2 0 0 1 - 1 3 1 0 2 7号公報、および Eberhard Scholzら， Proanthoc yanidins from Kramer i a triandra Root, Planta Medica, 55 (1989)， 379 - 384頁に開示されている。し力し、上記抽出方法においては、植物体の抽出液を吸着体に接触させて、吸着した成分を溶出させ、得られた画分を回収した後、この画分を用いてさらに同じ工程を繰り返さなければ、 O P C含有量を高めることができず、効率的ではない。合成方法についても、工程数が多く、コストおよぴ時間がかかる問題、廃液処理の問題などがある。

さらに、本出願人は、植物体の抽出物または搾汁を、キチン、キトサン、またはその誘導体と接触させ、非吸着物を回収し、この非吸着物を合成樹脂系吸着剤で処理することによってプロアントシァニジン含有物が得られること（国際公開第 0 3 / 0 9 0 7 7 0号公報）、および松樹皮抽出物を吸着性の樹脂（ダイアイオン H P— 2 0など）で処理することによってプロアントシァニジン含有量が高められた松樹皮抽出物が得られること（特開 2 0 0 5 - 4 7 8 1 8号公報）を開示している。

し力し、これら以外にも、簡便で、かつ O P Cを多く含有するプロアントシァニジンの精製方法が求められている。発明の開示

本発明者らは、優れた生理活性を有する O P Cを高い割合で含有するプロアントシァニジン含有物を効率よく得る方法について鋭意検討した。その結果、松樹皮 1質量部に対して、 5 0〜 8 0容量％のエタノール水溶液 1 0容量部を加えて 8 0〜8 5 °Cにて 1時間抽出したときに、乾燥質量換算で 7質量％以上の固形物が得られる松樹皮を出発原料として用い、この松樹皮を水 'および有機溶媒のうちの少なくとも 1種で抽出し、そして得られる抽出物を合成樹脂系吸着剤で処理することによって、 O P Cを 1 0質量％以上含有するプロアントシァニジン含有物が簡便でかつ効率良く得られることを見出して、本発明を完成するに至った。

本発明は、松樹皮 1質量部に対して、 5 0〜8 0容量％のェタノ一ル水溶液 1 0容量部を加えて 8 0〜8 5 °Cにて 1.時間抽出したときに、乾燥質量換算で 7質量％以上の固形物が得られる松榭皮を出発原料とし、該松樹皮を水および有機溶媒のうちの少なくとも 1種で抽出する工程、および該抽出物を合成樹脂系吸着剤で処理する工程を包含する、 0 〇を1 0質量％以上含有するプロアントシァニジン含有物の製造方法を提供する。

ある実施態様においては、上記合成樹脂系吸着剤は、芳香族系樹脂、（メタ）アクリル酸系樹脂、および（メタ）アタリレート系樹脂からなる群より選択される少なくとも 1種である。

ある実施態様においては、上記抽出物を合成樹脂系吸着剤で処理する工程において、該抽出物と該合成樹脂系吸着剤とを接触させた後に、アルコールを 1 0〜3 0容量％含有する水溶液で溶出させ、溶出液を回収する。発明を実施するための最良の形態

本発明のプロアントシァニジン含有物の製造方法は、松樹皮 1質量部に対して、 5 0〜8 0容量％のエタノール水溶液 1 0容量部を加えて 8 0〜8 5 °Cにて 1時間抽出したときに、乾燥質量換算で 7質量。 /₀以上の固形物が得られる松樹皮を出発原料とし、該松樹皮を水および有機溶媒のうちの少なくとも 1種で抽出する工程（以下、抽出工程という）、および該抽出物を合成樹脂系吸着剤で処理する工程（以下、合成樹脂系吸着剤処理工程という）を包含する。本明細書においては、まず、本発明に用いる松樹皮を説明した後、抽出工程および合成樹脂系吸着剤処理工程を説明する。そして得られるプロアントシァニジン含有物について説明する。

(本発明に用いる松樹皮）

本発明に用いる松樹皮は、松樹皮 1質量部に対して、 5 0〜8 0容量％のェタノール水溶液 1 0容量部を加えて 8 0〜 8 5 °Cにて 1時間抽出したときに、乾燥質量換算で 7質量％以上、好ましくは 1 3質量％以上、より好ましくは 1 3質量％〜3 0質量％の固形物（以下、含水エタノール可溶成分という）が得られる。含水エタノール可溶成分を 7質量％以上含有する松樹皮を用いることによって、 1回のカラム法で O P Cを 1 0質量％以上含有するプ口アントシァニジン含有物を効率的に得ることが可能となる。ェタノール含量が 5 0〜 8 0容量％の範囲を外れる水溶液を用いる場合、可溶成分が 7質量％以上であっても O P Cを 1 0質量％以上含有する所望のプロアントシァ二ジン含有物は得られない。本発明においては、上記の抽出条件を用いて、松樹皮を予め選別することによって、 O P Cを 1 0質量％以上含有するプロアントシァニジン含有物を簡便に得ることができる点を特徴の一つとする。上記松樹皮中の含水エタノール可溶成分の含有量は、例えば、以下のようにして測定することができる。まず、乾燥質量 1 0 0 gの松樹皮を、例えば、カッター、スライサー、ミルなど、あるいはミキサー、ジューサー、プレンダー、マスコ口イダーなどの破砕機を用いて粉末化し、この粉末 1 0 0 gに、 5 0〜8 0容量％の含水エタノール 1 Lを加えて、 8 0〜8 5 °Cにて 1時間加熱還流抽出する。抽出後、遠心分離、ろ過などの分離操作を行い、不溶成分を除去して、抽出液を得る。抽出残渣に対して、さらに上記抽出操作およぴ分離操作を 1回以上繰り返す再抽出工程を行うことが、松樹皮中の含水ェタノール可溶成分を正確に測定する観点から好ましい。得られた抽出液を凍結乾燥又は減圧濃縮乾固して、乾燥物とし、乾燥物の質量を測定する。そして、抽出前の松樹皮の乾燥質量に対する上記乾燥物の質量の割合を算出して、含水エタノール可溶成分の含有量が求められる。

(抽出工程）

本発明の方法は、まず、上記含水エタノール可溶成分を 7質量％以上含有する松樹皮を水および有機溶媒のうちの少なくとも 1種で抽出して松榭皮抽出物を得る。 - 上記抽出は、必要に応じて所定温度で保持することによって行われる。抽出効率の点から、松樹皮の体積当たりの表面積を大きくすることが好ましく、特に破碎物が好適に用いられる。松樹皮の破碎処理は、特に制限されず、例えば、上述の松樹皮中の含水エタノール可溶成分の含有量を測定する際に採用した破砕機を用いることができる。破砕効率を上げるために、松樹皮に、水、あるいはエタノール、メタノール、酢酸ェチルなどの有機溶媒を加えて破枠してもよい。破砕物の大きさは、好ましくは 0 . l〜1 0 mm、より好ましくは 0 . l〜5 mmの細片である。

抽出においては、上述のように、水おょぴ有機溶媒のうちの少なくとも 1 種、すなわち水、有機溶媒、または水と有機溶媒との混合溶媒（以下、これらをまとめて抽出溶媒という）が用いられる。抽出効率を高める点から、抽出温度は高い方が好ましい。例えば、水を用いる場合、 5 0〜1 2 0 °C、好ましくは 7 0〜 1 0 0 °Cで熱水抽出することが好ましい。松樹皮に熱水を加えてもよく、松榭皮に水を加えた後、加熱してもよい。抽出時間は、抽出温度により適宜決定され得る。一般的には 1 0分〜 2 4時間である。

有機溶媒としては、例えば、メタノール、エタノール、 1一プロパノール、 2—プロパノール、 1ープタノール、 2—プタノール、アセトン、プロピレングリコール、含水エタノール、含水プロピレングリコール、メチルェチルケトン、グリセリン、酢酸メチル、酢酸ェチル、 1 , 1， 1， 2—テトラフルォロェタン、および 1 , 1， 2—トリクロロェテンが挙げられる。これらの有機溶媒は単独で用いてもよいし、組合わせて用いてもよい。製造時の廃液処理の観点、あるいは後述する合成樹脂系吸着剤による処理を行う観点からは、水、エタノール、または水とエタノールとの混合溶媒（含水エタノール）が好適に用いられる。水よりも沸点の低いエタノールなどの有機溶媒、あるいはこれらの有機溶媒と水との混合溶媒は、得られる松樹皮抽出物をさらに濃縮する際に濃縮を比較的低温かつ短時間で行うことができる。最終的に得られるプロアントシァニジン含有物を食品、医薬品などとして用いる場合の安全性を考慮すると、水、エタノールまたは含水エタノールが特に好適である。

抽出溶媒の量は、目的とするプロアントシァニジン濃度および抽出効率を考慮して設定し得る。例えば、水、エタノール、または含水エタノールを抽出溶媒として使用する場合、松樹皮の乾燥質量 1質量部に対して、抽出溶媒が好ましくは 3〜1 0 0質量部、より好ましくは 1 0〜5 0質量部、あるいは好ましくは 3〜1 0 0容量部、より好ましくは 1 0〜1 0 0容量部となるように設定される。なお、水および/または有機溶媒を添加して破碎した場合は、破碎に使用した溶媒量を考慮し、添加する抽出溶媒の量を調整すればよい。

有機溶媒を用いる抽出方法としては、加温抽出法あるいは超臨界流体抽出法が好適である。

加温抽出法としては、松樹皮に加温した溶媒を加える方法、または松樹皮に溶媒を添加して加温する方法が用いられる。例えば、松樹皮の破枠物に対して、抽出溶媒として、水とエタノールとの比が、質量比で 1 ： 1〜： 1 ： 9 である水一ェタノール混合溶媒（含水ェタノール）を、松樹皮の 1倍〜 2 0 倍量使用して、 7 0〜 8 5 °Cで還流させながら、 0 . 5時間〜 6時間攪拌する方法が挙げられる。還流しない場合は、例えば、一度上記混合溶媒を用いて、加温抽出し、濾過などにより上清を回収し、残渣について、再度上記混合溶媒を加えて加温することによつても、抽出効率を上げることが可能である。

超臨界流体抽出法は、物質の気液の臨界点（臨界温度、臨界圧力）を超えた状態の流体である超臨界流体を用いて目的成分を抽出する方法である。超臨界流体としては、二酸化炭素、エチレン、プロパン、亜酸化窒素（笑気ガス）などが用いられ、二酸化炭素が好まし.く用いられる。超臨界流体抽出法は、目的成分を超臨界流体によって抽出する抽出工程および目的成分と超臨界流体とを分離する分離工程からなる。分離工程では、圧力変化による抽出分離、温度変化による抽出分離、または吸着剤 ·吸収剤を用いた抽出分離のいずれを行ってもよい。

また、ェントレーナー添加法による超臨界流体抽出を行ってもよい。この方法は、超臨界流体に、例えば、エタノール、プロパノール、 n —へキサン、アセトン、トルエン、その他の脂肪族低級アルコール類、脂肪族炭化水素類、芳香族炭化水素類、またはケトン類を 2〜 2 0 WZV%程度添加し、得られた抽出流体で超臨界流体抽出を行うことによって、 O P C、カテキン類（後述）などの目的とする被抽出物の抽出流体に対する溶解度を飛躍的に上昇させる、あるいは分離の選択性を増強させる方法であり、プロアントシァニジンを効率的に抽出する方法である。

抽出には、例えば、回分式、半連続式、または連続式などのいずれの抽出装置を用いてもよい。

上記抽出処理によって得られた抽出物は、必要に応じて、遠心分離や濾過などを行い、固形分あるいは抽出溶媒に不要な成分を除去しておいてもよい。濾過については、濾過の処理を短時間で行うために、ろ過助剤、例えば珪藻土を抽出物に添加してから濾過することが好ましく、この場合、添加するろ過助剤の量は、特に制限はなく、例えば、抽出物中の珪藻土の量として、 0 . 0 0 1 g Zm L〜 0 . 1 g Zm L程度となるようにして添加される。

このように前処理することによって得られる松樹皮抽出物は、次いで、合成樹脂系吸着剤処理に供される。本発明においては、合成樹脂系吸着剤で処理する工程の前に、松樹皮抽出物を予め濃縮処理しておいても良い。濃縮処理は、松樹皮抽出物に含有される有機溶媒を除去することができるため、有機溶媒によって、合成樹脂系吸着剤処理が阻害される可能性がある場合には、特に好適に用いられる。濃縮処理する場合、予め松樹皮抽出物中の不溶物を W

濾過などにより除去することが好ましい。これにより、濃縮を均一に行うことができ、濃縮物の濃縮率の調整が容易になる。

濃縮方法としては、加熱濃縮、減圧濃縮、凍結乾燥、限外濾過膜による濃縮、透析膜による濃縮などの当業者が通常用いる方法が挙げられる。ブロアントシァ-ジンおよび O P Cの熱変性が少ない点から、好ましくは減圧濃縮、凍結乾燥、および限外濾過膜による濃縮であり、より好ましくは、減圧濃縮である。これらの濃縮方法は、単独で行ってもよいし、複数を組み合わせて行ってもよレヽ。

加熱濃縮を行う場合は、加熱によるプロアントシァニジンおょぴ O P Cの熱変性を防ぐために、通常、 4 0 °C〜1 0 0 °Cの温度で行われる。また、減圧濃縮においても、より短時間に濃縮を行うために、上記温度範囲において、加熱しながら減圧濃縮を行つても良い。

得られた濃縮物の濃縮率に特に制限はない。濃縮物の体積が、濃縮前の抽出物等の体積に比べて、好ましくは 1 Z 2〜1 Z 1 0 0容量、より好ましくは 1 / 5〜1ノ7 0容量、さらに好ましくは l Z l 0〜1ノ5 0容量となるように濃縮が行われる。特に、松樹皮抽出物中の有機溶媒（例えばエタノール）濃度を 1 0容量％未満となるまで濃縮することが、プロアントシァニジンが高い収量で得られる点で好ましい。 (合成樹脂系吸着剤処理工程）

上記前処理工程で得られた松樹皮抽出物は、さらに合成樹脂系吸着剤で処理することにより、糖類、有機酸などの夾雑物が除去される。具体的には、松樹皮抽出物と合成樹脂系吸着剤とを接触させて、プロアントシァニジンを合成樹脂系吸着剤に吸着させた後、必要に応じて水で洗浄し、そして所定の溶媒で溶出させ、溶出液を回収することにより行われる。なお、松樹皮抽出 . 物中の不溶物を予め除去することが、効率的な合成樹脂系吸着剤処理を行う点から好ましい。

上記処理に用いられる合成樹脂系吸着剤としては、有機系樹脂、イオン交換榭脂、シリカゲル、逆相シリカゲルなどが挙げられる。合成樹脂系吸着剤は、単独で用いてもよいし、処理方法に応じて 2以上の吸着剤を組み合わせて用いてもよい。

有機系樹脂としては、例えば、芳香族系樹脂、（メタ）アクリル酸系樹脂、 (メタ）アタリレート系樹脂、アクリロニトリル脂肪族系樹脂などが挙げられる。好ましくは、芳香族系榭脂、（メタ）アクリル酸系榭脂、および（メタ）アタリレート系樹脂である。

芳香族系樹脂としては、例えば、スチレンとジビュルベンゼンとの共重合体からなる樹脂が挙げられる。具体的には、このようなスチレンとジビニルベンゼンとの共重合体からなる樹脂としては、ダイアイオン（登録商標） H P 20、 HP 21、 HP 30、 HP 40、 HP 50、セパビーズ（登録商標） SP 800、 SP825、 SP 850、 SP 875、 SP 70、 S P 7 00 (以上、三菱化学株式会社製）、アンバーライト（登録商標） XAD-

4 、 XAD- 16HP 、 XAD- 1 180、 XAD-2000 (以上、株式会社オルガノ製）等が挙げられる。

(メタ）アタリノレ酸系樹脂としては、例えば、アクリル酸の重合体からなる樹脂、メタクリル酸の重合体からなる樹脂などが挙げられる。

(メタ）ァクリレート系樹脂としては、例えば、アクリル酸エステルの重合体からなる樹脂、メタクリル酸エステルの重合体からなる樹脂などが挙げられる。アクリル酸エステルの重合体からなる樹脂としては、具体的には、アンパーライト（登録商標） XAD—7HP等が挙げられる。メタクリル酸エステルの重合体からなる樹脂としては、具体的には、ダイアイオン（登録商標） HP— 2MG (三菱化学株式会社製）などが挙げられる。

これらの吸着剤の中でも、特にスチレンとジビュルベンゼンとの共重合体力^なる樹脂が好ましく、ダイアイオン（登録商標） H P 2 0、 XAD - 1 1 8 0、 XAD— 2 0 0 0がさらに好ましい。スチレンとジビュルベンゼンとの共重合体からなる樹脂で処理する場合、予め松樹皮抽出物中の有機溶媒 ' の濃度が 1 0質量％未満となるように濃縮しておくことが好ましい。このような濃縮物を上記共重合体で処理することによって、プロアントシァニジンが高い収率で得られる。

合成樹脂系吸着剤の量は、溶媒の種類、合成樹脂系吸着剤の種類等によつて適宜設定すればよい。例えば、松樹皮抽出物の乾燥質量に対して、 0 . 0 1〜 5 0倍質量、好ましくは 0 . 1〜 2 0倍質量の合成樹脂系吸着剤を使用することが好ましい。合成樹脂系吸着剤の量が、松樹皮抽出物の乾燥質量に対して 0 . 0 1倍質量より少ないと、プロアントシァニジンの回収率が下がる場合があり、好ましくない。

合成樹脂系吸着剤の中でも、プロアントシァニジンの吸着効率が高い合成樹脂系吸着剤、例えば、ダイアイオン（登録商標）、アンパーライト（登録商標）などを用いる場合は、吸着効率がよい点から、上記の松樹皮抽出物の乾燥質量を基準とすることなく、原料の松樹皮の乾燥質量を基準に簡便に量を設定することができる。具体的には、松樹皮の乾燥質量 1 gあたりの合成樹脂系吸着剤が、水などの溶媒に膨潤させた場合の見かけの膨潤体積量で 0 . l m L〜5 m L、好ましくは 0 . 5〜 3 m Lとなるように設定する。この場合においても、松樹皮抽出物と合成樹脂系吸着剤との接触は十分であり、効率的な吸着が可能である。

松樹皮抽出物と合成樹脂系吸着剤との接触は、いかなる方法で行つてもよレ、。例えば、簡易な方法としては、合成樹脂系吸着剤をカラムに充填し、松樹皮抽出物を通過させるカラム法、合成樹脂系吸着剤を松樹皮抽出物に加え、一定時間後、合成樹脂系吸着剤を除去するパッチ法などが挙げられる。

カラム法を用いて処理するには、例えば、まず、合成樹脂系吸着剤をカラムに充填し、そのカラムに松樹皮抽出物を通液する。次いで合成樹脂系吸着剤の体積に対して、必要に応じて、 0 · 5〜1 0倍の体積の水を通液させる。これにより、不純物である糖類および有機酸が除去される。その後、溶媒によりプロアントシァニジンを溶出して、合成樹脂系吸着剤より溶出した液を回収することで O P Cをより多く含むプロアントシァニジン含有物を得ることができる。

溶出溶媒としては、水、メタノール、エタノール、酢酸ェチル、およぴこれらの混合溶媒が挙げられる。安全性の面から好ましくは水とアルコール (メタノール、エタノールなど）との混合溶媒、より好ましくは水とエタノールとの混合溶媒が用いられる。

上記溶出溶媒として、水とアルコールとの混合溶媒を用いる場合、水とェタノールとの混合比は、用いる合成樹脂系吸着剤に応じて適宜設定され得る。例えば、スチレンとジビュルベンゼンの共重合体を合成樹脂系吸着剤として用いる場合、好ましくは 5〜3 0容量％、より好ましくは 1 0〜3 0容量％、さらに好ましくは 1 5〜3 0容量％、最も好ましくは 2 0〜3 0容量％のァルコール（特にエタノール）を含有する水溶液が用いられる。このように設定することによって、好ましくは、松樹皮の乾燥質量の 0 . 0 1質量％以上、好ましくは 0 . 0 5質量％以上、より好ましくは 0 . 1質量％以上の収率でプロアントシァニジン含有物を得ることが可能となる。なお、アルコール濃度が低い場合、例えば、 5質量％未満の場合、得られるプロアントシァニジン含有物中の O P Cの含有量は高くなるが、カラムから吸着物を十分回収できなくなるため、プロアントシァニジン含有物の収率が低くなる場合がある。アルコール濃度が高い場合、例えば、 3 0容量％を超える場合、プロアントシァニジン含有物の収率は高くなるが、該含有物中の O P C含有量は低くなる場合がある。

バッチ法を用いて処理するには、上記カラム法と同様の質量比の合成樹脂系吸着剤を松樹皮抽出物に加え、攪拌しながら 1〜 3時間接触させた後に、濾過または遠心分離により吸着剤を回収する。プロアントシァニジンが吸着された合成樹脂系吸着剤を、さらに上記カラム法の場合と同様な組成の溶媒に加えて 1時間〜 3時間攪拌し、プロアントシァ-ジンを溶出させ、次いで濾過または遠心分離して上清を回収することにより、 O P Cをより多く含むプロアントシァニジン含有物を得ることができる。

このように、出発原料を特定し、抽出後、合成樹脂系吸着剤で処理することのみで O P Cを 1 0質量％以上含有するプロアントシァニジン含有物が得られる。

(プロアントシァニジン含有物)

このようにして得られたプロアントシァニジン含有物は、プロアントシァ二ジンを高い割合で含有し、特に O P Cを 1 0質量％以上含有する。ここで、プロアントシァニジン含有物には、その後、当業者が通常用いる方法によつて得られる濃縮物、希釈物、粉末なども含まれる。

プロアントシァニジンは、生理活性の点から重合度が低いプロアントシァ

'二ジンが好ましく、重合度の低い縮重合体としては、重合度が 2〜3 0の縮' 重合体（ 2〜 3 0量体）が好ましく、重合度が 2〜 1 0の縮重合体（ 2〜 1 0量体）がより好ましく、重合度が 2〜4の縮重合体（2〜4量体）がさらに好ましい。本発明の製造方法によって得られるプロアントシァニジン含有物は、特にこの 2〜4量体（オリゴメリック ·プロアントシァニジン； O P C) を乾燥質量換算で 1 0質量％以上、より好ましくは 2 0質量％以上、さらに好ましくは 3 0質量％以上、さらに好ましくは 3 5質量％以上、最も好ましくは 4 0質量％以上含有する。

本発明で得られるプロアントシァニジン含有物は、さらに、乾燥質量換算で力テキン類を好ましくは 1〜1 5質量％含有し得る。カテキン類は、ポリヒドロキシフラパン一 3—オールの総称である。カテキン類としては、（+ ) —カテキン、（一）ーェピカテキン、（+) —ガロカテキン、（一）一ェピガロカテキン、ェピガロカテキンガレート、ェピカテキンガレートなどが挙げられる。

本発明のプロアントシァニジン含有物は、さらに濃縮して種々の用途に利用することもできる。濃縮には、膜濃縮、カロ熱濃縮、真空（減圧）濃縮、凍結濃縮などの種々の方法が用いられる。

さらに必要に応じて、これらのプロアントシァニジン含有物を殺菌処理して保存する。殺菌は、高圧殺菌、加熱殺菌、濾過殺菌、マイクロウエーブ殺菌などの当業者が通常用いる方法により行われる。

また、これらのプロアントシァニジン含有物は、殺菌後、さらに濃縮、乾燥、および粉末ィ匕してもよい。乾燥は、当業者が通常用いる方法によって行われる。中でも、凍結乾燥、真空乾燥、噴霧乾燥、ドラム式乾燥、棚式乾燥、およぴマイクロウエープによる乾燥が好ましく用いられる。

得られたプロアントシァニジン含有物は、例えば、ドリンク剤およびゲル化した飲食物などとして利用できる。さらに、プロアントシァニジン含有物は、そのまま飲食に供するだけでなく、 s武形剤、増量剤、結合剤、增粘剤、乳化剤、香料、食品添加物、調味料などと混合し、用途に応じて、顆粒、錠剤などの形態に成形することもできる。例えば、ローヤルゼリー、ビタミン類、プロテイン、カルシウム、キトサン、レシチン、カフェインなどと混合し、さらに糖液および調味料により味が整えられる。さらにこれらは、ハードカプセルおよびソフトカプセルなどのカプセル剤、丸剤、またはテイーバッグ状などにされる。これらは、これらの形状または好みに応じて、そのまま食してもよく、あるいは水、湯、牛乳などに溶いて飲んでもよい。またテイーバッグ状などの場合、成分を浸出させてから飲んでもよい。

上述のように、本発明により得られたプロアントシァュジン含有物は、食品、化粧品、および医薬品の原料として広く使用することができる。実施例

以下、実施例に基づいて本努明を説明するが、この実施例は本発明を制限するものではない。実施例に示す単位 (V/V) は（容量 /容量）を、（W

Xw) は（質量/質量）を、（wZv) は（質量 Z容量）を示す。 (参考例：松樹皮の準備）

6種類の松樹皮を用意し、これらを各々松樹皮 A、松樹皮 B、松樹皮 C、松樹皮 D、松樹皮 E、および松樹皮 Fとした。まず、 2 k gの乾燥した松樹皮 Aをミルで:！〜 5 mmの大きさに粉碎して粉碎物とし、この粉碎物から 1 0 gを分取してサンプルとした。このサンプルに、 l O O m Lの 8 0容量 (V/V) %のエタノールを含有する水溶液を加えて、 8 0 °Cにて 1時間還流抽出を行った。次いで、濾過し、濾液 1を回収した。濾過残渣については、さらに上記と同様にエタノール水溶液を用いて抽出および濾過を行つて濾液を得る操作を 2回繰り返した（それぞれ濾液 2および 3という）。得られた濾液 1〜 3を合わせて抽出液とし、減圧濃縮乾固して乾燥物を得た（以下、含水エタノール可溶成分という）。この乾燥物の質量を測定したところ、 1 . 3 2 gであった。したがって、この松樹皮 Aには、含水エタノール可溶成分が 1 3 . 2質量％含まれることがわかった。

松樹皮 Bおよび松樹皮 Cについても上記と同様の操作を行い、サンプル 1 0 gから得られる含水エタノール（8 0容量（VZV) %) 可溶成分の質量を測定したところ、松樹皮 Bについては 0 . 7 1 g、松樹皮 Cについては 0 . 5 3 gであった。したがって、松樹皮 Bには含水エタノール可溶成分が 7 . 1質量％含まれ、松樹皮 Cには含水エタノール可溶成分が 5 . 3質量％含まれることがわかった。 . 松榭皮 Dについては、サンプル 10 gから得られる含水エタノール（40 容量 (V/V) %) 可溶成分の質量を上記と同様の操作により測定した。その結果、 0. 70 gであった。なお、松樹皮 Dの含水エタノール（80容量 (V/V) %) 可溶成分の質量は 0. 66 gであった。

松樹皮 Eついては、サンプル 10 gから得られる含水エタノール（30容量 (V/V) %) 可溶成分の質量を上記と同様の操作により測定した。その結果、 0. 35 gであった。なお、松樹皮 Eの含水エタノール（80容量 (V/V) %) 可溶成分の質量は 0. 47 gであった。

松樹皮 Fついては、サンプル 10 gから得られるエタノール（100容量 (V/V) %) 可溶成分の質量を上記と同様の操作により測定した。その結果、 0. 72 gであった。なお、松榭皮 Fの含水エタノール（80容量（V /V) %) 可溶成分の質量は 0. 67 gであった。

(実施例 1 )

上記の松樹皮 Aを用いて、以下のようにしてプロアントシァニジン含有物を得た。

1. 抽出工程

まず、松樹皮 A100 gに、水 0· 5 Lを加えて、 95°C以上にて 1時間還流抽出を行った。次いで、濾過して 0. 5 Lの濾液を回収し（濾液 1とする）、さらに、濾過後の不溶物に対して、上記と同様に、水 0. 5 Lを加えて還流抽出を行い、濾過して 0. 5 Lの濾液を得た（濾液 2とする）。濾液 1と濾液 2とを合わせて、 1 Lの松樹皮抽出液を得た。

2. 合成樹脂系吸着剤処理工程

次いで、水で膨潤させたスチレン一ジビュルべンゼンの共重合体からなる樹脂（ダイアイオン（登録商標） HP— 20 ：三菱化学株式会社製）を膨潤体積量で 0. 5 Lとなるように充填したカラムを準備し、このカラムに、上記の抽出液を通液し、抽出液中のプロアントシァニジンをカラムに吸着させた。このカラムを 2 Lの精製水で洗浄して、カラムに残存する糖類、有機酸などを除去した。次いで、 5% (V/V) のエタノールを含有する水溶液 1

Lを用いて、カラムからプロアントシァニジンを溶出し、 1 Lのプロアントシァニジン含有液 Aを得た。この含有液 Aを凍結乾燥して乾燥質量を測定したところ、 1 lmgであった。

3. 含有液中の成分の測定

まず、上記項目 1の前処理工程および項目 2の合成樹脂系吸着剤処理工程を 10回繰り返して含有液 Aの乾燥粉末約 12 Omgを得た。得られた乾燥粉末 l O Omgを 2mLのェタノールに溶解し、試料とした。

次いで、この試料を、セフアデックス LH— 20 (アマシャムバイオテツク株式会社製）を用いて、以下のようにして、 O PC画分と、 5量体以上のプロアントシァニジン画分と、力テキン類画分と、カテキン類以外の成分の画分とに分画して各成分の含有量を測定した。

まず、水で膨潤させたセフアデックス LH— 20 (アマシャムバイオテツク株式会社製） 25mLを 1 5mmX 30 Ommのカラムに充填し、 50m Lのエタノールで洗浄した。このカラムに試料を通液して吸着させた後、 1 00〜80% (V/V) エタノール一水混合溶媒でグラジェント溶出し、 1 OmLずつ分取した。分取すると同時に、 2〜4量体の O PCの標品（2量体：プロアントシァニジン B- 2 (R f値： 0. 6) 、 3量体：プロアントシァニジン C- 1 (R f値： 0. 4) 、および 4量体：シンナムタンニン A₂ (R f値： 0. 2) ) を指標として、各画分中の O PCの有無をシリカゲル薄層クロマトグラフィー（TLC) により以下の条件で検出した。

T L C ：シリ力ゲルプレート（Merck & CO. , Inc.製）

展開溶媒：ベンゼン蟻酸ェチル Z蟻酸（ 2 Z 7 Z 1 )

検出試薬：硫酸およびァニスアルデヒ.ド硫酸サンプル量：各 10 μ L

TLCにより OP Cが含まれることを確認した溶出画分を合わせて、 OP C画分を得た。次いで、 OP Cが検出されなくなった時点で、 300mLの 50% (V/ V) 水一アセトン混合溶媒を通液し、カラムに吸着した残りの吸着物を溶出させた。

回収した吸着物を含む画分について、カテキン（R f値： 0. 8) を指標として、 TLCを行い、力テキン類を含む画分と 5量体以上のプロアントシァニジン画分とに分離した。丁 L Cの展開条件および検出方法は上記と同様に行つた。

力テキン類を含む画分については、さらに、以下のようにしてカテキン類とカテキン類以外の成分とに分離した。まず、力テキン類を含む画分を凍結乾燥し、粉末を得た。この粉末を 3 mLの水に溶解させ、この溶液を水で膨潤させた 20 mLの MC Iゲル（三菱化学株式会社製）を 15 X 300 mm のカラムに充填したカラムに通液して吸着させた。このカラムを水で洗浄した後、 10〜 100 % (V/V) ェタノ一ルー水混合溶媒でダラジェント溶出し、 7mLずつ分取した。溶出終了後、カテキンを指標として、各画分中の力テキン類を TLCにより検出し、力テキン類画分とカテキン類以外の成分の画分とに分離した。

上記のようにして得た O PC画分、 5量体以上のプロアントシァニジン画分、力テキン類画分、およびカテキン類以外の成分の画分をそれぞれ凍結乾燥により粉末化し、乾燥質量を測定した。なお、 OPC画分、 5量体以上のプロアントシァニジン画分、力テキン類画分、カテキン類以外の成分の画分、およびその他の成分の画分の総和は、プロアントシァニジン含有液 Aの乾燥粉末 10 Omgに対して 99 mg以上であり、ほぼ全量回収されていた。表 1に、松樹皮 A100 gから得られるプロアントシァニジン含有液 Aの乾燥質量（固形物質量）、そしてプロアントシァニジン含有液 Aの乾燥粉末中に含まれる O P Cの含有量、 5量体以上のプロアントシァニジンの含有量、全プロアントシァニジン（O P Cおよび 5量体以上のプロアントシァニジンの合計）の含有量、およぴカテキン類の含有量、ならびに全プロアントシァ二ジン中の O P Cの割合を示す。

(実施例 2 )

合成樹脂系吸着剤処理工程において、 5 % (V/V) のエタノールを含有する水溶液の代わりに、 1 0 % (V/V) のエタノールを含有する水溶液を用いたこと以外は、実施例 1と同様にして、プロアントシァニジン含有液 B を得た。この含有液 Bの乾燥質量は 5 5 m gであった。実施例 1と同様に、

1 0 O m gの乾燥粉末を確保した後、各成分の含有量を測定した。結果を表

1に併せて示す。

(実施例 3 )

合成樹脂系吸着剤処理工程において、 5 % (V/V) のエタノールを含有する水溶液の代わりに、 2 0 % (V/V) のエタノールを含有する水溶液を用いたこと以外は、実施例 1と同様にして、プロアントシァニジン含有液 C を得た。この含有液 Cの乾燥質量は 1 3 1 m gであった。実施例 1と同様に、各成分の含有量を測定した。結果を表 1に併せて示す。

(実施例 4 )

合成樹脂系吸着剤処理工程において、 5 % (V/V) のエタノールを含有する水溶液の代わりに、 3 0 % (V/V) のエタノールを含有する水溶液を用いたこと以外は、実施例 1と同様にして、プロアントシァニジン含有液 D を得た。この含有液 Dの乾燥質量は 2 9 &m gであった。実施例 1と同様に、各成分の含有量を測定した。結果を表 1に併せて示す。 (実施例 5)

松樹皮 Aの代わりに、松樹皮 B (含水エタノール（8 0容量（V/ V) %) 可溶成分 7. 1質量％含有）を用いたこと以外は、実施例 3と同様にして、プロアントシァニジン含有液 Eを得た。この含有液 Eの乾燥質量は 82 m gであった。実施例 1と同様に、 100 m gの乾燥粉末を確保した後、各成分の含有量を測定した。結果を表 1に併せて示す。 (比較例 1 )

松樹皮 Aの代わりに、松樹皮 C (含水エタノール（8 0容量（VZ V) %) 可溶成分 5. 3質量％含有）を用いたこと以外は、実施例 3と同様にして、プロアントシァ-ジン含有液 Fを得た。この含有液 Fの乾燥質量は 64mgであった。実施例 1と同様に、 100 m gの乾燥粉末を確保した後、各成分の含有量を測定した。結果を表 1に併せて示す。

(比較例 2)

松樹皮 Aの代わりに、松榭皮 D (含水エタノール（40容量（VZ V) %) 可溶成分 7. 0質量％含有）を用いたこと以外は、実施例 3と同様にして、プロアントシァニジン含有液 Gを得た。この含有液 Gの乾燥質量は 53mgであった。実施例 1と同様に、 100 m gの乾燥粉末を確保した後、各成分の含有量を測定した。結果を表 1に併せて示す。

(比較例 3)

松樹皮 Aの代わりに、松樹皮 E (含水エタノール（3 0容量（VZ V) %) 可溶成分 3. 5質量％含有）を甩いたこと以外は、実施例 3と同様にして、プロアントシァニジン含有液 Hを得た。この含有液 Hの乾燥質量は 4 5 m gであった。実施例 1と同様に、 1 0 0 m gの乾燥粉末を確保した後、各成分の含有量を測定した。結果を表 1に併せて示す。

(比較例 4 )

松樹皮 Aの代わりに、松樹皮 F (エタノル（l o o容量（y/v) %) 可溶成分 7 . 2質量％含有）を用いたこと以外は、実施例 3と同様にして、プロアントシァニジン含有液 Iを得た。この含有液 Iの乾燥質量は 5 0 m g であった。実施例 1と同様に、 1 0 O m gの乾燥粉末を確保した後、各成分の含有量を測定した。結果を表 1に併せて示す。

(比較例 5 )

実施例 1と同様にして、松樹皮抽出液を得（これをプロアントシァニジン含有液 Jとする）、この松樹皮抽出液中に含まれる各成分の量を実施例 1と同様にして測定した。結果を表 1に併せて示す。

\S3

C71 表 1

*1···合成樹脂系吸着剤

*2" 'プロアントシァニジン

* 3 '■■ (OPCの含有量）（全プロアントシァニジンの含有量） X 100

* 4，·*エタノール水溶液

表 1の結果からわかるように、実施例 1〜 5の松榭皮 Aおよび松樹皮 Bを熱水抽出処理おょぴ合成樹脂系吸着剤処理して得られたプロアントシァニジン含有液 A〜Eは、 O P Cを 1 0質量％以上含有することがわかる。これらのことは、松樹皮 1質量部に対して、 5 0〜 8 0容量％のェタノール水溶液 1 0容量部を加えて 8 0〜 8 5 °Cにて 1時間抽出したときに、乾燥質量換算で 7質量％以上の固形物が得られる松樹皮を出発原料として用い、さらに抽出処理および合成樹脂系吸着剤処理を行うことによって、 0 ?じを1 0質量％以上含有するプロアントシァニジン含有物が簡便に得られることを示す。なお、実施例 1〜4から、合成樹脂系吸着剤で処理する工程において、溶出溶媒のエタノール濃度が低くなるほど、 O P Cの含有量が増加し、収率が俾くなる傾向にあることがわかる。逆に、エタノール濃度が高くなると松樹皮から得られる収量力 S増加する傾向にあることもわかる。

他方、比較例 1〜 4の松樹皮 C〜Fを用いて得られたプロアントシァニジン含有液 F〜 Iまたは比較例 5の松樹皮 Aを抽出処理のみ行って得られたプロアントシァニジン含有液 Jは、 O P C含有量が 1 0質量％未満であつた。特に松樹皮 Dおよぴ松樹皮 Fについては、 O P Cを抽出することが可能な溶媒である 4 0容量％エタノール水溶液または 1 0 0容量％エタノールを用いた場合の可溶成分が 7質量％以上であるにもかかわらず、 O P C含量が 1 0 質量％以上のプ口アントシァニジン含有物は得られなかつた。

(実施例 6 )

参考例の松樹皮 A 1 0 0 gに 1 Lの精製水を加え、破碎し、 1 0 0 °Cで 1 0分間加熱した。次いで、直ちに濾過し、濾過後の不溶物を精製水 2 0 O m Lで洗浄し、濾液と洗浄液とを合わせて 1 · 2 Lの抽出液を得た。次いで、 2 5 °Cまで放冷し、 l O O gのダイアイオン（登録商標） H P— 2 0を加え、 3時間攪拌した後に濾過し、.プロアントシァニジンが吸着した固形分を回収した。この固形分を 40 OmLの精製水で洗浄し、 200mL の 20% (V/V) エタノール水溶液を加え、 1時間攪拌した後に濾過し、濾液を回収して、プロアントシァニジン含有液 Kを得た。このプロアントシァニジン含有液 Kを減圧濃縮乾固して、 0. 1 3 gの乾燥粉末を得た。この含有液 Hの乾燥粉末 10 Omgを用いて、上記実施例 1と同様にして O P C およぴカテキン類の含有量を測定したところ、乾燥質量換算で OPCが 41. 1質量％およびカテキン類が 10. 1質量％であった。

(実施例 7)

実施例 1の合成樹脂系吸着剤（ダイアイオン（登録商標） HP— 20) の代わりに、アンバーライト（登録商標） XAD 1 180を用いたこと以外は、実施例 1と同様にして、プロアントシァニジン含有液 Lを得た。このブロアントシァニジン含有液 Lを減圧濃縮乾固して、 0 · 07 gの乾燥粉末を得た。実施例 1と同様に、 10 Omgの乾燥粉末を確保した後、 O PCおよびカテキン類の含有量を測定したところ、乾燥質量換算で OPCが 38. 2質量％およぴカテキン類が 9. 2質量％であった。

(実施例 8)

実施例 1の合成樹脂系吸着剤（ダイアイオン（登録商標） HP— 20) の代わりに、アンパーライト（登録商標） XAD 2000を用いたこと以外は、実施例 1と同様にして、プロアントシァニジン含有液 Mを得た。このブロアントシァニジン含有液 Mを減圧濃縮乾固して、 0. 13 gの乾燥粉末を得た。この含有液 Jの乾燥粉末 10 Omgを用いて、上記実施例 1と同様にして O P Cおよび力テキン類の含有量を測定したところ、乾燥質量換算で O P Cが 40. 2質量％およびカテキン類が 10. 2質量％含有であった。産業上の利用可能性

本発明の方法によれば、松樹皮 1質量部に対して、 5 0〜8 0容量％のェタノール水溶液 1 0容量部を加えて 8 0〜 8 5 °Cにて 1時間抽出したときに、乾燥質量換算で 7質量％以上の固形物が得られる松樹皮を出発原料とし、さらに該松樹皮を水および有機溶媒のうちの少なくとも 1種で抽出し、該抽出物を合成樹脂系吸着剤で処理することによつて、 O P Cを 1 0質量％以上含有するプロアントシァニジン含有物を簡便かつ効率良く得ることができる。この方法は、コストおよび環境保全の面から特に有用である。得られた O P C含量が 1 0質量％以上のプロアントシァニジン含有物中には、カテキン類も含有し得る。これらのプロアントシァニジン含有物は、食品、化粧品、医薬品の製造原料として非常に有用である。

Claims

請求の範囲

1 . 松樹皮 1質量部に対して、 5 0〜 8 0容量％のェタノール水溶液 1 0容量部を加えて 8 0〜 8 5 °Cにて 1時間抽出したときに、乾燥質量換算で 7質量％以上の固形物が得られる松樹皮を出発原料とし、

該松榭皮を水および有機溶媒のうちの少なくとも 1種で抽出する工程、および

該抽出物を合成樹脂系吸着剤で処理する工程

を包含する、 0 ?〇を1 0質量％以上含有するプロアントシァニジン含有物の製造方法。

2 . 前記合成樹脂系吸着剤が、芳香族系樹脂、（メタ）アクリル酸系樹脂、および（メタ）アタリレート系樹脂からなる群より選択される少なくとも 1 種である、請求項 1に記載の製造方法。

3 . 前記抽出物を合成樹脂系吸着剤で処理する工程において、該抽出物と該合成樹脂系吸着剤とを接触させた後に、アルコールを 1 0〜3 0容量％含有する水溶液で溶出させ、溶出液を回収する、請求項 1または 2に記載の製造方法。