KR101689618B1 - 소나무 수피로부터 저분자 프로안토시아니딘류의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 소나무 수피를 열수 추출하고 열수 추출물에 존재하는 다양한 분자량의 프로안토시아니딘류를 상업용 흡착제에 흡착시킨 후, 40~100℃에서 탈착시킴에 의하여, 식품 및 의약품에 사용 할 수 있는 저분자 프로안토시아니딘을 간단히 제조할 수 있는 방법에 관한 것이다.

Description

소나무 수피로부터 저분자 프로안토시아니딘류의 제조방법{Method for preparing low-molecular-weight proanth℃yanidins from pine bark}

본 발명은 소나무 수피 열수 추출물로부터 분자량 1,000 Da 이하이고, 3량체 이하인 저분자 프로안토시아니딘류의 제조방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 소나무 수피를 열수 추출하고 열수 추출물에 존재하는 다양한 분자량의 프로안토시아니딘류를 상업용 흡착제에 흡착시킨 후, 40~100℃에서 탈착시킴에 의하여 식품 및 의약품에 사용 할 수 있는 저분자 프로안토시아니딘을 간단히 제조할 수 있는 방법에 관한 것이다.

소나무 수피는 목재 산업에서 부산물로 다량 파생되며 주로 소각하여 열원으로 사용되거나 폐기된다. 그러나 소나무 수피는 프로안토시아니딘류(Proanth℃yanidins, PAs)의 주요 원천이며 유럽 등에서 수피 추출물이 피부 노화, 심혈관계 질환의 예방 및 치료 목적의 식이 보조제로 사용되고 있다(Rohdewald, P., Int. J. Clin. Pharmacol. Ther., 40: 158(2002).

하기 화학식 1과 같은 프로안토시아니딘류는 다양한 식물의 잎, 열매, 수피, 뿌리 등에 널리 분포하고 있는 물질로서, 주로 플라반-3-올(flavan-3-ol)의 C4-C8 결합을 기본 골격으로 한다(Ku C.S. and Mun, S.P., Wood Sci Technol, 41(3); 235(2007)).

최근 프로안토시아니딘류가 다양한 생리 활성, 즉 항산화(Ku, C.S. and Mun, S.P., Wood Sci Technol., 42(1); 47-60(2008)), 항균, 항염증 활성(Liu, X.외 5인, Life sciences, 74: 855(2004), 항암 효과(Bomser, J.A.외 3인, Cancer Letters 135: 151(1999), Reddy, L.외 2인, Pharmacology & Therapeutics 99: 1(2003), Chung, K.T.외 2인, Trends in Food Science & Technology, 9: 168(1998)) 등으로 인해 주목 받고 있으며, 이에 따른 많은 연구가 보고되고 있다.

이러한 프로안토시아니딘류는 분자의 중합도(DP)와 화학적 구조에 따라 서로 다른 생리 활성을 가진다(Ku, C.S. and Mun, S.P. Wood Science & Technology, 42: 47(2008).

프로안토시아니딘류를 기능성 화장품 원료 및 식품 첨가물로 사용하기 위해서는 분자량 1,500 이하 (5량체 이하)인 저분자의 프로안토시아니딘류가 요구되고 있어, 체계적인 분자량 분획이 필요하다.

따라서, 소나무 수피에 존재하는 프로안토시아니딘류를 추출하여 분자량 및 중합도에 따라 분리하고, 그 특성을 파악할 필요성이 대두되고 있는 실정이다.

본 발명자는 상기와 같은 종래기술의 문제점을 해결하기 위한 연구를 지속적으로 진행하여, 소나무 수피 열수추출물 중의 저분자 프로안토시아니딘류를 기존의 복잡한 분리 정제 수단을 거치지 않고, 상업용 흡착제와 열수처리로 간단히 3량체 이하의 저분자 프로안토시아니딘류를 제조할 수 있는 방법을 알아내고 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 저렴한 상업용 흡착제에 다양한 분자량을 가지는 프로안토시아니딘류를 흡착시킨 후, 열수를 이용하여 강력한 항산화 능력을 가지는 3량체 이하의 저분자 프로안토시아니딘류를 선택적으로 분리 정제할 수 있는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명은 상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, (a) 소나무 수피를 열수 추출하여 열수 추출물을 수득하는 단계, (b) 상기 열수 추출물을 흡착제에 흡착시키는 단계, 및 (c) 상기 열수 추출물이 흡착된 흡착제에 열수를 처리하여, 분자량이 1000 Da 이하이고, 3량체 이하인 저분자의 프로안토시아니딘류를 탈착시키는 단계를 포함하는 저분자 프로안토시아니딘류의 제조방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기의 방법에 의해 제조되고, 분자량이 1000 Da 이하이며, 3량체 이하인 저분자의 프로안토시아니딘류를 제공한다.

본 발명의 소나무 수피 열수 추출물을 상업용 수지에 흡착시킨 후 열수 탈착하는 방법은 기존의 유기 용매에 의한 분리나 복잡한 추출 정제공정 없이 단지 특정 온도의 열수 탈착에 의하여 고순도이면서 3량체 이하의 저분자 프로안토시아니딘을 얻을 수 있다.

즉, 본 발명은 소나무 수피로부터 열수 추출물을 조제하고. 이를 상업용 흡착제에 처리하여 고가의 프로안토시아니딘을 흡착시킨 후 단순한 열수 처리로 특정 분자량의 프로안토시아니딘, 특히 시아니딘 골격의 화합물을 용이하게 분리해 낼 수 있는 장점이 있다.

또한, 본 발명에 얻어지는 저분자 프로안토시아니딘은 높은 항산화 활성을 가지고 있어, 본 발명에 의해 얻은 저분자 프로안토시아니딘은 식품, 의약품, 화장품 등의 다양한 용도로 사용될 수 있다.

도 1은 다양한 탈착 온도에서의 탈착물의 용리 특성을 나타낸 것이다.
도 2는 각 탈착온도에서 탈착 시 280 nm에서의 각 온도별 탈착물의 흡광도 변화를 나타낸 것이다.
도 3은 순수 프로안토시아니딘(PAs) 및 열수 탈착물의 분자량 분포를 나타낸 것이다.
도 4는 90℃(a) 및 70℃(b)에서 탈착한 시료의 ¹³C NMR 스펙트라를 나타낸 것으로, 도 4에서 PC는 프로시아니딘(pr℃yanidin)을 의미하고, PD는 프로델피니딘(prodelphinidin)을 의미한다.
도 5는 아세틸화 열수 탈착물의 MALDI TOF Mass 스펙트라를 나타낸 것이다.
도 6은 각 열수 탈착물 및 순수 프로안토시아니딘의 DPPH 라디칼 소거 활성을 나타낸 것이다.

본 발명은 (a) 소나무 수피를 열수 추출하여 열수 추출물을 수득하는 단계, (b) 상기 열수 추출물을 흡착제에 흡착시키는 단계, 및 (c) 상기 열수 추출물이 흡착된 흡착제에 열수를 처리하여, 분자량이 1000 Da 이하이고, 3량체 이하인 저분자의 프로안토시아니딘류를 탈착시키는 단계를 포함하는 저분자 프로안토시아니딘류의 제조방법에 관한 것이다.

본 발명의 저분자 프로안토시아니딘류의 제조방법에서, 상기 소나무 수피는 라디아타 소나무 수피, 적송 수피, 흑송 수피, 리기다 소나무 수피를 사용 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 저분자 프로안토시아니딘류의 제조방법에서, 상기 소나무 수피는 입자크기가 40~325메쉬(mesh)인 분말을 사용할 수 있다.

본 발명의 저분자 프로안토시아니딘류의 제조방법에서, 상기 소나무 수피는 입자크기가 80~200메쉬(mesh)인 분말을 사용할 수 있다.

본 발명의 저분자 프로안토시아니딘류의 제조방법에서, 상기 소나무 수피는 입자크기가 100~150메쉬(mesh)인 분말을 사용할 수 있다.

본 발명의 저분자 프로안토시아니딘류의 제조방법에서, 상기 소나무 수피를 열수 추출 전 초음파 처리, 저주파 처리, 전기장 처리, 자기장 처리 중에서 선택된 어느 하나 이상의 처리를 추가로 실시 할 수 있다.

본 발명의 저분자 프로안토시아니딘류의 제조방법에서, 상기 (a) 단계는 소나무 수피와 물의 중량비인 액비를 1: 5~20으로 소나무 수피를 물에 분산시키는 단계 및 소나무 수피 분말을 1~100℃, 바람직하게는 실온~100℃, 보다 바람직하게는 80~100℃에서 5~60분 동안 추출하는 단계를 포함할 수 있다. 본 발명의 저분자 프로안토시아니딘류의 제조방법에서, 상기 "실온"은 20~25℃를 의미한다.

본 발명의 저분자 프로안토시아니딘류의 제조방법에서, 상기 (a) 단계에 의해 소나무 수피로부터 프로안토시아니딘이 주성분으로 함유된 열수 추출물을 수득할 수 있다.

본 발명의 저분자 프로안토시아니딘류의 제조방법에서, 상기 (b) 단계의 흡착제는 폴리스티렌계 흡착제인 Diaion HP 20, HP 21, HP 2MG, HP 20SS, Superbeads SP8252, SP850, SP700이나 다당류인 Sepharose, Agarose, 및 실리카겔, 활성탄 등을 사용할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 저분자 프로안토시아니딘류의 제조방법에서, 상기 (c) 단계의 열수의 온도, 즉 탈착 온도는 40℃ 내지 100℃일 수 있다.

본 발명의 저분자 프로안토시아니딘류의 제조방법에서, 상기 열수의 온도, 즉 탈착 온도는 70℃ 내지 90℃일 수 있다.

본 발명의 저분자 프로안토시아니딘류의 제조방법에서, 상기 저분자의 프로안토시아니딘류의 분자량은 500~1000 Da일 수 있다.

본 발명의 저분자 프로안토시아니딘류의 제조방법에서, 상기 저분자의 프로안토시아니딘류의 분자량은 900~1000 Da일 수 있다.

본 발명의 저분자 프로안토시아니딘류의 제조방법에서, 상기 저분자의 프로안토시아니딘류는 단량체, 2량체 또는 3량체일 수 있다.

본 발명의 저분자 프로안토시아니딘류의 제조방법에서은 상기 탈착된 프로안토시아니딘류를 농축 건조하는 단계를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 상기 저분자 프로안토시아니딘류의 제조방법에 의하면, 소나무 수피 열수 추출물에 함유된 프로안토시아니딘류 이외의 불순물과 고분자량의 프로안토시아니딘류를 제거한 후, 순도 높은 저분자 프로안토시아니딘류를 제조할 수 있다.

본 발명의 상기 저분자 프로안토시아니딘류의 제조방법은 소나무 수피로부터 프로안토시아니딘이 함유된 추출물의 추출시 다양한 조건에 의해 본 발명을 실시한바, 본 발명의 목적을 위해서는 상기에서 언급한 조건에서 열수를 이용하여 소나무 수피로부터 프로안토시아니딘이 함유된 추출물을 제조하는 것이 바람직하다.

또한 본 발명은 상기의 방법에 의해 제조되고, 분자량이 1000 Da 이하이며, 3량체 이하인 저분자 프로안토시아니딘류에 관한 것이다.

본 발명의 상기 저분자 프로안토시아니딘류의 분자량은 500~1000 Da일 수 있다.

본 발명의 상기 저분자 프로안토시아니딘류의 분자량은 900~1000 Da일 수 있다.

본 발명의 상기 저분자의 프로안토시아니딘류는 단량체, 2량체 또는 3량체일 수 있다.

본 발명의 상기 저분자의 프로안토시아니딘류에서, 상기 2량체의 일예를 들면 하기 화학식 2의 프로시아니딘 2량체 B3를 들 수 있다.

이하 본 발명의 내용을 하기 실시예 및 실험예를 통하여 구체적으로 설명한다. 그러나, 이들은 본 발명을 보다 상세하게 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 권리범위가 이들에 의해 한정되는 것은 아니다.

<실시예>

이하의 실시예에서 공시재료는 소나무 수피는 라디아타 소나무 수피를 사용하였다.

라디아타 소나무 수피는 전라북도 군산시 서수면 축동리 소재 (주)한영목재로부터 제공받았다. 수집된 수피는 3일간 자연건조 후 60±1℃의 송풍 건조기에서 48시간 건조시켰다.

건조된 수피는 분쇄기로 분쇄한 후 표준체를 사용하여 다양한 메시(mesh)의 수피 분말을 얻었다. 수피 분말은 지퍼 백에 담아 보관하였으며, 이를 공시 재료로 사용하였다.

<실시예 1> 열수 추출물의 조제

500 ml 용량의 평저 둥근 플라스크에 라디아타 소나무 수피 분말 10 g(o.d.)와 100 ml의 증류 이온교환수를 취하였다. 상기 라디아타 소나무 수피 분말(1mm 통과분)의 함수율은 14%이었다.

상기 플라스크를 미리 110℃로 가열시켜 놓은 PEG#400조에 넣고, 냉각관을 부착 한 후 때때로 흔들어주며 1시간 동안 가열하였다.

1시간 가열된 시료는 17G3 글래스 필터로 여과하였고, 90℃ 이상의 열수 200 ml로 플라스크와 잔사를 세정하였다. 그 후 필터는 105℃ 오븐에서 하룻밤 건조하고 열수 추출물 수율을 하기 식 1에 의해 계산한 결과, 상기 열수 추출물의 수율은 평균 28%이었다.

여과물은 세정수와 합쳐 500ml 용량의 메스실린더에 400 ml로 하였고, 이것을 열수 추출물(HWE)로 하였다.

<식 1>

상기에서, PB는 라디아타 소나무 수피 분말의 전건 중량(g), R은 열수추출물의 잔사 중량(g)을 나타낸다.

<실시예 2> 흡착제를 이용한 열수 추출물 중의 프로안토시아니딘류의 흡착

상기 열수 추출물 400 ml를 20℃의 폴리스티렌계 흡착제인 Diaion HP 20이 충진된 컬럼(3.2×21cm)에 3시간에 걸쳐 통과 시킨 후, 증류 이온교환수로 흡착제를 세정하였다.

흡착시키기 전 및 후의 열수 추출물의 280 nm에서의 흡광도를 분광 분석기(HP 8452 diode array spectrophotometer, HP, USA)로 측정하고, 흡광도의 차이로부터 흡착량을 확인하였다.

<실시예 3> 저분자 프로안토시아니딘류(시아니딘류)의 탈착

프로안토시아니딘이 흡착된 칼럼에 50℃, 60℃, 70℃, 80℃, 90℃의 열수를 흘려주었다. 각 온도에서 탈착된 용리물은 30분에 한 번씩 280 nm에서 흡광도를 측정하였다.

90℃ 열수 탈착이 끝난 뒤 95%(v/v) 에탄올을 흘려 칼람내에 남아있는 프로안토시아니딘류를 제거하였다. 각 온도별 탈착물은 동결건조하였으며, 건조된 시료들은 다시 P₂O₅하에서 진공 건조하였다.

별도로 단독 탈착 조건 즉, 70℃ 또는 90℃ 열수 탈착을 검토하였다. 각 온도 조건에서 1.8~2 L의 용리물을 받아낸 후 이들은 감압 농축하고 동결건조하였다. 동결건조된 시료들은 다시 P₂O₅하에서 진공건조하였다.

<실험예>

이하의 실험예에서, 기기 분석은 다음과 같이 하였다.

¹³C NMR 분석을 위하여 열수 탈착시료 100 mg을 acetone-d₆/D₂O = 1:1에 녹인 후 여과하였고, 그 여과액은 NMR tube에 넣어 분석하였다. 분석은 JEOL JNM-EX 400 스펙트로미터를 이용하였다.

MALDI TOF Mass 분석을 위하여 아세틸화 열수 탈착물을 사용하였다. 아세틸화는 각 열수 탈착물 (20 mg)을 1ml 피리딘으로 완전히 녹인 뒤, 1 ml의 무수 초산을 가하고 48시간 실온에 방치하면서 때때로 흔들어 주면서 실시하였다.

그 후, 냉수에 아세틸화물을 떨어뜨린 후, 생성되는 침전을 nylon 66 membrane filter(지름 47 mm, pore size 0.45 ㎛)로 여과, 세정하고 건조하였다. 0.6 mg의 아세틸화된 각 시료는 0.5 ml 테트라하이드로퓨란(THF)에 녹였다. DHB matrix는 70%(v/v) aqueous acetone에 녹였으며, 이온화 강화제로는 소디음 클로라이드를 70%(v/v) aqueous acetone에 녹여 매트릭스에 더해주었다. 매트릭스, 시료 및 이온화제는 10:1:1로 혼합하여 보텍스해 주었다.

이렇게 조제된 혼합 용액 1-2 ㎕는 두 개의 다른 MALDI 타겟에 놓고 공기 중에서 용매를 건조시켰다. 분석은 N₂-laser(337 nm)가 장착된 Applied Biosystems VOYAGER-STR MALDI-TOF MS (Palo Alto, CA, USA)을 이용하여 분석하였다.

또한, 분자량 및 분자량 분포는 GPC분석에 의하여 확인하였다. 즉, 상기 아세틸화한 시료 1 mg을 THF 1 ml에 녹인 후 GPC분석을 실시하였다. 분석은 Shimadzu LC-10AD pump와 Spectra 100 variable wavelength detector가 연결된 시스템에서 GPC column (10×300mm, AM GEL, American Polymer Standards Co., USA)을 사용하였다.

이때, 이동상 THF는 유속 0.5 ml/min으로 하여 분석하였다. 시료와 페놀은 280 nm에서, 표준물질(Polystyrene standards, American Polymer Standards Co., USA)은 254 nm에서의 흡광도를 30분간 측정하였다.

분자량은 폴리스티렌 표준물질과 페놀로 작성한 표준곡선으로부터 계산하였다.

<실험예 1> 다양한 온도에서의 열수 탈착

상기 실시예 3과 같이, 50℃에서 90℃까지 10℃씩 온도를 증가시키면서 흡착 물질의 탈착을 실시하였다. 이때, 도 1에 나타낸 것처럼, 50℃에서 70℃까지는 10분 간격으로, 80℃에서 90℃까지는 30분 간격으로 열수탈착물의 280 nm에서 흡광도를 측정하였다.

다양한 온도조건에서의 탈착시 탈착물의 수율을 나타내는 하기 표 1에 나타낸 것처럼, 각 설정 온도에서 탈착량이 70℃까지는 그 수율의 합이 3%이하였으며, 80℃에서부터 그 탈착량이 약 2배로 증가하였다.

본 실험예에서 60℃ 이하의 온도에서는 탈착되는 물질의 양이 적었으므로, 이하의 실험에서는 70℃ 또는 90℃로 탈착 온도를 설정하였다.

얻어진 70℃와 90℃ 열수 탈착 분획의 수율은 상기 표 1에 나타내었다. 각 분획의 수율은 95% 에탄올 탈착 분획을 100으로 하였을 경우, 70℃ 탈착의 경우 6.5%, 90℃에서는 9.4%를 나타내었다.

탈착 온도가 70℃에서 90℃로 높임에 따라 수율은 약 3% 증가하였다. 이러한 각 각의 탈착 온도에서의 수율은 상술한 다양한 온도별 탈착 실험에서의 조건에 비하여 각각 3% 이상 더 많이 얻어졌다.

이것은 짧은 탈착 시간으로 인해 흡착물의 열 변성이 적었던 것을 의미하는 것으로 판단되었다.

한편, 각 탈착 온도에서 탈착시의 280 nm에서의 각 온도별 탈착물의 흡광도 변화를 도 2에 나타내었다.

<실험예 2> 탈착물의 분자량 분포 및 분자량

상기 실시예 3과 같이, 70℃ 및 90℃의 탈착 온도에서 탈착한 탈착물의 중량평균 분자량(Mw) 및 수평균 분자량(Mn)을 측정한 결과를 하기 표 2 및 도 3에 나타내었다. 이때, 대조군으로는 상기 화학식 1에서 R이 H인 순수 프로안토시아니딘을 사용하였다.

도 3은 아세틸화된 시료의 분자량 분포를 나타낸 것이다. 도 3에 나타낸 것처럼 탈착 온도가 증가함에 따라 피크점이 분자량 증가를 나타내는 왼쪽으로 약간 이동하였다. 즉, 90℃ 열수 탈착물의 분자량이 70℃ 열수 탈착물의 분자량보다 크다는 것을 의미한다.

상기 양 온도 조건에서의 탈착물은 순수 PAs에 비하여 분자량 분포의 폭이 매우 작았다. 이것은 탈착물 중의 성분의 분자량이 매우 균일함을 나타낸다.

폴리스티렌 표준 물질과 페놀로 표준곡선을 작성하였으며 이에 따라 계산된 수평균 분자량, 중량평균 분자량 및 다분산도를 하기 표 2에 나타내었다.

하기 표 2를 참조하면, 열수 탈착물의 중량 평균 분자량은 70℃의 경우 926 Da, 90℃가 974 Da을 나타내었다. 프로안토시아니딘의 기본 구성 단위를 시아니딘 골격의 카테킨이라고 하면, 본 단량체의 아세틸화물의 분자량은 500 정도이다. 따라서 각 온도 별 탈착물은 평균 2량체의 프로안토시아니딘으로 구성되어 있음을 예상할 수 있었다.

<실험예 3> 탈착물의 특성화

도 4 및 표 3은 70℃, 90℃ 열수 탈착물의 400 MHz ¹³C NMR 스펙트럼과 각각의 피크의 귀속을 나타낸 것이다.

도 4의 27.2 ppm에서 나타난 피크는 이량체 또는 3량체 프로시아니딘류의 4번 탄소에 의한 것으로 확인되었으며, 이것은 다른 이량체들과 가장 뚜렷하게 차이를 나타낸 부분이었다.

또한 ¹³C NMR스펙트럼의 피크 귀속 결과, 탈착물은 대부분 프로시아니딘류이며, C2, C3의 경우 주로 trans형으로 이루어져 있음을 확인 하였다.

또한, 열수 탈착물은 C4와 C8이 연결된 (+)catechin-(4α→8)-(+)catechin 골격의 PC 이량체(2,3-trans procyanidin B3; 상기 화학식 2)가 많이 함유되어 있음을 알 수 있었다.

116 ppm과 107 ppm 피크 높이 비율은 프로시아니딘(PC)과 프로델피니딘(PD) 존재 비율은 의미하는데, 도 4에 스펙트럼상에 이들 피크의 높이를 보면 본 탈착물의 대부분은 PC이고, 단지 소량의 PD가 존재하는 것으로 판단되었다.

도 5는 70℃와 90℃ 열수 탈착물의 MALDI TOF Mass 분석 결과이다. 분자량 522의 주요 피크는 [시아니딘] 골격에 Na⁺가 결합하여 나타나는 피크이고, 그 다음 분자량 580에서 피크는 [델피니딘] 골격에 Na⁺가 결합하여 나타나는 피크이다.

피크 높이로 부터 본 탈착물에는 단분자량인 시아니딘 골격의 카테킨과 소량의 델피니딘 골격의 갈로카테킨이 존재하는 것으로 판단되었다.

분자량 1020의 주요 피크는 [시아니딘 + 시아니딘] 골격에 Na⁺가 결합하여 나타나는 피크이고, 그 다음 분자량 1078에서 나타나는 피크는 [시아니딘 + 델피니딘] 골격에 Na⁺가 결합하여 나타나는 피크로 시아니딘 이량체가 주성분임을 알 수 있었다.

분자량 1518의 피크는 [3 시아니딘] 골격에 Na⁺가 결합한, 분자량 1576의 피크는 [2 시아니딘 + 1 델피니딘] 골격에 Na⁺가 결합하여 나타나는 피크이다.

이 결과로 각 화합물의 정확한 수율을 계산할 수는 없으나, 도 6에 나타낸 것처럼 70℃와 90℃ 탈착물은 대부분 시아니딘 단량체, 2량체와 3량체로 이루어져 있고, 90℃ 열수 탈착물에 상대적으로 시아니딘 이량체가 많은 것으로 해석하였다.

MALDI TOF Mass 피크 높이를 토대로 중량 평균 분자량과 다분산도를 계산하면 전술한 GPC 결과와 좋은 일치를 보였다.

<실험예 4> 탈착물의 항산화 활성

항산화 활성은 DPPH법으로 확인하였다. 99% 메탄올을 사용하여 0.15 mM DPPH(Sigma, St. Louis, USA) 100 ml를 조제하였다. 순수 프로안토시아니딘(PAs), 70℃, 90℃ 열수 탈착물은 2 mg/ml 농도의 모액 2 ml를 조제하였다.

70℃ 및 90℃ 열수 탈착물은 99% 메탄올에 완전히 녹지 않고 약간의 침전이 발생하였다. 따라서 각 시료가 담긴 바이알을 동일하게 3분 초음파 처리하였다.

순수 PAs, 70℃, 90℃ 열수 탈착물은 각각 100 μg/ml, 50 μg/ml, 25 μg/ml, 12.5 μg/ml, 6.25 μg/ml, 3.125 μg/ml 농도로 96-웰에 취하였으며, 멀티 채널 피펫을 사용하여 0.15mM DPPH 용액을 각 웰에 150 ㎕씩 가하였다.

상기 96-웰 플레이트를 마이크로플레이트 리더(ELx808IU, Bio-Tek instruments Inc., USA)에 넣고, 25℃에서 30분간 프리 인큐베이션(free incubation) 하였다.

그 뒤 플레이트의 뚜껑을 제거한 뒤, 515 nm에서 흡광도를 확인하였다. DPPH 라디칼 소거능는 하기 식 2에 의해 계산하였다.

<식 2>

도 6은 열수 탈착물의 항산화활성을 DPPH 라디칼 소거능으로 나타낸 것이다. 각 열수 탈착물의 농도에 따른 항산화 활성은 비교를 위하여 나타낸 상기 화학식 1에서 R이 H인 순수 프로안토시아니딘과 유사하였다.

본 발명은 기존의 방법에 비하여 유기용매를 사용하지 않으므로, 식품 의약품 사용에 대한 제한이 없으며, 제조상에 있어서 폐기물을 배출하지 않는다는 장점이 있다.

또한, 본 방법에 의하여 고분자 및 저분자 프로안토시아니딘을 용이하게 분리정제할 수 있으므로, 이용상에 있어서 기존의 다양한 분자량의 혼합물 또는 조추출물 형태로 판매되는 제품에 비하여 경쟁력 있는 방법이라고 할 수 있기 때문에, 식품, 의약품 및 화장품 산업 등에 유용하게 적용될 수 있다.

Claims (8)

1. (a). 소나무 수피의 입자 크기는 10μm 내지 1mm이며, 상기 소나무 수피와 물의 중량비인 액비를 1:2 내지 1:5로 소나무 수피를 물에 분산시키고, 80 내지 100℃에서 5 내지 60분 동안 열수 추출하여 열수 추출물을 수득하는 단계;
   (b). 상기 열수 추출물 400㎖를 20℃의 1종의 폴리스티렌계 흡착제에 3시간 동안 통과시켜 흡착시키는 단계;
   (c). 상기 열수 추출물이 흡착된 흡착제에 90℃의 열수를 처리하여, 열수 탈착물을 수득하는 단계; 및
   (d). 상기 열수 탈착물을 아세틸화하여, 아세틸화된 열수 탈착물인 저분자의 프로안토시아니딘류를 수득하는 단계로서, 상기 아세틸화된 열수 탈착물의 중량평균분자량이 974 Da인 단계를 포함하는, 저분자 프로안토시아니딘류의 제조방법.
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