CN107602720A - 一种低共熔溶剂/盐双水相萃取分离锁阳多糖的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种低共熔溶剂/盐双水相萃取分离锁阳多糖的方法，其主要步骤为：向锁阳粉末中加入一定含水量的低共熔溶剂，室温充分浸提后，冰浴条件下，超声波脉冲进行处理，离心收集上清液，得到锁阳多糖粗提液；将锁阳多糖粗提液中加入磷酸氢二钾，混合溶解，静置，离心，形成双水相萃取体系；其中上相为低共熔溶剂，下相为含糖和磷酸氢二钾的溶液；将上相经冷冻干燥回收；下相经透析处理、冷冻干燥得到锁阳多糖。本方法所采用的低共熔溶剂具有无毒性、生物降解性、生物相容性好和熔点低的优点，提取及分离纯化操作简单、条件温和，分离效率高，锁阳多糖的得率高，低共熔溶剂可回收利用，有效降低了生产成本，适合于工业化规模生产。
Description
技术领域
本领域涉及天然产物深加工技术领域，尤其是涉及一种低共熔溶剂/盐双水相萃取分离锁阳多糖的方法。
背景技术
锁阳（学名：Cynomorium songaricum Rupr.），锁阳科、锁阳属多年生肉质寄生草本，无叶绿素，全株红棕色，大部分埋于沙中，主要分布于我国西北地区，作为中、蒙药中常用药材之一，具有提高免疫、预防疾病和抗癌等多种功效；锁阳含有多种化学成分和药效成分；锁阳多糖作为最重要活性成分之一，是由多个单糖分子脱水缩合形成的天然大分子化合物，是除核酸、蛋白质外又一大类传递信息的分子；其具有抗肿瘤、抗氧化和抗凝活性等多种较强的生物学效应。
锁阳多糖的提取方法有水溶醇沉法、稀碱溶液浸提法、超声辅助提取法等，专利文献CN104004108A《一种酶解制备锁阳多糖的方法》和专利文献CN103145863A《酶处理提取锁阳多糖的方法及锁阳多糖抗肿瘤制剂的制备》均采用酶辅助提取锁阳多糖；专利文献CN101580553《一种锁阳多糖的制备方法》采用超声结合微波方法提取锁阳多糖；上述方法结合sevage法除蛋白质、乙醇沉淀、离子交换层析、凝胶过滤层析、亲和吸附层析等方法中一种或多种对锁阳多糖进行纯化。但这些提取和纯化方法存在得率较低、试剂消耗量大、能耗高、价格昂贵、操作步骤繁琐等缺陷。
发明内容
本发明的目的在于提供一种低共熔溶剂/盐双水相萃取分离锁阳多糖的方法，以解决现有技术提取锁阳多糖存在得率较低、试剂消耗量大、能耗高、价格昂贵、操作步骤繁琐等问题。
一种低共熔溶剂/盐双水相萃取分离锁阳多糖的方法，本方法所用锁阳原材料为甘肃产的经过除脂自然晾晒干燥后的锁阳粉末，它包括以下步骤：
步骤一、锁阳多糖粗提液的制备：在锁阳粉末中加入含水量的体积百分比为(30-50)%低共熔溶剂，锁阳粉末与低共熔溶剂质量体积比为1: (20-40)(m/V)，充分混匀，在0-4℃冰浴条件下进行超声波处理，超声波的功率为200-400W，脉冲工作方式为超声2s，间歇2s，超声时间为30-50，然后进行离心5-10分钟，离心转速为每分钟2000-4000转，取上清液，得到锁阳多糖粗提液；
步骤二、双水相萃取：在步骤一制备的锁阳多糖粗提液中加入磷酸氢二钾充分混匀，磷酸氢二钾和锁阳多糖粗提液的质量体积比为(3-6):10(m/V)，待磷酸氢二钾完全溶解后，静置60-100分钟，再将溶液离心10-20分钟，离心转速为每分钟2000-4000转，形成双水相萃取体系；
步骤三、回收低共熔溶剂和多糖：取步骤二所制备的双水相萃取后的上相，经冷冻干燥至恒重的粘性液体状态，得到低共熔溶剂，回收低共熔溶剂；取下相，并经透析除磷酸氢二钾，所用透析袋分子截留量为8000-12000Da，冷冻干燥得到锁阳多糖。
优选的，所述低共熔溶剂的制备方法为：季铵盐与氢键供体按照摩尔比为1:（1-3）的比例混合，常压，温度为80-100℃搅拌加热1-3h至透明无色溶液，冷却至室温即可得到低共熔溶剂；低共熔溶剂中季铵盐与氢键供体之间以氢键连接，能够提高多糖得率。
所述季铵盐为氯化胆碱，氢键供体为乳酸、甘油、苹果酸、琥珀酸或酒石酸中的一种。
低共熔溶剂/盐双水相体系是将一定量低共熔溶剂和盐溶液相互混合，当二者达到一定浓度后，由于盐析作用，促使低共熔溶剂和盐形成两相。采用低共熔溶剂/盐双水相体系对植物中有效成分进行萃取时，目标产物和少量杂质分布在一相，而大部分杂质分布在另一相，可达到初步分离纯化目的。该技术是一种简单、快速、高效、低成本、易放大、无需层析处理的方法。
本发明具有如下优点及有益效果：
（1）本方法所采用的低共熔溶剂具有无毒性、生物降解性、生物相容性好和熔点低的优点，提取及分离纯化操作简单、条件温和，分离效率高，锁阳多糖的得率高，合成的原料来源广泛，低共熔溶剂可回收利用，有效降低了生产成本，适合于工业化规模生产。
（2）该方法兼有低共熔溶剂和双水相萃取的优点，是一种更为绿色的萃取分离的方法。
说明书附图
图1为实施例4所述方法制备的锁阳多糖的红外光谱图；
图中吸收峰说明：
3348.84cm-1，O-H伸缩振动吸收峰；
2977.12cm-1，C-H伸缩振动吸收峰；
1643.56cm-1，COO-伸缩振动吸收峰；
1382.73cm-1，C-H弯曲振动吸收峰；
1085.26cm-1，C-OH伸缩振动吸收峰；
1043.8cm-1，C-O-C伸缩振动吸收峰；
877.95cm-1，吡喃环伸缩振动吸收峰。
具体实施方式
以下实施例是对本发明的进一步说明，不是对本发明的限制。
实施例1
一种低共熔溶剂/盐双水相萃取分离锁阳多糖的方法，本方法所用锁阳原材料为甘肃产的经过除脂自然晾晒干燥后的锁阳粉末，它包括以下步骤：
步骤一、锁阳多糖粗提液的制备：取1g的锁阳粉末，加入含水量的体积百分比为40%氯化胆碱-苹果酸低共熔溶剂20mL，充分混匀，在4℃冰浴条件下进行超声波处理，超声波处理功率为300W，脉冲工作方式为超声2s，间歇2s，超声时间为30分钟，然后将溶液以每分钟4000转的转速离心5分钟，取上清液，得到锁阳多糖粗提液；
步骤二、双水相萃取：向步骤一制备的锁阳多糖粗提液中加入10g磷酸氢二钾粉末，待磷酸氢二钾完全溶解后，室温静置70分钟后，将溶液以每分钟4000转的转速离心15分钟，形成双水相萃取体系，上相为氯化胆碱-苹果酸低共熔溶剂相，下相为含多糖的磷酸氢二钾相。
步骤三、回收氯化胆碱-苹果酸低共熔溶剂和多糖：取步骤二所制备的双水相萃取后上相，经冷冻干燥至恒重的粘性液体状态，得到氯化胆碱-苹果酸低共熔溶剂，回收氯化胆碱-苹果酸低共熔溶剂；取下相，经透析除磷酸氢二钾，所用透析袋分子截留量为12000Da，冷冻干燥得到锁阳多糖。
所述氯化胆碱-苹果酸低共熔溶剂的制备方法为：氯化胆碱与苹果酸按照摩尔比为1：2的比例混合，常压，温度为80-100℃搅拌加热1-3h至透明无色溶液，冷却至室温即可得到氯化胆碱-苹果酸低共熔溶剂；氯化胆碱-苹果酸低共熔溶剂中氯化胆碱与苹果酸之间以氢键连接，能够提高多糖得率。
本实施例中锁阳多糖得率为19.76%±1.25%，锁阳多糖含量为87.21%±0.79%。
实施例2
一种低共熔溶剂/盐双水相萃取分离锁阳多糖的方法，本方法所用锁阳原材料为甘肃产的经过除脂自然晾晒干燥后的锁阳粉末，它包括以下步骤：
步骤一、锁阳多糖粗提液的制备：取1g锁阳粉末，加入含水量的体积百分比为50%氯化胆碱-甘油低共熔溶剂30mL，充分混匀，在4℃冰浴条件下进行超声波处理，超声波处理功率为350W，脉冲工作方式为超声2s，间歇2s，超声时间为40分钟，然后将溶液以每分钟3000转的转速离心10分钟，取上清液，得到锁阳多糖粗提液；
步骤二、双水相萃取：向步骤一制备的锁阳多糖粗提液中加入15g固体磷酸氢二钾粉末，待磷酸氢二钾溶解后，室温静置60分钟后，将溶液以每分钟2000转的转速离心20分钟，形成双水相体系，上相为氯化胆碱-甘油低共熔溶剂相，下相为含多糖的磷酸氢二钾相。
步骤三、回收氯化胆碱-甘油低共熔溶剂和多糖：取步骤二所制备的双水相萃取后上相，经冷冻干燥至恒重的粘性液体状态，得到氯化胆碱-甘油低共熔溶剂，回收氯化胆碱-甘油低共熔溶剂；取下相，经透析除磷酸氢二钾，所用透析袋分子截留量为8000Da，冷冻干燥得到锁阳多糖。
所述氯化胆碱-甘油低共熔溶剂的制备方法为：氯化胆碱与甘油按照摩尔比为1：1的比例混合，常压，温度为80-100℃搅拌加热1-3h至透明无色溶液，冷却至室温即可得到氯化胆碱-甘油低共熔溶剂；氯化胆碱-甘油低共熔溶剂中氯化胆碱与甘油之间以氢键连接，能够提高多糖得率。
本实施例所得锁阳多糖得率为17.81%±2.01%，锁阳多糖含量为86.70%±1.41%。
实施例3
一种低共熔溶剂/盐双水相萃取分离锁阳多糖的方法，本方法所用锁阳原材料为甘肃产的经过除脂自然晾晒干燥后的锁阳粉末，它包括以下步骤：
步骤一、锁阳多糖粗提液的制备：取1g锁阳粉末，加入含水量的体积百分比为45%氯化胆碱-琥珀酸低共熔溶剂30mL，充分混匀，在4℃冰浴条件下进行超声波处理，超声波处理功率为400W，脉冲工作方式为超声2s，间歇2s，超声时间为50分钟，然后将溶液以每分钟3000转的转速离心10分钟，取上清液，得到锁阳多糖粗提液；
步骤二、双水相萃取：向步骤一制备的锁阳多糖粗提液中加入10g固体磷酸氢二钾粉末，待磷酸氢二钾溶解后，室温静置90分钟后，将溶液以每分钟3000转的转速离心15分钟，形成双水相体系，上相为氯化胆碱-琥珀酸低共熔溶剂相，下相为含多糖的磷酸氢二钾相。
步骤三、回收氯化胆碱-琥珀酸低共熔溶剂和多糖：取步骤二所制备的双水相萃取后上相，经冷冻干燥至恒重的粘性液体状态，得到氯化胆碱-琥珀酸低共熔溶剂，回收氯化胆碱-琥珀酸低共熔溶剂；取下相，经透析除磷酸氢二钾，所用透析袋分子截留量为10000Da，冷冻干燥得到锁阳多糖。
所述氯化胆碱-琥珀酸低共熔溶剂的制备方法为：氯化胆碱与琥珀酸按照摩尔比为1：3的比例混合，常压，温度为80-100℃搅拌加热1-3h至透明无色溶液，冷却至室温即可得到氯化胆碱-琥珀酸低共熔溶剂；氯化胆碱-琥珀酸低共熔溶剂中氯化胆碱与琥珀酸之间以氢键连接，能够提高多糖得率。
本实施例所制备的锁阳多糖得率为19.12%±2.04%，锁阳多糖含量为87.18%±1.86%。
实施例4
一种低共熔溶剂/盐双水相萃取分离锁阳多糖的方法，本方法所用锁阳原材料为甘肃产的经过除脂自然晾晒干燥后的锁阳粉末，它包括以下步骤：
步骤一、锁阳多糖粗提液的制备：取1g锁阳粉末，加入含水量的体积百分比为40%氯化胆碱-酒石酸低共熔溶剂40mL，充分混匀，在4℃冰浴条件下进行超声波处理，超声波处理功率为200W，脉冲工作方式为超声2s，间歇2s，超声时间为50分钟，然后将溶液以每分钟4000转的转速离心10分钟，取上清液，得到锁阳多糖粗提液；
步骤二、双水相萃取：向步骤一制备的锁阳多糖粗提液中加入20g固体磷酸氢二钾粉末，待磷酸氢二钾溶解后，室温静置100分钟后，将溶液以每分钟3000转的转速离心15分钟，形成双水相体系，上相为氯化胆碱-酒石酸低共熔溶剂相，下相为含多糖的磷酸氢二钾相。
步骤三、回收氯化胆碱-酒石酸低共熔溶剂和多糖：取步骤二所制备的双水相萃取后上相，经冷冻干燥至恒重的粘性液体状态，得到氯化胆碱-酒石酸低共熔溶剂，回收氯化胆碱-酒石酸低共熔溶剂；取下相，经透析除磷酸氢二钾，所用透析袋分子截留量为9000Da，冷冻干燥得到锁阳多糖。
所述氯化胆碱-酒石酸低共熔溶剂的制备方法为：氯化胆碱与酒石酸按照摩尔比为1：2的比例混合，常压，温度为80-100℃搅拌加热1-3h至透明无色溶液，冷却至室温即可得到氯化胆碱-酒石酸低共熔溶剂；氯化胆碱-酒石酸低共熔溶剂中氯化胆碱与酒石酸之间以氢键连接，能够提高多糖得率。
本实施例所制备的锁阳多糖得率为18.94%±1.39%，锁阳多糖含量为88.90%±1.62%。
Claims (3)
1.一种低共熔溶剂/盐双水相萃取分离锁阳多糖的方法，本方法所用锁阳原材料为甘肃产的经过除脂自然晾晒干燥后的锁阳粉末，其特征在于：它包括以下步骤：
步骤一、锁阳多糖粗提液的制备：在锁阳粉末中加入含水量的体积百分比为(30-50)%低共熔溶剂，锁阳粉末与低共熔溶剂质量体积比为1:(20-40)(m/V)，充分混匀，在0-4℃冰浴条件下进行超声波处理，超声波的功率为200-400W，脉冲工作方式为超声2s，间歇2s，超声时间为30-50，然后进行离心5-10分钟，离心转速为每分钟2000-4000转，取上清液，得到锁阳多糖粗提液；
步骤二、双水相萃取：在步骤一制备的锁阳多糖粗提液中加入磷酸氢二钾充分混匀，磷酸氢二钾和锁阳多糖粗提液的质量体积比为(3-6):10(m/V)，待磷酸氢二钾完全溶解后，静置60-100分钟，再将溶液离心10-20分钟，离心转速为每分钟2000-4000转，形成双水相萃取体系；
步骤三、回收低共熔溶剂和多糖：取步骤二所制备的双水相萃取后的上相，经冷冻干燥至恒重的粘性液体状态，得到低共熔溶剂，回收低共熔溶剂；取下相，经透析除磷酸氢二钾，所用透析袋分子截留量为8000-12000Da，冷冻干燥得到锁阳多糖。
2.根据权利要求1所述的一种低共熔溶剂/盐双水相萃取分离锁阳多糖的方法，其特征在于：所述低共熔溶剂的制备方法为：季铵盐与氢键供体按照摩尔比为1:（1-3）的比例混合，常压，温度为80-100℃搅拌加热1-3h至透明无色溶液，冷却至室温即可得到低共熔溶剂；低共熔溶剂中季铵盐与氢键供体之间以氢键连接，能够提高多糖得率。
3.根据权利要求2所述的一种低共熔溶剂/盐双水相萃取分离锁阳多糖的方法，其特征在于：所述季铵盐为氯化胆碱，氢键供体为乳酸、甘油、苹果酸、琥珀酸或酒石酸中的一种。
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