CN112739440B - 低共熔提取物形成和纯化 - Google Patents

Abstract

本发明涉及用于形成低共熔提取物的方法、用于纯化低共熔提取物的方法和所述低共熔提取物例如在食品、药品、营养保健品和补剂例如食品补剂和运动补剂中的用途。

Description

低共熔提取物形成和纯化

本发明涉及用于形成低共熔提取物的方法、用于纯化低共熔提取物的方法和所述低共熔提取物例如在芳香用品和香料、食品、化妆品、药品、营养保健品(nutraceuticals)和补剂例如食品补剂和运动补剂中的用途。

从天然产物中提取分子是常用方法，其通常使用水或挥发性有机溶剂进行。

提取物的特性通常由溶剂的极性和提取温度控制。尽管存在约300种分子溶剂，但由于可能的毒性问题和不良的溶剂特性(例如溶剂的沸点)，因此仅一小部分用于天然产物提取。

典型地，由于没有毒性，因此可以使用基于醇的溶剂或超临界流体(通常为CO₂)得到供人消费的提取物。

已经使用深度低共熔溶剂(DES)作为萃取溶剂进行了一些研究(Abbott AP，Capper G，Davies DL，Rasheed RK，Tambyrajah V.Novel solvent properties ofcholine chloride/urea mixtures.Chem.Commun.2003，7，70-71；Choi YH，van SpronsenJ，Dai Y，Verberne M，Hollmann F，Arends IWCE，Witkamp GJ，Verpoorte R.Are naturaldeep eutectic solvents the missing link in understanding cellular metabolismand physiology，Plant Physiol.2011，156，1701-1705)，并导致使用这些溶剂得到的提取物的工业化和商业化(Laguerre M，Lavaud A.The rise of deep eutectics from natureto cosmetics.Personal Care 2016，45-47)。

然而，除了典型地耗时且收率低的色谱方法之外，没有可利用的方法来分离存在于深度低共熔溶剂中的“活性成分”。这主要是由于DES的挥发性低、使得很难通过蒸发从提取物中去除所致。

因此，使用DES得到的所得液体提取物存在如下主要缺陷：它们被溶剂极度稀释与利用当前成本有效的纯化技术对其进行浓缩的有限方法。

这种限制对不同市场的商业价值产生了重大影响。

目前，尚无使用深度低共熔溶剂(无论它们是否由天然存在的成分构成)从生物材料中提取活性成分或物质的方法，例如酚类化合物，抗氧化剂，皂苷，类胡萝卜素，萜烯等，同时确保所得提取物含有高水平的活性化合物。还没有以增加提取物中活性化合物水平和活性的方式浓缩低共熔提取物的方法。

在本说明书中显然是在先出版的文件的列出或讨论不应视为承认该文件是现有技术或公知常识的组成部分。

发明公开

提取方法

本发明人令人惊奇且出人意料地发现，可以通过将所述至少一种外源性胺与植物和/或动物和/或原核生物材料混合而原位得到低共熔提取物。

本发明提供了一种用于制备液体、凝胶或凝胶状低共熔提取物的方法，所述方法包括下列步骤：

(i)在如下成分之间形成混合物：

(a)至少一种外源性胺；和

(b)为植物和/或动物和/或原核生物材料的生物材料；

(ii)使所述混合物相互作用，以形成液体、凝胶或凝胶状低共熔提取物；

(iii)任选地使液体、凝胶或凝胶状混合物与未溶解的固体分离。

下文将所述方法称作本发明的提取方法。

如本文所用，术语“低共熔”是指在低于混合物成分熔点的单一温度下熔化或固化的均匀物质混合物。

如本文所用，术语“深度低共熔”是指由路易斯酸或布朗斯台德酸与碱的低共熔混合物形成的系统/混合物，其可以包含多种阴离子和/或阳离子种类。

如本文所用，术语“植物生物材料”是已经从植物得到或可从植物例如从根，地上部分，叶，花，茎，树皮，果实或种子或它们的组织得到的材料。

如本文所用，术语“动物生物材料”是已经从动物来源得到或可从动物来源得到的材料，例如从哺乳动物腺体的分泌物中得到的材料，即麝香。

如本文所用，术语“原核生物材料”是已经从单细胞生物体例如细菌得到或可从单细胞生物体例如细菌得到的材料。

正如本领域技术人员将理解的，如本文所用，术语“可得到的”是指植物和/或动物和/或原核生物材料可直接从植物/动物/原核生物得到或可分离自植物/动物/原核生物，或可从替代来源得到，例如，通过化学合成或酶促生产。而本文所用的术语“得到的”是指提取物直接来自植物/动物/原核生物来源。

从本发明的方法得到的或可得到的低共熔提取物(下文称作本发明的低共熔提取物)可以是液体或凝胶/凝胶状的形式。在某些方面，提取物为液体形式。在其他方面，提取物为凝胶形式或为凝胶状。例如，从本发明的方法得到的或可得到的低共熔提取物可以具有在20℃下约1cP至在20℃下约100,000cP的粘度。

如本文所用，术语“液体”是指一种物质状态，其中液体中的原子或分子可以在保持彼此接触的同时更自由地运动，并具有其容器的形状。典型地，液体具有在20℃时为约1cP至20℃时为约10,000cP的粘度，例如在20℃时为约50cP至20℃时为约5,000cP。

如本文所用，术语“凝胶”或“凝胶状”是指一种原子或分子处于刚性或半刚性混合物中的物质状态，当处于稳态时，其典型地几乎没有或无流动。典型地，凝胶或凝胶状物质具有在20℃时为约10,000cP至20℃时为约250,000cP的粘度，例如在20℃时为约30,000cP至20℃时为约100,000cP的粘度。

本发明的低共熔提取物可以包括具有关注的化妆品或营养价值的任何天然化合物，例如来自植物和/或动物和/或原核生物材料的天然生物调味剂和味道改良剂、香料、杀生物剂、抗微生物剂、蛋白质、酶、着色剂、色素、表面活性剂、螯合剂、抗氧化剂、维生素及其混合物。

典型地，具有关注的化妆品或营养价值的特性的天然化合物例如天然生物调味剂和味道改良剂、香料、杀生物剂、抗微生物剂、蛋白质、酶、着色剂、色素、表面活性剂、螯合剂、抗氧化剂、维生素及其混合物作为来自植物和/或动物和/或原核生物材料的酚类化合物(包括酚酸、酚酯、酚二萜、类黄酮、裂环烯醚萜类(secoiridoids)、茋类和酚醇)、精油、萜类化合物(包括单-、倍半-、二-、三-和四-萜类化合物，例如类胡萝卜素类)、生物碱、脂质、苯丙素类化合物(phenylpropanoids)及其混合物存在于低共熔提取物中。

步骤(i)

所述方法的步骤(i)可以在不存在添加的有机溶剂的情况下进行。

所述方法的步骤(i)可以在不存在另外的氢键形成化合物(除外至少一种外源性胺或水)的情况下进行。例如，所述方法的步骤(i)可以如下进行：

(i)在如下成分之间形成混合物：

(a)至少一种外源性胺；

(b)为植物和/或动物和/或原核生物的生物材料；和

(c)水。

典型地，在所述方法中所使用的至少一种外源性胺不为低共熔或深度低共熔溶剂或混合物的组成成分。

水可以直接添加到所述至少一种外源性胺和生物材料中，可以在形成混合物的同时被所述至少一种外源性胺和生物材料吸附，或者可以作为内源水存在于生物材料中。

不希望受到理论束缚，认为添加水可通过辅助物质转运来加速该过程。典型地，在所述方法的步骤(i)中，水的存在量可以为混合物的约0至约70％重量，例如约5至约60％重量或约10至约30％重量。

在所述方法的步骤(i)中，不将预形成的低共熔溶剂添加到生物材料中。而是低共熔溶剂与生物材料原位形成。

如本文所用，术语“外源性胺”是指该胺尚未存在于植物和/或动物和/或原核生物材料中，而必须添加到植物和/或动物和/或原核生物材料中。

所述至少一种外源性胺可以选自季铵、吡啶鎓胺、烷基咪唑鎓胺及其混合物。例如，所述至少一种外源性胺可以选自氯化胆碱(ChCl)、氯化苄基三乙基铵(BTEAC)、氯化苄基三甲基铵(BTMAC)、肉碱、甜菜碱和1-丁基-3-甲基咪唑氯化物(BminCl)及其混合物。

所述至少一种外源性胺可以为固体形式，例如粉末，或者所述胺可以为水溶液形式。

生物材料优选为植物生物材料。植物生物材料可以是从植物的根、地上部分、叶、花、茎、树皮、果实或种子或它们的组织中得到或可从其中得到。例如，果实组织可以为果实的外皮。

植物生物材料可以得自或可得自唇形科(Lamiaceae)(包括迷迭香、鼠尾草属(Salvia)或来自唇形科的任意其他物种)、柑橘属(Citrus)、树皮(例如雪松属(Cedrus)树皮)、墨西哥橘属(Choisya)(例如德维特墨西哥橘(Choisya×dewitteana)'阿兹台克珍珠'(墨西哥橘(Choisya ternate)))、越桔(bulebeery)(清液果亚属(Cyanococcus))(例如干越桔)、辣椒属(Capsicum)(辣椒(Capsicum annuum))、青辣椒(Green chilli)(小米椒(Capsicum frutescens))、茄子(茄子(Solanum melongena))(例如干茄子)、姜(姜(Zingiber officinale))、芫荽叶、枣属(Ziziphus)、水飞蓟属(Silybum)(例如奶蓟(Silybum marianum))和鸡脚参属(Orthosiphon)。

生物材料包括能够与所述至少一种外源性胺形成复合物的至少一种内源性化合物。所述生物材料中的至少一种内源性化合物与所述至少一种外源性胺之间形成的复合物可以通过氢键和/或离子-偶极相互作用形成。

如本文所用，术语“内源性化合物”是指该化合物已经存在于植物和/或动物和/或原核生物材料中，而不是添加至植物和/或动物和/或原核生物材料中的。

所述至少一种内源性化合物可以选自氨基酸、肽、蛋白质、碳水化合物、脂肪酸、三酰基甘油或其他脂质、维生素、有机酸、多元醇、烯醇、生物碱类、裂环烯醚萜类、萜类化合物、酚类化合物及其混合物。

所述方法的步骤(i)典型地使用约1:1至约10:1、例如约2:1至约8:1或约4:1至约6:1质量比的胺:植物和/或动物和/或原核生物材料来进行。

在所述方法的步骤(i)中，生物材料可以选自迷迭香，例如迷迭香叶，墨西哥橘属，例如墨西哥橘，越桔，例如干越桔汁，辣椒，茄子，例如干茄子(有或没有皮)，姜，雪松树皮，鸡脚参属，枣属，芫荽叶，奶蓟(奶蓟)，药用鼠尾草(Salvia officinalis)及其混合物；且所述至少一种外源性胺可以选自ChCl、BTEAC、BTMAC、肉碱、甜菜碱、BmimCl及其混合物，胺与生物材料的比例为约1:1至约10:1，例如约2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1或9:1至约9:1、8:1、7:1、6:1、5:1、4:1、3:1或2:1。

在步骤(i)中，与所述至少一种外源性胺混合的植物和/或动物和/或原核生物材料可以为固体、液体、凝胶或凝胶状形式。例如，生物材料可以为粉末的固体形式。

植物和/或动物和/或原核生物材料可以为液体的形式，例如来自生物材料的流体，即来自植物或果实的汁液。

或者，生物材料可以是固体的形式，例如研磨的或捣碎的生物材料，即从植物根、地上部分、叶、花、茎、树皮，果实或种子或其组织得到或可得自它们的研磨或捣碎的材料。

如果与所述至少一种外源性胺混合的植物和/或动物和/或原核生物材料为液体(即汁液)形式，则可以在步骤(i)中将液体生物材料与所述至少一种外源性胺混合，并且干燥得到的混合物。

或者，可以在步骤(i)中将液体植物和/或动物和/或原核生物材料干燥，然后与所述至少一种外源性胺混合。

可以使用本领域已知的任意适合的干燥技术，例如但不限于冷冻干燥，喷雾干燥，烘箱干燥，加热干燥或真空干燥。

如果需要，可以在步骤(i)中将干燥的液体植物和/或动物和/或原核生物材料研磨成粉末，然后与所述至少一种外源性胺混合。

如果与步骤(i)中的所述至少一种外源性胺混合的植物和/或动物和/或原核生物材料为固体，则可以通过干燥植物和/或动物和/或原核生物材料，例如通过冷冻干燥或加热干燥除去过量的水得到固体植物和/或动物和/或原核生物材料。

然后可以将干燥的生物材料研磨成粉末。

或者，可以新鲜使用固体植物和/或动物和/或原核生物材料，而无需除去存在的内源水。

步骤(ii)

一旦已将所述至少一种外源性胺与植物和/或动物和/或原核生物材料混合，则使该混合物在步骤(ii)中相互作用并且可以经历加热和/或机械作用。

通过将所述至少一种外源性胺直接添加到植物和/或动物和/或原核生物材料中，在步骤(ii)中原位形成深度低共熔混合物。

步骤(ii)可以在约0至120℃，例如约10至约100℃的温度下进行。

如果在步骤(ii)中使用了机械作用，则可以通过使用研杵和研钵、挤出机、球磨机或其他装置来提供这种作用，而这种机械压力可以通过本领域技术人员已知的方式施加。

所述至少一种外源性胺与植物和/或动物和/或原核生物材料可以在步骤(ii)中相互作用约30分钟至约20天，例如约1小时至约15天，或约10天。

步骤(ii)允许在所述至少一种外源性胺与存在于植物和/或动物和/或原核生物材料中的内源性化合物之间形成复合物。该复合物可以通过所述至少一种外源性胺与植物和/或动物和/或原核生物材料中存在的内源性化合物之间的氢键和/或离子-偶极相互作用形成。

步骤(iii)

步骤(ii)中得到的低共熔提取物可以任选地与混合物中存在的没有与所述至少一种外源性胺复合的固体分离。可以使用本领域已知的任何方法，例如过滤。

为避免疑问，除非上下文另有指示，否则应针对本发明的给定方面、特征或参数指示的偏好、选项、特定特征等应视为已与如针对本发明的相同或其他方面、特征和参数所指示的任何其他偏好、选项、特定特征等结合使用。

除非本文另有说明，否则所列举的重量百分比基于提取物的总重，例如，至少一种外源性胺的总重和/或植物和/或动物和/或原核生物材料的总重。

如本文所用，术语“约”在指可测量值(例如组合物或反应混合物中特定成分的重量的量)时，是指规定量的±20％、±10％、±5％、±1％、±0.5％，或具体地±0.1％。

步骤(ii)或(iii)中得到的低共熔提取物也可以任选地使用下述纯化方法纯化。

例如，用于制备液体、凝胶或凝胶状低共熔提取物的方法可以包括在步骤(ii)和/或步骤(iii)之后的纯化方法，所述纯化方法包括：

a)将步骤(ii)或(iii)中得到的低共熔提取物和与所述低共熔提取物不能混溶的液体混合；

b)使步骤(a)中形成的混合物平衡为两相；和

c)使低共熔相与包含与低共熔提取物或低共熔组合不能混溶的液体的相分离。

在低共熔提取物或低共熔组合中不能混溶的液体可以为液体形式的脂质。例如，游离脂肪酸(例如油酸)、游离脂肪醇、三酰基甘油或植物油(例如向日葵油，低芥酸菜子油)。

或者，在低共熔提取物或低共熔组合中不能混溶的液体可以为醇，例如甲醇或乙醇，脂族有机溶剂，例如己烷，萜类溶剂，例如柠檬烯或对薄荷烷，芳族有机溶剂，例如苯或甲苯，或与原始低共熔提取物不能混溶的任何溶剂。

在本发明的纯化方法中，低共熔提取物与不能混溶的液体的比例为约1:0.1至约1:10，优选约1:0.5至约1.2。

本发明的纯化方法允许除去尚未通过与生物材料中的内源性化合物的氢键和/或离子-偶极相互作用而形成复合物的外源性胺。该纯化方法也可用于浓缩存在的活性化合物。

例如，低共熔提取物中抗氧化剂化合物的浓度可能会增加，导致低共熔提取物的ORAC和CAT值增加约10％，例如增加约20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。

纯化方法

本发明人还令人惊奇且出人意料地发现，可以纯化低共熔提取物，例如上述原位得到的低共熔提取物，以浓缩低共熔提取物中存在的活性化合物并提高所述低共熔提取物的活性。例如，增加所述低共熔提取物的抗氧化活性。

因此，本发明提供了一种用于纯化低共熔提取物或低共熔组合的方法，下文称作本发明的纯化方法。

本发明提供了一种纯化方法，所述方法包括：

a)将低共熔提取物或低共熔组合和与低共熔提取物或低共熔组合不能混溶的液体混合；

b)使步骤(a)中形成的混合物平衡为两相；和

c)将低共熔相与包含与低共熔提取物或低共熔组合不能混溶的液体的相分离。

如果需要，可以使用分离的低共熔相作为步骤(a)中的低共熔提取物或低共熔组合来重复所述纯化方法。

典型地，低共熔相是两个平衡相中的下面的相。然而，这可能取决于与低共熔提取物或低共熔组合不能混溶的液体。

低共熔提取物或低共熔组合可以使用上述描述的本发明的提取方法制备，或者可以为已经使用其他方式制备的低共熔提取物或低共熔组合，例如通过使用预先制备的低共熔溶剂提取生物材料制备的低共熔提取物。

在低共熔提取物或低共熔组合中不能混溶的液体可以为液体形式的脂质。例如，游离脂肪酸(例如油酸)、游离脂肪醇、三酰基甘油或植物油(例如向日葵油，低芥酸菜子油)。

或者，在低共熔提取物或低共熔组合中不能混溶的液体可以为醇，例如甲醇或乙醇，脂族有机溶剂例如己烷，萜类溶剂，例如柠檬烯或对薄荷烷，芳族有机溶剂，例如苯或甲苯，或与原始低共熔提取物不能混溶的任何溶剂。

在本发明的纯化方法中，低共熔提取物与不能混溶的液体的比例为约1:0.1至约1:10，优选约1:0.5至约1.2。

本发明的纯化方法允许除去尚未通过与生物材料中的内源性化合物的氢键和/或离子-偶极相互作用而形成复合物的外源性胺。该纯化方法也可以用于浓缩存在的活性化合物。

例如，可能会增加低共熔提取物中抗氧化剂化合物的浓度，导致低共熔提取物的ORAC和CAT值增加约10％，例如增加约20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。

低共熔提取物

本发明提供了使用如前所述的制备本发明的液体、凝胶或凝胶状低共熔提取物的方法得到的液体或凝胶/凝胶状低共熔提取物，下文可以将其称作“本发明的提取物”。

本发明还提供一种液体或凝胶/凝胶状的低共熔提取物，其已使用如前所述的本发明的纯化方法纯化，在下文中可以称作“本发明的纯化的提取物”。

本发明还涉及至少一种外源性胺与植物和/或动物和/或原核生物材料的液体或凝胶/凝胶状低共熔组合，其中胺和生物材料的质量比为约1:1至约10:1，例如约2:1至约8:1或约4:1至约6:1，在下文中可以称作“本发明的组合”。

本发明还涉及至少一种外源性胺与植物和/或动物和/或原核生物材料的液体或凝胶/凝胶状低共熔混合物，所述液体或凝胶/凝胶状低共熔混合物已使用本发明的纯化方法纯化，其中所述胺和生物材料以胺:生物材料的质量比为约1:1至约5:1或约1:1至约1:5，例如约1.5:1至约4:1或约1:1.5至1:4存在，其在下文中可以称作“本发明的纯化的组合”。

在本发明的低共熔提取物或低共熔组合或纯化的低共熔提取物或低共熔组合中，所述至少一种外源性胺选自季铵、吡啶鎓胺、烷基咪唑鎓胺及其混合物。例如，所述至少一种外源性胺可以选自氯化胆碱、氯化苄基三乙基铵、氯化苄基三甲基铵、肉碱、甜菜碱和氯化1-丁基-3-甲基咪唑鎓及其混合物。

在本发明的低共熔提取物或低共熔组合或纯化的低共熔提取物或低共熔组合中，生物材料优选为植物生物材料。植物生物材料可以从植物的根、地上部分、叶、花、茎、树皮、果实或种子或它们的组织中得到或可以得自它们。例如，果实组织可以为果实的外皮。植物生物材料的地上部分可能是优选的，例如植物叶。

在本发明的低共熔提取物或低共熔组合或纯化的低共熔提取物或低共熔组合中，植物生物材料可以得自或可得自唇形科(包括迷迭香、鼠尾草属或来自唇形科的任意其他物种)、柑橘属、树皮(例如雪松属树皮)、墨西哥橘属(例如德维特墨西哥橘'阿兹台克珍珠'(墨西哥橘))、越桔(清液果亚属)(例如干越桔)、辣椒属(辣椒)、青辣椒(Green chilli)(辣椒)、茄子(茄子)(例如干茄子)、姜(姜)、芫荽叶、枣属、水飞蓟属(例如奶蓟)和鸡脚参属。

低共熔提取物或低共熔组合或纯化的低共熔提取物或低共熔组合可以包含具有关注的化妆品或营养特性的天然化合物，例如，天然调味剂、味道改良剂、香料、杀生物剂、抗微生物剂、蛋白质、酶、着色剂、色素、表面活性剂、螯合剂、抗氧化剂、维生素及其混合物。

典型地，具有关注的化妆品或营养价值的特性的天然化合物例如天然生物调味剂和味道改良剂、香料、杀生物剂、抗微生物剂、蛋白质、酶、着色剂、色素、表面活性剂、螯合剂、抗氧化剂、维生素及其混合物作为来自植物和/或动物和/或原核生物材料的酚类化合物(包括酚酸、酚酯、酚二萜、类黄酮、裂环烯醚萜类、茋类和酚醇)以及精油、萜类化合物(包括单-、倍半-、二-、三-和四-萜类化合物，例如类胡萝卜素类)、生物碱、脂质、苯丙素类化合物及其混合物存在于低共熔提取物或低共熔组合或纯化的低共熔提取物或低共熔组合中。

例如，使用迷迭香得到的低共熔提取物或低共熔组合中存在的活性化合物包括、但不限于：

使用墨西哥橘属得到的低共熔提取物或低共熔组合中存在的活性化合物包括、但不限于：

使用来檬(lime)得到的低共熔提取物或低共熔组合中存在的活性化合物包括、但不限于：

在本发明的提取物或组合或纯化的提取物或组合中，生物材料包含至少一种能够与所述至少一种外源性胺形成复合物的内源性化合物。所述生物材料中的至少一种内源性化合物与所述至少一种外源性胺之间形成的复合物可以通过氢键和/或离子-偶极相互作用形成。

所述至少一种内源性化合物可以选自氨基酸、肽、蛋白质、碳水化合物、脂肪酸、三酰基甘油或其他脂质、维生素、有机酸、多元醇、烯醇、生物碱、裂环烯醚萜类、萜类化合物、酚类化合物及其混合物。

本发明的低共熔提取物或低共熔组合或纯化的低共熔提取物或低共熔组合的用途

本发明的低共熔提取物或低共熔组合或纯化的低共熔提取物或低共熔组合可用于提供赋予关注的化妆品或营养价值特性的天然化合物。例如天然生物调味剂和味道改良剂，香料，杀生物剂，抗微生物剂，蛋白质，酶，着色剂，色素，表面活性剂，螯合剂，抗氧化剂，维生素及其混合物，其来自植物和/或动物和/或原核生物材料，优选来自植物生物材料。

典型地，具有关注的化妆品或营养价值的天然化合物，例如，天然生物调味剂和味道改良剂，香料，杀生物剂，抗菌剂，蛋白质，酶，着色剂，色素，表面活性剂，螯合剂，抗氧化剂，维生素及其混合物作为酚类化合物(包括酚酸、酚酯、酚二萜、类黄酮、裂环烯醚萜类、茋类和酚醇)以及精油、萜类化合物(包括单-、倍半-、二-、三-和四萜类化合物(例如类胡萝卜素)、生物碱、脂质、苯丙素类化合物及其混合物存在于低共熔提取物或低共熔组合或纯化的低共熔提取物或低共熔组合中，其来自植物和/或动物和/或原核生物材料，优选来自植物生物材料。

例如，本发明的低共熔提取物或低共熔组合或纯化的低共熔提取物或低共熔组合可以具有高含量的提供抗氧化活性的化合物。

因此，本发明提供了包含从植物和/或动物和/或原核生物材料得到的抗氧化剂的低共熔提取物或低共熔组合或纯化的低共熔提取物或低共熔组合。

本发明还提供了低共熔提取物或低共熔组合或纯化的低共熔提取物或低共熔组合作为抗氧化剂的用途。该抗氧化剂可用于如下所述的组合物和/或产品中。

本发明的低共熔提取物或低共熔组合或纯化的低共熔提取物或低共熔组合可用于提供用于人或动物的营养保健品组合物、膳食或食品(例如功能性食品组合物，即食品、饮料、饲料或宠物食品或食品、饮料、饲料或宠物食品补剂)，营养补剂，香料或调味剂，药物(药物组合物或制剂)，兽用组合物，酿酒或化妆品制剂。

用于人或动物的营养保健品组合物、膳食或食品(例如功能性食品组合物，即食品、饮料、饲料或宠物食品或食品、饮料、饲料或宠物食品补剂)，营养补剂，香料或调味剂，药物(药物组合物或制剂)，兽用组合物，酿酒或化妆品制剂可以通过口服或肠胃外施用，或用于局部、直肠、鼻、耳、阴道和/或眼部施用。

因此，本发明提供了用于人或动物的营养保健品组合物、膳食或食品(例如功能性食品组合物，即食品、饮料、饲料或宠物食品或食品、饮料、饲料或宠物食品补剂)，营养补剂，香料或调味剂，药物(药物组合物或制剂)，兽用组合物，酿酒或化妆品制剂的低共熔提取物或低共熔组合或纯化的低共熔提取物或低共熔组合。

本发明还提供了用于人或动物的营养保健品组合物、膳食或食品(例如功能性食品组合物，即食品、饮料、饲料或宠物食品或食品、饮料、饲料或宠物食品补剂)，营养补剂，香料或调味剂，药物(药物组合物或制剂)，兽用组合物，酿酒或化妆品制剂，其包含本发明的低共熔提取物或低共熔组合或纯化的低共熔提取物或低共熔组合，以及任选的药物/兽用可接受的成分，如果适合，例如为赋形剂或载体或(功能性)食品可接受的赋形剂及其混合物。

如本文所用，对药用或兽用可接受的赋形剂的提及可以指本领域技术人员已知的药用或兽用可接受的佐剂、稀释剂和/或载体。

食品可接受的成分包括本领域已知的那些(包括在本文中也称作药学上可接受的赋形剂)，并且可以是天然的或非天然的，即它们的结构可以天然存在或不存在。在某些情况下，它们可以源自天然化合物，并在使用前进行修饰(例如麦芽糊精)。

所谓“药学上或兽医学上可接受的”是指组合物的其他成分通常是安全的，无毒的，并且在生物学上或其他方面都不是不期望的。例如，其他成分通常是无菌的且无热原的。从与本发明的提取物相容的意义上说，这样的成分必须是“可接受的”，并且对其接受者无害。因此，“药学上可接受的赋形剂”包括用于形成制剂的组成部分的任何化合物，其仅旨在充当赋形剂，即预期本身不具有生物活性。

本领域技术人员将理解，本发明的提取物(例如以组合物的形式，例如药用或兽用组合物的形式)可以通过任意适合的途径施用于患者或受试者(例如人或动物患者或受试者)，例如通过口服，直肠，鼻，肺，口含，舌下，经皮，脑内，腹膜内或肠胃外(包括皮下，肌内，鞘内，静脉内和皮内)途径。

本发明的提取物可以口服施用。在这种情况下，可以将本发明的药用或兽用组合物特别配制用于通过口服途径施用。

口服施用的药用或兽用组合物包括固体剂型，例如硬或软胶囊，片剂，药片，糖锭剂，丸剂，锭剂，粉剂和颗粒剂。在适当的情况下，它们可以用包衣衣料例如肠溶衣来制备，或者可以按照本领域众所周知的方法将它们配制成可以提供活性成分的受控释放，例如持续或延长释放。

口服施用的液体剂型包括溶液剂、乳剂、水性或油性混悬剂、糖浆剂和酏剂。

可以根据本领域技术人员已知的方法，例如通过将组合物的成分混合在一起，来制备本文所述的组合物(例如，药物、兽药或食品组合物)，例如用于口服施用的那些。

本发明的组合物可以包含一种或多种另外的成分，例如食品成分或药物成分和赋形剂，例如甜味剂，矫味剂，着色剂和防腐剂。本发明的组合物可以包含与无毒的药学上可接受的赋形剂(或多种成分)混合的活性成分，所述赋形剂适于制造片剂。这些赋形剂(或成分)例如可以为：惰性稀释剂，例如碳酸钙，碳酸钠，乳糖，磷酸钙或磷酸钠；制粒和崩解剂，例如，玉米淀粉，麦芽糊精或藻酸；粘合剂，例如淀粉，明胶或阿拉伯胶；或润滑剂，例如硬脂酸镁，硬脂酸，滑石粉及其混合物。

本发明的固体组合物可以是未包衣的，也可以通过已知技术包衣，以延迟在胃肠道中的崩解和吸收，从而在更长的时间内提供持续的作用。例如，可以使用延时材料，例如单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯。

本发明的液体组合物可以包含在胶囊中，该胶囊可以是未包衣的或如上述所定义地包衣的。

适合的药用或兽用载体包括惰性固体稀释剂或填充剂，无菌水溶液和各种有机溶剂。固体载体的实施例为乳糖，白土，蔗糖，环糊精，麦芽糊精，滑石粉，明胶，琼脂，果胶，阿拉伯胶，硬脂酸镁，硬脂酸，阿拉伯树胶，改性淀粉以及纤维素的低级烷基醚，蔗糖，二氧化硅及其混合物。液体载体的实例为糖浆，花生油，橄榄油，磷脂，脂肪酸，脂肪酸胺，聚氧乙烯和水。

此外，载体或稀释剂可以包括本领域已知的任何缓释材料，例如单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯，它们单独地或与蜡混合使用。

适合的药用载体包括惰性固体稀释剂或填充剂，无菌水溶液和各种有机溶剂。固体载体的实例为乳糖，白土，蔗糖，环糊精，麦芽糊精，糊精，滑石粉，明胶，琼脂，果胶，阿拉伯胶，硬脂酸镁，氢氧化镁；硬脂酸，阿拉伯树胶，改性淀粉和纤维素的低级烷基醚，蔗糖，二氧化硅。液体载体的实例为糖浆，植物油，磷脂，脂肪酸，脂肪酸胺，聚氧乙烯和水。此外，载体或稀释剂可以包括本领域已知的任何缓释材料，例如单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯，它们单独地或与蜡混合使用。

如本文所用，术语“载体”还可以指天然产物或已经被转化或修饰以使其不同于其天然来源的天然产物的产品，例如麦芽糊精。

根据疾病和待治疗的受试者以及施用途径的不同，本发明的提取物可以不同的剂量(即治疗有效剂量，作为对有此需要的患者施用的)施用。在这方面，本领域技术人员将理解，在本发明的上下文中，施用于哺乳动物、特别是人的剂量应足以在合理的时间内影响哺乳动物的治疗反应。本领域技术人员将认识到，确切剂量和组合物以及最合适的递送方案的选择还将特别地受到制剂的药理特性、所治疗病症的性质和严重程度以及身体健康状况、接受者的精神敏度、待治疗患者的年龄、状况、体重、性别和反应以及疾病的阶段/严重程度影响。

药用或兽用或食品组合物包含治疗有效量的本发明的提取物。如本文中所用，术语“有效量”与“治疗有效量”、“有效剂量”或“治疗有效量”同义，并且在本发明中使用时是指为达到期望的治疗效果所必需的本发明提取物的最小剂量，并且包括足以减轻与炎症相关的症状的剂量。可以通过基于一种或多种临床症状和/或与病症相关的生理指标观察个体的改善来确定治疗本文所述的疾病或病症的有效性。还可以通过减少对同时疗法的需求来表明本文所述的疾病或状况的改善。

另外，在使用本发明提取物的重复施用的情况下，本发明提取物的有效量将进一步取决于如下因素，包括但不限于施用频率、本发明提取物的半衰期或其任意组合。

在用于人或动物的营养保健品组合物、膳食或食品(例如功能性食品组合物，即食品、饮料、饲料或宠物食品或食品、饮料、饲料或宠物食品补剂)，营养补剂，香料或调味剂，药物(药物组合物或制剂)，兽用组合物，酿酒或化妆品制剂中存在的低共熔提取物或低共熔组合的量将根据应用的不同而改变。

典型地，在用于人或动物的营养保健品组合物、膳食或食品(例如功能性食品组合物，即食品、饮料、饲料或宠物食品或食品、饮料、饲料或宠物食品补剂)，营养补剂，香料或调味剂，药物(药物组合物或制剂)，兽用组合物，酿酒或化妆品制剂中存在的低共熔提取物或低共熔组合的量占营养保健品组合物、膳食或食品，营养补剂，香料或调味剂，药物组合物或制剂，兽用组合物，酿酒或化妆品制剂的重量的约0.001至约50％，例如约0.01至约10％或约0.1至1％。

本发明的药用或兽用或食品组合物可以由或基本上由本发明的提取物和药用或兽用或食品组合物组成。

为避免疑问，在本说明书中，当我们使用术语“包含”时，我们是指所描述的提取物或组合物必须包含所列成分，但可以任选地包含其他成分。当我们使用术语“基本上由……组成”或“主要由……组成”时，我们是指所描述的提取物或组合物必须含有所列成分，并且还可以含有少量(例如至多5％重量，或至多1％或0.1％(重量)的其他成分，前提是任何其他成分均不影响提取物或组合物的主要特性。当我们使用“由...组成”时，我们是指所描述的提取物或组合物必须仅包含所列成分。

附图简述

图1.使用本发明的方法得到的低共熔溶剂的视觉表示。

图2.通过HPLC测定，与Eutectys和氢化含甘油的提取剂相比的从干迷迭香生物质中用纯胺提取的选择的抗氧化剂的含量。

图3.通过ChCl(1:2)和BTEAC(1:2)的低共熔作用(eutecticgenesis)辅助提取墨西哥橘属叶得到的墨西哥橘属低共熔提取物的LC-MS色谱图(ESI-TIC)。

图4.通过用ChCl固态提取来檬外皮和汁液得到的来檬低共熔提取物的LC-MS色谱图。

图5.雪松属树皮低共熔提取物的纯化工艺对其ORAC和CAT值(A)、BTEAC含量(B)以及在280和350nm处吸收的化合物的总峰面积(C)的影响。

图6.迷迭香低共熔提取物的纯化工艺对ORAC和CAT值(A)以及某些酚类化合物(B)和BTEAC、水和油酸(C)的影响。

图7.纯化工艺对枣属低共熔提取物的ORAC值的影响。

实施例

通过参照如下非限制性实施例进一步描述本发明。

实施例1-用于制备低共熔提取物的通用方法

天然存在的植物的不同部分以及果实和植物的外皮用于与不同的胺形成深度低共熔物。

使用的叶来源于迷迭香(Rosmarinus officinalis)和墨西哥橘'阿兹台克珍珠'(墨西哥橘)；使用的果实为来檬(来檬(Citrus aurantifolia))，越桔(清液果亚属)，辣椒属(辣椒)，青辣椒(小米椒)和茄子。姜(Zingiber officinale)作为雪松属物种树的植物根和树皮的实例使用。

在液氮存在下，用研钵和研杵将所需量的每种材料研磨，以使该材料变脆并更易破碎。

将多汁的果实例如来檬和越桔用厨房榨汁机通过机械排出法分成汁液和果肉，并分别进行处理，同时在处理之前将辣椒和青辣椒通过物理方式分离为种子和外皮。在处理前应除去茄子皮。将过滤后的果汁冷冻干燥(48h)，得到相应的粉末，还将汁液的一部分加热干燥(50℃，48h)，以去除多余的水分。

将由此得到的研磨粉末过筛(Fisherbrand Test Sieve，1mm)以形成均匀的细粉。

使用不同的胺来证明脂族胺和芳族胺之间的差异和特异性：

(i)3种季铵盐：氯化胆碱(ChCl)(Sigma-Aldrich，>99％)和氯化苄基三乙基铵(BTEAC)，氯化苄基三甲基铵(BTMAC)(Sigma-Aldrich，99％)，

(ii)1种季铵两性离子：甜菜碱(Sigma-Aldrich，98％)，和

(iii)1种二烷基咪唑鎓盐：氯化1-丁基-3-甲基咪唑鎓(Sigma-Aldrich，≥98％)(BmimCl)。

将上面列出的固态胺以不同的质量比与天然产物粉末混合，通过与天然产物中存在的氢键供体(HBD)特异性相互作用，原位生成(即在提取过程中)低共熔混合物。图1示例了在下面讨论的实施例3A1至3A19的每一个中形成的低共熔提取物的一些代表性实施例。

实施例2-用于分析低共熔提取物的通用方法和通过高效液相色谱法(HPLC))对所关注的化合物的抗氧化活性的组合测定和鉴定和定量

作为抗氧化剂的物理化学功效的测试─氧自由基吸收能力(ORAC)方法

使用Ou等人公布的参比方法确定了原始或纯化的低共熔提取物捕获过氧自由基的能力(Determination of total antioxidant capacity by oxygen radicalabsorbance capacity(ORAC)using fluorescein as the fluorescent probe：Firstaction 2012.23.Journal of AOAC International，2013，96，1372-1376)in the AOACOfficial Journal.For information，the AOAC is the Association of OfficialAgricultural Chemists of the United States Department of Agriculture(USDA)。

制备了含有期望浓度的低共熔提取物的磷酸盐缓冲溶液(pH 7.2)。通过多通道移液器将每种溶液的五十毫升转移至Fluotrac 96-孔微孔板(Greiner)中。然后在每个孔中加满100μL含0.126μM荧光素二钠盐的pH 7.2磷酸盐缓冲液。

为了提高可重复性，将微孔板在温度受控的热振荡器(PHMT系列，GrantInstruments Ltd，Shepreth，England)中以1200rpm在轨道搅拌下于37℃预热20分钟。

然后使用多通道移液器添加新鲜配制的磷酸盐缓冲溶液中的50μL AAPH溶液。

每个孔中包含200μL最终混合物，该混合物由0.063M的荧光二钠盐、12.7mM的AAPH和磷酸盐缓冲溶液中递增浓度的低共熔提取物组成。

立即记录到515nm(λex：490nm)的荧光下降。然后在37±0.1℃下每分钟用微孔板读出器进行一次测量，持续2小时，在每次测量前搅拌5秒。然后根据Ou等人Developmentand validation of an improved oxygen radical absorbance capacity usingfluorescein as the fluorescent probe.J.Agric.Food Chem.2001，49，4619-4626)计算结果，以每克液体提取物的μmol Trolox当量计(ORAC值)。

用于以下实施例中使用的共轭可自氧化三烯(CAT)分析的通用方法

通过(Laguerre M，López-Giraldo LJ，Lecomte J，Baréa B，Cambon E，TchoboPF，Barouh N，Villeneuve P.Conjugated autoxidizable triene(CAT)assay：a novelspectrophotometric method for determination of antioxidant capacity usingtriacylglycerol as ultraviolet probe.Anal Biochem.2008，380，282-290)所述稍作修改的CAT方法测定原始或纯化的低共熔提取物的抗氧化能力。

如下制备抗氧化剂溶液：以期望的浓度制备低共熔提取物或Trolox(参比)的甲醇溶液。将低共熔提取物溶液过滤(0.45μm)以除去可能干扰CAT值测量的杂质。

然后将不同体积的该溶液(25、50、75和100μL)添加到24.9mL pH 7.2的磷酸盐缓冲溶液(PBS)中，然后用纯甲醇(分别为75、50、25和0μL)填充至25.0mL。

按照这种方式，所有低共熔提取物的缓冲溶液都包含相同的甲醇体积(100μL)，从而最大程度地减少了样品之间的任何可能偏差。

使用多通道微量移液器将这些溶液的样品(50μL/孔)转移到UV-Star 96-孔微孔板(Greiner，Frickenhausen，Germany)中(在273nm处的吸光度＝0.03)。然后将微孔板预热并在恒温振荡器(PHMT Grant Instruments，Shepreth，England)中在37℃下以1200rpm搅拌5min。

在棕色玻璃烧瓶中，将25毫升含34μM Brij 35(中性乳化剂，估计MW＝1,198g/mol)的缓冲溶液(pH 7.2)添加到5mg桐油(未精馏)中。

对于下一步，使用Vortex装置将该混合物搅拌10s，然后在Ultra Turrax均化器(Janke&Kunkel，Staufen，Germany)中以约2,400rpm的速度匀化90s。

然后在每个孔中填充100μL PBS包桐油型乳剂。为了提高可重复性，然后即刻将微孔板在37℃在恒温振荡器(PHMT Grant Instruments)中以1,200rpm预热和振荡，避光保存。

用多通道微量移液管添加五十微升新鲜制备的AAPH PBS溶液(4mM)。

最后，每个孔中包含200μL最终混合物，其由115μM精馏的桐油、17μm Brij 35、1mMAAPH以及PBS中不同浓度的Trolox(0-2μM)和低共熔提取物组成。通过记录在273nm处吸光度的下降，立即监测反应进程。使用配备Magellan软件的Saffire 2微孔板读出器(Tecan，Groedig，Austria)在37±0.1℃下每分钟进行测量，持续5h，在每次测量前搅拌5秒钟。

每个实验一式三份地进行(3个孔)，结果表示为CAT值的平均值(见下文)±SD。

类似地，对于ORAC分析，根据该样品曲线下的面积与空白样品(无低共熔提取物)的曲线下面积之差来计算样品的抗氧化值。该操作的结果得到曲线下的净面积(AUC)，然后将其绘制在曲线上作为浓度的函数。仅考虑曲线的线性部分来计算斜率，然后将其除以在相同条件下计算并在同一微孔板上分析的Trolox(标准品)的斜率。因此，CAT值表示为μmolTrolox当量/g低共熔提取物。

HPLC-ESI/MS分析实施例-墨西哥橘属和来檬的液体提取物的化学分布中包含的主要化合物的鉴定

为了鉴定和定量存在于所产生的不同提取物中的化合物，应用以下色谱条件。

柱：Waters BEH C18 50mm x 2.1mm 1.7μm

温度：45℃

流速：0.3mL/min

注射体积：2μL

负模式

流动相：A：0.1％甲酸乙腈溶液

B：0.1％甲酸水溶液

时间(min)	A％	B％
			0	10	90
20	10	90
			30	90	10

注意：在每次运行之间在起始流动相条件下再平衡至少10分钟

样品制备：将100mg DES稀释入5mL甲醇/水(50:50)，过滤，注入LC系统。

HPLC-DAD分析的实施例-迷迭香的液体提取物的迷迭香酸浓度

直接通过HPLC分析使用实施例1中所述方法得到的液体提取物，无预先浓缩或干燥。

迷迭香酸的定量和鉴定使用分析标准品(Extrasynthese-参比：4957S)并通过绘制校准曲线来进行。Agilent 1100 HPLC仪器配备了UV-可见DAD检测器或等效装置。通过添加99％三氟乙酸(TFA)的HPLC级乙腈和HPLC级水的混合物使用洗脱梯度。使用以下色谱条件：

Zorbax Eclipse XDB C18柱，1.8μηι，4.6mm x 50mm或等效物

流动相：

时间(min)	％乙腈0.1％TFA	％水0.1％TFA
			0	15	85
2	15	85
			2.5	18	82
2.7	100	0
			3.5	100	0

流速：2mL/min.

检测：328nm

温度：60℃

注射体积：2pL

压力：210巴±5巴

观察到如下保留时间：

迷迭香酸：2.0min；木犀草素3-葡糖苷酸：2.3min。

与火焰离子化检测器(FID)偶联的气相色谱法(GC)分析的实施例-纯化工艺应用于原始低共熔提取物后上和下两相中油酸的浓度

制备使用实施例3B1至3B3中所述的纯化方法制备的液相(上和下)用于如下分析：将50mg每个液相分配到20mL玻璃自动进样器小瓶中，然后加入1mL内标(十五烷酸甲酯)和4mL的0.5N NaOH甲醇溶液。在用隔膜将其密封之前，将小瓶用氮气吹扫，然后搅拌并在100℃加热5min。然后将样品冷却至室温，然后谨慎地打开，并加入5mL的14％BF3甲醇溶液。然后将样品用氮气吹扫，然后关闭，搅拌并在15min开始搅拌的同时在100℃加热30min。然后将样品冷却至室温，然后打开，并加入4mL的10％NaCl水溶液和4mL的纯正己烷。然后将样品涡旋并以3000rpm离心3min。将所得的上层相转移至2mL-小瓶中，然后置于自动进样器上进行GC-FID分析。

使用配备自动进样器和毛细管柱(2330 60m x 0.25mm，0.20μm薄膜厚度)的7890Agilent气相色谱仪分析样品。将注射器温度设置250℃，分流模式(1:50)并且使用衬板(ref 092003，SGE Analytical Sciences)。将GC烘箱温度设置在120℃5min，以5℃/min的速率升至200℃，保持在200℃10min，然后以2℃/min升至230℃，最后在230℃保持15min。将氦气以2mL/min用作载气(30psi的恒定压力)。将FID温度设定在300℃。

实施例3-低共熔提取物的具体实施例

用于生产低共熔提取物的方法且更优选用于生产高活性和浓缩的液体低共熔提取物的方法如下作为实施例3A和3B举出。

实施例3A是一组19个通用实施例，其证明了对多种生物原料例如种子、果皮、汁液、完整果实、蔬菜、根、叶和树皮进行的低共熔作用辅助提取工艺的可行性。

实施例3B是一组结果，其示例了使用该纯化方法提高提取物活性和特性。

实施例3A

实施例3A1：新鲜迷迭香叶(Rosmarinus officinalis)+胺

将新鲜迷迭香叶用液体N₂研磨，然后与氯化胆碱混合，并在开放的结晶皿中于20℃保持5天。在此期间结束时，皿中形成了液体。发现胺与新鲜迷迭香的最佳重量比为1-10倍。

实施例3A1是将0.5克新鲜迷迭香粉末和2.0克氯化胆碱(ChCl)混合而得到的结果(重量比分别为：1:4)。

其他低共熔提取物得自新鲜迷迭香。一些与ChCl(1:2、1:6和1:8)和另一种与氯化苄基三乙基铵(BTEAC)(1:2)的重量比不同。

在所有情况下，都通过离心从生物质成分中分离出液体，并使用氧自由基吸收能力(ORAC)和共轭可自氧化三烯(CAT)方法进行分析。结果表明它们发挥抗氧化活性，这启示植物活性化合物提取自新鲜迷迭香。

5种提取物的抗氧化活性如表1中所示。正如可以观察到的，胺(ChCl)越多，则抗氧化剂活性越低，这可能归因于胺对抗氧化剂化合物的稀释作用。

表1.不同低共熔提取物的组成和抗氧化活性

实施例3A2：干迷迭香叶(迷迭香)+胺

通过用液N₂冷冻迷迭香叶并用研杵和研钵研磨来生产干迷迭香叶粉末。将所得粉末与不同的胺以不同的比例混合，制成深度低共熔混合物，并提取具有与测试胺形成氢键能力的成分。

将干燥的生物质与胺混合，并在室温下于敞口容器中保持10天，以提取尽可能多的天然产物。

发现胺与干迷迭香的最佳重量比为1-10倍。实施例3A2是将0.5g干迷迭香粉末和2.0g ChCl(重量比分别为：1:4)合并的结果。

在此期间(10天)结束时，由于胺的吸湿性，形成了大量的有色液体。使用HPLC分析该液体，发现其中含有从植物中提取的多种天然产物。提取物的颜色明显比新鲜迷迭香的颜色深，这归因于干燥的生物质中天然产物的相对浓度较高。

其他低共熔提取物得自干迷迭香：一些与ChCl(1:6)的重量比不同，其他与BTEAC(1:8)或氯化1-丁基-3-甲基咪唑鎓(BmimCl)(1:4)的重量比不同。

表2.不同低共熔提取物的组成和抗氧化活性。

图2显示从干迷迭香叶中提取的一些重要植物活性物质的含量，例如木犀草素-3-葡糖苷酸、迷迭香酸和鼠尾草酸。本文提供的数据还包含相当于使用(i)已经形成的DES用作萃取溶剂(Rosemary Eutectys^TM)和(ii)已经形成的氢化含甘油的溶剂(迷迭香氢化含甘油的)得到的迷迭香提取物的值。

实施例3A3：干迷迭香叶(迷迭香)+55％重量H₂O+胺

实施例3A3显示首先添加55％重量的H₂O、然后以各种化学计量比添加胺的典型的干迷迭香粉末的混合物。

选择55％的水值，因为它典型地相当于新鲜与干迷迭香叶之间观察到的差异。通过机械搅拌剧烈混合后，将混合物在敞口容器中保持3天。加入H₂O以通过降低胺的粘度来提高提取速率，从而改善质量传递。由于所用胺类的吸湿性，这自然会在开放系统中发生，然而，这将减少达到平衡所需的时间。

迷迭香干燥叶:胺的最佳重量比范围在1:1至1:10。实施例3A3是在添加胺之前将0.5g干迷迭香叶粉末、2.0g ChCl和0.275g H₂O混合的结果(重量比分别为：1:4:0.55)。

其他低共熔提取物得自干迷迭香粉末和ChCl(1:6)或BTEAC(1:6)。已评估了后两个系统的抗氧化活性(表3)以及其在迷迭香酸、鼠尾草酸和木犀草素-3-葡糖苷酸中的含量(图2)。

表3.不同低共熔提取物的组成和抗氧化活性

实施例3A4：新鲜墨西哥橘属叶(墨西哥橘)+胺

酚类化合物和其他活性化合物例如生物碱的提取也可以从芸香科(Rutaceae)的其他叶例如墨西哥橘属(墨西哥橘)中进行。

观察到胺的量和类型与提取效率的变化趋势相同。在研杵和研钵中，将新鲜的墨西哥橘叶与胺混合在一起，并在敞口容器中保持7天。发现新鲜的墨西哥橘:胺的最佳比例范围在1:1至1:10。实施例A4(a)是将0.75g新鲜墨西哥橘叶片4.5g ChCl(重量比分别为：1:6)混合的结果，而实施例A4(b)是将0.75g新鲜墨西哥橘叶与4.5g BTEAC(重量比分别为：1:4:2)混合的结果。在两种情况下，将所得液体离心并过滤。当使用ChCl作为胺时，得到棕色液体，而用BTEAC生产绿色液体。

这些混合物的ORAC和CAT值测量显示提取物内良好的抗氧化物质含量。

在该实施例(图3)中，在使用脂族(ChCl)或芳族(BTEAC)胺盐得到的低共熔提取物的LC-MS谱中没有观察到显著性差异。

此外，LC-MS数据显示，从墨西哥橘叶中提取的化合物主要是酚类，例如类黄酮(例如芹菜素-二葡糖苷、芦丁、木犀草素-7-芸香糖苷)、酚酸衍生物(迷迭香酸葡糖苷)和生物碱(喹啉类生物碱及其大量异构体、东莨菪碱、巴福定、吴茱萸素、甲基吴茱萸素和朝森因(choisyne)，作为唯一引用的几个实例)(图4)。它们主要包含HBD部分，其可以得到与测试胺ChCl或BTEAC的H-键(表4)。

此外，对这些低共熔混合物的ORAC和CAT值测量结果显示对粗制液体提取物具有明显的抗氧化活性(表5)，这通过LC-MS鉴定的4种有效抗氧化剂分子得到证实：芦丁，木犀草素7-O-芸香糖苷，芹菜素6,8-二-C-葡糖苷和迷迭香酸β-D-葡糖苷(表4)。

表5.不同低共熔提取物的组成和抗氧化活性

所鉴定的生物碱无一不具有还原基团，例如能够具有抗氧化潜能的酚部分。然而，它们具有广泛的生物活性。可以举出东莨菪碱，它在医学上有许多用途，其中用于治疗术后恶心和呕吐和晕船，从而使它可以被潜水员使用。它还可用于治疗晕动病，胃肠道痉挛，肾或胆道痉挛，肠绞痛，肠易激综合征，氯氮平诱导的多涎(垂涎)和眼睛发炎。

实施例3A5和3A6：干燥的越桔汁液(清液果亚属)+胺

实施例3A5和3A6显示使用热蒸发(实施例A5)和冷冻干燥(实施例A6)并且产生白色粉末的与干燥越桔汁液粉末混合的ChCl。在添加成分(胺+干燥的越桔汁液)时，通过使用研杵和研钵进行混合。

将混合物在室温下在敞口容器中保持7天。形成非常浅的黄色/棕色液体。对于所有尝试使用的胺(ChCl/BTEAC/BmimCl)该结果均相同。

胺与天然产物的重量比不会改变液体的颜色。发现该系统的最佳天然产物:胺比在1:2至1:8。实施例A5是将0.5g热蒸发(热干燥)的越桔汁液与2.0g ChCl(重量比分别为：1:4)混合的结果，实施例A6是将0.5g冷冻干燥的越桔汁液与2.0g ChCl(重量比分别为：1:4)混合的结果。

其他低共熔提取物以其热干燥或冷冻干燥的形式得自干燥的越桔汁液(表6)。得到与ChCl不同的重量比(1:2，1:6)的一些熔化物，同时测定了其他熔化物与BTEAC(1:4，1:8)和BmimCl(1:4)的重量比。

表6.不同低共熔提取物的组成和抗氧化活性

实施例3A7：干燥的越桔果肉(清液果亚属)+胺

实施例3A7是用研杵和研钵将0.5g干燥的越桔果肉与4.0g ChCl(重量比分别为：1:4)混合并在敞口容器中保持7天的结果。

发现该体系的最佳天然产物:胺的重量比在1:2至1:8，而使用BTEAC以1:4至1:8的重量比得到其他低共熔熔化物。

所得液体提取物的颜色比干越桔汁液测试所得的提取物颜色深。对于使用果肉尝试使用的所有胺，这都是相同的，并且天然产物:胺的比例不会改变液体的颜色。就抗氧化活性而言，当胺比例增加时，我们可以观察到活性略有下降，这可能是由于胺中抗氧化剂分子的某种稀释作用所致(表7)。

表7.不同低共熔提取物的组成和抗氧化活性

实施例3A8、3A9、3A10、3A11：辣椒属(辣椒)/青辣椒(小米椒)+胺

将辣椒和青辣椒果实的外壳和种子分别与胺混合，以回收植物这些部分中所含的天然物质(能够提供氢键)。

实施例3A8(a)显示将0.5g新鲜辣椒壳与3.0g ChCl混合的结果(比例1:6)，实施例3A10(a)显示将0.5g新鲜辣椒壳与4.0g ChCl合并的结果(比例：1:8)。实施例3A8(b)显示将0.5g新鲜辣椒外壳与3.0g BTEAC混合的结果(比例1:6)，实施例3A10(b)显示将0.5g新鲜辣椒外壳与4.0g BTEAC混合的结果(比例：1:8)。

低共熔提取物的颜色根据所用胺的不同而改变。当使用ChCl(实施例3A8(a)和3A10(a))时，会形成极浅黄色的溶液，但是当使用BTEAC(实施例3A8(b)和3A10(b))时，会形成粉红色溶液。

实施例3A9显示0.5g研磨的辣椒属种子与4.0g ChCl的结果(比例1:8)，实施例3A11显示0.5g研磨的辣椒属种子与4.0g ChCl的结果(比例1:8)。

还发现其他比例会导致低共熔熔化物的形成(表8)。在所有实施例中，使用研杵和研钵将纯胺与植物材料混合，并在室温下于敞口容器中保持7天。将得到的液体离心并过滤。发现辣椒属：胺或青辣椒:胺的最佳重量比范围为1:2至1:10。

表8.不同低共熔提取物的组成和抗氧化活性

实施例3A12：干茄子(茄子)+胺

实施例3A12显示将0.5g茄子干汁与2.0g ChCl混合并在敞口容器中保持7天(重量比分别：1:4)的结果。将液体离心并过滤。当使用替代的胺时，产生浅黄色液体，并且颜色不变。将茄子的果肉榨汁并冷冻干燥。然后将所得的干燥果肉研磨成粉末。发现茄子:胺的最佳重量比范围为1:2至1:8。实施例A12显示使用ChCl作为胺的所得液体低共熔提取物。表9还示例了使用BTEAC形成低共熔熔化物的可能性。

表9.不同低共熔提取物的组成和抗氧化活性

实施例3A13：姜(姜)+胺

实施例3A13显示如何用胺提取根，在这种情况下为整个姜根。将姜榨汁，冷冻干燥并研磨成粉末，然后加入胺。实施例3A13显示用研杵和研钵将0.5g干姜与2.0g ChCl(重量比分别为：1:4)混合并在敞口容器中保持7天的最终结果。将这种低共熔提取物以与其他样品相同的方式进行离心和过滤。

发现可以从中提取干姜的最佳比例范围是1:2至1:8姜:胺，而其他比例和胺(BTEAC)也会产生低共熔熔化物。

表10.不同低共熔提取物的组成和抗氧化活性

实施例3A14和3A15：来檬(来檬)+胺

一旦将来檬的果皮和果汁从来檬的果肉中分离出来，则已经与各种胺独立地混合，并显示出可以产生具有高浓度的苹果酸、柠檬酸和抗坏血酸的低共熔提取物。将果皮用液N₂冷冻，然后在加入胺之前研磨成粉末，然后将果汁冷冻干燥。

为了从液相中除去任何不溶性固体物质，将混合物离心，且然后倾析。实施例A14是将0.5g干燥和粉状果皮与3.0g ChCl(重量比分别为1:6)混合的结果，实施例A15是将0.5g冷冻干燥的来檬果汁与3.0g ChCl(重量比分别为：1:6)混合的结果。使用研杵和研钵将两个样品混合，并在敞口容器中保持10天。发现得到低共熔熔化物的最佳来檬:胺重量比为1:2至1:10(表11)。

表11.来自来檬的两种低共熔提取物的组成

天然产物材料	添加的胺	天然产物:胺重量比	低共熔物形成
				干来檬果皮	ChCl	1:6	熔化物
冷冻干燥的来檬果汁	ChCl	1:6	熔化物

表12给出了通过LC-MS在ESI+中发现和鉴定的两种低共熔提取物的化学化合物。首先，显然来檬汁低共熔提取物的化学特征不同于从果皮部分得到的化学特征。在其他差异中，人们可以注意到与果汁相比，橙皮中橙皮苷的浓度更高，并且其中的citrobilin(三萜类化合物)、柠美内酯(目前在来檬精油中普遍存在的香豆素)和佛手柑内酯(目前也发现的柑橘属精油中的呋喃并香豆素)的含量更高。表13提供了对来檬果皮和果汁的低共熔提取物中发现的化合物的定量。

表13.来自来檬果皮和果汁低共熔提取物的化合物的鉴定

(1)表示为芦丁

(2)表示为橙皮苷

(3)表示为诺米林

(4)表示为香豆素

实施例3A16：雪松属树皮(雪松属物种)+胺

实施例3A16显示，可以使用相同的低共熔作用辅助提取方法提取树皮，以产生具有高植物活性成分的提取物。实施例3A16中所示的样品是使用研杵和研钵将0.5g雪松属树皮粉末与3.0g BmimCl(重量比分别为：1:6)合并并在敞口容器中保持8天的结果。用液N₂将雪松属树皮冷冻，然后用研杵和研钵研磨成细粉。

值得注意的是，其他重量比(1:8)和胺(BTEAC，BmimCl)允许得到低共熔熔化物(表14)。雪松属树皮与胺的最佳重量比范围在1:2至1:10。所得提取物为深棕色，并且ORAC和CAT值显示出强抗氧化特性，表明胺已回收了抗氧化成分。雪松属树皮:BTEAC(1:8)、然后是雪松属树皮：BmimCl(1:6)表现出最高的活性，这是我们通过使用低共熔作用辅助提取技术发现的(无需进一步纯化)：液体提取物(ORAC值)分别为302.9和285.2μmol TE/g(表14)。还观察到来自雪松属树皮：BTEAC(1:8)中的低共熔提取物的最高CAT值(79.1μmol TE/g)，不过，不是来自同一重复。

表14.来自雪松属树皮的不同低共熔提取物的组成和抗氧化活性

实施例3A17：爪哇茶、猫须草(Orthosiphon aristatus)(Blume)Miq.(syn.Orthosiphon stamineus Benth.)、地上部分(干燥和研磨的)+胺

实施例3A17显示使用纯胺的典型的药草鸡脚参属的提取物。在本实施例中，将0.5g干燥的鸡脚参属与3.0g ChCl(重量比分别为：1:6)混合，并用研杵和研钵混合在一起。然后将混合物在敞口容器中保持8天。所得液体为浅棕色/橙色。还发现其他比例(1:4、1:8)和另一种胺(BmimCl)产生低共熔熔化物(表15)。发现鸡脚参属:胺的最佳重量比范围在1:2至1:8。ORAC和CAT值表明该液体提取物中存在抗氧化剂化合物，其中来源于鸡脚参属：BmimCl(1:4)的低共熔提取物具有较高的抗氧化剂活性：133.1(ORAC)和40.9(CAT)μmolTE/g。

表15.来自鸡脚参属的不同低共熔提取物的组成和抗氧化活性

实施例3A18：枣属(枣(Ziziphus jujuba Mill.)，种子(干燥和研磨的))+胺

实施例3A18显示来自枣属植物(枣)的种子的典型提取物。在本实施例中，将0.5g的干燥的枣属种子与3.0g的ChCl(重量比分别为：1:6)混合，并使用研杵和研钵混合，并在敞口容器中保持7天。还发现其他比例(1:4、1:8)和胺(BTEAC，BmimCl)可产生低共熔熔化物(表16)。枣属:胺的最佳重量比范围为1:2至1:8。所得液体为浅棕色/橙色。值得注意的是，在ORAC方法中，只有BTEAC提取物(比例为1:6)具有显著的抗氧化活性，其值为41.4μmolTE/g。

表16.来自枣属的不同低共熔提取物的组成和抗氧化活性

实施例3A19：芫荽叶(芫荽(Coriandrum sativum L.)，叶(干燥和研磨的))+胺

实施例3A19显示当将0.5g的药草芫荽叶(或芫荽)与2.0g的ChCl(重量比分别为：1:4)混合时得到的提取物。当与不同的胺混合时，将植物材料干燥并制成粉末，并在开放容器中保持10天。还发现其他比例(1:6、1:8)和另一种胺(BmimCl)产生低共熔熔化物(表17)。发现芫荽叶:胺的最佳重量比范围为1:2至1:8。所得液体为浅棕色/橙色。

表17.来自芫荽叶的不同低共熔提取物的组成和抗氧化活性

实施例3B

此处展示了使用各种植物材料(如树皮、叶或种子)的一组结果，其示例了使用纯化方法增强低共熔提取物活性和特性的情况。

实施例3B1：雪松属树皮低共熔提取物纯化

低共熔提取物的纯化通过使用长链单不饱和脂肪酸作为不能混溶相的液-液萃取来进行。向1.0mL的雪松属树皮低共熔提取物中加入0.75mL的纯油酸，并通过磁搅拌器在50℃下混合30分钟。然后将所得混合物离心以使两层的分离最大化。然后用Pasteur移液管将上层与下层隔离，并根据抗氧化剂活性、BTEAC含量和在280nm(酚醛)和350nm(主要是类黄酮)处吸收的化合物的分布情况评估两相。

ORAC和CAT值均增加约>2倍，这表明抗氧化剂活性显著增强(图4)。纯化步骤后活性的改善可以用在280nm(主要是具有抗氧化剂潜能的酚类)和350nm(主要是具有抗氧化剂潜能的类黄酮酚类化合物)吸收的化合物的增加来解释。同时，当对提取物进行纯化时，BTEAC(不含任何抗氧化剂活性的胺)的含量会从71％稍降至63％。

实施例3B2：迷迭香叶低共熔提取物纯化

向1.0mL的迷迭香叶低共熔提取物中添加0.5或0.75mL的纯油酸，并通过磁搅拌器在50℃下混合30分钟。然后将所得混合物以5000rpm离心15分钟，以最大程度地分离两层。然后将上层与下层隔离。

图5A显示在应用纯化步骤后，在ORAC和CAT测量中迷迭香低共熔提取物的抗氧化活性增加。当使用0.5mL的纯油酸洗涤1mL的液体提取物时，所得提取物(下层)的ORAC值增加37％，而CAT值增加25％。类似地，当使用0.75mL油酸(用于1毫升提取物)时，ORAC值增加17.5％，而CAT值增加19％。

活性的显著改善与两种相对亲水性的酚类抗氧化剂即迷迭香酸和木犀草素-3-O-葡糖苷酸的增加同时出现(图5B)。同时，当采用纯化方法时，BTEAC和水从提取物中被部分消耗掉，尽管对于雪松属树皮低共熔提取物而言，消耗仍然适度(对于BTEAC<10％；对于水<20％)。因此，从提取物中去除的BTEAC和水存在于上层，其中它们构成了很大一部分(38-42％)，几乎等于油酸的比例(43-46％)(图5C)。令人惊讶的是，尽管与水和油酸不混溶，但上层仍包含约10％的水(图5C)，当水H键合至BTEAC分子(水-BTEAC复合物)时，其可能会迁移。

总之，这些结果表明，纯化步骤能够通过将非抗氧化剂分子部分迁移到长链脂肪酸形成的相中来提高活性分子的水平，从而增加了所考虑的活性。值得注意的是，除抗氧化剂特性外，还可以通过其他特性得到这种活性的改善。

在我们的实验中，在纯化步骤中没有油酸迁移到提取物中。实际上，在下层中仅发现少量的油酸(<1％)，而未纯化的迷迭香低共熔提取物已经包含1.7％的油酸(图5C)。还值得注意的是，如通过ORAC方法测量的(图5A)，上层相具有适度的抗氧化活性。首先，组成数据表明鼠尾草酸从提取物中部分迁移到洗涤阶段(图5B)。其次，已经发现，与CAT方法不同，对于ORAC方法而言，纯油酸可以诱导正值，不过为适度的。

实施例3B3：枣属种子低共熔提取物纯化

向1.0mL的枣属种子低共熔提取物中加入0.75mL的油酸，并通过磁搅拌器在50℃下混合30分钟。然后将得到的混合物离心(5000rpm，15min)以最大程度地分离两层。然后用Pasteur移液管将上层与下层分离。

图6显示，纯化技术使低共熔提取物的ORAC活性提高了61％。母体提取物在纯化前包含约67.5％的BTEAC，而在纯化后包含约59.7％，表明胺部分耗尽(13％)。因此，在下面的相中分配的活性分子被浓缩，因此，抗氧化剂活性可能增加。

Claims (23)

1.用于纯化低共熔提取物或低共熔组合的方法，包括：

(i)将低共熔提取物或低共熔组合与在所述低共熔提取物或组合中不能混溶的液体混合；

(ii)使步骤(i)中形成的混合物平衡为两相；和

(iii)将低共熔相与包含在所述低共熔提取物或组合中不能混溶的液体的相分离，其中所述在低共熔提取物或低共熔组合中不能混溶的液体为液体形式的脂质相，其为游离脂肪酸、游离脂肪醇、三酰基甘油和/或植物油。

2.权利要求1的纯化方法，其中使用分离的低共熔相作为纯化方法的步骤(i)中的低共熔提取物或组合，重复步骤(i)至(iii)。

3.权利要求1或2的纯化方法，其中所述低共熔提取物或低共熔组合是预先制备的低共熔提取物或低共熔组合。

4.权利要求3的纯化方法，其中所述低共熔提取物或低共熔组合是通过用预先制备的低共熔溶剂提取生物材料来制备的低共熔提取物。

5.权利要求1或2的纯化方法，其中低共熔提取物与不能混溶的液体的体积比为1:0.1至1:10。

6.权利要求5的纯化方法，其中低共熔提取物与不能混溶的液体的体积比为1:0.5至1.2。

7.权利要求1或2的纯化方法，其中使用至少一种外源性胺和植物和/或动物和/或原核生物材料制备所述低共熔提取物。

8.权利要求7的纯化方法，其中所述方法除去了尚未与生物材料中的内源性化合物形成复合物的外源性胺。

9.使用权利要求1-8中任一项的纯化方法得到的纯化的低共熔提取物或低共熔组合。

10.至少一种外源性胺与植物和/或动物和/或原核生物材料的液体、凝胶或凝胶状低共熔组合，其中所述胺与生物材料以1:1至10:1的重量比存在，其中所述低共熔组合已经使用权利要求7-8中任一项的纯化方法纯化。

11.权利要求10的低共熔组合，其中所述胺与生物材料以1:1或2:1的重量比存在。

12.权利要求9的低共熔提取物或低共熔组合，其中所述胺选自季铵、吡啶鎓胺、烷基咪唑鎓胺及其混合物。

13.权利要求10的低共熔组合，其中所述胺选自季铵、吡啶鎓胺、烷基咪唑鎓胺及其混合物。

14.权利要求9-13中任一项的低共熔提取物或低共熔组合，其中所述生物材料包含至少一种内源性化合物，其选自氨基酸、肽、蛋白质、碳水化合物、脂肪酸、三酰基甘油、维生素、有机酸、多元醇、烯醇、生物碱、萜类化合物、酚类化合物及其混合物。

15.权利要求14的低共熔提取物或低共熔组合，其中所述萜类化合物为裂环烯醚萜类。

16.权利要求14的低共熔提取物或低共熔组合，其中所述至少一种内源性化合物与所述至少一种外源性胺通过氢键和/或离子-偶极相互作用形成复合物。

17.权利要求9-13中任一项的低共熔提取物或低共熔组合，其中所述生物材料得自或可得自以下植物：唇形科，柑橘属，辣椒属，茄子，姜，树皮，芫荽叶，枣属，水飞蓟属和鸡脚参属。

18.权利要求9-13中任一项的低共熔提取物或低共熔组合，包含得自或可得自生物材料的抗氧化剂。

19.权利要求9-13中任一项的低共熔提取物或低共熔组合在提供用于人或动物的营养保健品组合物或食品，调味剂，药物组合物，酿酒或化妆品制剂中的用途。

20.权利要求9-13中任一项的低共熔提取物或低共熔组合在提供用于人或动物的膳食，营养补剂，香料或兽药组合物制剂中的用途。

21.权利要求9-13中任一项的低共熔提取物或低共熔组合作为抗氧化剂的用途。

22.用于人或动物的营养保健品组合物或食品，调味剂，药物，酿酒或化妆品制剂，包含权利要求9-13中任一项的低共熔提取物或低共熔组合，以及任选的药学/兽药可接受的赋形剂或食品可接受的成分。

23.用于人或动物的膳食，营养补剂，香料或兽药组合物制剂，包含权利要求9-13中任一项的低共熔提取物或低共熔组合，以及任选的药学/兽药可接受的赋形剂或食品可接受的成分。