KR20090010964A - 계피 종을 포함하는 추출물 및 방법 - Google Patents

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조지 더블유. 사이퍼트
댄 리
랜달 에스. 알버트
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Abstract

본 발명은 초임계 CO2 추출 방법에 의해 제조된 계피 종 식물 물질의 추출에 관한 것이다.

Description

계피 종을 포함하는 추출물 및 방법 {Extracts and Methods Comprising Cinnamon Species}
본 출원은 2006년 3월 23일에 출원된 미국 가출원 제60/785,012호, 및 2006년 12월 7일에 출원된 제60/873,475호에 대한 우선권의 이익을 주장하며, 이들은 여기서 전부 참조로 통합된다.
본 발명은 상승된 에센셜 오일 양, 상승된 페놀산 (phenolic acid) 양, 상승된 프로안토시아니딘 양, 및/또는 상승된 다당류 양을 갖는 계피 종으로부터 유래된 추출물, 이러한 추출물의 제조 방법, 및 이러한 추출물의 사용 방법에 관한 것이다.
계피 (시나모뮴 질라니쿰 (Cinnamomum zeylanicum) 또는 베럼, C. 아로마티쿰, 및 C. 카시아)는 열대 인도 남부 및 스리랑카 산이며 해수면으로부터 9백 미터의 높이까지 자라는 10-15 미터 크기의 작은 상록수이다. 그것은 두껍고 거칠거칠한 나무껍질 및 강한 가지를 갖는다. 어린 싹은 얼룩덜룩한 초록빛을 띤 오렌지색이다. 잎은 성숙하면 잎꼭지가 있으며 질기고, 빛나는 초록색 윗면과 밝은 밑면을 갖는다. 잎은 향긋한 냄새가 나며 매운 맛을 갖는다. 열매는 블랙베리보다 더 큰 달걀 모양의 베리이며; 그것의 꽃턱 (receptacle)에서 도토리와 유사하다. 열매는 그것에 흰 반점을 동반하며 익었을 때 푸르스름하고, 주니퍼와 유사한 맛을 내며 테레빈 향이 난다. 끓였을 때, 그것은 계피 기름으로 호칭되는 오일성 물질을 낸다. 뿌리-껍질은 계피향이 나며 캄포 (camphor)와 유사한 맛을 내고, 증류에 의해 분리될 수 있다. 시나모늄 (Cinnamonum) 종의 약용 부분인 "계피 (cinnamon)"는 시나모움 (Cinnamoum) 종의 어린 가지 및 싹의 코르크 및 밑에 있는 유조직 (underlying parenchyma)으로부터 분리된 건조된 껍질로 이루어진다.
계피 종은 인도양 및 동남 아시아의 섬들을 통해 도입되었으며, 지금은 스리랑카 및 인도의 근해 영역에서 광범위하게 경작되고 있다. 실질적으로 계피 종이 인도, 말레이지아, 마다가스카르 및, 세이셸 제도로부터 유래되긴 하였지만, 스리랑카가 주 생산국이다. 계피 (cinnamon bark)는 수천년에 걸쳐 전통적인 동양 및 서양 의약에 사용되어 왔다. 전통적인 중국 의약 (TCM)에서 유력한 이론에 따르면, 계피는 비장 및 신장이 따뜻하고 정상 상태가 되도록 몸에 열을 공급하며; 따라서 가슴 및 배의 통증, 무력증에 기인하는 설사, 및 신장의 기능 저하에 효과적이다. 계피의 생약 제조품은 구풍제, 소화제, 또는 TCM 내 화합물의 건위제 성분, 전통적인 그레코-유러피언 요법, 및 전통적인 인도 야유르베다 요법 및 유나니 요법으로서 사용된다. 독일 위원회 E는 식욕 상실 및 소화불량 호소증상, 예컨대 위장관의 경증 연축, 팽창, 및 위창자내공기참에 대해 계피의 국제적 사용을 승인하였다. 미국 및 독일에서, 계피는 수용성 주입 또는 달임물, 알코올 유체 추출물 또는 팅크제, 및 에센셜 오일을 포함하는 복용 형태에서 구풍제 및 본초 화합물의 건위제 성분으로써 사용된다. 그것은 또한 복합-약초 기침, 감기, 및 열 처방제의 성분으로서 나타날 수 있다. 좀더 최근에, 과학적인 증거는 타입 2 당뇨병 (NIDDM-인슐린 비의존성 당뇨병), 항산화 활성, 항혈소판 유착 활성, 항염증 활성, 항균 및 항진균 활성, 및 뇌기능의 증강에 대한 계피의 사용을 뒷받침하였다. 다음의 문헌들을 참조하라 (Khan A et al. Diabetes Care 26:3215-3218, 2003; Anderson RA et al. J Agric Food Chem 52:65-70, 2004; Jarville-Taylor et al. J Am Coll Nutri 20:327-336, 2001; Qin R et al. Horm Metab Res 36:119-123, 2004; Vespohl EJ et al. Phytother Res 19:203-206, 2005; Lee SH et al Biochem Pharmacol 69:791-9, 2005; Chericoni S et al. J Agric Food Chem 53:4762-4765, 2005; Lin CC et al. Phytother Res 17:7260730, 2003; Jayaprakasha GK et al. J Agric Food Chem 51 :4344-4348, 2003; Huss U et al. J Nat Prod 65:1517-21, 2002; Nagai H et al. Jpn J Pharmacol 32:813-822, 1982; Su MJ et al. J Biomed Sci 6:376-386, 1999; Shimada Y et al. Phytomed 11:404-410, 2004; Taher M et al. Med J Malayia 59B:97-98, 2004; Kamath JV et al. Phytother Res 17:970-972, 2003; Kurokawa M et al. Eur J Pharmacol 348:45-51, 1998; Simic A et al. Phytother Res 18:713-717, 2004; Tabak M et al. J Ethnopharmacol 67:269-277, 1999; Kong LD et al. J Ethnopharmacol 73:199-207, 2000; Kwon BM et al. Arch Pharm Res 21 :147-152, 1998; Ka H et al. Cancer Lett 196:143-152, 2003).
계피의 화학 성분은 에센셜 오일 (휘발성 및 비휘발성), 폴리페놀산 (polyphenolic acid), 쿠마린, 검, 점액 (muscilage), 레진, 탄수화물 (전분, 다당류), 및 회 (표 1)를 포함한다. 상업적 및 생물학적 입장으로부터, 에센셜 오일 (특히 신남알데하이드 및 테르펜) 및 폴리페놀산 (특히 플라보놀 글리코사이드-프로안토시아니딘 및 플라보노이드)은 일반적으로 다른 구성요소보다 더욱 중요한 것으로 고려되어 왔다. 폴리페놀 화합물은 하나 이상의 방향족 고리 상에 하나 이상의 하이드록실기 (OH)를 포함한다. 폴리페놀 및 특히 플라보노이드의 물리적 및 화학적 특성, 분석 및 생물학적 활성은 여러해 동안 연구되어 왔다. 그러나, 다른 화학적 성분, 예컨대 다당류 또한 중요한 생물학적으로 유익한 효과를 가질 수 있다. 모든 식물과 유사하게, 계피의 화학적 조성물은 종들, 수확 연령, 날씨, 토양, 및 원예 실행에 의하여 변한다.
표 1. 계피의 기본적인 화학적 성분
화학적 성분 % 건조 중량
에센셜 오일 휘발성 오일 트랜스-신남알데하이드 벤즈알데하이드 2'-하이드록시신남알데하이드 2-메톡시신남알데하이드 2'-벤즈옥시신남알데하이드 유제놀 트랜스-신남산 신나밀 아세테이트 신나밀 알코올 리낼룰 1,8-시네올레 모노테르펜 및 세스퀴테르펜 알파-피넨 베타-피넨 보네올 폴리페놀 플라보놀 글리코사이드 캠페리트린 (Kaempferitrin) 캠페롤 (Kaempferol) 3-O-베타-D-글루코피라노실-(l→4)-알파-L-람노피라노사이드 (rhamnopyranoside) 캠페롤 3-O-베타-D-아피오푸라노실-(l→2)-알파-L-람노피라노사이드 캠페롤 3-O-베타-D-아피오푸라노실-(l→4)-알파-L-람노피라노사이드 플라보노이드 메틸하이드록시찰콘 카테킨 에피카테킨 안토시아니딘 카테킨/에피카테킨 올리고머 3-(2-하이드록시페닐)-프로판산 3-(2-하이드록시페닐)-O-글리코사이드 프로안토시아니딘 축합된 탄닌 칼슘-모노테르펜 옥살레이트 검 점액 (Muscilage) 레진 탄수화물 전분 다당류 회 1-4% (60-80%) (10%까지) (5-10%) (1-3%) 5-10% 80-90%
발명의 요약
한 양태에서, 본 발명은 임의의 도 6 내지 85의 실시간 직접 분석 (DART) 질량 분석기 크로마토그램을 갖는 분획물을 포함하는 계피 종 추출물에 관한 것이다.
다른 구체예에서, 분획물은 신남알데하이드, 벤즈알데하이드, 신나밀 알코올, 트랜스-신남산, 신나밀 아세테이트, 에센셜 오일, 폴리페놀, 다당류, 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 화합물을 포함한다.
다른 구체예에서, 분획물은 약 2중량%를 초과하는 양의 신남알데하이드를 포함한다. 다른 구체예에서, 분획물은 약 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 또는 95중량%를 초과하는 양의 신남알데하이드를 포함한다. 다른 구체예에서, 분획물은 약 65% 내지 약 95중량%인 양의 신남알데하이드를 포함한다.
다른 구체예에서, 분획물은 유제놀, 2'-하이드록시신남알데하이드, 2-메톡시신남알데하이드, 2'-벤즈옥시신남알데하이드, 리낼룰, 1,8-시네올레, 알파-피넨, 베타-피넨, 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 에센셜 오일을 포함한다. 다른 구체예에서, 분획물은 약 1% 내지 약 5중량%인 양의 에센셜 오일을 포함한다. 다른 구체예에서, 분획물은 약 5% 내지 약 40중량%의 신남알데하이드 및 에센셜 오일의 조합된 양을 포함한다.
다른 구체예에서, 분획물은 플라보노이드, 플라보놀 글리코사이드, 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 폴리페놀을 포함한다. 다른 구체예에서, 플라보노이드는 3-(2-하이드록시페닐)-프로판산, 3-(2-하이드록시페닐)-O-글리코사이드, 안토시아니딘, 에피카테킨, 카테킨, 메틸하이드록시찰콘, 카테킨 올리고머, 에피카테킨 올리고머, 올리고머 프로안토시아니딘, 중합체 프로안토시아니딘, 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된다. 다른 구체예에서, 플라보놀 글리코사이드는 캠페리트린, 캠페롤 (Kaempferol) 3-O-베타-D-글루코피라노실-(l→4)-알파-L-람노피라노사이드 (rhamnopyranoside), 캠페롤 3-O-베타-D-아피오푸라노실-(l→2)-알파-L-람노피라노사이드, 캠페롤 3-O-베타-D-아피오푸라노실-(l→4)-알파-L-람노피라노사이드, 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된다. 다른 구체예에서, 분획물은 약 20% 내지 약 70중량%인 양의 폴리페놀을 포함한다. 다른 구체예에서, 분획물은 약 6중량%에서 신남알데하이드 및 약 70중량%에서 폴리페놀을 포함한다. 다른 구체예에서, 분획물은 약 40중량%에서 신남알데하이드 및 약 20중량%에서 폴리페놀을 포함한다.
다른 구체예에서, 분획물은 글루코오스, 아리비노오스, 갈락토오스, 람노오스, 크실로오스 우론산 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 다당류를 포함한다. 다른 구체예에서, 분획물은 약 30중량%에서 다당류를 포함한다.
다른 양태에서, 본 발명은 본 발명의 계피 종 추출물을 포함하는 식품 또는 약제에 관한 것이다.
다른 양태에서, 본 발명은 a) 에센셜 오일 분획물 및 제 1 잔여물을 얻기 위해 초임계 이산화탄소 추출에 의해 계피 종 식물 물질을 추출하는 단계; b) 다당류 분획물 및 제 2 잔여물을 얻기 위해 뜨거운 물로 단계 a)로부터 계피 종 식물 물질 또는 제 1 잔여물을 추출하는 단계; 및 c) 비-탄닌 폴리페놀 분획물을 얻기 위해 하이드로-알코올 용액으로 계피 종 식물 물질, 단계 a)로부터 제 1 잔여물 및/또는 단계 b)로부터 제 2 잔여물을 추출하고 친화성 흡착 공정 (affinity adsorbent process)을 사용하여 상기 추출물을 정제하는 단계에 의한 에센셜 오일 분획물, 비-탄닌 폴리페놀 분획물 및 다당류 분획물을 얻기 위해 계피 종 식물 물질을 순차적으로 추출하는 단계를 포함하는 계피 추출물을 제조하는 방법에 관한 것이다.
다른 구체예에서, 단계 a)는 1) 추출 용기에 분쇄된 계피 종 식물 물질을 로딩하는 단계; 2) 초임계 조건 하에서 이산화탄소를 첨가하는 단계; 3) 분쇄된 계피와 이산화탄소를 한동안 접촉시키는 단계; 및 4) 수집 용기에 에센셜 오일 분획물을 수집하는 단계를 포함한다. 다른 구체예에서, 초임계 조건은 35℃ 내지 90℃에서 60 bars 내지 800 bars의 압력을 포함한다. 다른 구체예에서, 초임계 조건은 40℃ 내지 80℃에서 60 bars 내지 500 bars의 압력을 포함한다. 다른 구체예에서, 시간은 30분 내지 2.5시간이다. 다른 구체예에서, 시간은 1시간이다. 다른 구체예에서, 초임계 이산화탄소 분획성 분리 시스템은 에센셜 오일 분획물의 분획, 정제, 및 프로파일링에 사용된다.
다른 구체예에서, 단계 b)는 1) 다당류 화학적 성분을 추출하기 위해 충분한 시간 동안 단계 a)로부터 분쇄된 계피 종 식물 물질 또는 제 1 잔여물과 수용액 (water solution)을 접촉시키는 단계; 및 2) 알코올 침전에 의해 용액으로부터 고체 다당류를 분리하고 정제하는 단계를 포함한다. 다른 구체예에서, 수용액은 80℃ 내지 100℃이다. 다른 구체예에서, 수용액은 80℃ 내지 90℃이다. 다른 구체예에서, 시간은 1-5시간이다. 다른 구체예에서, 시간은 2-4시간이다. 다른 구체예에서, 시간은 2시간이다. 다른 구체예에서, 알코올은 에탄올이다.
다른 구체예에서, 단계 c)는 1) 폴리페놀 화학적 성분을 추출하기 위해 충분한 시간 동안 계피 종 식물 물질, 단계 a)로부터 제 1 잔여물 및/또는 단계 b)로부터 제 2 잔여물을 하이드로알코올 용액과 접촉시키는 단계; 2) 친화성 흡착 레진 컬럼 (여기서 폴리페놀산이 흡착된다)을 통해 하이드로알코올 용액 혼합물로부터 추출된 폴리페놀 화학적 성분의 농축된 알코올 용액을 통과시키는 단계; 및 3) 친화성 흡착 레진에 흡착되는 탄닌 폴리페놀을 제거하여 친화성 흡착 레진으로부터 정제된 비-탄닌 폴리페놀 화학적 성분 분획물(들)을 용리시키는 단계를 포함한다.
다른 구체예에서, 하이드로알코올 용액은 에탄올 및 물을 포함하며, 여기서 에탄올 농도는 10-95중량%이다. 다른 구체예에서, 하이드로알코올 용액은 에탄올 및 물을 포함하며, 여기서 에탄올 농도는 25중량%이다. 다른 구체예에서, 단계 1)을 30℃ 내지 100℃에서 수행하였다. 다른 구체예에서, 단계 1)을 60℃ 내지 100℃에서 수행하였다. 다른 구체예에서, 시간은 1-10시간이다. 다른 구체예에서, 시간은 1-5시간이다. 다른 구체예에서, 시간은 2시간이다.
다른 양태에서 본 발명은 본 발명의 방법에 의해 제조된 계피 종 추출물에 관한 것이다.
다른 양태에서 본 발명은 신남알데하이드, 신남알데하이드의 1 내지 5중량%에서 신남산, 신남알데하이드의 5 내지 15중량%에서 메틸 신남산, 신남알데하이드의 1 내지 5중량%에서 신나밀 알코올, 신남알데하이드의 20 내지 30중량%에서 β-구알렌/시스-γ-비사바볼렌, 및 신남알데하이드의 1 내지 5중량%에서 피로갈롤을 포함하는 계피 종 추출물에 관한 것이다.
다른 양태에서 본 발명은 피로갈롤, 피로갈롤의 80 내지 90중량%에서 신남산, 피로갈롤의 85 내지 95중량%에서 메틸 신남산, 피로갈롤의 20 내지 30중량%에서 쿠마릭 산, 피로갈롤의 15 내지 25중량%에서 호모바닐산, 피로갈롤의 85 내지 95중량%에서 신남알데하이드, 및 피로갈롤의 10 내지 15중량%에서 벤질 벤조에이트를 포함하는 계피 종 추출물에 관한 것이다.
다른 양태에서 본 발명은 카테킨, 카테킨의 5 내지 15중량%에서 신남산, 카테킨의 5 내지 15중량%에서 메틸 신남산, 카테킨의 5 내지 15중량%에서 쿠마릭 산, 카테킨의 1 내지 10중량%에서 페루릭 산, 카테킨의 1 내지 5중량%에서 2-메톡시페놀, 카테킨의 5 내지 15중량%에서 호모바닐산, 카테킨의 20 내지 30중량%에서 바닐산, 카테킨의 1 내지 5중량%에서 벤즈알데하이드, 카테킨의 35 내지 45중량%에서 신남알데하이드, 카테킨의 85 내지 95중량%에서 피로갈롤, 및 카테킨의 15중량%에서 카페인산을 포함하는 계피 종 추출물에 관한 것이다.
다른 양태에서 본 발명은 β-구알렌/시스-γ-비사바볼렌 및 β-구알렌/시스-γ-비사바볼렌의 5 내지 15중량%에서 신남알데하이드를 포함하는 계피 종 추출물에 관한 것이다.
다른 양태에서 본 발명은 신남알데하이드 및 신남알데하이드의 10 내지 20중량%에서 β-구알렌/시스-γ-비사바볼렌을 포함하는 계피 종 추출물에 관한 것이다.
다른 양태에서 본 발명은 신남알데하이드, 신남알데하이드의 30 내지 40중량%에서 피로갈롤, 및 신남알데하이드의 1 내지 10중량%에서 카테킨/에피카테킨을 포함하는 계피 종 추출물에 관한 것이다.
다른 양태에서 본 발명은 신남알데하이드, 신남알데하이드의 1 내지 5중량%에서 신남산, 신남알데하이드의 0.5 내지 5중량%에서 메톡시 신남알데하이드, 신남알데하이드의 0.1 내지 5중량%에서 유제놀, 신남알데하이드의 1 내지 5중량%에서 p-사이멘, 신남알데하이드의 0.1 내지 5중량%에서 캄포, 신남알데하이드의 0.5 내지 5중량%에서 카바크롤, 신남알데하이드의 25 내지 35중량%에서 캐리오필렌/휴물렌, 신남알데하이드의 0.1 내지 5%에서 피로갈롤, 및 신남알데하이드의 40 내지 50중량%에서 신나밀 신나메이트를 포함하는 계피 종 추출물에 관한 것이다.
다른 양태에서 본 발명은 신나밀 신나메이트, 신나밀 신나메이트의 0.5 내지 5중량%에서 메톡시 신남알데하이드, 신나밀 신나메이트의 0.1 내지 5중량%에서 신나밀 알코올, 신나밀 신나메이트의 1 내지 5중량%에서 p-사이멘, 신나밀 신나메이트의 0.1 내지 5중량%에서 리낼룰, 신나밀 신나메이트의 0.1 내지 5중량%에서 캄포, 신나밀 신나메이트의 0.5 내지 5중량%에서 카바크롤, 신나밀 신나메이트의 70 내지 80중량%에서 신남알데하이드, 신나밀 신나메이트의 45 내지 55중량%에서 캐리오필렌/휴물렌, 및 신나밀 신나메이트의 0.1 내지 5%에서 피로갈롤을 포함하는 계피 종 추출물에 관한 것이다.
다른 양태에서 본 발명은 피로갈롤, 피로갈롤의 5 내지 10중량%에서 신남산, 피로갈롤의 60 내지 70중량%에서 쿠마릭 산, 피로갈롤의 1 내지 10%에서 페루릭 산, 피로갈롤의 5 내지 15%에서 2-메톡시페놀, 피로갈롤의 1 내지 10중량%에서 바닐산, 피로갈롤의 30 내지 40중량%에서 카테킨/에피카테킨, 피로갈롤의 1 내지 5중량%에서 벤즈알데하이드, 피로갈롤의 5 내지 15중량%에서 아프젤레킨 (afzelechin)/에피아프젤레킨, 피로갈롤의 1 내지 10중량%에서 레스베라트롤, 및 피로갈롤의 1 내지 5중량%에서 바닐린을 포함하는 계피 종 추출물에 관한 것이다.
다른 양태에서 본 발명은 피로갈롤, 피로갈롤의 0.5 내지 5중량%에서 신남산, 피로갈롤의 10 내지 20중량%에서 쿠마릭 산, 피로갈롤의 0.5 내지 5%에서 페루릭 산, 피로갈롤의 1 내지 5중량%에서 2-메톡시페놀, 피로갈롤의 0.5 내지 5중량%에서 호모/이소바닐산, 피로갈롤의 1 내지 10중량%에서 바닐산, 피로갈롤의 25 내지 35중량%에서 카테킨/에피카테킨, 피로갈롤의 1 내지 5중량%에서 벤즈알데하이드, 피로갈롤의 1 내지 5중량%에서 신남알데하이드, 피로갈롤의 0.1 내지 5중량%에서 아프젤레킨/에피아프젤레킨, 및 피로갈롤의 65 내지 75중량%에서 바닐린을 포함하는 계피 종 추출물에 관한 것이다.
개시하고 있는 추출은, 제한되는 것은 아니지만, 항산화 활성, 활성 산소 라디칼 스캐빈징, 나이트로소화 억제, 항-돌연변이 활성 (암 억제), 항-발암 활성 (암 요법), 피부 보호, 항-노화, 항-심혈관병, 항-뇌졸중 및 요법, 뇌 보호, 항-고지혈증, 항-치주병, 항-골다공증, 면역 증강, 항바이러스, 항-HIV 및 항균 활성, 항진균 활성, 항바이러스 활성, 체중조절 및 열발생, 항-당뇨병, 및 불안 감소, 기분 증진 및 인지 증진을 포함하는 생리적 및 의학적 효과를 제공하는데 유용하다.
본 발명의 상기 구체예들, 다른 구체예들 및 이들의 구성 및 특징은 본 명세서, 도면 및 그 아래의 특허청구범위로부터 명백할 것이다.
발명의 상세한 설명
정의
여기서 사용된, 계피는 시나모뮴 종 식물로부터 유래된 껍질 식물 물질을 나타낸다. 용어 "계피"는 또한 계피 종과 교환하여 사용될 수 있으며 상기 식물, 클론, 변형물, 및 돌연변이 (sports) 등과 관련된다.
여기서 사용된, 용어 "하나 이상의 화합물"은 적어도 하나의 화합물, 예컨대, 제한되는 것은 아니지만, 트랜스-신남알데하이드 (계피 종의 지용성 에센셜 오일 화학적 성분), 또는 메틸하이드록시찰콘 (계피 종의 수용성 폴리페놀) 또는 계피 종의 다당류 분자를 의도하거나, 하나 이상의 화합물, 예를 들어, 트랜스-신남알데하이드 및 메틸하이드록시찰콘이 의도되는 것을 의미한다.
여기서 사용된, 용어 "분획물(fraction)"은 어떤 물리적 성질 및/또는 화학적 성질에 의해 특정되는 특정 군의 화학적 화합물을 포함하는 추출 조성물을 의미한다.
여기서 사용된, 용어 "에센셜 오일 분획물"은 계피 및 관련 종으로부터 얻어지거나 유래된 지용성, 수 불용성 화합물을 포함하는 분획물을 나타내며, 제한되는 것은 아니지만, 트랜스-신남알데하이드와 같은 계열의 화학적 화합물을 포함한다.
여기서 사용된, 용어 "에센셜 오일 부분-분획물"은 계피 및 관련 종으로부터 얻어지거나 유래된 지용성, 수 불용성 화합물을 포함하는 분획물을 나타내며, 제한되는 것은 아니지만, 계피 종의 에센셜 오일에서 발견된 특정 화합물의 증강된 농도를 갖는 트랜스-신남알데하이드와 같은 계열의 화학적 화합물을 포함한다.
여기서 사용된, 용어 "폴리페놀 분획물"은 계피 및 관련 종으로부터 얻어지거나 유래된 수용성 및 에탄올 가용성 폴리페놀산 화합물을 포함하는 분획물을 나타내며, 제한되는 것은 아니지만, 화합물 예컨대 메틸하이드록시찰콘, 및 카테킨 및 에피카테킨 올리고머를 추가로 포함한다.
여기서 사용된, 용어 "다당류 분획물"은 계피 및 관련 종으로부터 얻어지거나 유래된 가용성-에탄올 불용성 다당류 화합물을 포함하는 분획물을 나타낸다.
계피의 다른 화학적 성분 또한 이들 추출 분획물에 존재할 수 있다.
여기서 사용된, 용어 "정제된" 분획물은 분획물의 화학적 성분의 20% 초과로 농축된 어떤 물리-화학적 성질 또는 물리적 성질 또는 화학적 성질에 의해 특징되는 특정 군의 화합물을 포함하는 분획물에 관한 것이다. 다시 말해서, 정제된 분획물은 분획물을 정의하는 어떤 요망되는 물리적 성질, 화학적 성질, 또는 물리-화학적 성질을 특징으로 하지 않는 80% 미만의 화학적 성분을 포함한다.
여기서 사용된, 용어 "프로파일"은 추출 분획물 또는 부분-분획물 내의 화학적 화합물의 질량 퍼센트 (percent mass weight)의 비 또는 최종 계피 추출에서 각각 세 가지의 계피 분획물 화학적 성분의 질량 퍼센트의 비를 나타낸다.
여기서 사용된, 용어 "원료(feedstock)"는 일반적으로 전체 식물 자체, 또는 잎, 제한되는 것은 아니지만, 주뿌리, 말단 뿌리 및 섬유 뿌리를 포함하는 뿌리, 줄기, 껍질, 잎, 씨 및 꽃을 포함하는 식물의 하나 이상의 구성 부분과의 조합물을 포함하는 가공되지 않은 식물 물질을 말하며, 여기서, 식물 또는 구성 부분은 미가공되거나, 건조되거나, 스팀처리되거나, 가열되거나, 공정을 촉진하기 위해 물리적 공정에 영향을 미치는 다른 방법으로 처리된 물질을 포함할 수 있고, 추가적으로 손대지 않거나, 자르고, 다지고, 썰거나, 분쇄하거나, 가루로 하거나, 식물 물질의 크기 및 물리적 농도에 영향을 주기 위해 처리된 다른 물질을 포함할 수 있다. 경우에 따라, 용어 "원료"는 추가 추출 공정을 위한 공급원으로서 사용되는 추출 생성물을 특정하기 위해 사용될 수 있다.
여기서 사용된, 용어 "계피 성분"은 계피 종에서 발견되는 화학적 화합물을 의미하며 이전에 확인된 모든 화학적 화합물뿐 아니라 계피 종에서 발견되는 다른 화합물을 포함하며, 제한되는 것은 아니지만 에센셜 오일 화학적 성분, 폴리페놀산, 및 다당류를 포함한다.
계피의 화학적 성분은 광범위한 치료적 가치를 갖는다. 최근의 과학적 연구 및 임상 연구는 계피의 다양한 화학적 화합물, 화학적 분획물, 및 전반적인 추출 제품의 아래의 치료적 효과를 증명하였으며, 그것을 아래를 포함한다: NIDDM-타입 2 당뇨병 (프로안토시아니딘, 메틸하이드록시찰콘, 카테킨 및 에피카테킨 올리고머, 플라보노이드, 수용성 추출물); 감소된 저밀도 지질단백을 포함하는 개선된 콜레스테롤 대사 (프로안토시아니딘을 포함하는 페놀산, 메틸하이드록시차콘, 카테킨, 에피카테킨 올리고머, 플라보노이드, 수용성 추출물); 항-동맥 손상 자유 라디칼 및 작은 혈관의 개선된 기능 (에센셜 오일, 신남알데하이드, 2'-하이드록시신남알데하이드, 2'-메톡시신남알데하이드, 페놀산, 플라보노이드 글리코사이드, 프로안토시아니딘, 플라보노이드, 카테킨, 에피카테킨 올리고머, 추출물); 항-혈전 및 항혈소판 응집 (에센셜 오일, 신남알데하이드); 항-염증 활성 (에센셜 오일, 신남알데하이드, 유제놀, 1,8-시네올레, 알파-피넨, 베타-피넨, 보네올, 플라보놀 글리코사이드, 추출물); 항산화 (페놀산, 플라보놀 글리코사이드, 프로안토시아니딘, 플라보노이드, 수용성 추출물); 항-알러지 (페놀산, 플라보놀 글리코사이드, 프로안토시아니딘, 플라보노이드, 수용성 추출물); 신경계 보호제 (수용성 추출물); 심혈관 보호제 (에센셜 오일, 수용성 추출물); 증강된 뇌기능 (에센셜 오일, 특히 휘발성 오일); 구풍제, 식욕 상실, 소화불량 호소증상, 항-구토, 항-팽창 & 위창자내공기참, 장 운동의 촉진, 체중 증가의 촉진, (플라보노이드, 3-(2-하이드록시페닐)-프로판산, 3-(2-하이드록시페닐)-O-글리코사이드, 수용성 추출물); 항-기침, 흔한 감기 및 열 (에센셜 오일, 신나밀 아세테이트); 항균 & 항-진균 활성 (에센셜 오일, 신남알데하이드, 유제놀, 1,8-시네올레, 베타-피넨, 보네올); 지질 분해 & 개선된 상처 치료 (에탄올 추출물); 및 항암 & 항-통풍 (에센셜 오일, 신남알데하이드, 2'-하이드록시신남알데하이드, 2'-벤즈옥시신남알데하이드, 메탄올 추출물); 문헌을 참조하라 (Khan A et al. Diabetes Care 26:3215-3218, 2003; Anderson RA et al. J Agric Food Chem 52:65-70, 2004; Jarville-Taylor et al. J Am Coll Nutri 20:327-336, 2001; Qin R et al. Horm Metab Res 36:119-123, 2004; Vespohl EJ et al. Phytother Res 19:203-206, 2005; Lee SH et al Biochem Pharmacol 69:791-9,2005; Chericoni S et al. J Agric Food Chem 53:4762-4765, 2005; Lin CC et al. Phytother Res 17:7260730, 2003; Jayaprakasha GK et al. J Agric Food Chem 51 :4344-4348, 2003; Huss U et al. J Nat Prod 65:1517-21, 2002; Nagai H et al. Jpn J Pharmacol 32:813-822, 1982; Su MJ et al. J Biomed Sci 6:376-386, 1999; Shimada Y et al. Phytomed 11 :404-410, 2004; Taher M et al. Med J Malayia 59B:97-98, 2004; Kamath JV et al. Phytother Res 17:970-972, 2003; Kurokawa M et al. Eur J Pharmacol 348:45-51, 1998; Simic A et al. Phytother Res 18:713-717, 2004; Tabak M et al. J Ethnopharmacol 67:269-277, 1999; Kong LD et al. J Ethnopharmacol 73:199-207, 2000; Kwon BM et al. Arch Pharm Res 21 :147-152, 1998; Ka H et al. Cancer Lett 196:143-152, 2003.
안토시아닌은 많은 과일, 야채, 씨리얼 곡물, 및 꽃의 적색, 보라색, 및 파란색을 내는 천연의 플라보노이드 화합물의 특정한 계열이다. 예를 들어, 과일, 예컨대 블루베리, 빌베리(bilberries), 스트로베리, 라스베리, 보이슨베리, 마리온베리, 크랜베리, 엘더베리 등의 색은 많은 다른 안토시아닌에 기인한다. 최근, 안토시아닌 안료에 대한 관심이 증가하고 있는데 이는 식이성 항신화제로서 건강에 유익한 그들의 가능성 때문이다. 예를 들어, 빌베리 (Vaccinium myrtillus)의 안토시아닌 안료는 시각적 예리함을 개선하고 순환계 질환을 치료하는데 오랫동안 사용되어 왔다. 어떤 안토시아닌 및 다른 플라보노이드가 항염증 특성을 갖는다는 실험적 증거가 있다. 게다가, 경구적으로 투여된 안토시아닌이 당뇨병 및 궤양 치료에 유익하며 항바이러스 및 항균 활성을 가질 수 있다는 보고가 있다. 플라보노이드의 이러한 바람직한 특성에 대한 화학적 근거는 그들의 항산화 능력에 관련된 것으로 믿어진다. 따라서, 베리 및 다른 과일 및 야채와 관련된 항산화 특징은 그들의 안토시아닌 함량 덕분이다.
"올리고머 프로안토시아니딘," "OPCs," 또는 "프로시아니딘,"으로도 알려진 프로안토시아니딘은 과일, 야채, 견과류, 씨, 꽃, 및 껍질에서 입수할 수 있는 천연의 플라보노이드 화합물의 다른 계열이다. 프로안토시아니딘은 농축 (condensed) 탄닌으로 알려진 카테고리의 일원이다. 그들은 탄닌의 가장 일반적인 형태는 과일 및 야채에서 발견되며, 씨 및 껍질에 더 많은 양이 존재한다. 사실상, 서로 다른 프로안토시아니딘의 혼합물이 개개의 단위 내지 많이 연결된 단위의 컴플렉스 분자 (올리고머 또는 중합체)에서 보통 함께 발견된다. 중합체 프로안토시아니딘의 일반적인 화학적 구조는 보통 C(4)-C(6) 및/또는 C(4)-C(8) 결합을 통해 서로 연결된 선형 사슬의 플라보노이드 3-올 단위를 포함한다. 프로안토시아니딘은 C4-C8 및/또는 C4-C6 결합을 통해 연결된 카테킨 및/또는 에피카테킨 단위를 함유하는 올리고머 및 중합체의 혼합물이다. 이들 플라반-3-올은 또한 C4-C8 결합 및 C7-C2 사이의 추가적인 에테르 결합에 의해 이중 연결될 수 있다. 13C NMR은 중합체 프로안토시아니딘의 구조를 확인하는데 유용하여 왔으며, 최근의 작업은 디-, 트리-, 및 테트라머릭 프로안토시아니딘의 화학을 명료하게 하였다. 플라보노이드 3-올 단위의 더욱 큰 올리고머는 대부분의 식물에서 우세하며 2,000 달톤 초과의 평균 분자량을 가지고 6개 이상의 단량체 단위를 함유하는 것으로 확인되었다 (Newman, et al, Mag. Res. Chem., 25:118 (1987)). 상당한 최근 연구는 그들의 항산화 활성으로 주로 알려진 프로안토시아니딘의 치료적 적용에 대해 조사하였다. 그러나, 이들 화합물 또한 항균, 항바이러스, 항발암, 항염증, 항-알러지, 및 혈관 확장 작용 증거에 대한 보고가 있어왔다. 게다가, 그들은 지질 과산화, 혈소판 응집, 모세혈관 투과성 및 취약성을 억제하고, 포스포리파아제 A2, 사이클로옥시저네이스, 및 리포옥시저네이스를 포함하는 효소 시스템에 영향을 주는 것으로 알려졌다. 예를 들어, 프로안토시아니딘 단량체 (즉, 안토시아닌) 및 다이머는 증가된 모세혈관 취약성과 관련된 질병의 치료에 사용되며 동물에서 항염증 효과를 가지는 것으로 나타났다 (Beladi, I. et al., Ann. N.Y. Acad. Sci., 284:358 (1977)). 이들 보고된 발견들에 근거하면, 올리고머 프로안토시아니딘 (OPCs)은 수많은 조건의 치료에서 유용한 성분이 될 수 있다 (Fine, A. M., Altern. Med. Rev. 5(2): 144-151 (2000)).
프로안토시아니딘 또한 바이러스에 대해 보호할 수 있다. 시험관 내 연구에서, 조롱 나무 (Hamamelis virginiana)로부터의 프로안토시아니딘은 단순 헤르페스 1 (HSV-I) 바이러스를 죽인다 (Erdelmeier, C. A., Cinatl, J., Plant Med. June: 62(3):241-5 (1996); DeBruyne, T., Pieters, L., J. Nat. Prod. JuI: 62(7):954-8 (1999)). 다른 연구가 다양한 탄닌의 항바이러스 활성의 구조-활성 관계를 결정하기 위해 수행되었다. 좀더 축합된 화학 구조가 더욱 큰 항바이러스 효과를 가짐을 발견하였다 (Takechi, M., et al., Phytochemistry, 24:2245-50 (1985)). 또다른 연구에서는, 프로안토시아니딘이 단순 헤르페스 플라크 형성을 감소시키는데 필요한 50 퍼센트 유효량이 50 퍼센트 세포독성량 미만인 2 내지 3차의 크기인 항-단순 헤르페스 활성을 가짐을 보여준다 (Fukuchi, K., et al., Antiviral Res., 11 :285-298 (1989)).
사이클로옥시저네이스 (COX-I, COX-2) 또는 프로스타글란딘 엔도퍼옥사이드 H 신테이스 (PGHS-I, PGHS-2) 효소는 식물 제품의 항-염증 효과를 측정하는데 널리 사용된다 (Bayer, T., et al., Phytochemistry, 28:2373-2378 (1989); and Goda, Y., et al., Chem. Pharm. Bull, 40:2452-2457 (1992)). COX 효소는 비스테로이드성 항-염증제에 대한 약제학적 표적 부위이다 (Humes, J. L., et al, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 78:2053-2056 (1981); and Rome, L. H., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 72:4863-4865 (1975)). 프로스타글란딘 합성에 참여하는 사이클로옥시저네이스의 두 이소자임은 사이클로옥시저네이스-1 (COX-I) 및 사이클로옥시저네이스-2 (COX-2) 이다 (Hemler, M., et al., J. Biol. Chem., 25:251, 5575-5579 (1976)). 선택적인 COX-2 억제제는 주로 항-염증 활성의 원인이 된다고 가정된다 (Masferrer, J. L., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 91 :3228-3232 (1994)). 플라보노이드는 이제 항염증 물질로서 뿐만 아니라, 사이클로옥시저네이스 (COX) 억제 활성에 대한 그들의 구조적 특징에 대해서 연구되고 있다.
계피가 일반적으로 높은 농도에서도 안전하고 비독성이긴 하지만, 계피 또는 페루비안 발사 (Peruvian balsa)에 민감한 개인에서는 알러지 반응을 유도할 수 있다. 그것은 임신 및 수유 동안 추천되지 않는다. 다른 약물과의 상호작용에 대해서는 알려져 있지 않다.
필요한 것은 정제된 에센셜 오일, 높은 플라보놀 글리코사이드 및 플라보노이드를 갖는 정제된 폴리페놀, 및 표준화되고 신뢰할 수 있는 양의 이들 상승적인 작용과 함께 생성될 수 있는 다당류 화학적 성분 분획물, 생리적 및 의약적으로 유익한 계피의 화학적 성분을 조합한 신규 및 재생가능한 계피 추출물이다. Williamson EM. Phtomedicine 8:401-409, 2001.
추출
에센셜 오일 분획물
계피는 에센셜 오일이 풍부하며 사용된 식물의 부분에 의존하여 다양한 종류의 오일을 제공한다. 계피 내에서는 질량 퍼센트로 1-2% 에센셜 오일이 존재하는 것으로 보고되었다. 계피 오일의 주성분은 방향족 알데하이드-3-페닐-2(E)-프로펜알이며, 또한 신남알데하이드라고도 호칭된다 (에센셜 오일에서 약 60질량%).
계피는 현재의 연구에 대해 원료로서 사용되었다. 초임계 이산화탄소 추출 및 분획 기술이 지용성 화학물질의 공정상에서 그것의 공지된 장점 때문에 추출 방법으로서 선택되었다. 그것은 추출에 대해 유용한데, 이는 기체-유사 무게 전달 특성 및 액체 용매의 그것보다 더욱 큰 확산 계수를 갖는 액체-유사 용매화 특징의 조합에 기인한다. 추출된 에센셜 오일 성분은 가스 크로마토그래피-질량 분석기를 사용하여 분석하였다. 초임계 CO2에 의해 추출된 계피 오일로부터 총 71종의 화합물이 확인되었다. 주성분인 신남알데하이드의 동종물, 예컨대 벤즈알데하이드 (Pl), 신남알데하이드 (PlO 및 P14), 신나밀 알코올 (P16), 트랜스-신남산 (P23), 신나밀 아세테이트 (P25)를 제외하고, 다른 소수 화합물은 다음을 포함한다: 4개의 모노테르펜, 16개의 세스퀴테르펜, 9개의 지방산 및 이들의 유도체, 및 6개의 스테로이드 (P64 및 P67-P71)가 또한 확인되었다. 지방산 및 스테로이드는 이전에 계피 오일로부터 보고되지 않았다.
초임계 CO2는 에센셜 오일 분획물을 정제하고 프로파일하기 위한 훌륭한 수단임이 밝혀졌다. 이들 분획물의 추출 수율은 공정상의 온도, 압력, 및 용매/공급 원료 비율에 의존하여 변한다. 가장 높은 추출 수율은 114의 용매/공급 원료 비율로 80℃의 온도 및 100-500 bar의 압력에서 1.76질량%이었다. 정제되지 않은 추출된 계피 에센셜 오일에서, 신남알데하이드는 정제된 분획물의 58질량% - 69질량%로 계산되었다. 추출 분획물 내의 추출물에서 20%에 달하는 스테로이드 화합물은 오직 약 40℃의 저온에서 추출될 수 있음을 발견하였다. 고순도의 신남알데하이드'의 동종물 (90% 초과)은 60-90℃의 고온 및 약 100 bar의 저압에서 얻어질 수 있다. 고압 및 고온이 지방산 화합물의 처리에 더 좋으며 가장 높은 순도는 추출 분획물 내에서 ~ 10% 이하가 될 수 있다.
정제되지 않은 추출된 계피 에센셜 오일은 또한 고정된 온도에서 연속적으로 증가하는 처리 압력에 의한 다중 단계 공정에 의해 분획될 수 있다. 결과를 표 2에 나타내었다. 주 화합물 신남알데하이드 동종물은 67.1-93.1%에서 프로파일될 수 있음이 밝혀졌다. 분획물 (상대적 다수)의 질량%에 의해 세스퀴테르펜과 같은 다른 소수 화합물은 1.1-2.7%에서 프로파일될 수 있고; 지방산은 0.9-9.9%에서 프로파일될 수 있으며; 스테로이드는 오직 40℃의 온도에서 추출될 수 있고 0.0-20.3%에서 프로파일될 수 있다. 신남알데하이드의 가장 높은 순도는 91.13%에 이를 수 있고, 이는 계피 원료에서 발견된 그것보다 76배를 초과한다.
표 2. 다른 조건에서 얻은 추출물에서 계피 에센셜 오일 화합물 프로파일
Figure 112008073751038-PCT00001
페놀산 분획물
계피의 항산화 활성은 페놀산 화학적 성분 함량과 관련된다. 계피에서 확인된 특정 항산화 파이토 케미컬은 아래의 페놀산을 포함한다: 에피카테킨, 캄펜, 유제놀, 감마-테르피넨, 페놀, 살리실산 및 탄닌. 좀더 최근에, 미 농무부에서 과학자들은 인슐린의 효과를 모방한 물에 의해 추출된 한 형태의 플라보노이드, 타입-A 프로시아니딘을 발견하였다. 이 화합물은 분리된 지방세포에서 인슐린 작용을 가능하게 한다. 생체 연구 또한 계피 물 추출물이 골격근에서 인슐린-신호전달경로를 일부 증강시킴을 통해 글루코오스 업테이크를 증가시켜 인슐린 작용을 개선함을 보여준다. 본 발명의 이 섹션의 목적은 탄닌산의 제거에 의해 페놀산을 정제하기 위한 것이다. 그들의 저혈당 활성에 기인하는 페놀산의 관심 대상은 프로안토시아니딘이다. 프로안토시아니딘은 C4-C8 및/또는 C4-C6 결합 (B-타입)을 통해 연결된 (+)-카테킨 및/또는 (-)-에피카테킨 단위를 포함하는 올리고머 및 중합체의 혼합물이다. 이들 플라반-3-올은 또한 C4-C8 결합 및 C7-C2 결합 (A-타입) 사이의 추가적인 에테르 결합에 의해 이중 연결될 수 있다. 상업적으로 유용한 HPLC 표준 물질의 없기 때문에, 전체 페놀산 함유량을 분석하기 위해 폴린-치오칼토 (Folin-Ciocalteu) 방법을 사용하였으며 전체 탄닌산 함량을 분석하기 위해 단백질-침전 페놀 방법을 사용하였다. 전체 페놀산에서 개개의 페놀산을 확인하였으며 실시간 직접 분석 (DART) 질량 분석기에 의해 반-정량 (semi-quantified)하였다.
계피 원료에서, 약 2.27%가 비탄닌 페놀산이고 약 2.61%가 탄닌산인 약 4.87% 전체 페놀산이 존재한다. 전체 페놀산 추출 조건을 서로 다른 용매, 온도, PH 값, 및 다중 단계 공정의 효과의 연구에 의해 최적화하였다. 수용성 에탄올 (25-75% 에탄올)이 최적의 추출 용매임을 발견하였다. 최대 추출 수율은 각각 10 및 5의 용매 공급 비율에서 두 단계의 공정을 사용하여 40℃의 온도에서 추출 용매로서 25% 에탄올을 사용함에 의해 약 17.6%임이 밝혀졌다. 처리하는 동안 필요한 pH 값의 변화는 없었다.
세파덱스 LH-20 덱스트란 비드가 탄닌산으로부터 비탄닌 페놀산을 분리하기 위한 훌륭한 매질이 됨을 발견하였다. 결과를 표 3에 나타내었다. 탄닌산이 현저히 제거되었고 비탄닌 페놀산은 100%에 달하도록 정제되었다 (원료에서 그것의 44배).
표 3. 세파덱스 LH-20 처리 동안 변화한 계피 페놀 중량 퍼센트.
Figure 112008073751038-PCT00002
다당류 분획물
계피 다당류-당단백질 분획물을 물 추출 및 80% 에탄올 침전에 의해 얻었다. 정제된 계피 다당류-당단백질 분획물의 수율은 약 3.5%였다. 계피 다당류의 순도는 0.29-0.47 g 덱스트란 동등물/g 다당류였다 (유용한 계피 다당류 표준물질이 없기 때문에 덱스트란을 표준 물질로서 사용하였다). 계피 다당류의 평균 분자량은 ~ 2500 KDa이었다. AccuTOF-DART 질량 분석기가 또한 계피 다당류를 분석하기 위해 사용되었으며, 결과를 도 6 및 7에 나타내었다.
천연 계피 종에 관한 추출
본 발명는 하나 이상의 계피 종으로부터 에센셜 오일의 분리되거나 정제된 분획물 (또는 에센셜 오일 부분-분획물), 폴리페놀산, 및 다당류의 추출을 포함한다. 이들 개개의 분획물은 유익한 조합을 제공하기 위해 특정 비율 (프로파일)로 조합될 수 있고 현재 알려진 추출 생성물에 발견되지 않은 신뢰할 수 있거나 재생가능한 추출 생성물을 제공할 수 있다. 예를 들어, 한 종으로부터의 에센셜 오일 분획물 또는 부분-분획물은 동일하거나 다른 종으로부터의 에센셜 오일 분획물 또는 부분-분획물 또는 동일하거나 다른 종으로부터의 폴리페놀산 분획물과 조합될 수 있고, 상기 조합은 동일하거나 다른 종의 계피로부터의 다당류 분획물과 조합되거나 되지 않을 수 있다.
본 발명의 추출은 또한 천연 계피 종에서 발견된 것들과 관련된 농도의 관점에서 정의될 수 있다. 구체예들은 또한 천연 계피 종 식물 물질에 발견된 것보다 더욱 높은 농도를 가지는 것으로 발견되는 에센셜 오일, 폴리페놀산, 또는 다당류를 포함하는 하나 이상의 분획물인 추출물을 포함한다. 구체예들은 또한 천연 계피 종 식물 물질에 발견된 것보다 더욱 낮은 농도를 가지는 것으로 발견되는 에센셜 오일, 폴리페놀, 또는 다당류를 포함하는 하나 이상의 분획물인 추출물을 포함한다. 계피 종의 생-활성 화학적 성분 분획물의 공지된 양은 (표 1) 본 발명의 실시예로서 사용된다. 예를 들어, 본 발명의 추출물은 에센셜 오일의 농도가 천연 계피 종의 0.001 내지 50배 농도인 분획물, 및/또는 요망되는 폴리페놀산의 농도가 천연 계피 종의 0.001 내지 50배 농도인 조성물, 및/또는 수용성-에탄올 불용성 다당류의 농도가 천연 계피 종의 0.001 내지 20배 농도인 조성물을 포함한다.
본 발명의 추출물은 에센셜 오일의 농도가 천연 계피 종의 0.01 내지 50배 농도인 분획물, 및/또는 요망되는 폴리페놀산의 농도가 천연 계피 종의 0.01 내지 50배 농도인 조성물, 및/또는 다당류의 농도가 천연 계피 종의 0.01 내지 20배 농도인 조성물을 포함한다. 또한, 본 발명의 추출물은 천연 계피 식물 물질 에센셜 오일 화학적 성분에서 발견되는 것보다 더욱 높거나 낮은 양의 천연 식물 물질 에센셜 오일에 존재하는 적어도 하나 이상의 화학적 화합물을 갖는 에센셜 오일 화학적 성분의 부분-분획물을 포함한다. 예를 들어, 화학적 화합물인, 트랜스-신남알데하이드는 천연 계피 식물 물질에서 전체 에센셜 오일 화학적 성분의 60 질량%의 그것의 농도로부터 부분-분획물의 80 질량%로 에센셜 오일 부분-분획물에서 증가된 그것의 농도를 가질 수 있다. 대조적으로, 트랜스-신남알데하이드는 천연 식물 물질에서 전체 에센셜 오일 화학적 성분의 약 60질량%의 그것의 농도로부터 부분-분획물의 약 6질량%로 에센셜 오일 부분-분획물에서 감소된 그것의 농도를 가질 수 있으며, 농도에서 10배 감소된다. 본 발명의 추출물은 이러한 신규 에센셜 오일 부분-분획물에서 특정 화학적 화합물의 농도가 천연 계피 에센셜 오일 화학적 성분에서 발견된 그 농도보다 약 1.1 내지 약 10배 증가되거나 약 0.1 내지 약 10배 감소된 분획물을 포함한다.
추가적인 구체예는 천연 식물 물질에서 발견되는 것들 또는 현재 유용한 계피 종 추출 생성물과 관련된 계피 종의 화학적 성분의 변경된 프로파일 (분포 비율)을 포함하는 추출물을 포함한다. 예를 들어, 에센셜 오일 분획물은 폴리페놀산 및/또는 다당류 농도에 관련하여 증가되거나 감소될 수 있다. 유사하게, 폴리페놀산 또는 다당류는 특정 생물학적 효과에 대한 신규 성분의 화학적 프로파일 추출을 수행하기 위해 다른 추출물 성분 분획물에 관련하여 증가되거나 감소될 수 있다. 하나 이상의 에센셜 오일, 폴리페놀 및/또는 다당류의 분리되고 정제된 분획물의 조합에 의해, 추출물은 에센셜 오일의 신규 조합물을 제공하는 것으로 제조될 수 있다.
본 발명의 방법은 인간의 질병의 치료 및 억제를 위한 신규의 계피 추출을 제공하는 단계를 제공한다. 예를 들어, 타입 2 당뇨병의 치료를 위한 신규의 계피 종 추출물은 계피 종 천연 식물 물질 또는 통상적인 공지의 추출 생성물에서 발견되는 것보다, 중량%로, 증가된 폴리페놀 분획물 농도 및 감소된 에센셜 오일 및 다당류 분획물 농도를 가질 수 있다. 항산화, 항-혈관 손상, 및 허혈 뇌혈관병에 대한 신규의 계피 종 추출물은 천연 계피 종 식물 물질 또는 통상적인 공지의 추출 생성물에서 발견되는 것보다, 중량%로, 증가된 에센셜 오일 및 폴리페놀산 분획물 및 감소된 다당류 분획물을 가질 수 있다. 알러지 질병의 치료를 위한 신규 계피 종의 다른 예는 천연 계피 종 식물 물질 또는 통상적인 공지의 추출 생성물에서 발견되는 것보다 증가된 폴리페놀 분획물 농도, 증가된 다당류 분획물, 및 감소된 에센셜 오일 분획물을 가진 분획물을 포함한다.
추출의 방법
개시된 아래의 방법은 개별적으로 또는 공지된 방법 또는 당업자에게 공지된 방법과 조합하여 사용될 수 있다. 추출을 위한 출발 물질은 하나 이상의 계피 종으로부터의 식물 물질이다. 껍질이 가장 바람직한 출발 물질이지만, 식물 물질은 식물의 임의의 부분에 될 수 있다.
계피 종 식물 물질은 물질이 임의의 특정 형태가 되도록 전-추출 단계를 수행할 수 있으며, 추출에 유용한 임의의 형태는 본 발명에 의해 계획되었다. 이 같은 전-추출 단계는, 제한되는 것은 아니지만, 물질을 자르고, 다지고, 절단하고, 분쇄하고, 가루로 하고, 잘라내거나 끊을 수 있고, 전-추출단계 이전의 출발 물질은 건조하거나 신선한 식물이다. 바람직한 전-추출 단계는 미세분말로 계피 종 껍질 물질을 분쇄 및/또는 가는 것을 포함한다. 출발 물질 또는 전-추출 단계후의 물질은 건조되거나 수분을 추가할 수 있다. 계피 종 식물 물질이 추출을 위한 형태가 되면, 추출 방법은 본 발명에 의해 계획된다.
본 발명의 추출 방법들은 본 명세서에 개시된 방법들을 포함한다. 일반적으로 본 발명의 방법들은, 일부, 용매로서 이산화탄소(SCCO2)를 사용한 초임계 유체 추출 (SFE) 후에 하나 이상의 용매 추출 단계, 예컨대, 제한되지는 않지만, 물 하이드로알코올, 및 친화성 중합체 흡착제 추출 방법을 사용하여 계피 종 식물 물질을 추출하는 방법을 포함한다. 본 발명에 의해 의도되는 추가적인 다른 방법들은 다른 유기 용매, 냉각용 화학물(refrigerant chemicals), 압축성 가스, 소니피케이션, 압력 액체 추출, 고속 역류 크로마토그라피, 분자 임프린티드(imprinted) 중합체 및 다른 공지의 추출 방법을 사용한 계피 종 식물 물질의 추출을 포함한다. 이와 같은 기술은 당업자에게 공지이다. 한 양태에서, 본 발명의 추출물은 도 1-5에 도시된 단계를 포함하는 방법에 의해 제조될 수 있다.
본 발명은 SCCO2 기술을 사용한 계피 식물 물질로부터 에센셜 오일 및 다른 지용성 화합물의 농축(정제) 및 프로파일링을 위한 방법을 포함한다. 본 발명은 예를 들어, 고순도의 에센셜 오일 분획물(고 에센셜 오일 화학적 성분 농도)로 계피의 지용성 화학적 성분의 분획화를 포함한다. 또한 본 발명은 SCCO2 방법을 포함하고, 여기서, 추출 분획물내의 개개의 화학적 성분은 변경된 그것의 화학적 성분 비율 또는 프로파일을 갖는다. 예를 들어, 에센셜 오일 분획물 내에서 화학적 성분의 SCCO2 분획 분리는 다른 에센셜 오일 화합물에 비하여 특정 에센셜 오일 화합물의 우선적 추출을 허가하여, 에센셜 오일 추출물 부분-분획물은 다른 화합물의 농도 이상의 어떤 화합물의 농도를 가지도록 제조될 수 있다. 본 발명에서 개시된 SCCO2를 사용한 계피 종의 에센셜 오일 화학적 성분의 추출은 독성의 유기 용매의 사용을 피할 수 있고, 추출물의 동시적 분획화를 제공할 수 있다. 이산화탄소는 천연의 안전한 생물학적 생성물이고 많은 식물 및 음료에서의 성분이다.
이전에 기재된 추출 방법의 수행에 있어서, 계피 종의 원래 건조된 계피 원료에서 95%를 초과하는 순도의 에센셜 오일 화학적 성분을 갖는 80질량%를 초과하는 수율의 에센셜 오일 화학적 성분이 에센셜 오일 SCCO2 추출 분획물 (단계 IA)에서 추출될 수 있다는 점을 발견하였다. 단계 IB (SCCO2 추출 및 분획 공정)에서 개시된 바와 같은 방법을 사용하여, 에센셜 오일 수율은 고도로 정제된 (>90%) 에센셜 오일 부분-분획물로의 에센셜 오일 화학적 성분의 분획으로 인해 감소된다. 또한, 본 발명에서 개시된 SCCO2 추출 및 분획 공정은 독특한 에센셜 오일 부분-분획물 프로파일이 특정 의약적 목적에 대해 생성될 수 있도록 변경된 에센셜 오일 화학적 성분 분획물을 포함하는 개개의 화학적 화합물의 비율 (프로파일)을 허용한다. 예를 들어, 지방산 화합물의 농도가 동시에 감소되거나 그 반대인 동안 스테로이드 에센셜 오일 화학적 성분의 농도는 증가될 수 있다.
본 발명의 단계 2에서 개시된 바와 같은 방법을 사용하여, 천연 계피 원료에서 발견되는 26.0% 농도의 전체 페놀산, 약 10질량%의 수율의 페놀산 화학적 성분을 가진 원래의 계피 종 원료로부터 수용성 분획물은 4.8질량% 수율로 얻어졌다. 그러나, 이 물 용매 추출물은 가치있는 수용성-에탄올 불용성 다당류 화학적 성분을 함유한다. 또한, 이 추출 단계는 천연 계피 종 식물 물질에서 발견되는 약 100% 수율의 수용성, 에탄올 불용성 다당류를 얻는다. 이 수용성 추출 분획물에서 다당류 농도는 이 수용성 추출 분획물에서 약 27건조질량% (by % dry mass weight)이다. 다당류를 침전시키기 위해 95% 에탄올을 사용하여, 정제된 다당류 분획물은 이 물 침출 추출물로부터 수집될 수 있다. 다당류 분획물이 수율은 계피 근경 원료를 근거로 약 1.3질량%이다. 표준 물질로서 덱스트란을 사용한 비색계 분석 방법 (colormetric analytical method)에 근거한, 순도 > 95%의 계피 다당류 화합물을 얻을 수 있다.
본 발명의 단계 3에서 개시된 바와 같은 방법을 사용하여, 64% 농도의 페놀산, 페놀산의 약 1/3인 비-생활성 탄닌을 갖는 원래의 계피 종 원료로부터 하이드로알코올 침출 분획물을 17.6% 수율로 얻었다. 이것은 또한 천연 계피 종 식물 물질에서 발견되는 약 90% 수율의 페놀산 관련 화학적 성분과 동등하다.
본 발명의 단계 4에서 개시된 바와 같은 방법 (친화성 흡착 추출 공정 또는 공정 크로마토그래피)을 사용하여, 0.1질량% 미만의 탄닌을 갖는 95건조질량%를 초과하는 순도의 추출 분획물을 갖는 폴리페놀산 분획물이 얻어질 수 있다. 하이드로알코올 침출 추출물 원료로부터 약 77%의 비-탄닌 폴리페놀산을 추출하는 것이 가능하다. 이것은 천연 계피 종 식물 물질에서 발견되는 69% 수율의 폴리페놀산 화학적 성분과 동등하다. 평균 중합도 (the average degree of polymerization)에 근거하여, 정제된 폴리페놀 분획물은 유익한 생활성 폴리페놀 올리고머로 주로 구성된다.
또한, 정제된 폴리페놀 분획물의 폴리페놀 화학적 성분을 프로파일하는 것이 가능하다. 예를 들어, 정제된 폴리페놀 부분-분획물은 고농도의 폴리페놀 트라이머 또는 테트라머를 함유하여 얻어질 수 있다. 이러한 신규의 정제된 폴리페놀 부분-분획물은 특정 의학 조건에 매우 큰 가치를 가질 수 있다.
최종적으로, 본 발명에서 개시된 바와 같은 방법은 에센셜 오일 분획물에서 99질량% 만큼의 원하는 화학적 성분, 폴리페놀 페놀 분획물에서 97질량% 만큼, 그리고 다당류 분획물에서 98질량% 만큼이 되도록 계피 종 에센셜 오일 화학적 성분 분획물, 신규의 폴리페놀 분획물 또는 부분-분획물 및 신규의 다당류 분획물의 정제 (농도)를 허용한다. 특정 추출 환경, 추출의 속도, 용매, 및 사용된 추출 기술은 원료 물질의 출발시 화학적 성분 프로파일 및 최종 추출 생성물에서 바람직한 정제의 수준에 의존한다. 본 발명에서 개시한 바와 같은 특정 방법은 특정 속성을 갖는 물질을 배출하도록 처리되는 시작 물질의 속성에서 샘플 변화를 설명하기 위해 공정을 조절하기 위한 일상적인 것에 지나지 않는 전형적인 실험을 사용하여 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있다. 예를 들어, 특히 수많은 계피 종 식물 물질에서, 에센셜 오일 화학적 성분, 폴리페놀산, 및 다당류의 초기 농도는 본 발명에서 개시된 바와 같이 당업자에게 공지된 방법을 사용하여 결정된다. 당업자는 최종적인 계피 종 추출 생성물에서 원하는 농도 및/또는 화학적 프로파일에 이르도록, 여기서 기재된 바와 같이, 에센셜 오일 화학적 성분의 초기 농도로부터, 예를 들어, 추출 방법을 사용하여 최종 추출 생성물에 대한 에센셜 오일 화학적 성분의 예정된 양 또는 분배로 변화의 양을 결정할 수 있다.
계피의 생물학적 활성 화학적 성분의 추출 방법의 도식은 도 1-5에 나타내었다. 이 추출 방법은 일반적으로, 제한되는 것은 아니지만, 4 단계이다.
단계 1: 계피 에센셜 오일의 초임계 유체 이산화탄소 추출
에센셜 오일의 소수성 성질 때문에, 제한되는 것은 아니지만, SCCO2, 헥산, 석유 에테르, 및 에틸 아세테이트를 포함하는 비극성 용매가 본 추출 방법에 사용될 수 있다. 에센셜 오일의 일부 성분은 휘발성이므로, 수증기 증류 또한 추출 방법으로 사용할 수 있다.
SCCO2를 사용한 계피 종의 껍질로부터 에센셜 오일 화학적 성분의 추출의 일반적인 기술은 도 2-단계 2A 및 2B에 기재된다. 원료 (10)는 건조 분쇄된 계피 (약 140 메쉬)이다. 추출 용매 (210)는 순수 이산화탄소이다. 에탄올이 공-용매로서 사용될 수 있다. 원료를 SFE 추출 용기 (20)내로 로드한다. 퍼지 및 누출 테스트 후에, 본 방법은 냉각기를 통해 저장 용기로부터 CO2 펌프로의 액화 흐름을 포함한다. CO2는 압력 및 온도가 원하는 수준으로 유지되는 추출 용기내에서 원료를 통해 목적하는 압력 및 흐름을 위해 압축된다. 추출압력은 약 60 bar 내지 800 bar의 범위이고, 온도는 약 35℃ 내지 약 90℃ 범위이다. 본 명세서에 개시된 SCCO2 추출은 바람직하게는 100 bar 이상의 압력 및 35℃ 이상의 온도, 보다 바람직하게는 약 60 bar 내지 500 bar의 압력 및 약 40℃ 내지 약 80℃의 온도에서 수행된다. 추출의 단일 단계에 대한 추출시간은 약 30분 내지 약 2.5시간, 내지 약 1시간의 범위이다. 용매 대 주입 비율은 일반적으로 각각의 SCCO2 추출물에 대해 약 60 대 1이다. CO2는 재순환된다. 추출된, 정제된, 및 프로파일된 정유 화학적 성분 (30)은 그 후 빛보호 유리병에 저장된 수집기 또는 분리기에 수집되고 4 ℃에서 어두운 냉장고에서 보존된다. 계피 원료 (10) 물질은 1 단계 방법으로 추출될 수 있고(도 2, 단계 2A), 여기서 생성된 추출 및 정제된 계피 에센셜 오일 분획물 (30)은 하나의 수집기 SFE 또는 SCCO2 시스템 (20) 또는 다중 단계 (도 2, 단계 2B)에서 수집되고, 여기서 추출된 정제되고 프로파일된 계피 에센셜 오일 부분-분획물(50, 60, 70, 80)은 별개로 순차적으로 수집기 SFE 시스템 (20)에서 수집된다. 택일적으로, 분별 SFE 시스템에서와 같이, SCCO2 추출된 계피 원료 물질은 수집기 용기 (분리기)내로 분리되어, 각각의 수집기 내에서 에센셜 오일 화학적 구성 조성물 (프로파일)이 상대적 비율이 다른 각각의 정제된 에센셜 오일 부분-분획물이 수집된다. 잔류물 (나머지 것) (40)은 수집되고, 저장되고, 계피 종 페놀산 및 다당류의 정제된 분획물을 얻기 위해 추가적 과정에 사용된다. 본 발명의 구체예는 60 bar 내지 500 bar의 압력 및 35℃ 내지 90℃의 온도에서 다중-단계 SCCO2 추출을 사용한 계피 종 원료 물질의 추출 및 각각의 단계 후의 추출된 계피 물질의 수집을 포함한다. 본 발명의 제 2 구체에는 60 bar 내지 500 bar의 압력 및 35℃ 내지 90℃의 온도에서 분획화 SCCO2 추출을 사용한 계피 종 원료 물질을 추출하고, 예정된 조건(압력, 온도 및 농도) 및 예정된 간격(시간)에서 다른 수집기 용기에 추출된 계피 물질의 수집을 포함한다. 각각의 다중-단계 추출기 또는 다른 수집기 용기 (분별 시스템)로부터 얻어진 추출된 계피 정제된 에센셜 오일 부분-분획물은 회수되고 즉시 사용될 수 있거나, 천연 식물 물질 또는 통상의 계피 추출 생성물에서 발견되는 것 보다 높거나 낮은 예정된 에센셜 오일 화학적 성분 농도를 포함하는 하나 이상의 계피 에센셜 오일 분획물과 결합할 수 있다. 일반적으로, 단일 단계 최대 SCCO2 추출을 사용한 계피 종으로부터의 에센셜 오일 분획물의 총 수율은, 추출물의 95질량%를 초과하는 에센셜 오일 화학적 성분 순도를 갖는, 약 0.4 내지 약 1.8중량% (> 85%의 에센셜 오일 화학적 성분)이다. 이 추출 방법의 결과를 아래 및 표 4에 나타내었다. 공정은 실시예 1에서 확인할 수 있다.
표 4. 단일 단계 SFE 계피 에센셜 오일 추출의 HPLC 분석.
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이들 결과는 추출의 동력학상 압력의 효과를 증명한다. 더욱 높은 추출 압력은 더욱 적은 양으로 소비된 CO2로 짧은 시간에 시스템 도달 평형을 달성한다. 총 추출 수율은 압력의 증가와 관련된 농도의 증가에 기인하여 증가된 추출 압력으로 증가된다. 흥미롭게, 압력이 낮을 수록, 예컨대, 100-300 bar, 온도가 낮을 수록, 높은 농도와 관련하여 수율 또한 높아졌다. 고압, 예컨대, 300-500 bar에서, 온도는 추출 수율에 더욱 낮은 효과를 갖는다. 비록 높은 수율 및 증대된 추출능이 200 bar 이상의 압력에서 달성되었지만, 에센셜 오일 화학적 성분의 95% 순도는 300 bar 보다 낮은 압력 및 약 40-80℃의 온도에서 달성될 수 있다.
조사된 실험 범위에서, 온도와 농도 사이의 경쟁적 효과가 있다는 것을 명백하게 알 수 있다. 이 것은 문헌에서 잘 확립되고, 문서화되며, 일정 온도에서 압력이 증가되면, 초임계 및 근임계 유체의 용매능의 증가에 기인하여 수율의 증가를 유발한다. 온도의 증가는 추출에 유리한 화합물의 증기압에서 증강을 촉진한다. 또한 확산 계수의 증가 및 용매 점성의 감소 또한 온도가 높은 값으로 증가함에 따라, 식물의 다공성 기질로부터의 화합물 추출을 돕는다. 한편, 일정한 시스템 압력에서 온도의 증가는 용매 농도의 감소를 유발한다.
71개의 화합물이 GC-MS 분석을 사용하여 계피 에센셜 오일에서 분리되고 확인되었다. 과학 문헌에서 데이터와 함께 샘플의 질량 스펙트럼 데이터를 비교하여, 신남알데하이드, 쿠마린, 및 신나밀 아세테이트를 확인하였다 (표 3 및 4). 그 외에 신남알데하이드 및 그것의 동종물, 예컨대 벤즈알데하이드 (Pl), 신남알데하이드 (PlO & P14), 신나밀 알코올 (P16), 트랜스-신남산 (P23), 및 신나밀 아세테이트 (P25), 4개의 모노테르펜 (P6, P8, 및 P9), 16개의 세스퀴테르펜 (P20-22, P26, P29, P31-2, P35-42, 및 P46), 및 9개의 지방산 및 지방산 유도체가 확인되었다. 다른 소량의 방향족 및 지방족 화합물이 또한 존재하였다. 확인된 화합물에서, SFE는 계피 에센셜 오일에서 이전에 확인되지 않았던 추출물 지방산 및 스테로이드 화합물을 추출할 수 있었다. 이들 화합물은 약 90질량%의 에센셜 오일 화학적 성분으로 구성된다. 신남알데하이드는 약 70-91질량%에서 계피 에센셜 오일의 주 화학적 성분이다. 수많은 화합물은 더 높은 온도 및 압력의 SFE 추출 조건에서 보다 약 100%의 더욱 높은 순도를 갖는 40℃ 및 120 bar 조건하에서의 추출로부터 확인된다. 90질량%를 초과하는 신남알데하이드 순도는 스테로이드 화합물의 상실 및 더욱 낮은 지방산 및 세스퀴테르펜 순도를 갖는 60℃의 SFE 온도 및 100 bar에서 달성된다. 스테로이드 화합물은 40℃의 저온도에서만 추출될 수 있다. 40℃의 SFE 온도 및 80 bar에서, 스테로이드 화합물 화학적 성분 순도는 20질량%였다. 대조적으로, 더욱 높은 SFE 온도 (60-80℃) 및 압력 (500 bar)은 지방산 화합물의 추출을 촉진한다. 이들 데이터는 SCCO2가 계피 에센셜 오일의 화학적 성분을 프로파일하기 위한 능력을 가짐을 나타낸다.
표 5. 계피 에센셜 오일 분획물에서 확인된 화합물.
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표 6. 서로 다른 조건에서 GC-MS 분석 피크면적, 피크면적 퍼센트 및 계피 에센셜 오일 추출물의 계산된 중량 퍼센트
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주의: 중량%는 다음으로 계산된다:
중량% = (각 화합물의 중량 / 추출물의 총 중량) x 100
여기서 각 화합물의 중량 = 피크면적 퍼센트 x 추출물의 총중량.
단계 2. 물 침출 공정 및 다당류 침전
계피 종의 화학적 성분의 다당류 추출 분획물은 과학 문헌에서는 "수용성, 에탄올 불용성 추출 분획물"로써 정의된다. 물 용매 침출 및 에탄올 침전 방법을 사용한 계피 종의 추출물로부터의 다당류 분획물의 추출의 일반적인 기술은 도 3-단계 2에 도시된다. 원료 (10 또는 40)는 천연의 분쇄된 계피 종 식물 물질 또는 단계 1의 SFE 추출 공정으로부터의 고체 잔여물이다. 이 원료는 2개의 단계에서 침출 추출된다. 용매는 증류수 (220)이다. 이 방법에서, 계피 종 원료 (10 또는 40) 및 추출 용매 (220)를 추출 용기 (100, 110)내에 로드하고, 가열하고, 교반하였다. 이것은 100℃로, 약 80℃로, 또는 약 80-90℃로 가열될 수 있다. 추출은 약 1-5시간, 약 2-4시간, 또는 약 2시간 동안 수행되었다. 2개의 단계 추출 용액 (300+320)을 혼합하고, 용액 (330)에서 화학 물질의 농도가 약 8배 증가될 때까지 슬러리를 여과하고 (120), 원심분리하고 (130), 물을 제거하기 위해 증발시켰다 (140). 무수 에탄올 (230)이 그후 최종 에탄올 농도를 95%로 만드는 용액의 원래의 부피를 재구축하기 위해 사용되었다. 큰 침전물 (150)이 발견되었다. 용액을 원심분리하고 (160), 웃물을 따라내었고 (170), 상청 잔여물 (340)은 추가의 처리를 위해 보관될 수 있다. 침전 생성물 (350)은 표준 물질으로써 덱스트란 5,000-410,000 분자량을 사용하여 비색계 방법을 사용한 다당류에 대해 분석될 수 있는 정제된 다당류 분획물이다. 실제 절차는 실시예 3에서 찾을 수 있다. 표준 물질로써 서로 다른 3개의 분자량 덱스트란을 사용하여 추출된 다당류 분획물의 순도는 원래의 천연 계피 원료의 총 1.3질량%의 수율을 가지며, 각각 29, 35, 및 47%이다. 3개의 덱스트란 표준의 순도 측정을 종합하면 95% 초과의 매우 높은 수준의 순도를 나타낸다. 또한 AccuTOF-DART 질량 분석 (실시예 섹션 참조)을 정제된 다당류 분획물을 포함하는 화합물의 분자량의 추가적 프로파일을 위해 사용하였다. 실제 절차는 실시예 섹션에서 찾을 수 있다.
단계 3. 정제되지 않은 폴리페놀산 분획물의 추출을 위한 하이드로알코올 침출 방법
한 양태에서, 본 발명은 생활성 폴리페놀산 화학적 성분의 추출 및 농도를 포함한다. 이 단계의 일반적인 기술은 도 4-단계 3에 도식된다. 이 단계 2 추출 방법은 용매 침출 방법이다. 이 추출을 위한 원료는 계피 종 분쇄된 건조 껍질 식물 (10) 또는 각각 에센셜 오일 화학적 성분의 단계 1 SCCO2 추출 또는 단계 2 다당류 추출-침전로부터의 잔여물 (40 또는 330+340)이다. 추출 용매 (240)는 수용성 에탄올이다. 추출 용매는 10-95% 수용성 알코올일 수 있고, 25% 수용성 에탄올이 바람직하다. 이 방법에서, 계피 원료 물질 및 추출 용매는 추출 용기 (400)내로 로드되고, 가열되고 교반되었다. 이것은 100℃로, 약 90℃로, 약 80℃로, 약 70℃로, 약 60℃로, 또는 약 30-50℃로 가열될 수 있다. 추출은 약 1-10시간, 약 1-5시간, 약 2시간 동안 수행될 수 있다. 생성된 추출물 용액을 여과 (410)하고 원심분리 (420)하였다. 여과액 (상청액) (500, 520, 540)을 생성물로써 수집하고, 용매를 증발시킨 후에 부피 및 고체 함량 건조 중량을 측정하였다. 추출 잔여물 물질 (530)을 추가적인 처리를 위해 보유하고, 저장하거나 폐기하였다. 추출은 필요 또는 목적에 따라 수 회 반복할 수 있다. 이것은 2회 이상, 3회 이상, 4회 이상 등으로 반복될 수 있다. 예를 들어, 도 1-단계 2는 3개의 단계 방법을 나타내며, 제2 단계 및 제3 단계는 동일한 방법 및 조건을 사용한다.
흥미롭게도, 잔여 신남알데하이드는 모든 에센셜 오일 화학적 성분이 상기 SFE 조건을 사용하여 상대적으로 남김없는 추출로 추출되는 것은 아니라는 것을 나타내는 이 하이드로알코올 침출 추출 방법으로 추출된다. 또한, 상당한 양의 탄닌은 20% 초과의 추출 생성물을 만들기 위해 추출된다. 또한, 2개 단계의 하이드로알코올 침출 방법은 약 64질량%의 총 페놀산 농도 및 약 20질량%의 탄닌산 농도를 갖는 폴리페놀의 높은 추출 수율 (가공하지 않은 원료 물질에 근거하여 약 18질량%)을 달성하는데 바람직하다. 고농도의 생활성 폴리페놀을 함유한 정제된 폴리페놀 분획물을 개발하기 위해, 정제되지 않은 단계 3 폴리페놀 분획물로부터 탄닌을 제거하기 위해서는 추가적인 공정 단계 (단계 4)가 필요하다.
단계 4. 친화성 흡착 폴리페놀 추출 및 정제 방법
유익한 생활성 폴리페놀산은 프로안토시아니딘이다. 프로안토시아니딘은 축합된 (condensed) 탄닌으로 알려져 있다. 그들은 어디에나 있으며 리그닌 다음 2번째로 천연의 식물 폴리페놀에 풍부하게 존재한다 (Analytical Chem 28:350-356, 1956). 프로안토시아니딘은 C4-C8 및/또는 C4-C6 결합 (B-타입)을 통해 주로 결합되는 (+)-카테킨 및/또는 (-)-에피카테킨 단위로 구성된 올리고머 및 중합체의 혼합물이다. 이들 플라반-3-올은 또한 C4-C8 결합 및 C7-C2 결합 (A-타입) 사이의 추가적인 에테르 결합에 의해 이중 연결될 수 있다. 중합도 (DPn)로서 표현된 프로안토시아니딘의 분자량은 가장 중요한 특성 중의 하나이다. 과학 문헌에서 정의한 바와 같이, 각각 DP 1은 단량체이고, DP 2-10는 올리고머이며, DP > 10은 중합체이다.
계피 폴리페놀 (앞을 참조)에 관한 생의학적 문헌에서, DP 4-5 (올리고머)가 의학적으로 유익한 생물학적 활성을 보여준다. 따라서, 단계 4 처리에서, 탄닌 제거 및 프로안토시아니딘 추출 및 정제가 처리의 각 단계에서 총 페놀산 농도 및 DPn 추척에 의해 연구되어 왔다.
본 명세서에 교시된 바와 같이, 계피 및 관련 종으로부터의 정제된 폴리페놀산 분획물 추출물은 친화성 흡착제상에 하이드로알코올 추출물을 포함하는 폴리페놀산을 흡착하기 위해 계피 원료의 하이드로알코올 추출물과 고체 친화성 중합체 흡착 레진을 접촉하여 얻을 수 있다. 결합된 화학적 성분은 본 명세서에서 교시된 방법에 의해 순차적으로 용리된다. 폴리페놀산 분획물 화학적 성분을 용리하기 전에, 그 위에 목적하는 화학적 성분을 흡착하는 친화성 흡착제는 임의의 편리한 방법, 바람직하게는 흡착제와 접촉시키는 방법으로 추출물의 잔여물로부터 분리될 수 있고, 분리는 추출 컬럼 또는 흡착제 물질의 베드(bed)를 통해 수용성 추출물을 통과시키는 방법에 의하는 것이 효과적이다.
친화성 흡착제의 다양성은 계피 종의 페놀산 화학적 성분을 정제하기 위해 사용될 수 있고, 제한되는 것은 아니지만, 예컨대, 세파덱스 LH-20 (Sigma Aldrich Co.), "Amberlite XAD-2" (Rohm & Hass), "Duolite S-30" (Diamond Alkai Co.), "SP207" (Mitsubishi Chemical), ADS-5 (Nankai University, Tianjin, China), ADS-17 (Nankai University, Tianjin, China), Dialon HP 20 (Mitsubishi, Japan), 및 Amberlite XAD7 HP (Rohm & Hass)이다.
세파덱스 LH020은 폴리페놀산 화학적 성분에 대한 높은 친화성 및 비-탄닌 폴리페놀로부터 탄닌 폴리페놀을 분리하는 그것의 능력 때문에 공정 크로마토그래피에 바람직하게 사용된다. 탄닌 폴리페놀은 알코올에서 세파덱스 LH-20에 흡착된다. 대조적으로 비-탄닌 폴리페놀은 비드 상에 탄닌 잔여물이 흡착됨에 반해 알코올을 사용하여 레진 비드로부터 용리될 수 있다. 탄닌은 후에 수용성 아세톤으로 용리될 수 있다. 이 방법은 계피의 원하는 비-탄닌 폴리페놀로부터 탄닌 폴리페놀의 분리를 가능하게 한다. 따라서, 서로 다른 용리 용매가 폴리페놀 화합물의 분리 및 비-탄닌 생활성 계피 폴리페놀의 정제에 사용될 수 있다. 폴린-치오칼토 방법 및 단백질-침전 가능한 페놀 방법을 사용하여, 탄닌 및 비-탄닌 폴리페놀 농도는 정제되지 않은 추출 분획물 및 용리 분획물에서 측정될 수 있다.
다양한 용리액(eluant)이 흡착제로부터 비-탄닌 폴리페놀산 화학적 성분을 회수하기 위해 사용될 수 있지만, 본 발명의 한 양태에서, 용리액은, 제한되는 것은 아니지만, 메탄올, 에탄올, 또는 프로판올을 포함하는 저분자량 알코올을 포함한다. 제 2 양태에서, 용리액은 물과 혼합된 저분자 알코올을 포함한다. 다른 양태에서, 용리액은 저분자량 알코올, 제 2 유기용매 및 물을 포함한다.
다양한 용리액이 탄닌 폴리페놀산 화학적 성분을 회수하기 위해 사용될 수 있지만, 본 발명의 한 양태에서, 용리액은 수용성 아세톤을 포함한다.
바람직하게 계피 종 원료는 하나 이상의 예비적 정제 과정, 예컨대, 제한되는 것은 아니지만, 친화성 흡착 물질로 추출물을 함유하는 수용성 페놀산 화학적 성분을 접촉하기 전에 단계 1 및 3에서 기술된 방법을 수행할 수 있다.
본 발명에서 교시된 친화성 흡착제를 사용하여 천연 식물 물질 또는 상업적으로 유용한 추출 생성물에 일반적으로 존재하는 다른 화학적 성분이 현저하게 없는 계피 종의 잘 정제된 생활성 폴리페놀 올리고머 (DP2-10) 산 화학적 성분을 얻었다. 예를 들어, 본 발명에서 교시된 방법은 단지 극소량의 탄닌 폴리페놀만을 함유하는 95건조질량%를 초과하는 총 페놀산 화학적 성분을 포함하는 정제된 폴리페놀산 추출물을 얻을 수 있다.
중합체 친화성 흡착 레진 비드를 사용하는 계피 종의 껍질로부터 생활성 폴리페놀산의 추출 및 정제의 일반적인 기술은 도 1-단계 4에 도시되었다. 이 추출 방법을 위한 원료는 단계 3 하이드로알코올 침출 추출 (500 +/- 520 +/- 540)로부터의 페놀산을 함유하는 수용성 에탄올 용액이 될 수 있다. 흡착 레진 비드의 적합한 중량 (흡착 레진의 gm당 22 mg의 폴리페놀산)을 컬럼 (620)내에 로드하기 전에 4-5 BV의 95% 에탄올 (250)로 세척하였다 (젖음). 수용성 용액 (500+520)을 함유하는 폴리페놀산을 그것의 원래 부피의 1%로 증발시켜 농축하였다. 다음에 무수 에탄올 (260)을 부피가 20배로 증가하도록 충분히 농축된 샘플에 첨가하여, 95% 에탄올 용액에 폴리페놀을 용해하였다. 이 용액을 원심분리 (640)하여 임의의 불용성 물질을 제거하고 상청액을 로딩 샘플 (550)로써 수집하였다. 로딩 샘플 (550)을 컬럼 (650) 상에 로드하였다. 일단 컬럼에 완전히 로드하면, 친화성 흡착 컬럼으로부터 등용매(isocratic) 방식으로 생활성 비-탄닌 폴리페놀을 용리시키도록 컬럼을 2-3 BV/시간의 유속에서 95% 에탄올 (270)로 용리시켰다 (660). 용리액 (700)을 1 BV 분획물에 수집하였다. 폴리페놀 분획물은 각각 용리가 멈추는 시간에 분획물 샘플에서 흡수가 더 이상 검출되지 않을 때까지 280 nm (폴리페놀산 파장 흡수)에서 UV 분광광도계에 의해 시험되었다. 컬럼 (약 3-4시간)으로부터 비-탄닌 폴리페놀을 용리하는데는 일반적으로 7-10 BV의 95% 에탄올이 필요하였다. 용리된 컬럼 (670)을 5 BV/시간 (3시간)의 흐름 속도에서 3 BV의 70% 수용성 아세톤 (280)으로 세척하여 (680) 레진 비드 상에 흡착된 탄닌 폴리페놀을 용리시켰다. 용리된 탄닌 폴리페놀 세척액 (710)을 버렸다 (730). 추가의 공정 크로마토그래피 (740)를 위해 컬럼에서 임의의 여분 화학물질을 제거하여 세척된 컬럼을 제조하기 위해 세척된 컬럼 (730)은 다음에 5 BV/시간의 흐름 속도에서 4-5 95% 에탄올 (250)로 세척하였다. 세척액 (720)은 버렸다 (730). 용리 분획물 부피 (700)는 약 1 BV 마다 수집될 수 있으며 이들 샘플은 총 폴리페놀 (폴린-치오칼토 방법), 탄닌 폴리페놀 (단백질-침전 방법), DPn (가티올 분해 HPLC) 분석되며 고체 함량 및 순도를 위해 시험된다.
프로안토시아니딘 폴리페놀 화합물의 올리고머 및 중합체는 넓은 머무름 윈도우 (머무름 시간 12-30분)에서 용리되므로 카테킨 및 에피카테킨 농도가 계산될 때 기준선의 벗어남 및 크로마토그래피 피크의 정확한 적분의 어려움을 초래한다. 이 HPLC 성질은 과학 문헌에서 대부분의 프로안토시아니딘에 대해 입증되어 왔다. 그러나, 가티올 분해 후, HPLC 크로마토그램은 크로마토그래피 해상도의 개선의 증거를 깨끗하게 보여준다. 가티올 분해된, 프로안토시아니딘은 HPLC 크로마토그램 상에서 잘-분해된 피크가 얻어지는 단량체 단위로 전환된다. 과학 문헌에 따른 프로안토시아니딘 구조의 연장된 단위로부터 벤질티오에테르를 얻었다 (Guyot 2001을 참조). DPn은 Pl, P2, P3, 및 P4의 총 면적 및 카테킨 및 에피카테킨의 총 면적에 의해 계산될 수 있다.
세파덱스 LH-20은 계피 하이드로알코올 추출물에서 비탄닌 폴리페놀 화합물로부터 탄닌의 분리를 위한 효율적인 친화성 흡착을 보여주었다. 용리 분획물 F2-F8을 모으면 약 77.4% 비-탄닌 폴리페놀 화학적 성분이 이 모아진 추출 분획물에 단지 0.2%의 탄닌만이 회수된 채 회수될 수 있다. 용리 분획물 F2-F8을 모은 수율은 로딩 용액의 21.5질량%이고 가공하지 않은 계피 원료를 기준으로 3.78질량%이다. 비-탄닌 폴리페놀 순도는 단계 3의 정제되지 않은 폴리페놀 추출 생성물보다 3배 더 높은 65건조질량%이다. 또한, 95질량%를 초과하는 순도를 용리 분획물 F6-F8을 모은 것에 의해 얻을 수 있다.
평균 중합도 (DPn)는 각 용리 분획물에서 폴리페놀 올리고머의 크기를 나타낸다. 정제되지 않은 추출물 (로딩 용액)에서, 중합도는 더욱 큰 탄닌 폴리페놀 중합체의 존재로 인해 6.9였다. 폴리페놀 용리 분획물에서, 본질적으로 탄닌 폴리페놀은 발견되지 않았다. 따라서, 정제된 폴리페놀 용리 분획물은 주로 폴리페놀 올리고머로 이루어진다 (다이머-DPn = 2; 트라이머-DPn = 3; 테트라머-DPn = 4; 등의 혼합물). 표 5에서 보여주는 바와 같이, 용리 분획물 F3-F5에서 트라이머가 더 용리되며 용리 분획물 F6-F8 에서 테트라머가 더 용리되었다. 용리 분획물 내에서 DPn의 범위는 2.7 내지 4.2이며, 이들 분획물이 계피의 유익한 생활성 프로안토시아니딘 폴리페놀 화학적 성분의 고수준 순도를 포함하는 것이 증명된다. 또한, 다른 용리 분획물의 모음에 의해, 비탄닌 폴리페놀의 다른 순도를 갖는 다른 추출 생성물 및 수율이 표 7 및 8에 나타낸 바와 같이 얻어질 수 있다.
표 7. 세파덱스 LH-20 공정 크로마토그래피로부터 폴리페놀 분획물의 95% 에탄올 용리의 분석.
Figure 112008073751038-PCT00012
* 용리 1은 화학적 성분으로 단지 용매만이 있기 때문에 표로 작성되지 않았다.
표 8. 다른 비탄닌 폴리페놀 용리 분획물의 수율 및 순도의 결과.
Figure 112008073751038-PCT00013
* 전체 페놀산은 이들을 모은 분획물에서 측정 가능한 탄닌산을 가지지 않는다.
용액으로부터 알코올을 제거하기 위한 많은 방법이 당업계에 공지되었다. 만일 알코올을 재순환하는 것이 바람직하다면, 알코올은 추출후, 정상 또는 감소된 대기 압력하의 증류에 의해 제거할 수 있다. 알코올은 재사용할 수 있다. 또한 알코올이 제거될 수용성 용액 또는 용액으로부터 물을 제거하기 위한 많은 방법이 당업계에 공지되었다. 이 방법은, 제한되는 것은 아니지만, 적당한 캐리어, 예컨대, 마그네슘 카보네이트 또는 말토덱스트린 상에서 수용성 용액의 스프레이 건조를 포함하고, 또는 대체적으로 액체를 냉동 건조 또는 굴절 윈도우 건조에 의해 건조시킬 수 있다.
식품 및 약제
본 발명의 식품의 형태로써, 임의의 형태, 예컨대, 과립 상태, 입자 상태, 페이스트 상태, 겔 상태, 고체 상태, 또는 액체 상태로 포뮬레이트될 수 있다. 식품에 첨가가 허용되어온 것으로 당업자에게 통상적으로 공지된 다양한 종류의 물질, 예컨대, 결합제, 붕해제, 증점제, 분산제, 재흡수 촉진제, 감미제 (tasting agent), 버퍼, 계면활성제, 용해 촉진제, 방부제, 유화제, 등장성제, 안정제 또는 pH 조절제, 등이 이들 형태에 임의로 함유될 수 있다. 식품에 첨가되기 위한 엘더베리 추출물의 양은 특별히 제한되지 않으며, 예컨대, 약 60kg의 몸무게를 갖는 성인의 섭취량으로써 일당 약 10 mg 내지 5 g, 바람직하게는 50 mg 내지 2 g이 될 수 있다.
특히, 건강 유지를 위한 식품, 기능성 식품 등으로써 사용되는 경우, 본 발명의 예정된 효과가 충분히 나타나는 양에서 본 발명의 유효 성분을 함유하는 것이 바람직하다.
본 발명의 약제는, 예를 들어, 고체제, 에컨대, 정제, 과립, 파우더, 캡슐, 등 또는 액체제, 예컨대, 주사액 등으로 통상적으로 공지된 방법에 따라 임의로 제조될 수 있다. 이들 약제에, 일반적으로 사용되는 임의의 물질, 예컨대, 결합제, 붕해제, 증점제, 분산제, 재흡수 촉진제, 감미제, 버퍼, 계면활성제, 용해 촉진제, 방부제, 유화제, 등장성제, 안정제 또는 pH 조절제가 포뮬레이트될 수 있다.
약제에서 유효 성분(계피 추출물)의 투여량은, 종류, 제형, 연령, 몸무게 또는 환자에 적용되는 증상 등에 의존하여 변화할 수 있는데, 예컨대, 경구로 투여되는 경우, 약 60 kg의 몸무게를 갖는 성인에 대해 일당 1회 또는 수회 투여되고, 일당 약 10 mg 내지 5 g, 바람직하게는 50 mg 내지 2 g의 양으로 투여된다. 유효 성분은 계피 추출물의 하나 또는 여러 가지 성분이 될 수 있다.
방법은 또한 하루에 한 번 이상, 하루에 두 번 이상, 하루에 세 번 이상 및 하루에 1 내지 15회 이러한 추출물을 투여하는 단계를 포함한다. 이러한 투여는 여러 날, 여러 주, 여러 달, 여러 해의 기간에 걸쳐 매일처럼 연속적일 수 있거나, 특정 조건을 치료 또는 억제하기 위해 특정 시간에 될 수도 있다. 예를 들어, 인간은 정신 집중, 인지, 및 기억력을 증진시키거나, 타입 2 당뇨병을 억제하거나 치료하기 위해, 심혈관병 뇌졸중을 억제하기 위해, 또는 위장관 질병을 치료하기 위해, 또는 염증 질환 및 통풍을 포함하는 관절염을 치료하기 위해, 또는 일상적인 감기, 균 및 진균 감염을 치료하기 위해 수년간 하루에 적어도 한 번 계피 종 추출물을 투여할 수 있다.
상기 설명은 본 발명을 수행하는 현재 최상으로 고려되는 모드를 포함한다. 이러한 설명은 본 발명의 일반적인 원리를 기술할 목적으로 이루어진 것으로서 제한된 의미를 지니지 않는다. 본 발명은 또한 하기 실시예에 의해 설명되며, 이는 임의의 방식으로 이의 범위를 제한하는 것으로 구성되지 않는다. 반대로, 여러 다른 구체예, 변형예, 및 이의 균등물을 가질 수 있는 것으로 명확하게 이해될 것이며, 이는 본원의 설명을 읽은 후에, 본 발명의 정신으로부터 벗어나지 않게 당업자들에게 제안될 것이다.
본원에서 사용되는 모든 용어는 당업자에 의해 이들의 일반적으로 수용되는 사용법으로 해석되는 것으로 사료된다. 본원에 인용된 특히 및 특허 출원 또는 문헌 모두는 전문이 참고문헌으로 통합된다.
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도 1은 계피 추출 공정의 예시적 개요도를 나타낸 것이다.
도 2는 에센셜 오일 분획물의 제조에 대한 예시적 방법을 나타낸 것이다.
도 3은 다당류 분획물의 제조에 대한 예시적 방법을 나타낸 것이다.
도 4는 용매 침출 추출에 대한 예시적 방법을 나타낸 것이다.
도 5는 정제된 폴리페놀 분획물의 제조에 대한 예시적 방법을 나타낸 것이다.
도 6은 계피 다당류에 대한 AccuTOF-DART 질량 스펙트럼을 나타낸 것이다 (양이온 모드).
도 7은 계피 다당류에 대한 AccuTOF-DART 질량 스펙트럼을 나타낸 것이다 (음이온 모드).
도 8은 계피에 대한 AccuTOF-DART 질량 스펙트럼을 나타낸 것이다 (양이온 모드).
도 9는 세파덱스 LH-20 패킹 물질을 사용한 컬럼 크로마토그래피에 의해 분리된 계피의 정제되지 않은 추출물에 대한 AccuTOF-DART 질량 스펙트럼을 나타낸 것이다 (양이온 모드).
도 10은 75% EtOH 추출 용매를 사용한 계피 HS#147의 정제되지 않은 추출물에 대한 AccuTOF-DART 질량 스펙트럼을 나타낸 것이다 (양이온 모드).
도 11은 세파덱스 LH-20 패킹 물질을 사용한 컬럼 크로마토그래피에 의해 분리된 분획물 F3에 대한 AccuTOF-DART 질량 스펙트럼을 나타낸 것이다 (양이온 모드).
도 12는 세파덱스 LH-20 패킹 물질을 사용한 컬럼 크로마토그래피에 의해 분리된 분획물 F4에 대한 AccuTOF-DART 질량 스펙트럼을 나타낸 것이다 (양이온 모드).
도 13은 세파덱스 LH-20 패킹 물질을 사용한 컬럼 크로마토그래피에 의해 분리된 분획물 F5에 대한 AccuTOF-DART 질량 스펙트럼을 나타낸 것이다 (양이온 모드).
도 14는 세파덱스 LH-20 패킹 물질을 사용한 컬럼 크로마토그래피에 의해 분리된 분획물 F6에 대한 AccuTOF-DART 질량 스펙트럼을 나타낸 것이다 (양이온 모드).
도 15는 세파덱스 LH-20 패킹 물질을 사용한 컬럼 크로마토그래피에 의해 분리된 분획물 F7에 대한 AccuTOF-DART 질량 스펙트럼을 나타낸 것이다 (양이온 모드).
도 16은 세파덱스 LH-20 패킹 물질을 사용한 컬럼 크로마토그래피에 의해 분리된 분획물 F8에 대한 AccuTOF-DART 질량 스펙트럼을 나타낸 것이다 (양이온 모드).
도 17은 계피에 대한 AccuTOF-DART 질량 스펙트럼을 나타낸 것이다 (음이온 모드).
도 18은 75% EtOH 추출 용매를 사용한 계피 HS#147의 정제되지 않은 추출물에 대한 AccuTOF-DART 질량 스펙트럼을 나타낸 것이다 (음이온 모드).
도 19는 세파덱스 LH-20 패킹 물질을 사용한 컬럼 크로마토그래피에 의해 분 리된 계피의 정제되지 않은 추출물에 대한 AccuTOF-DART 질량 스펙트럼을 나타낸 것이다 (음이온 모드).
도 20은 세파덱스 LH-20 패킹 물질을 사용한 컬럼 크로마토그래피에 의해 분리된 분획물 F3에 대한 AccuTOF-DART 질량 스펙트럼을 나타낸 것이다 (음이온 모드).
도 21은 세파덱스 LH-20 패킹 물질을 사용한 컬럼 크로마토그래피에 의해 분리된 분획물 F4에 대한 AccuTOF-DART 질량 스펙트럼을 나타낸 것이다 (음이온 모드).
도 22는 세파덱스 LH-20 패킹 물질을 사용한 컬럼 크로마토그래피에 의해 분리된 분획물 F5에 대한 AccuTOF-DART 질량 스펙트럼을 나타낸 것이다 (음이온 모드).
도 23은 세파덱스 LH-20 패킹 물질을 사용한 컬럼 크로마토그래피에 의해 분리된 분획물 F6에 대한 AccuTOF-DART 질량 스펙트럼을 나타낸 것이다 (음이온 모드).
도 24는 세파덱스 LH-20 패킹 물질을 사용한 컬럼 크로마토그래피에 의해 분리된 분획물 F7에 대한 AccuTOF-DART 질량 스펙트럼을 나타낸 것이다 (음이온 모드).
도 25는 세파덱스 LH-20 패킹 물질을 사용한 컬럼 크로마토그래피에 의해 분리된 분획물 F8에 대한 AccuTOF-DART 질량 스펙트럼을 나타낸 것이다 (음이온 모드).
도 26은 마운틴 로즈 허브로부터 상업적으로 구매한 계피 스틱에 대한 AccuTOF-DART 질량 스펙트럼을 나타낸 것이다 (양이온 모드).
도 27은 40℃ 및 100 bar에서 SCCO2 방법에 의해 추출된 계피 에센셜 오일에 대한 AccuTOF-DART 질량 스펙트럼을 나타낸 것이다 (양이온 모드).
도 28은 40℃ 및 300 bar에서 SCCO2 방법에 의해 추출된 계피 에센셜 오일에 대한 AccuTOF-DART 질량 스펙트럼을 나타낸 것이다 (양이온 모드).
도 29는 40℃ 및 500 bar에서 SCCO2 방법에 의해 추출된 계피 에센셜 오일에 대한 AccuTOF-DART 질량 스펙트럼을 나타낸 것이다 (양이온 모드).
도 30은 60℃ 및 100 bar에서 SCCO2 방법에 의해 추출된 계피 에센셜 오일에 대한 AccuTOF-DART 질량 스펙트럼을 나타낸 것이다 (양이온 모드).
도 31은 60℃ 및 300 bar에서 SCCO2 방법에 의해 추출된 계피 에센셜 오일에 대한 AccuTOF-DART 질량 스펙트럼을 나타낸 것이다 (양이온 모드).
도 32는 60℃ 및 500 bar에서 SCCO2 방법에 의해 추출된 계피 에센셜 오일에 대한 AccuTOF-DART 질량 스펙트럼을 나타낸 것이다 (양이온 모드).
도 33은 80℃ 및 100 bar에서 SCCO2 방법에 의해 추출된 계피 에센셜 오일에 대한 AccuTOF-DART 질량 스펙트럼을 나타낸 것이다 (양이온 모드).
도 34는 80℃ 및 300 bar에서 SCCO2 방법에 의해 추출된 계피 에센셜 오일에 대한 AccuTOF-DART 질량 스펙트럼을 나타낸 것이다 (양이온 모드).
도 35는 80℃ 및 500 bar에서 SCCO2 방법에 의해 추출된 계피 에센셜 오일에 대한 AccuTOF-DART 질량 스펙트럼을 나타낸 것이다 (양이온 모드).
도 36은 정제되지 않은 계피의 80% EtOH 침출 추출물에 대한 AccuTOF-DART 질량 스펙트럼을 나타낸 것이다 (양이온 모드).
도 37은 정제되지 않은 계피의 SCCO2 추출로부터 잔여물의 80% EtOH 침출 추출물에 대한 AccuTOF-DART 질량 스펙트럼을 나타낸 것이다 (양이온 모드).
도 38은 HSl14 SCCO2 잔여물의 세파덱스 LH-20 패킹 물질을 사용한 계피 에탄올 용리 분획물 F4에 대한 AccuTOF-DART 질량 스펙트럼을 나타낸 것이다 (양이온 모드).
도 39는 HSl14 SCCO2 잔여물의 세파덱스 LH-20 패킹 물질을 사용한 계피 에탄올 용리 분획물 F5에 대한 AccuTOF-DART 질량 스펙트럼을 나타낸 것이다 (양이온 모드).
도 40은 HSl14 SCCO2 잔여물의 세파덱스 LH-20 패킹 물질을 사용한 계피 에탄올 용리 분획물 F6에 대한 AccuTOF-DART 질량 스펙트럼을 나타낸 것이다 (양이온 모드).
도 41은 HSl14 SCCO2 잔여물의 세파덱스 LH-20 패킹 물질을 사용한 계피 에탄올 용리 분획물 F7에 대한 AccuTOF-DART 질량 스펙트럼을 나타낸 것이다 (양이온 모드).
도 42는 HSl14 SCCO2 잔여물의 세파덱스 LH-20 패킹 물질을 사용한 계피 에탄올 용리 분획물 F8에 대한 AccuTOF-DART 질량 스펙트럼을 나타낸 것이다 (양이온 모드).
도 43은 HSl14 SCCO2 잔여물의 세파덱스 LH-20 패킹 물질을 사용한 계피 에탄올 용리 분획물 F9에 대한 AccuTOF-DART 질량 스펙트럼을 나타낸 것이다 (양이온 모드).
도 44는 HSl14 SCCO2 잔여물의 세파덱스 LH-20 패킹 물질을 사용한 계피 에탄올 용리 분획물 F10에 대한 AccuTOF-DART 질량 스펙트럼을 나타낸 것이다 (양이온 모드).
도 45는 HSl14 SCCO2 잔여물의 세파덱스 LH-20 패킹 물질을 사용한 계피 에탄올 용리 분획물 F11에 대한 AccuTOF-DART 질량 스펙트럼을 나타낸 것이다 (양이온 모드).
도 46은 HSl14로부터 정제되지 않은 계피 추출물에 대한 AccuTOF-DART 질량 스펙트럼을 나타낸 것이다 (양이온 모드).
도 47은 HSl14 (SCCO2)로부터 정제되지 않은 계피 추출물에 대한 AccuTOF-DART 질량 스펙트럼을 나타낸 것이다 (양이온 모드).
도 48은 세파덱스 LH-20으로부터 가티올 분해 (thiolytic degradation) 후 계피 에탄올 용리 분획물 F4에 대한 AccuTOF-DART 질량 스펙트럼을 나타낸 것이다 (양이온 모드).
도 49는 세파덱스 LH-20으로부터 가티올 분해 후 계피 에탄올 용리 분획물 F5에 대한 AccuTOF-DART 질량 스펙트럼을 나타낸 것이다 (양이온 모드).
도 50은 세파덱스 LH-20으로부터 가티올 분해 후 계피 에탄올 용리 분획물 F6에 대한 AccuTOF-DART 질량 스펙트럼을 나타낸 것이다 (양이온 모드).
도 51은 세파덱스 LH-20으로부터 가티올 분해 후 계피 에탄올 용리 분획물 F7에 대한 AccuTOF-DART 질량 스펙트럼을 나타낸 것이다 (양이온 모드).
도 52는 세파덱스 LH-20으로부터 가티올 분해 후 계피 에탄올 용리 분획물 F8에 대한 AccuTOF-DART 질량 스펙트럼을 나타낸 것이다 (양이온 모드).
도 53은 세파덱스 LH-20으로부터 가티올 분해 후 계피 에탄올 용리 분획물 F9에 대한 AccuTOF-DART 질량 스펙트럼을 나타낸 것이다 (양이온 모드).
도 54는 세파덱스 LH-20으로부터 가티올 분해 후 계피 에탄올 용리 분획물 F10에 대한 AccuTOF-DART 질량 스펙트럼을 나타낸 것이다 (양이온 모드).
도 55는 세파덱스 LH-20으로부터 가티올 분해 후 계피 에탄올 용리 분획물 F11에 대한 AccuTOF-DART 질량 스펙트럼을 나타낸 것이다 (양이온 모드).
도 56은 마운틴 로즈 허브로부터 상업적으로 구매한 계피 스틱에 대한 AccuTOF-DART 질량 스펙트럼을 나타낸 것이다 (음이온 모드).
도 57은 40℃ 및 100 bar에서 SCCO2 방법에 의해 추출된 계피 에센셜 오일에 대한 AccuTOF-DART 질량 스펙트럼을 나타낸 것이다 (음이온 모드).
도 58은 40℃ 및 300 bar에서 SCCO2 방법에 의해 추출된 계피 에센셜 오일에 대한 AccuTOF-DART 질량 스펙트럼을 나타낸 것이다 (음이온 모드).
도 59는 40℃ 및 500 bar에서 SCCO2 방법에 의해 추출된 계피 에센셜 오일에 대한 AccuTOF-DART 질량 스펙트럼을 나타낸 것이다 (음이온 모드).
도 60은 60℃ 및 100 bar에서 SCCO2 방법에 의해 추출된 계피 에센셜 오일에 대한 AccuTOF-DART 질량 스펙트럼을 나타낸 것이다 (음이온 모드).
도 61은 60℃ 및 300 bar에서 SCCO2 방법에 의해 추출된 계피 에센셜 오일에 대한 AccuTOF-DART 질량 스펙트럼을 나타낸 것이다 (음이온 모드).
도 62는 60℃ 및 500 bar에서 SCCO2 방법에 의해 추출된 계피 에센셜 오일에 대한 AccuTOF-DART 질량 스펙트럼을 나타낸 것이다 (음이온 모드).
도 63은 80℃ 및 100 bar에서 SCCO2 방법에 의해 추출된 계피 에센셜 오일에 대한 AccuTOF-DART 질량 스펙트럼을 나타낸 것이다 (음이온 모드).
도 64는 80℃ 및 300 bar에서 SCCO2 방법에 의해 추출된 계피 에센셜 오일에 대한 AccuTOF-DART 질량 스펙트럼을 나타낸 것이다 (음이온 모드).
도 65는 80℃ 및 500 bar에서 SCCO2 방법에 의해 추출된 계피 에센셜 오일에 대한 AccuTOF-DART 질량 스펙트럼을 나타낸 것이다 (음이온 모드).
도 66은 정제되지 않은 계피의 80% EtOH 침출 추출물에 대한 AccuTOF-DART 질량 스펙트럼을 나타낸 것이다 (음이온 모드).
도 67은 정제되지 않은 계피의 SCCO2 추출로부터 잔여물의 80% EtOH 침출 추출물에 대한 AccuTOF-DART 질량 스펙트럼을 나타낸 것이다 (음이온 모드).
도 68은 HSl14 SCCO2 잔여물의 세파덱스 LH-20 패킹 물질을 사용한 계피 에탄올 용리 분획물 F4에 대한 AccuTOF-DART 질량 스펙트럼을 나타낸 것이다 (음이온 모드).
도 69는 HSl14 SCCO2 잔여물의 세파덱스 LH-20 패킹 물질을 사용한 계피 에탄올 용리 분획물 F5에 대한 AccuTOF-DART 질량 스펙트럼을 나타낸 것이다 (음이온 모드).
도 70은 HSl14 SCCO2 잔여물의 세파덱스 LH-20 패킹 물질을 사용한 계피 에탄올 용리 분획물 F6에 대한 AccuTOF-DART 질량 스펙트럼을 나타낸 것이다 (음이온 모드).
도 71은 HSl14 SCCO2 잔여물의 세파덱스 LH-20 패킹 물질을 사용한 계피 에탄올 용리 분획물 F7에 대한 AccuTOF-DART 질량 스펙트럼을 나타낸 것이다 (음이온 모드).
도 72는 HSl14 SCCO2 잔여물의 세파덱스 LH-20 패킹 물질을 사용한 계피 에탄올 용리 분획물 F8에 대한 AccuTOF-DART 질량 스펙트럼을 나타낸 것이다 (음이온 모드).
도 73은 HSl14 SCCO2 잔여물의 세파덱스 LH-20 패킹 물질을 사용한 계피 에 탄올 용리 분획물 F9에 대한 AccuTOF-DART 질량 스펙트럼을 나타낸 것이다 (음이온 모드).
도 74는 HSl14 SCCO2 잔여물의 세파덱스 LH-20 패킹 물질을 사용한 계피 에탄올 용리 분획물 F10에 대한 AccuTOF-DART 질량 스펙트럼을 나타낸 것이다 (음이온 모드).
도 75는 HSl14 SCCO2 잔여물의 세파덱스 LH-20 패킹 물질을 사용한 계피 에탄올 용리 분획물 F11에 대한 AccuTOF-DART 질량 스펙트럼을 나타낸 것이다 (음이온 모드).
도 76은 HSl14로부터 정제되지 않은 계피 추출물에 대한 AccuTOF-DART 질량 스펙트럼을 나타낸 것이다 (음이온 모드).
도 77은 HSl14 (SCCO2)로부터 정제되지 않은 계피 추출물에 대한 AccuTOF-DART 질량 스펙트럼을 나타낸 것이다 (음이온 모드).
도 78은 세파덱스 LH-20으로부터 가티올 분해 후 계피 에탄올 용리 분획물 F4에 대한 AccuTOF-DART 질량 스펙트럼을 나타낸 것이다 (음이온 모드).
도 79는 세파덱스 LH-20으로부터 가티올 분해 후 계피 에탄올 용리 분획물 F5에 대한 AccuTOF-DART 질량 스펙트럼을 나타낸 것이다 (음이온 모드).
도 80은 세파덱스 LH-20으로부터 가티올 분해 후 계피 에탄올 용리 분획물 F6에 대한 AccuTOF-DART 질량 스펙트럼을 나타낸 것이다 (음이온 모드).
도 81은 세파덱스 LH-20으로부터 가티올 분해 후 계피 에탄올 용리 분획물 F7에 대한 AccuTOF-DART 질량 스펙트럼을 나타낸 것이다 (음이온 모드).
도 82는 세파덱스 LH-20으로부터 가티올 분해 후 계피 에탄올 용리 분획물 F8에 대한 AccuTOF-DART 질량 스펙트럼을 나타낸 것이다 (음이온 모드).
도 83은 세파덱스 LH-20으로부터 가티올 분해 후 계피 에탄올 용리 분획물 F9에 대한 AccuTOF-DART 질량 스펙트럼을 나타낸 것이다 (음이온 모드).
도 84는 세파덱스 LH-20으로부터 가티올 분해 후 계피 에탄올 용리 분획물 F10에 대한 AccuTOF-DART 질량 스펙트럼을 나타낸 것이다 (음이온 모드).
도 85는 세파덱스 LH-20으로부터 가티올 분해 후 계피 에탄올 용리 분획물 F11에 대한 AccuTOF-DART 질량 스펙트럼을 나타낸 것이다 (음이온 모드).
물질
아세톤 (67-64-1), > 99.5%, ACS 시약 (179124); HPLC 용 아세토니트릴 (75-05-8), 기울기 급 > 99.9% (GC)(000687); 헥산 (110-54-3), 95+%, 분광광도 급 (248878); 에틸 아세테이트 (141-78-6), 99.5+%, ACS 급 (319902); 에탄올, 4.8% 이소프로판올로 변성됨 (02853); 에탄올 (64-17-5), 무수, (02883); 메탄올 (67-56-1), 99.93%, ACS HPLC 급, (4391993); 및 물 (7732-18-5), HPLC 급, (95304). 모두 시그마-알드리치로부터 구매하였다.
포름산 (64-18-6), 50% 용액 (09676); 아세트산 (64-19-7), 99.7+%, ACS 시약 (320099); 염산 (7647-01-0), 부피 표준 1.0N 수용액 (318949); 수산화 칼슘 (7789-78-8), 파우더, CA 0-2 mm, 90-95% (213268); 무수 염화철 (Ferric chloride anhydrous) (7705-08-0), 97%, 시약급 (157740); 폴린-치오칼토 페놀 시약 (2N)(47641); 페놀 (108-95-2)(P3653); 황산 (7664-93-9), ACS 시약, 95-97% (44719); 트리에탄올아민 (102-71-6), 트리에탄올아민 자유 염기 (T1377); 소듐 도데실 설페이트 (l51-21-3), 최소 98.5% GC (L4509); 모두 시그마-알드리치로부터 구매하였다. 소듐 카보네이트 (S263-1, Lot #: 037406)를 피셔사로부터 구매하였다.
세럼 알부민 (9048-46-8), 알부민 보바인 분획물 V 파우더 세포 배양 시험됨 (A9418); (+)-카테킨 하이드레이트 (88191-48-4), 순도 > 98% (C1251); 갈산 (149-91- 7), ACS 시약, >98% (HPLC); 벤질티올 (100-53-8), 99% (B25401); 트랜스-신남알데하이드 (14371-10-9), 99+% 순도; 탄닌산 (1401-55-4), 파우더 (T0125); 모두 시그마-알드리치로부터 구매하였다. (-)-에피카테킨 93.6% (05125-550, CAS# 490-46-0)를 크로마덱스로부터 구매하였다. DIN에 따라 보증된 덱스트란 표준 [5000 (00269), 50,000 (00891) 및 410,000 (00895)]을 플루카사로부터 구매하였다. HPLC 화학 표준 물질의 구조는 아래에 나타내었다.
트랜스-신남알데하이드 갈산
Figure 112008073751038-PCT00014
Figure 112008073751038-PCT00015
(+)-카테킨 (-)-에피카테킨
Figure 112008073751038-PCT00016
Figure 112008073751038-PCT00017
세파덱스 LH-20: 세파덱스TM LH-20 (Lot #: 308822, 팩 167600, 제품 #: 17-0090-01)을 아머샴 바이오사이언스 AB 웁살라 스웨덴으로부터 구매하였다. 그것은 비드-형태인 덱스트란 매질, 세파덱스 G-25의 하이드록시프로필레이션에 의해 제조되며, 특히 유기 용매에서 천연물, 예컨대 스테로이드, 테르페노이드, 지질 및 저분자량 펩타이드의 겔 여과를 위해 개발되었다.
HPLC 방법
크로마토그래피 시스템: LClOADVP 펌프와 SPD-M IOAVP 포토 다이오드 어레이 검출기가 장착된 시마주(Shimadzu) 고성능 액체 크로마토그래피 LC- 10AVP 시스템. 얻어진 추출 생성물을 역상 주피터 C18 컬럼(250x4.6 mm I. D., 5μ, 300 Å)(페노메넥스, 파트 #: 00G-4053-E0, 시리얼 No: 2217520-3, 배치 No.: 5243-17)에서 측정하였다. 주입 부피는 10 μl이고 이동상의 흐름 속도는 l ml/분이었다. 컬럼 온도는 50℃였다. 이동상은 A(0.5% 수용성 포름산, v/v) 및 B(아세토니트릴)로 이루어진다. 기울기는 아래와 같이 프로그램되었다: 처음 6분은, A를 100%에서 유지, 6-10분, 용매 B를 선형적으로 0% 내지 12%로 증가, 및 10-35분, B를 선형적으로 12% 내지 21%로, 다음에 35-40분, B를 선형적으로 21% 내지 25%로, 다음에 40- 50분, B를 선형적으로 100%로 한다.
3개의 표준 물질 (카테킨, 에피카테킨 및 트랜스-신남알데하이드)의 메탄올 저장 용액은 1 mg/ml에서 메탄올에 표준 화합물의 무게를 잰 양을 용해하여 제조하였다. 혼합된 표준 물질 용액은 다음에 각각 0.75, 0.5, 0.1, 0.05 mg/ml의 최종 농도에서 일련의 용액을 얻기 위해 단계적으로 희석하였다. 모든 저장 용액 및 작업 용액은 7일간 사용하였고, +4℃에서 저장하였으며, 사용전에 실온으로 만들었다. 용액은 계피에서 화합물을 확인하고 정량하는데 사용하였다. (+)-카테킨 (C), (-)-에피카테킨 (EC), 및 트랜스-신남알데하이드 (CAN)의 머무름 시간은 각각 약 14.02, 15.22, 및 34.00분이었다. 0.01 내지 10 μg 범위의 선형 피트(fit)가 발견되었다. 회귀 방정식 및 상관 계수는 다음과 같다: (+)-카테킨: 피크면적 = 465303 x C (μg) - 5701.4, R2 = 0.9996 (N = 6); (-)-에피카테킨: 피크면적 = 124964 x C (μg) - 215.88, R2 = 0.9998 (N = 6); 트랜스-신남알데하이드: 피크면적/100 = 69657 x C (μg) - 1162.1, R2 = 0.9997 (N = 6). HPLC 결과를 표 9에 나타내었다. 각 샘플에서 표준 물질의 함량은 피크 면적에 근거하여 대응하는 검정곡선으로부터 내삽법에 의해 계산하였다.
표 9. 메탄올 내 1 mg/ml의 농도에서 계피 표준의 HPLC 분석결과
Figure 112008073751038-PCT00018
1 이론판을 다음에 의해 계산하였다: N = 16 x (tR/w)2. tR은 머무름 시간이고 w는 피크의 넓이이다, https://www.mn-net.com/web%5CMN-WEB-HPLCKatalog.nsf/WebE/GRUNDLAGEN
GC-MS 분석
GC-MS 분석을 시마주 GCMS-QP2010 시스템을 사용하여 수행하였다. 시스템은 고성능 기체 크로마토그래프, 직접 결합된 GC/MS 인터페이스, 독립적인 온도 조절을 가진 전자 충격(EI) 이온 소스, 및 4중극자 질량 여과기를 포함한다. 데이터 획득 및 포스트 런 분석을 위해 시스템을 GCMS 용액 Ver. 2 소프트웨어로 조절하였다. 분리는 아래의 온도 프로그램을 사용하여 아질렌트(Agilent) J&W DB-5 융합 실리카 모세관 컬럼(30 m x 0.25 mm i.d., 0.25 μm 막 두께)(카탈로그: 1225032, 시리얼 No: US5285774H) 상에서 수행하였다. 초기 온도는 60℃이었고, 2 분간 유지, 다음에 4℃/분의 속도에서 120 ℃로 증가시키고, 15 분간 유지, 다음에 4℃/분의 속도에서 240℃로 증가시키고, 15 분간 유지하였으며, 총 실행 시간은 77 분이었다. 샘플 주입 온도는 250 ℃였다. lμl의 샘플을 1 분간 비분할 모드에서 자 동 주입기에 의해 주입하였다. 운반 기체는 헬륨이었고 흐름 속도는 60KPa에서 압력에 의해 조절하였다. 이러한 압력하에서, 흐름 속도는 1.03 ml/분이었고 선형 속도는 37.1 cm/분이었다. MS 이온 소스 온도는 230 ℃였고, GC/MS 인터페이스 온도는 250 ℃였다. MS 검출기는 1000 AMU/초의 스캔 속도에서 50 내지 500의 m/z에서 스캔하였다. 용매 차단 온도는 3.5 분이었다.
전체 페놀산에 대한 폴린-치오칼토 방법 (Markar 1993)
시마주 UV-Vis 분광 광도계(UV 프로브를 갖는 UV 1700: S/N: All02421982LP)가 사용되었다.
표준 물질: 1 mg/ml의 농도에서 갈산/물 저장 용액을 만들었다. 적당한 양의 갈산 용액을 시험 튜브에 넣고, 증류수로 0.5 ml 부피로 만들고, 0.25 ml의 폴린-치오칼토 시약을 첨가한 다음, 1.25 ml의 20 wt% 소듐 카보네이트 용액을 첨가하였다. 초음파 배스(bath)에서 튜브를 40 분간 잘 흔들어 주고 725 nm에서 흡수를 기록하였다. 표준 물질 데이터를 표 10에 나타내었다.
표 10. 갈산에 대한 검정곡선의 작성
Figure 112008073751038-PCT00019
*갈산 용액의 양은 흡수 정보에 의존한다.
다당류 분석을 위한 실시간 직접 분석(DART) 질량 분석.
기기: JOEL AccuTOF DART LC 유체 속도 강조(time of flight) 질량 분석기(조엘 USA, Inc, 피보디, 메사추세츠, USA). 이 유체 속도 강조(TOF) 질량 분석기 기술은 임의의 샘플 제조를 필요로 하지 않으며 0.00001 질량 단위 정확도를 갖는 질량을 수득한다.
방법: 분획물을 기록하고 분석하기 위해 사용되는 기기 세팅은 아래와 같다: 양이온 모드에 대하여, DART 니들(needle) 전압은 3000 V, 250 ℃에서 가열 구성 요소, 100 V에서 전극 1, 250 V에서 전극 2, 및 7.45 리터/분(L/min)의 헬륨 가스 흐름 속도이다. 질량 분석기에 대하여, 구멍(orifice) 1은 10 V이고, 고리 렌즈는 5 V이며, 구멍 2는 3 V이다. 피크 전압은 약 60 m/z에서 시작하는 분해능, 게다가 더 큰 질량 범위에서 충분한 분해능을 주기 위해 600 V에 맞추었다. 마이크로-채널 플레이트 검출기(MCP) 전압은 2450 V에 맞추었다. 검정은 0.5 M 카페인 용액 표준(시그마-알드리치 Co., 세인트루이스, USA)을 사용하여 샘플 도입 이전에 아침마다 수행하였다. 검정 허용 오차는 ≤ 5 mmu로 유지되었다.
샘플은 상기 샘플의 최대 표면적이 확실하게 헬륨 플라즈마 빔에 노출되도록 무균 집게와 함께 DART 헬륨 플라즈마 내로 도입하였다. 샘플을 빔에 도입하기 위해 스위핑 모션(sweeping motion)이 사용되었다. 이 모션은 약 0.5 sec/swipe 동안 전후 스트로크 상에서 반복적으로 노출되며 샘플의 열분해를 방지하도록 한다. 이 모션을 감지할 수 있는 총 이온 전류(TIC)가 검출기에서 관찰될 때까지 반복하 였으며, 다음에 샘플을 제거하고, 기저선/배경 정상화시켰다.
음이온 모드에 대하여, DART 및 AccuTOF MS는 음이온 모드로 스위치하였다. 니들 전압은 3000 V, 250 ℃에서 가열 구성 요소, 100 V에서 전극 1, 250 V에서 전극 2, 및 7.45 L/분의 헬륨 가스 흐름 속도이다. 질량 분석기에 대하여, 구멍 1은 -20 V이고, 고리 렌즈는 -13 V이며, 구멍 2는 -5이다. 피크 전압은 200 V이다. MCP 전압은 2450 V에 맞추었다. 샘플은 양이온 모드와 정확히 동일한 방법으로 도입하였다. 모든 데이터 분석은 기기에 제공된 메스센터메인 수트(MassCenterMain Suite) 소프트웨어를 사용하여 수행되었다.
실시예 1
단계 1A의 예: 단일 단계 SFE 최대 추출 및 계피 에센셜 오일의 정제
모든 SFE 추출은 압력 및 온도가 각각 690 bar 및 200℃로 설정된 SFT 250 (Supercritical Fluid Technologies, Inc., Newark, Delaware, USA) 상에서 수행되었다. 이 장치는 동적 또는 정적 모드에서 조작되기 위해 유연성을 갖는 초임계 조건에서 간단하고 효율적인 추출을 허용한다. 이 장치는 주된 3개의 모듈; 오븐, 펌프와 컨트롤, 및 수집 모듈로 구성된다. 오븐은 1개의 예열 컬럼 및 1개의 100 ml 추출 용기를 갖는다. 펌프 모듈은 300 ml/분의 일정한 유량 용량을 갖는 압축 공기를 원동력으로 하는 펌프를 갖는다. 수집 모듈은 두껑으로 밀봉된 40 ml의 유리 바이알 및 추출된 산물의 회수를 위한 격벽이다. 이 장치는 마이크로미터 밸브 및 플로우 미터를 제공한다. 추출 용기 압력 및 온도는 3 bar 및 ± 10℃로 모니터 및 조절된다.
전형적 실험예들에서, 스크린(140 메쉬)를 사용하여 채질된 105 μm 이상의 크기를 갖는, 30 그램의 계피 파우더를 각 실험을 위해 100 ml 추출 용기내로 로드하였다. 고체 물질이 넘어갈 가능성을 피하기 위해, 유리 울을 컬럼의 두 말단상에 두었다. 오븐을 채워진 용기가 로드되기 전에 목적하는 온도로 예열하였다. 용기를 오븐내에 연결한 후에, 추출 시스템은 CO2 (~ 850 psig)으로 시스템을 압력화하여 누출을 시험하고, 퍼지하였다. 이 시스템을 닫고 공기를 원동력으로 하는 액체 펌프를 사용하여 원하는 추출 압력으로 압력을 주었다. 그 후, 이 시스템을 ~ 3분 동안 평형상태로 두었다. 샘플링 바이알(40 ml)을 칭량하고, 샘플링 포트에 연결하였다. 추출은 ~ 10 SLPM (19 g/분)의 속도에서 CO2 흐름에 의해 시작하였으며, 이는 미터 밸브(meter valve)로 조절된다. 로드된 가공하지 않은 물질의 중량에 대해 사용된 총 CO2의 중량비로서 정의되는 용매/공급 비율이 계산되었다. 추출 공정 동안, 추출된 샘플은 5분마다 무게를 달았다. 추출은 샘플의 무게가 두 번의 무게 측정에서 5% 이상 변화하지 않을 때 종료된 것으로 가정하였다. 수율은 추출 용기내로 로드된 원료 물질의 초기 총 중량에 대한 추출된 에센셜 오일의 중량 퍼센트로 정의된다. 완전한 공정의 추출 디자인은 40-80℃의 온도 및 80-500 bar를 변화시켜 채택하였다.
이 실험 실시예에서, 추출 조건을 40-80℃의 온도 범위 및 80-500 bar의 압력 범위에서 정하였다. CO2 흐름 속도는 19 g/분이었다. 결과를 표 11에 나타내었다.
표 11. 단일 단계 SFE 계피 에센셜 오일 추출의 HPLC 분석.
Figure 112008073751038-PCT00020
실시예 2
단계 1B의 예: 계피 에센셜 오일의 다중-단계 SCCO 2 분획
다중-단계 SCCO2 추출/분획은 SFT 250 (Supercritical Fluid Technologies, Inc., Newark, Delaware, USA) 상에서 수행되었다. 전형적인 다중-단계 추출에서, 105 μm 이상의 입자 크기를 갖는 30 그램의 계피 파우더를 100 ml의 내부 부피를 가진 추출 용기내로 로드하였다. 추출 용액을 추출 용기의 출구에 연결된 40 ml 수집 용기에 수집하였다. CO2 흐름 속도는 19 g/분에 맞추었다. 제 1 추출 단계는 80 bar의 압력 및 40℃의 온도에서 수행하였다 (CO2 농도 = 0.29 g/ml). 이 추출 단계를 1시간 동안 수행하였다. 제 2 추출 단계는 100 bar의 압력 및 40℃의 온도에서 수행하였다 (CO2 농도 = 0.64 g/ml). 이 추출 단계를 계속하여 1시간 동안 수행하였다. 제 3 추출 단계는 120 bar의 압력 및 40℃의 온도에서 1시간 동안 수행 하였다 (CO2 농도 = 0.72 g/ml). 제 4 추출 단계는 40℃의 온도 및 300 bar의 압력에서 1시간 동안 수행하였다 (CO2 농도 = 0.92 g/ml). 60℃ 및 80℃에서 세 단계들을 이용한 다중-단계 추출을 또한 수행하였다. 동일한 SFE 조건 하에서 정제되지 않은 추출물과 다중-단계 GC-MS 데이터가 비교될 수 있는 표 12에 분석 결과를 나타내었다.
표 12. 계피 에센셜 오일의 다중 단계 SFE 추출 수율.
Figure 112008073751038-PCT00021
40, 60, 및 80℃에서 다중-단계 추출의 총 수율은 원래의 원료를 기준으로 각 단계로부터의 수율을 합하여 각각 약 1.6%, 1.3%, 및 1.8질량%였다. 이들 수율은 다중-단계 공정에서 사용된 높은 용매-공급 비율 때문에 단일 단계 정제되지 않은 추출에서의 수율보다 높다. 만약 그렇지 않으면, 데이터는 일치한다. 데이터로부터 명백한 바와 같이, 화학적 성분 화학적 화합물 예컨대 트랜스-신남알데하이드의 농도는 이들 부분-분획물 추출 생성물에서 변화될 수 있으며, 계피 에센셜 오일의 화학적 성분을 프로파일하는 SFE의 능력이 증명된다.
표 13. 다른 조건에서 얻어진 추출물에서 계피 에센셜 오일 화합물 프로파일.
Figure 112008073751038-PCT00022
실시예 3
단계 2의 예: 다당류 분획물 추출
계피 종의 수용성, 에탄올 불용성 정제된 다당류 분획물 화학적 성분의 용매 추출 및 침전의 전형적인 실험예는 아래와 같다: 60℃ 및 300 bar에서 SFE 추출로부터 20 gm의 고체 잔여물을 2 단계에서 85℃에서 2시간동안 400 ml의 증류수를 사용하여 추출하였다. 2개의 추출 용액들을 모으고, 슬러리를 피셔브랜드 (Fisherbrand) P4 여과 용지 (구멍 크기 4-8 μm)를 사용하여 여과하였고, 2,000 rpm에서 20분 동안 원심분리하였다. 상청액을 수집하였다. 회전식 증발기를 800 ml 내지 80 ml의 깨끗한 상청액 추출물을 농축하는데 사용하였다. 그 후 1520 ml의 무수 에탄올을 첨가하여 95%의 최종 에탄올 농도를 만들었다. 용액을 30분 동안 방치하였고 침전이 관찰되었다. 추출 용액을 2,000 rpm에서 20분 동안 원심분리하고, 상청액을 따라내고, 추가 공정을 위해 저장하거나 버렸다. 다당류의 수율을 계산하기 위해 물질 밸런스를 침전 전후에 수행하였다. 침전물을 수집하고, 50 ℃에서 12 시간동안 오븐에서 건조하였다. 건조된 다당류 분획물의 무게를 재고 표준 물질로서 덱스트란을 사용하는 비색계 방법으로 다당류 순도를 분석하기 위해 물에 용해시켰다. 또한, AccuTOF-DART 질량 분석기를 다당류 분획물을 추가로 특징지우기 위해 사용하였다. 결과를 도 6 및 7 및 표 14 및 15에 나타내었다.
표 14. 물 침출 및 95% 에탄올 침전을 사용함에 의한 침전된 다당류 분획물 분석.
SPE 60℃ 및 300 bar 잔여물
원료 (g) 20
물 침출 수율 (%) 4.8
침전 이전 침출 추출물 (g) 0.96
침전 후 침출 추출물 (g) 0.71
침전 (pcp)(g) 0.25
침전 수율 (%) 1.3
침전 이전 총 페놀산 (g) 0.25
침전 후 총 페놀산 (g) 0.26
덱스트란 5K (mg/mg pcp) 0.47
덱스트란 50K (mg/mg pcp) 0.35
덱스트란 410K (mg/mg pcp) 0.29
표 15. 계피로부터 DART 분석 다당류.
Figure 112008073751038-PCT00023
Figure 112008073751038-PCT00024
Figure 112008073751038-PCT00025
Figure 112008073751038-PCT00026
계피 다당류 수율은 원래의 계피 원료를 기준으로 1.3질량%였다. 다당류 분획물의 순도는 분획물에서 > 95% 계피 다당류 화학적 성분의 순도를 나타내는 290-470 mg/g 덱스트란 표준 동등물이었다. 침전 전후 용액에서 총 페놀산의 분석을 비교하면, 침전은 페놀산에 아무런 효과를 가지지 않는 것으로 나타났다. 실험적 접근의 많은 수와 다양성에 근거하면, 1.3% 수율은 천연 계피 종 원료 물질에서 거의 100%의 수용성-에탄올 불용성 다당류라는 결론은 상당히 합리적이다.
실시예 4
단계 3의 예: 하이드로알코올 침출 추출
계피 종의 페놀산 화학적 성분의 3 단계 용매 추출의 전형적인 예는 아래와 같다: 원료는 에센셜 오일의 단계 1 SCCO2 추출 (40℃, 300 bar)로부터 2 gm의 분쇄된 계피 SFE 잔류물이다. 40 ml의 25% 수용성 에탄올을 용매로 하였다. 이 방법에서, 원료 물질 및 40 ml의 수용성 에탄올을 100 ml 추출 용기 내로 별개로 로드하고, 40℃에서 4시간 동안 가열된 워터배스에서 혼합하였다. 추출 용액을 4-8 μm의 입자 머무름 크기를 갖는 피셔브랜드 P4 여과 용지를 사용하여 여과하고, 2000 rpm에서 20분 동안 원심분리하고, 미립화된 잔여물을 추가적 추출을 위해 사용하였다. 여과물 (상청액)을 수집하고, 수율 계산 및 HPLC 분석을 위해 모았다. 단계 1의 잔여물을 상기한 방법을 사용하여 2시간 (단계 2)동안 추출하였고, 단계 2로부터의 잔여물을 2시간 동안 추출하였다. 추출물 내 신남알데하이드 (CND), 카테킨 (C), 및 에피카테킨 (EC)에 대한 물질 밸런스, HPLC 분석을 위해 상청액을 수집하였다. 폴린-치오칼토 분석을 총 페놀산 농도 (순도)를 측정하기 위해 사용하였으며 단백질 침전 방법을 탄닌산 순도를 측정하기 위해 사용하였다. 결과를 표 16에 나타내었다.
표 16. 추출 수율 상의 다중 하이드로알코올 침출 단계의 효과
Figure 112008073751038-PCT00027
주의:
1. CND = 트랜스-신남알데하이드; C = (+)-카테킨; EC = (-)-에피카테킨; TPA = 총 페놀산; TA = 탄닌산.
2. CND, C, EC는 HPLC로 분석하였다; TPA는 표준물질로서 갈산을 사용하여 폴린-치오칼토 방법으로 분석하였다; TA는 단백질-침전 방법으로 분석하였다.
폴린-치오칼토 방법을 증명하기 위해, 1 mg/ml의 농도에서 공지된 페놀산, 캠페롤, 카페인산, 카테킨을 시험하였다. 캠페롤 및 카테킨을 측정하는 실험 오차는 대략 2-4%였고 카페인산의 경우에는 약 10%였다. 또한, 그들의 방법 추출물에서 총 페놀산이 시험된 한 참조물 (Sindhu 2006) 및 결과는 289±2.2 mg 갈산/g 추출물이었고, 이는 본 결과와 상당히 근사치이다.
실시예 5
단계 4의 예: 정제된 폴리페놀산 분획물의 친화성 흡착 추출
전형적인 실험에서, 작업 용액은 단계 3에서 계피 종 수용성 에탄올 침출 추출물의 투명한 하이드로알코올 용액이었다. 친화성 흡착 중합체 레진은 세파덱스 LH-20이었다. 6 gm의 친화성 흡착제를 1.5 cm의 ID 및 100 cm의 길이를 갖는 컬럼내에 채우기 전에 95% 에탄올 (4-5 BV)로 미리 세척하였다. 채워진 컬럼 부피는 25 ml였다. 100 ml의 계피 25% 에탄올 단계 I + 단계 II 추출 용액 (샘플 용액. 2.4 mg/ml)을 1 ml 농축하였고 용매를 제거하기 위해서 회전식 증발이 사용되었다. 다음에 19 ml의 무수 에탄올을 농축된 용액에 첨가하여 화학적 성분을 용해하였다. 이 용액을 2000 rpm에서 10분간 원심분리하고 최종 폴리페놀 로딩 용액 (llmg/ml)으로서 상청액을 수집하였다. 12 ml의 로딩 용액을 컬럼 상에 로드하였다. 로드 된 컬럼을 100분의 용리 시간으로 2.4 BV/hr (lml/분)의 흐름 속도에서 240 ml의 95% 에탄올로 용리시켰다. 용리시키는 동안, 8개의 비-탄닌 폴리페놀 분획물을 각 30 ml의 용리에서 수집하였다 (표지된 용리 분획물 F1-F8). 흡수가 수집된 분획물에서 더 이상 검출할 수 없을 때까지 각 분획물을 UV 분광 광도계를 사용하여 280 nm에서 시험하였다. 5 BV/hr (2.1 ml/분)의 흐름 속도에서 컬럼을 70 ml의 70% 수용성 아세톤으로 세척하여 친화성 흡착제 상에 흡착된 탄닌 폴리페놀을 제거하였다. 탄닌 세척 용액을 버렸다. 마지막으로, 추가의 공정을 위한 컬럼을 제조하기 위해 컬럼을 4-5 BV의 95% 에탄올로 세척하여 임의의 잔여 화학물질 불순물을 제거하였다. 각각의 폴리페놀 용리 분획물을 수집하고 분석하여 결과를 표 17에 나타내었다.
표 17. 세파덱스 LH-20 공정 크로마토그래피로부터 폴리페놀 분획물의 95% 에탄올 용리액의 분석.
Figure 112008073751038-PCT00028
* 용리 1은 화학적 성분으로 단지 용매만이 있기 때문에 표로 작성되지 않았다.
실시예 6
포뮬레이션을 위해 아래의 성분들을 혼합하였다.
------------------------------------------------------------------
C. 카시아 바크의 추출물 150.0 mg
에센셜 오일 분획물 (10 mg, 6.6% 건조 중량)
폴리페놀 분획물 (100 mg, 66.7% 건조 중량)
다당류 (40 mg, 26.6% 건조 중량)
스테비오사이드 (스테비아의 추출물) 12.5 mg
카복시메틸셀룰로오스 35.5 mg
락토오스 77.0 mg
------------------------------------------------------------------
총계 275.0 mg
계피 종의 신규 추출물은 천연 근경 물질 또는 통상적인 추출 생성물에서 발견되는 것보다, 큰 질량%의 폴리페놀 분획물 농도, 증가된 다당류 분획물, 및 감소된 에센셜 오일 분획물을 가진 분획물을 포함한다. 포뮬레이션은 임의의 경구 복용 형태로 만들어질 수 있으며 요망되고 (증강된 뇌 기능 및 무통증) 의학적인 효과 (인슐린 비의존성 당뇨병, 항혈소판 응집 및 항-혈전증, 심혈관 및 뇌혈관 질환 억제 및 치료, 항-죽상동맥경화증, 항-고콜레스테롤혈증, 심장 보호, 신경계 보호, 항염증, 항-알러지, 항-관절염, 항-류마티스, 항-통풍, 위장관 질환, 기침, 일반 감기, 열, 지질 분해, 개선된 상처 치료, 항균, 항진균, 및 항암)의 생리적 및 심리적 효과에 필요한 만큼, 하루에 한 번 또는 하루에 15회 투여될 수 있다.
실시예 7
아래의 포뮬레이션을 위해 아래의 성분들을 혼합하였다.
------------------------------------------------------------------
C. 카시아 바크의 추출물 150.0 mg
에센셜 오일 분획물 (60 mg, 40% 건조 중량)
폴리페놀 분획물 (30 mg, 20% 건조 중량)
다당류 (60.0 mg, 40% 건조 중량)
비타민 C 15.0 mg
슈크라로오스 35.0 mg
녹두 (Mung Bean) 파우더 10:1 50.0 mg
모카 향미제 40.0 mg
초콜릿 향미제 10.0 mg
------------------------------------------------------------------
총계 300.0 mg
계피 추앙지옹 (chuangxiong)의 신규 추출물은 천연의 식물 물질 또는 통상적인 추출 생성물에서 발견된 것보다 큰 질량%의 에센셜 오일, 페놀산-에센셜 오일, 및 다당류 화학적 성분 분획물을 포함한다. 상기 포뮬레이션은 임의의 경구 복용 형태로 제조될 수 있고, 목적으로 하는 생리적, 심리적 및 의학적 효과(상기 실시예 1 참조)을 위해 필요에 따라 1일 15회까지 안전하게 투여될 수 있다.

Claims (50)

  1. 도 6 내지 85 중 어느 하나의 실시간 직접 분석 (Direct Analysis in Real Time: DART) 질량 분석 크로마토그램을 갖는 분획물을 포함하는 계피 종 (cinnamon species) 추출물.
  2. 제 1 항에 있어서, 분획물이 신남알데하이드, 벤즈알데하이드, 신나밀 알코올, 트랜스-신남산 (cinnamic acid), 신나밀 아세테이트, 에센셜 오일, 폴리페놀, 다당류, 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 화합물을 포함하는 계피 종 추출물.
  3. 제 2 항에 있어서, 분획물이 약 2중량%를 초과하는 양의 신남알데하이드를 포함하는 계피 종 추출물.
  4. 제 2 항에 있어서, 분획물이 약 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 또는 95중량%를 초과하는 양의 신남알데하이드를 포함하는 계피 종 추출물.
  5. 제 2 항에 있어서, 분획물이 약 65% 내지 약 95중량%인 양의 신남알데하이드를 포함하는 계피 종 추출물.
  6. 제 2 항에 있어서, 분획물이 유제놀, 2'-하이드록시신남알데하이드, 2-메톡시신남알데하이드, 2'-벤즈옥시신남알데하이드, 리낼룰, 1,8-시네올레, 알파-피넨, 베타-피넨, 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 에센셜 오일 (essential oil)을 포함하는 계피 종 추출물.
  7. 제 2 항에 있어서, 분획물이 약 1% 내지 약 5중량%인 양의 에센셜 오일을 포함하는 계피 종 추출물.
  8. 제 2 항에 있어서, 분획물이 약 5% 내지 약 40중량%의 신남알데하이드 및 에센셜 오일의 조합된 양을 포함하는 계피 종 추출물.
  9. 제 2 항에 있어서, 분획물이 플라보노이드, 플라보놀 글리코사이드, 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 폴리페놀을 포함하는 계피 종 추출물.
  10. 제 2 항에 있어서, 분획물이 약 20% 내지 약 70중량%인 양의 폴리페놀을 포함하는 계피 종 추출물.
  11. 제 2 항에 있어서, 분획물이 약 6중량%에서 신남알데하이드 및 약 70중량%에서 폴리페놀을 포함하는 계피 종 추출물.
  12. 제 2 항에 있어서, 분획물이 약 40중량%에서 신남알데하이드 및 약 20중량%에서 폴리페놀을 포함하는 계피 종 추출물.
  13. 제 2 항에 있어서, 분획물이 글루코오스, 아리비노오스, 갈락토오스, 람노오스, 크실로오스 우론산 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 다당류를 포함하는 계피 종 추출물.
  14. 제 2 항에 있어서, 분획물이 약 30중량%에서 다당류를 포함하는 계피 종 추출물.
  15. 제 9 항에 있어서, 플라보노이드가 3-(2-하이드록시페닐)-프로판산, 3-(2-하이드록시페닐)-O-글리코사이드, 안토시아니딘, 에피카테킨, 카테킨, 메틸하이드록시찰콘, 카테킨 올리고머, 에피카테킨 올리고머, 올리고머 프로안토시아니딘, 중합체 프로안토시아니딘, 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 계피 종 추출물.
  16. 제 9 항에 있어서, 플라보놀 글리코사이드가 캠페리트린, 캠페롤 (Kaempferol) 3-O-베타-D-글루코피라노실-(l→4)-알파-L-람노피라노사이드 (rhamnopyranoside), 캠페롤 3-O-베타-D-아피오푸라노실-(l→2)-알파-L-람노피라노 사이드, 캠페롤 3-O-베타-D-아피오푸라노실-(l→4)-알파-L-람노피라노사이드, 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 계피 종 추출물.
  17. 제 1 항의 계피 종 추출물을 포함하는 식품 또는 약제.
  18. 에센셜 오일 분획물, 비-탄닌 폴리페놀 분획물 (polyphenolic fraction) 및 다당류 분획물을 얻기 위해 계피 종 식물 물질을 순차적으로 추출하는 단계를 포함하는 계피 추출물을 제조하는 방법으로서,
    a) 에센셜 오일 분획물 및 제 1 잔여물을 얻기 위해 초임계 이산화탄소 추출에 의해 계피 종 식물 물질을 추출하는 단계;
    b) 다당류 분획물 및 제 2 잔여물을 얻기 위해 약 70℃ 내지 약 90℃에서 물로 단계 a)로부터 계피 종 식물 물질 또는 제 1 잔여물을 추출하는 단계; 및
    c) 비-탄닌 폴리페놀 분획물을 얻기 위해 하이드로-알코올 용액으로 계피 종 식물 물질, 단계 a)로부터 제 1 잔여물 및/또는 단계 b)로부터 제 2 잔여물을 추출하고 친화성 흡착 공정 (affinity adsorbent process)을 사용하여 상기 추출물을 정제하는 단계를 포함하는 계피 추출물을 제조하는 방법.
  19. 제 18 항에 있어서, 단계 a)가,
    1) 추출 용기에 분쇄된 계피 종 식물 물질을 로딩하는 단계;
    2) 초임계 조건 하에서 이산화탄소를 첨가하는 단계;
    3) 분쇄된 계피와 이산화탄소를 한동안 접촉시키는 단계; 및
    4) 수집 용기에 에센셜 오일 분획물을 수집하는 단계를 포함하는 계피 추출물을 제조하는 방법.
  20. 제 19 항에 있어서, 초임계 조건이 35℃ 내지 90℃에서 60 bars 내지 800 bars의 압력을 포함하는 방법.
  21. 제 19 항에 있어서, 초임계 조건이 40℃ 내지 80℃에서 60 bars 내지 500 bars의 압력을 포함하는 방법.
  22. 제 19 항에 있어서, 시간이 30분 내지 2.5시간인 방법.
  23. 제 19 항에 있어서, 시간이 1시간인 방법.
  24. 제 19 항에 있어서, 초임계 이산화탄소 분획성 분리 시스템이 에센셜 오일 분획물의 분획, 정제, 및 프로파일링에 사용되는 방법.
  25. 제 18 항에 있어서, 단계 b)가,
    1) 다당류 화학적 성분을 추출하기 위해 충분한 시간 동안 단계 a)로부터 분쇄된 계피 종 식물 물질 또는 제 1 잔여물과 물을 접촉시키는 단계; 및
    2) 알코올 침전에 의해 용액으로부터 고체 다당류를 분리하고 정제하는 단계를 포함하는 계피 추출물을 제조하는 방법.
  26. 제 25 항에 있어서, 물이 70℃ 내지 90℃인 방법.
  27. 제 25 항에 있어서, 물이 80℃ 내지 90℃인 방법.
  28. 제 25 항에 있어서, 시간이 1-5시간인 방법.
  29. 제 25 항에 있어서, 시간이 2-4시간인 방법.
  30. 제 25 항에 있어서, 시간이 2시간인 방법.
  31. 제 25 항에 있어서, 알코올이 에탄올인 방법.
  32. 제 18 항에 있어서, 단계 c)가,
    1) 폴리페놀 화학적 성분을 추출하기 위해 충분한 시간 동안 계피 종 식물 물질, 단계 a)로부터 제 1 잔여물 및/또는 단계 b)로부터 제 2 잔여물을 하이드로알코올 용액과 접촉시키는 단계;
    2) 친화성 흡착 레진 컬럼 (여기서 폴리페놀산이 흡착된다)을 통해 하이드로 알코올 용액 혼합물로부터 추출된 폴리페놀 화학적 성분의 농축된 알코올 용액을 통과시키는 단계; 및
    3) 친화성 흡착 레진에 흡착되는 탄닌 폴리페놀을 제거하여 친화성 흡착 레진으로부터 정제된 비-탄닌 폴리페놀 화학적 성분 분획물(들)을 용리시키는 단계를 포함하는 계피 추출물을 제조하는 방법.
  33. 제 32 항에 있어서, 하이드로알코올 용액이 에탄올 및 물을 포함하며, 여기서 에탄올 농도는 10-95중량%인 방법.
  34. 제 32 항에 있어서, 하이드로알코올 용액이 에탄올 및 물을 포함하며, 여기서 에탄올 농도는 25중량%인 방법.
  35. 제 32 항에 있어서, 단계 1)을 30℃ 내지 100℃에서 수행하는 방법.
  36. 제 32 항에 있어서, 단계 1)을 60℃ 내지 100℃에서 수행하는 방법.
  37. 제 32 항에 있어서, 시간이 1-10시간인 방법.
  38. 제 32 항에 있어서, 시간이 1-5시간인 방법.
  39. 제 32 항에 있어서, 시간이 2시간인 방법.
  40. 제 18 항의 방법에 의해 제조된 계피 종 추출물.
  41. 신남알데하이드, 신남알데하이드의 1 내지 5중량%에서 신남산, 신남알데하이드의 5 내지 15중량%에서 메틸 신남산, 신남알데하이드의 1 내지 5중량%에서 신나밀 알코올, 신남알데하이드의 20 내지 30중량%에서 β-구알렌/시스-γ-비사바볼렌 (bisababolene), 및 신남알데하이드의 1 내지 5중량%에서 피로갈롤을 포함하는 계피 종 추출물.
  42. 피로갈롤, 피로갈롤의 80 내지 90중량%에서 신남산, 피로갈롤의 85 내지 95중량%에서 메틸 신남산, 피로갈롤의 20 내지 30중량%에서 쿠마릭 산 (coumaric acid), 피로갈롤의 15 내지 25중량%에서 호모바닐산 (homovanilic acid), 피로갈롤의 85 내지 95중량%에서 신남알데하이드, 및 피로갈롤의 10 내지 15중량%에서 벤질 벤조에이트를 포함하는 계피 종 추출물.
  43. 카테킨, 카테킨의 5 내지 15중량%에서 신남산, 카테킨의 5 내지 15중량%에서 메틸 신남산, 카테킨의 5 내지 15중량%에서 쿠마릭 산, 카테킨의 1 내지 10중량%에서 페루릭 산 (ferulic acid), 카테킨의 1 내지 5중량%에서 2-메톡시페놀, 카테킨의 5 내지 15중량%에서 호모바닐산, 카테킨의 20 내지 30중량%에서 바닐산, 카테킨 의 1 내지 5중량%에서 벤즈알데하이드, 카테킨의 35 내지 45중량%에서 신남알데하이드, 카테킨의 85 내지 95중량%에서 피로갈롤, 및 카테킨의 15중량%에서 카페인산을 포함하는 계피 종 추출물.
  44. β-구알렌/시스-γ-비사바볼렌 및 β-구알렌/시스-γ-비사바볼렌의 5 내지 15중량%에서 신남알데하이드를 포함하는 계피 종 추출물.
  45. 신남알데하이드 및 신남알데하이드의 10 내지 20중량%에서 β-구알렌/시스-γ-비사바볼렌을 포함하는 계피 종 추출물.
  46. 신남알데하이드, 신남알데하이드의 30 내지 40중량%에서 피로갈롤, 및 신남알데하이드의 1 내지 10중량%에서 카테킨/에피카테킨 (epicatechin)을 포함하는 계피 종 추출물.
  47. 신남알데하이드, 신남알데하이드의 1 내지 5중량%에서 신남산, 신남알데하이드의 0.5 내지 5중량%에서 메톡시 신남알데하이드, 신남알데하이드의 0.1 내지 5중량%에서 유제놀, 신남알데하이드의 1 내지 5중량%에서 p-사이멘 (cymene), 신남알데하이드의 0.1 내지 5중량%에서 캄포 (camphor), 신남알데하이드의 0.5 내지 5중량%에서 카바크롤 (carvacrol), 신남알데하이드의 25 내지 35중량%에서 캐리오필렌 (caryophyllene)/휴물렌 (humulene), 신남알데하이드의 0.1 내지 5%에서 피로갈롤, 및 신남알데하이드의 40 내지 50중량%에서 신나밀 신나메이트를 포함하는 계피 종 추출물.
  48. 신나밀 신나메이트, 신나밀 신나메이트의 0.5 내지 5중량%에서 메톡시 신남알데하이드, 신나밀 신나메이트의 0.1 내지 5중량%에서 신나밀 알코올, 신나밀 신나메이트의 1 내지 5중량%에서 p-사이멘, 신나밀 신나메이트의 0.1 내지 5중량%에서 리낼룰 (linalool), 신나밀 신나메이트의 0.1 내지 5중량%에서 캄포, 신나밀 신나메이트의 0.5 내지 5중량%에서 카바크롤, 신나밀 신나메이트의 70 내지 80중량%에서 신남알데하이드, 신나밀 신나메이트의 45 내지 55중량%에서 캐리오필렌/휴물렌, 및 신나밀 신나메이트의 0.1 내지 5%에서 피로갈롤을 포함하는 계피 종 추출물.
  49. 피로갈롤, 피로갈롤의 5 내지 10중량%에서 신남산, 피로갈롤의 60 내지 70중량%에서 쿠마릭 산, 피로갈롤의 1 내지 10%에서 페루릭 산, 피로갈롤의 5 내지 15%에서 2-메톡시페놀, 피로갈롤의 1 내지 10중량%에서 바닐산, 피로갈롤의 30 내지 40중량%에서 카테킨/에피카테킨, 피로갈롤의 1 내지 5중량%에서 벤즈알데하이드, 피로갈롤의 5 내지 15중량%에서 아프젤레킨 (afzelechin)/에피아프젤레킨, 피로갈롤의 1 내지 10중량%에서 레스베라트롤, 및 피로갈롤의 1 내지 5중량%에서 바닐린을 포함하는 계피 종 추출물.
  50. 피로갈롤, 피로갈롤의 0.5 내지 5중량%에서 신남산, 피로갈롤의 10 내지 20중량%에서 쿠마릭 산, 피로갈롤의 0.5 내지 5%에서 페루릭 산, 피로갈롤의 1 내지 5중량%에서 2-메톡시페놀, 피로갈롤의 0.5 내지 5중량%에서 호모/이소바닐산, 피로갈롤의 1 내지 10중량%에서 바닐산, 피로갈롤의 25 내지 35중량%에서 카테킨/에피카테킨, 피로갈롤의 1 내지 5중량%에서 벤즈알데하이드, 피로갈롤의 1 내지 5중량%에서 신남알데하이드, 피로갈롤의 0.1 내지 5중량%에서 아프젤레킨/에피아프젤레킨, 및 피로갈롤의 65 내지 75중량%에서 바닐린을 포함하는 계피 종 추출물.
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