CN108676102A - 一种采用氯化胆碱和丙三醇制作的深度共熔溶剂提取辣木籽多糖的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了采用氯化胆碱和丙三醇制作的深度共熔溶剂提取辣木籽多糖的方法，包括深度共熔溶剂的制备，辣木籽的预处理，辣木籽多糖的提取，辣木籽多糖的粗纯化，总多糖含量的测定，蛋白含量的测定，DEAE‑52柱层析纯化得到多糖样品。本发明具有可操作性强，工艺简便，成本低，易获取，总多糖的提取率高等优点。同时，深度共熔溶剂制作简单，起始物质可再生、可降解，广泛存在于自然界。
Description
技术领域
本发明涉及一种辣木籽多糖制备方法，具体涉及一种由氯化胆碱和丙三醇制作的深度共熔溶剂提取辣木籽多糖的方法，属于高效生物质资源提取技术领域。
背景技术
辣木(Moringa oleifera)又名鼓槌树、洋椿树，属百花菜目辣木科，因其根茎有辛辣味，故得名辣木。它是一种多年生热带乔木，主要分布于印度、非洲、南美以及东南亚国家，在我国主要分布于台湾、广东、云南等地区。辣木籽中含有许多营养成分和活性物质，且具有多种生理活性，在保健品和医药行业具有广泛的用途及开发前景。
多糖是一种高分子的聚合物，由成千上万个单糖通过糖苷键连接而成。多糖广泛分布于自然界，植物、动物、微生物体内均有存在。天然多糖可用于临床试验，如抗糖尿病、抗肿瘤、降血脂等病症的治疗或者作为抗炎、抗病毒的药物，多糖对于维持人体正常运行具有重要的作用。辣木籽多糖为天然产物，无毒无害，具有很高的研究价值。
深度共熔溶剂(Deep Eutectic Solvents,DES)是一种由氢键受体和氢键供体形成的分子复合物，是一种盐溶液。氢键受体将两种化合物通常采用季铵盐，如便宜可得、易降解、无毒的氯化胆碱，而氢键受体则可选择尿素、乙二醇、丙三醇、草酸等。在将两种化合物混合过程中由于阴离子和氢键供体之间形成的氢键引发电荷的离域，导致深度共熔溶剂的熔点低于各组分化合物的熔点。例如常温下将氯化胆碱和尿素以1：2的摩尔比混合，所得的深度共熔溶剂的熔点大约为12℃，而氯化胆碱的熔点为302-305℃，尿素的熔点为132.7℃，远远低于各个组份的熔点。深度共熔溶剂相较于其他离子液体具有价格低廉，容易获取等优点。
运用深度共熔溶剂提取辣木籽多糖比传统的提取方法提取效率更高且操作方便，能够更大限度的获得辣木籽多糖，提高辣木籽的利用率。
发明内容
本发明的目的是提供一种采用氯化胆碱和丙三醇制作的深度共熔溶剂提取辣木籽多糖的方法，该提取方法提取率高，成本低，能耗低，环保，操作简单，制备的多糖经过纯化，纯度提高，是一种优良的提取方法。原技术方案如下：
一种采用氯化胆碱和丙三醇制作的深度共熔溶剂提取辣木籽多糖的方法，其特征包括以下步骤：
(1)深度共熔溶剂的制备：将置于真空干燥箱中干燥后的氯化胆碱和丙三醇以1:2的摩尔比混合，室温研磨直至得到均一稳定的液体，即深度共熔溶剂；
(2)原材料的处理：选取完好的辣木籽，去壳，50-70℃条件下干燥2-3d 后粉碎过60目筛，得到辣木籽细粉；
(3)辣木籽多糖的提取：准确称取10g步骤(2)辣木籽细粉与100mL 步骤(1)深度共熔溶剂混合，置于50-70℃恒温水浴锅、240r/min转速下磁子搅拌20-40min，混合物使用高速冷冻离心机12000r/min下离心10-15min分离固体颗粒，取上清液备用；
(4)辣木籽多糖的脱蛋白：取步骤(3)制得的上清液置于冰水中加入 3％-5％TCA搅拌10-15min后4℃冰箱静置4-5h，NaOH调pH至中性，重复操作2次得到除去蛋白质的辣木籽多糖上清液；
(5)辣木籽多糖醇沉：取步骤(4)制得的除蛋白的辣木籽多糖上清液加入4倍体积85％的乙醇，4℃下静置过夜，取上清液；
(6)浓缩干燥：收集步骤(5)制得的上清液真空浓缩至原来的1/5-1/7，浓缩液冷冻干燥12-24h得到辣木籽粗多糖；
(7)总多糖含量的测定：对步骤(6)制得的辣木籽粗多糖采用考马斯亮蓝法测定；
(8)蛋白含量的测定：再对步骤(7)的辣木籽粗多糖采用苯酚-硫酸法测定；
(9)DEAE-52柱层析纯化：将步骤(8)的辣木籽粗多糖配置成10mg/mL 的溶液过DEAE-52柱，用0-0.5mol/L NaCl溶液进行洗脱，收集洗脱液进行浓缩干燥，即得到辣木籽多糖。
本发明相对于现有技术的有益效果是：
本发明采用深度共熔溶剂提取辣木籽多糖，大大提高了辣木籽中多糖的提取率；且提取剂容易制作，原材料价格低，对环境友好，制作方法简便。通过柱层析提高了多糖的纯度；通过冷冻干燥极大保存了多糖的生物活性。
具体实施方式
下面通过实例对本发明做进一步详细说明，这些实例仅用来说明本发明，并不限制本发明的范围。
实施例1
一种采用氯化胆碱和丙三醇制作的深度共熔溶剂提取辣木籽多糖的方法，包括以下步骤：
(1)深度共熔溶剂的制备：将置于真空干燥箱中干燥后的氯化胆碱和丙三醇以1:2的摩尔比混合，室温研磨直至得到均一稳定的液体，即深度共熔溶剂；
(2)原材料的处理：选取完好的辣木籽，去壳，50℃条件下干燥3d后粉碎过60目筛，得到辣木籽细粉；
(3)辣木籽多糖的提取：准确称取10g步骤(2)辣木籽细粉与100mL 步骤(1)深度共熔溶剂混合，置于55℃恒温水浴锅、240r/min转速下磁子搅拌30min，混合物使用高速冷冻离心机12000r/min下离心15min分离固体颗粒，取上清液备用；
(4)辣木籽多糖的脱蛋白：取步骤(3)制得的上清液置于冰水中加入 5％TCA搅拌10min后4℃冰箱静置4h，NaOH调pH至中性，重复操作2次得到除去蛋白质的辣木籽多糖上清液；
(5)辣木籽多糖醇沉：取步骤(4)制得的除蛋白的辣木籽多糖上清液加入4倍体积85％的乙醇，4℃下静置过夜，取上清液；
(6)浓缩干燥：收集步骤(5)制得的上清液真空浓缩至原来的1/5，浓缩液冷冻干燥20h得到辣木籽粗多糖；
(7)总多糖含量的测定：对步骤(6)制得的辣木籽粗多糖采用考马斯亮蓝法测定；
(8)蛋白含量的测定：再对步骤(7)的辣木籽粗多糖采用苯酚-硫酸法测定；
(9)DEAE-52柱层析纯化：将步骤(8)的辣木籽粗多糖配置成10mg/mL 的溶液过DEAE-52柱，用0-0.5mol/L NaCl溶液进行洗脱，收集洗脱液进行浓缩干燥，即得到辣木籽多糖。
实施例2
一种采用氯化胆碱和丙三醇制作的深度共熔溶剂提取辣木籽多糖的方法，包括以下步骤：
(1)深度共熔溶剂的制备：将置于真空干燥箱中干燥后的氯化胆碱和丙三醇以1:2的摩尔比混合，室温研磨直至得到均一稳定的液体，即深度共熔溶剂；
(2)原材料的处理：选取完好的辣木籽，去壳，60℃条件下干燥3d后粉碎过60目筛，得到辣木籽细粉；
(3)辣木籽多糖的提取：准确称取10g步骤(2)辣木籽细粉与100mL 步骤(1)深度共熔溶剂混合，置于60℃恒温水浴锅、240r/min转速下磁子搅拌40min，混合物使用高速冷冻离心机12000r/min下离心10min分离固体颗粒，取上清液备用；
(4)辣木籽多糖的脱蛋白：取步骤(3)制得的上清液置于冰水中加入 5％TCA搅拌10min后4℃冰箱静置4h，NaOH调pH至中性，重复操作2次得到除去蛋白质的辣木籽多糖上清液；
(5)辣木籽多糖醇沉：取步骤(4)制得的除蛋白的辣木籽多糖上清液加入4倍体积85％的乙醇，4℃下静置过夜，取上清液；
(6)浓缩干燥：收集步骤(5)制得的上清液真空浓缩至原来的1/5，浓缩液冷冻干燥18h得到辣木籽粗多糖；
(7)总多糖含量的测定：对步骤(6)制得的辣木籽粗多糖采用考马斯亮蓝法测定；
(8)蛋白含量的测定：再对步骤(7)的辣木籽粗多糖采用苯酚-硫酸法测定；
(9)DEAE-52柱层析纯化：将步骤(8)的辣木籽粗多糖配置成10mg/mL 的溶液过DEAE-52柱，用0-0.5mol/L NaCl溶液进行洗脱，收集洗脱液进行浓缩干燥，即得到辣木籽多糖。
实施例3
一种采用氯化胆碱和丙三醇制作的深度共熔溶剂提取辣木籽多糖的方法，包括以下步骤：
(1)深度共熔溶剂的制备：将置于真空干燥箱中干燥后的氯化胆碱和丙三醇以1:2的摩尔比混合，室温研磨直至得到均一稳定的液体，即深度共熔溶剂；
(2)原材料的处理：选取完好的辣木籽，去壳，70℃条件下干燥2d后粉碎过60目筛，得到辣木籽细粉；
(3)辣木籽多糖的提取：准确称取10g步骤(2)辣木籽细粉与100mL 步骤(1)深度共熔溶剂混合，置于70℃恒温水浴锅、240r/min转速下磁子搅拌20min，混合物使用高速冷冻离心机12000r/min下离心15min分离固体颗粒，取上清液备用；
(4)辣木籽多糖的脱蛋白：取步骤(3)制得的上清液置于冰水中加入 5％TCA搅拌12min后4℃冰箱静置4h，NaOH调pH至中性，重复操作2次得到除去蛋白质的辣木籽多糖上清液；
(5)辣木籽多糖醇沉：取步骤(4)制得的除蛋白的辣木籽多糖上清液加入4倍体积85％的乙醇，4℃下静置过夜，取上清液；
(6)浓缩干燥：收集步骤(5)制得的上清液真空浓缩至原来的1/5，浓缩液冷冻干燥24h得到辣木籽粗多糖；
(7)总多糖含量的测定：对步骤(6)制得的辣木籽粗多糖采用考马斯亮蓝法测定；
(8)蛋白含量的测定：再对步骤(7)的辣木籽粗多糖采用苯酚-硫酸法测定；
(9)DEAE-52柱层析纯化：将步骤(8)的辣木籽粗多糖配置成10mg/mL 的溶液过DEAE-52柱，用0-0.5mol/L NaCl溶液进行洗脱，收集洗脱液进行浓缩干燥，即得到辣木籽多糖。
Claims (1)
1.一种采用氯化胆碱和丙三醇制作的深度共熔溶剂提取辣木籽多糖的方法，其特征包括以下步骤：
(1)深度共熔溶剂的制备：将置于真空干燥箱中干燥后的氯化胆碱和丙三醇以1:2的摩尔比混合，室温研磨直至得到均一稳定的液体，即深度共熔溶剂；
(2)原材料的处理：选取完好的辣木籽，去壳，50-70℃条件下干燥2-3d后粉碎过60目筛，得到辣木籽细粉；
(3)辣木籽多糖的提取：准确称取10g步骤(2)辣木籽细粉与100mL步骤(1)深度共熔溶剂混合，置于50-70℃恒温水浴锅、240r/min转速下磁子搅拌20-40min，混合物使用高速冷冻离心机12000r/min下离心10-15min分离固体颗粒，取上清液备用；
(4)辣木籽多糖的脱蛋白：取步骤(3)制得的上清液置于冰水中加入3％-5％TCA搅拌10-15min后4℃冰箱静置4-5h，NaOH调pH至中性，重复操作2次得到除去蛋白质的辣木籽多糖上清液；
(5)辣木籽多糖醇沉：取步骤(4)制得的除蛋白的辣木籽多糖上清液加入4倍体积85％的乙醇，4℃下静置过夜，取上清液；
(6)浓缩干燥：收集步骤(5)制得的上清液真空浓缩至原来的1/5-1/7，浓缩液冷冻干燥12-24h得到辣木籽粗多糖；
(7)总多糖含量的测定：对步骤(6)制得的辣木籽粗多糖采用考马斯亮蓝法测定；
(8)蛋白含量的测定：再对步骤(7)的辣木籽粗多糖采用苯酚-硫酸法测定；
(9)DEAE-52柱层析纯化：将步骤(8)的辣木籽粗多糖配置成10mg/mL的溶液过DEAE-52柱，用0-0.5mol/L NaCl溶液进行洗脱，收集洗脱液进行浓缩干燥，即得到辣木籽多糖。
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