CN109293791B - 紫丁香蘑水溶性多糖及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种紫丁香蘑水溶性多糖的制备方法，该方法针对紫丁香蘑水溶性多糖的提取纯化，采用水提醇沉法在特定的工艺条件下初步提取粗多糖，并采用易于工业化的大孔吸附树脂层析法进行脱色纯化，获得高纯度的紫丁香蘑水溶性多糖。该方法具有操作简单、操作条件温和、能耗低、安全性高、不破坏多糖成分、多糖的得率高等特点。并且制备所得为两种新结构的紫丁香蘑水溶性多糖，从而进一步提高紫丁香蘑的利用价值，为紫丁香蘑多糖的开发应用奠定了生产基础。

Description

紫丁香蘑水溶性多糖及其制备方法与应用
技术领域
本发明属于生物提取技术，特别是涉及一种紫丁香蘑水溶性多糖及其制备方法与应用。
背景技术
紫丁香蘑(Lepista nuda)，又名裸口蘑、紫晶蘑，属担子菌纲、伞菌目口蘑科、香蘑属真菌，以群生为主，菌盖大小不一，直径1～9cm，中部稍凹或呈波浪起伏，边缘呈小锯齿状，菌柄呈圆柱状，根部有絮状粉末，整体上呈现肉桂色，菌肉白色而细嫩，光滑干燥，主要分布于亚洲、北美、欧洲、和澳大利亚等地区，中国主要分布于云南、西藏、黑龙江、青海、甘肃、山西、福建等地。紫丁香蘑以群生为主，形态美观，伞肉鲜嫩甜美，口感上佳，有浓郁独特的菇香，子实体中含有大量营养元素，具有较高的营养价值和药用价值。
目前，未见报道有关紫丁香蘑多糖制备方法的专利，国内外对紫丁香蘑的研究主要还集中在菌丝生物学特性、食药用价值、化学成分、驯化栽培等方面。如Ouzouni等研究得到，每100g紫丁香蘑中含有干物质8.65g，有机物6.14～90g，蛋白质1.71～19.83g，氨基酸0.56～6.01g，矿物质元素Ca 8.8mg、K 21.2mg、Na 0.62mg，糖类主要是葡萄糖、果糖、海藻糖、甘露醇、阿拉伯糖，其中海藻糖含量最高，约为2.24％(PK Ouzouni，KARiganakos.Nutritional value and metal content profile of Greek wild ediblefungi.Acta Alimentaria，2007，36(1)：99-110)。Lee等而利用微波辅助法和回流法获得的乙醇提取物中，多酚含量分别高达11.84±0.17mg/g和12.06±0.12mg/g(Lee Y S，Joo EY，Kim N W.Polyphenol contents and antioxidant activity of Lepistanuda.Journal of the Korean Society of Food Science&Nutrition，2006，35(10)：1309-1314)。Dulger等通过60％的甲醇提取紫丁香蘑多糖具有抗菌活性(B.Dulger，C.Ergul，F.Gucin.Antimicrobial activity of the macrofungus Lepistanuda.Fitoterapia，2002，73(7)：695-697)。Yama等通过氯仿提取紫丁香蘑多糖，对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、鼠伤寒沙门氏菌、白色念珠菌、表皮葡萄球菌、枯草芽孢杆菌和酿酒酵母有抗菌活性(
Figure BDA0001797456080000011
M，Bilgili F.Antimicrobial activities of fruit bodies and/or mycelial cultures of some mushroom isolates.Pharmaceutical Biology，2008，44(9)：1668-1670)。Lee等发现乙醇提取紫丁香蘑多糖的抗氧化活性随浓度的增加而增强，随着pH值的升高而降低(Lee Y S，Joo P E Y，Shin S R，et al.Study on the antioxidantactivity of the extracts from the Lepista nuda.Journal of the Korean Societyof Food Science&Nutrition，2005，34(7)：942-947)。
目前为止，研究过的真菌种类较多，但紫丁香蘑的研究甚少，上述相关报道与研究均是对紫丁香蘑进行初步提取，所得的紫丁香蘑多糖的纯度较低，且均为粗多糖，并没有进行进一步的分离纯化，实验室的研究结果更关注小试条件下的功能研究，对于大规模生产操作以及完整的紫丁香蘑水溶性粗多糖提取制备工艺并未报道。由于紫丁香蘑多糖有极高的营养价值、功效和商用价值，而国内外还没有人系统的研究紫丁香蘑多糖提取制备，因此，紫丁香蘑多糖的制备工艺亟待人们去探索发现。
发明内容
发明目的：针对上述技术问题，本发明提供了一种设备简单、操作方便、成本低廉、可工业连续化生产、无环境污染的紫丁香蘑水溶性多糖的制备方法，并进一步提供了由此获得的两种新结构的紫丁香蘑水溶性多糖。
技术方案：本发明所述的紫丁香蘑水溶性多糖的制备方法，包括如下步骤：
(1)取紫丁香蘑子实体鲜品清洗干净，干燥后粉碎备用；
(2)热水浸提步骤(1)粉碎后的紫丁香蘑子实体，浸提后离心，收集上层清液，下层沉淀再加水重提，重复1～4次；
(3)合并步骤(2)收集的上层清液，旋蒸浓缩后加入乙醇，静置沉淀；
(4)过滤步骤(3)沉淀后的溶液，回收乙醇循环利用，得到的沉淀用无水乙醇、丙酮、无水乙醚依次洗涤1～4次，然后抽真空冷冻干燥，获得紫丁香蘑水溶性多糖粗提物；
(5)将步骤(4)所得紫丁香蘑水溶性多糖粗提物加水溶解，然后过大孔树脂脱色除杂；
(6)将经由步骤(5)脱色除杂后的溶液，采用离子交换柱和凝胶柱层析纯化，得到两种高纯度的紫丁香蘑水溶性多糖。
其中，步骤(1)中，干燥后粉碎备用是指在40～80℃干燥3～24h，粉粹至100～400目颗粒。
步骤(2)中，热水浸提时，紫丁香蘑与水的重量比1∶10～60，浸提温度75～95℃，浸提时间1～4h；离心所得下层沉淀再加入等量水重提。
优选的，步骤(2)中，在紫丁香蘑与水的重量比1∶35、提取温度94℃、提取时间3.6h的条件下提取3次，得到的多糖提取率最大，为5.49％。
步骤(2)中，离心采用离心机离心力为1000～5000×g，离心时间5～30min。
步骤(3)中，步骤(3)中，旋蒸浓缩是指在45～60℃旋转蒸发浓缩至原总体积的1/5～1/3。
进一步的，步骤(3)中，加入乙醇静置沉淀是指向浓缩液中加入2～5倍体积的乙醇，静置沉淀6～15h。
步骤(4)中，冷冻干燥温度为-60～-30℃，干燥时间为24～56h。
优选的，步骤(5)中，所述大孔树脂为AB-8、D101、HPD100、D301、D941或D900。其中，最优选为D301。
步骤(5)中，所述大孔树脂脱色除杂时，静态脱色条件为：粗提物与树脂用量比1∶50～150，摇床转速60～180rpm，脱色时间0.5～2.5h，脱色温度30～50℃；动态脱色流速0.1～0.8BV/h，上样量0.1～1.0BV。
优选的，步骤(5)中，所述大孔树脂脱色除杂时，静态脱色条件为：多糖与树脂用量比1∶125，摇床转速120rpm，脱色时间1.5h，脱色温度50℃，能够达到最大多糖保留率和脱色率，分别为79.02％和86.29％；动态脱色流速0.46BV/h，多糖保留率和脱色率分别为71.21％和81.07％，上样量0.92BV，多糖保留率和脱色率分别为72.33％和80.81％。
步骤(6)中，离子交换柱纯化时，上样浓度10.0～20.0mg/mL，依次采用去离子水以及0.1mol/L、0.3mol/L、0.5mol/L浓度梯度的NaCl洗脱，洗脱流速为0.1～1.0BV/h；凝胶柱纯化时，上样浓度5.0～15.0mg/mL，依次采用去离子水以及0.1mol/L、0.3mol/L、0.5mol/L浓度梯度的NaCl洗脱，洗脱流速为0.1～1.0BV/h。
优选的，步骤(6)中，离子交换柱纯化时，上样浓度优选15.0mg/mL，依次采用去离子水、0.1、0.3、0.5mol/L浓度梯度的NaCl洗脱，洗脱流速优选0.27BV/h。步骤(6)中的凝胶柱纯化时，上样浓度优选10.0mg/mL，洗脱流速优选0.32BV/h。
进一步的，步骤(6)中，所述离子交换柱为DEAE-52，所述凝胶柱为SephadexG-150。
上述制备过程中洗涤和纯化产生的废液，进行回收而环保处理。
根据上述制备方法得到的两种高纯度紫丁香蘑水溶性多糖也在本发明的保护范围内。
其中一种紫丁香蘑水溶性多糖，由6个单糖组成，含有α构型和β构型，发生C6取代，存在1→6糖苷键，主要是β-1，6-吡喃型糖类；其中，单糖组成摩尔比为甘露糖∶葡萄糖∶半乳糖∶木糖∶阿拉伯糖∶岩藻糖＝19.0∶33.5∶18.0∶4.6∶21.0∶3.9。
另一种紫丁香蘑水溶性多糖，由5个单糖组成，同样含有1→6糖苷键，存在α构型和β构型，以β-1，6-吡喃型糖类为主；其中，单糖组成摩尔比为甘露糖∶葡萄糖∶半乳糖∶阿拉伯糖∶岩藻糖＝23.5∶11.4∶34.2∶21.4∶9.5。
本发明制备所得紫丁香蘑水溶性多糖在制备抗菌、抗氧化药物中的应用也在本发明的保护范围内。
综合可见，本发明针对紫丁香蘑水溶性多糖的提取纯化，采用水提醇沉法在特定的工艺条件下初步提取粗多糖，并采用易于工业化的大孔吸附树脂层析法进行脱色纯化，获得高纯度的紫丁香蘑水溶性多糖(纯度高达87.71％)，使紫丁香蘑成为多糖新的食用菌来源，提高紫丁香蘑的利用价值，为紫丁香蘑多糖的开发应用奠定了生产基础。
有益效果：本发明所述制备方法采用水提醇沉法和大孔树脂层析法，操作简单、条件温和、效率高、能耗低、安全性高，且不破坏紫丁香蘑多糖自身的活性；制备工艺中的溶剂只需要水和乙醇，无污染环境的废液废渣产生，且水、乙醇以及脱色纯化过程中的大孔树脂均可循环反复利用，绿色环保；可实现连续化操作，设备简单、成本少、投资小。制备得到两个不同组分的紫丁香蘑水溶性多糖，并且纯度高，最高可达87.71％，且为新型结构的多糖分子，进一步为紫丁香蘑水溶性多糖的应用研究提供了依据。
附图说明
图1为紫丁香蘑水溶性多糖制备工艺流程图；
图2为两个紫丁香蘑水溶性多糖液相色谱图(a.单糖标准样品的HPLC色谱图；b.第一个组分紫丁香蘑水溶性多糖的HPLC色谱图；c.第二个组分紫丁香蘑水溶性多糖的HPLC色谱图；1-甘露糖；2-核糖；3-鼠李糖；4-葡萄糖醛酸；5-半乳糖醛酸；6-葡萄糖；7-半乳糖；8-木糖；9-阿拉伯糖；10-岩藻糖)；
图3为两个紫丁香蘑水溶性多糖的紫外光谱图(a.第一个组分紫丁香蘑水溶性多糖的紫外光谱图；b.第二个组分紫丁香蘑水溶性多糖的紫外光谱图)；
图4为两个紫丁香蘑水溶性多糖的红外光谱图(a.第一个组分紫丁香蘑水溶性多糖的红外光谱图；b.第二个组分紫丁香蘑水溶性多糖的红外光谱图)；
图5为两个紫丁香蘑水溶性多糖的电镜扫描图(a.第一个组分紫丁香蘑水溶性多糖的电镜扫描图；b.第二个组分紫丁香蘑水溶性多糖的电镜扫描图)；
图6为两个紫丁香蘑水溶性多糖的核磁共振谱(a.第一个组分紫丁香蘑水溶性多糖的1H NMR谱；b.第一个组分紫丁香蘑水溶性多糖的13C NMR；c.第二个组分紫丁香蘑水溶性多糖的1H NMR谱；d.第二个组分紫丁香蘑水溶性多糖的13C NMR)。
具体实施方式
下面对本发明作出详细说明。
原料来源：紫丁香蘑，鲜品直接采购云南大理原产紫丁香蘑。
其中，DEAE-52离子交换柱和SephadexG-150凝胶柱均购自：索莱宝科技有限公司，根据说明书进行预处理。
实施例1
紫丁香蘑水溶性多糖的制备方法，流程图如图1，具体包括如下步骤：
1、将1000g云南大理原产紫丁香蘑清洗干净，80℃干燥15h，粉粹至250目颗粒；
2、加入40000g水，加热至90℃，浸提3h后过滤得到滤液，滤渣相同条件下继续浸提，重复提取3次，合并滤液；
3、滤液在50℃下旋转蒸发浓缩至原总体积的1/5，向浓缩液中加入4倍体积的乙醇，静置沉淀10h；
4、过滤沉淀后的溶液，回收乙醇循环利用，得到的沉淀用无水乙醇、丙酮、无水乙醚依次顺序洗涤三次，抽真空冷冻干燥，获得紫丁香蘑水溶性多糖粗提物53.6g；
5、将紫丁香蘑水溶性多糖粗提物溶解，选取D301大孔树脂对溶液进行脱色，静态脱色条件树脂用量6700g，摇床转速120rpm，脱色时间1.5h，脱色温度50℃，动态脱色流速0.46BV/h，同时除去粗多糖中含有的蛋白质；
6、脱色后的溶液经DEAE纤维素-52离子交换柱和SephadexG-150葡萄糖凝胶柱层析纯化，其中，DEAE纤维素-52离子交换柱纯化时，上样浓度15.0mg/mL，去离子水、0.1、0.3、0.5mol/L浓度梯度的NaCl洗脱，洗脱流速为0.27BV/h；SephadexG-150葡萄糖凝胶柱纯化时，上样浓度10.0mg/mL，洗脱流速为0.32BV/h；
7、回收循环利用水、乙醇和大孔树脂，洗涤和纯化过程中产生的废液，进行回收环保处理。
结果检测：
经过检测根据上述制备方法得到两个组分的紫丁香蘑水溶性多糖，纯度分别为87.71％和81.21％。
两个组分紫丁香蘑水溶性多糖经表征结构鉴定：
经高效液相色谱分析，两种多糖的分子量分别为11703Da和13369Da，两种多糖的单糖组成摩尔比分别为甘露糖∶葡萄糖∶半乳糖∶木糖∶阿拉伯糖∶岩藻糖＝19.0∶33.5∶18.0∶4.6∶21.0∶3.9和甘露糖∶葡萄糖∶半乳糖∶阿拉伯糖∶岩藻糖＝23.5∶11.4∶34.2∶21.4∶9.5(图2)。
两种多糖通过紫外扫描光谱分析在260nm和280am处均没有吸收峰，不含蛋白质和核酸(图3)。
两种多糖经红外光谱扫描，在4000～400cm-1波数范围内有多糖典型吸收峰，且具有羧基和硫酸基基团吸引峰，是一种酸性多糖(图4)。
两种多糖经扫描电镜观察，第一种多糖呈片层堆积，表面光滑，第二种多糖表面粗糙，呈现纤维状，均体现分子间相互排斥，而吸引力较小(图5)。
两种多糖经核磁分析，第一种多糖由6个单糖组成(与其液相色谱图相吻合)，含有α构型和β构型，发生C6取代，存在1→6糖苷键，主要是β-1，6-吡喃型糖类；第二种多糖由5个单糖组成(与其液相色谱图相吻合)，同样含有1→6糖苷键，存在α构型和β构型，以β-1，6-吡喃型糖类为主(图6)。
实施例2
1、将1000g云南大理原产紫丁香蘑清洗干净，40℃干燥20h，粉粹至300目颗粒；
2、加入30000g水，加热至95℃，浸提2h后过滤得到滤液，滤渣相同条件下继续浸提，重复提取3次，合并滤液；
3、滤液在50℃下旋转蒸发浓缩至原总体积的1/4，向浓缩液中加入3倍体积的乙醇，静置沉淀10h；
4、过滤沉淀后的溶液，回收乙醇循环利用，得到的沉淀用无水乙醇、丙酮、无水乙醚依次顺序洗涤三次，抽真空冷冻干燥，获得紫丁香蘑水溶性多糖粗提物48.1g。
5、将紫丁香蘑水溶性多糖粗提物溶解，选取D101大孔树脂对溶液进行脱色，静态脱色条件树脂用量4800g，摇床转速100rpm，脱色时间1h，脱色温度40℃，动态脱色流速0.6BV/h，同时除去粗多糖中含有的蛋白质；
6、脱色后的溶液经DEAE纤维素-52离子交换柱和SephadexG-150葡萄糖凝胶柱层析纯化，得到两个组分紫丁香蘑水溶性多糖，纯度分别为82.29％和77.46％。其中，DEAE纤维素-52离子交换柱纯化时，上样浓度18mg/mL，去离子水、0.1、0.3、0.5mol/L浓度梯度的NaCl洗脱，洗脱流速为0.32BV/h。步骤(6)中的SephadexG-150葡萄糖凝胶柱纯化时，上样浓度12.0mg/mL，洗脱流速为0.40BV/h。
7、回收循环利用水、乙醇和大孔树脂，洗涤和纯化过程中产生的废液，进行回收环保处理。
实施例3
1、将1000g云南大理原产紫丁香蘑清洗干净，60℃干燥6h，粉粹至200目颗粒；
2、加入50000g水，加热至85℃，浸提4h后过滤得到滤液，滤渣相同条件下继续浸提，重复提取3次，合并滤液；
3、滤液在50℃下旋转蒸发浓缩至原总体积的1/3，向浓缩液中加入3倍体积的乙醇，静置沉淀10h；
4、过滤沉淀后的溶液，回收乙醇循环利用，得到的沉淀用无水乙醇、丙酮、无水乙醚依次顺序洗涤三次，抽真空冷冻干燥，获得紫丁香蘑水溶性多糖粗提物50.6g。
5、将紫丁香蘑水溶性多糖粗提物溶解，选取AB-8大孔树脂对溶液进行脱色，静态脱色条件树脂用量6000g，摇床转速80rpm，脱色时间2h，脱色温度45℃，动态脱色流速0.8BV/h，同时除去粗多糖中含有的蛋白质；
6、脱色后的溶液经DEAE纤维素-52离子交换柱和SephadexG-150葡萄糖凝胶柱层析纯化，得到两个组分紫丁香蘑水溶性多糖，纯度分别为84.25％和76.13％。其中DEAE纤维素-52离子交换柱纯化时，上样浓度12.0mg/mL，去离子水、0.1、0.3、0.5mol/L浓度梯度的NaCl洗脱，洗脱流速为50.15BV/h；SephadexG-150葡萄糖凝胶柱纯化时，上样浓度8.0mg/mL8，洗脱流速为0.29BV/h9。
7、回收循环利用水、乙醇和大孔树脂，洗涤和纯化过程中产生的废液，进行回收环保处理。

Claims (1)

1.一种紫丁香蘑水溶性多糖的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)取紫丁香蘑子实体鲜品清洗干净，干燥后粉碎备用；
(2)热水浸提步骤(1)粉碎后的紫丁香蘑子实体，浸提后离心，收集上层清液，下层沉淀再加水重提，重复1～4次；
(3)合并步骤(2)收集的上层清液，旋蒸浓缩后加入乙醇，静置沉淀；
(4)过滤步骤(3)沉淀后的溶液，回收乙醇循环利用，得到的沉淀用无水乙醇、丙酮、无水乙醚依次洗涤，然后抽真空冷冻干燥，获得紫丁香蘑水溶性多糖粗提物；
(5)将步骤(4)所得紫丁香蘑水溶性多糖粗提物加水溶解，然后过大孔树脂脱色除杂；
(6)将经由步骤(5)脱色除杂后的溶液，依次通过离子交换柱和凝胶柱层析纯化，得到紫丁香蘑水溶性多糖；
步骤(1)中，干燥后粉碎备用是指在40～80℃干燥3～24h，粉粹至100～400目颗粒；
步骤(2)中，热水浸提时，紫丁香蘑与水的重量比1:10～60，浸提温度75～95℃，浸提时间1～4h；离心所得下层沉淀再加入等量水重提；
步骤(3)中，旋蒸浓缩是指在45～60℃旋转蒸发浓缩至原总体积的1/5～1/3；加入乙醇静置沉淀是指向浓缩液中加入2～5倍体积的乙醇，静置沉淀6～15h；
步骤(5)中，所述大孔树脂为AB-8、D101、HPD100、D301、D941或D900，所述大孔树脂脱色除杂时，静态脱色条件为：粗提物与树脂用量比1:50～150，摇床转速60～180rpm，脱色时间0.5～2.5h，脱色温度30～50℃；动态脱色流速0.1～0.8BV/h，上样量0.1～1.0BV；
步骤(6)中，所述离子交换柱纯化时，上样浓度10.0～20.0mg/mL，依次采用去离子水以及0.1mol/L、0.3mol/L、0.5mol/L浓度梯度的NaCl洗脱，洗脱流速为0.1～1.0BV/h；凝胶柱纯化时，上样浓度5.0～15.0mg/mL，依次采用去离子水以及0.1mol/L、0.3mol/L、0.5mol/L浓度梯度的NaCl洗脱，洗脱流速为0.1～1.0BV/h；
所述紫丁香蘑水溶性多糖由6个单糖组成，含有α构型和β构型，发生C6取代，存在1→6糖苷键，主要是β-1,6-吡喃型糖类；其中，单糖组成摩尔比为甘露糖：葡萄糖：半乳糖：木糖：阿拉伯糖：岩藻糖＝19.0:33.5:18.0:4.6:21.0:3.9；
或者所述紫丁香蘑水溶性多糖由5个单糖组成，含有1→6糖苷键，存在α构型和β构型，以β-1,6-吡喃型糖类为主；其中，单糖组成摩尔比为甘露糖：葡萄糖：半乳糖：阿拉伯糖：岩藻糖＝23.5:11.4:34.2:21.4:9.5。
CN201811067087.9A 2018-09-12 2018-09-12 紫丁香蘑水溶性多糖及其制备方法与应用 Active CN109293791B (zh)

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