CN112010989B - 一种具有抗氧化活性的竹荪菌托多糖的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及食用菌类的加工领域，具体涉及一种具有抗氧化活性的竹荪菌托多糖的制备方法，包括脱脂、粉碎、提取、分离、除蛋白、纯化步骤，其特征在于，所述提取是以pH4.5‑5.5的富硒茶汤为溶剂对竹荪菌托进行恒温提取；本发明利用茶叶种植的废弃物老叶和竹荪栽培的废弃物菌托提取具有抗氧化活性的多糖，能提高多糖提取率，对多糖的抗氧化功能有协同增效作用，所提取多糖抗氧化、清除自由基功效更强；本发明制备工艺简单，产品安全，可规模化生产，能变废为宝，保护环境，具有较好的经济、社会、生态效益。

Description

一种具有抗氧化活性的竹荪菌托多糖的制备方法
技术领域
本发明涉及食用菌类的加工领域，具体涉及一种具有抗氧化活性的竹荪菌托多糖的制备方法。
背景技术
竹荪是鬼笔科竹荪属真菌，具有较高的食用价值和药用价值，是云南、四川、贵州、福建等地广泛种植的主要经济食用菌。竹荪全株由菌托、菌柄、菌盖构成，商品竹荪是菌柄和菌盖，菌托在采收时都是被摘除废弃，而菌托中粗多糖含量为10％以上、氨基酸总量为14％以上、蛋白质含量为23％以上，还含有钙、铁、锌等微量元素，经济价值较高目前菌托废弃不用是对该种珍贵食用菌资源的巨大浪费，而且还可能造成环境污染。
已有的研究表明，竹荪多糖主要的生理功能有：(1)调节免疫功能；(2)抑制肿瘤和癌细胞；(3)抗氧化、延缓衰老；(4)降血糖、降血脂等，由于竹荪子实体价格较高，利用子实体提取多糖成本昂贵，所以从菌托提取多糖提供了竹荪多糖开发利用的新途径。而目前对竹荪菌托多糖提取技术及功效的研究还比较少。专利申请号CN201810880401.9提供了具有神经保护功效的长裙竹荪多糖的制备方法包括将长裙竹荪烘干粉碎、脱脂、水提、除蛋白、乙醇沉淀，随后分别经过阳离子柱和阴离子柱进行离子交换、透析和凝胶层析工序分离纯化；专利申请号CN201710126554.X提供了一种高纯度竹荪多糖的制备方法，首先采用热水提取获得提取液，提取液经浓缩、干燥获得竹荪提取物。然后采用不同体积分数的乙醇对竹荪提取物依次沉淀，离心收集沉淀。沉淀再经复溶、透析、醇沉后，再次离心收集沉淀并依次经过无水乙醇洗涤、挥干乙醇及干燥等工艺，得到三种不同的高纯度竹荪多糖。专利申请号CN201410470022.4提供了一种具有免疫活性的新型红托竹荪多糖及其制备方法和应用，所述方法，以红托竹荪为原料，经过如下方法制备：热水浸提、Savege法除蛋白、乙醇沉淀，然后采用离子交换柱层析、凝胶过滤柱层析、超滤分离、凝胶过滤柱层析四步分离法分离纯化后获得。但目前多采用水、有机试剂为溶剂进行提取，这多是利用多糖与提取溶剂的溶解度参数相近，相似相溶原理，对多糖类物质进行提取，但一般多糖在植物体内不会单独存在，而是与蛋白质和核酸结合在一起，因此pH直接影响到多糖在溶剂中的溶解状况，这造成了多糖提取率以及抗氧化性能不理想。
贵州凤冈县是中国富锌富硒有机茶之乡，所产的茶叶中硒主要集中在叶片，尤其是老叶，有机硒的含量达3.50mg/kg，硒是人体必不可缺的微量矿物质元素，具有抗氧化、保护细胞膜、消除人体的自由基、增强人体免疫功能等作用，而这部分老叶通常废弃不用，对其加以利用可以变废为宝，提升茶叶的经济价值。
竹荪菌托、凤冈富硒茶老叶都是贵州当地的特色资源，都具有抗氧化功效，目前都未有效开发利用，因此综合利用这2种农产品种植过程中产生的废弃料，利用富硒的茶汤来制备竹荪菌托多糖，提高多糖提取率，并对所提取多糖的抗氧化功能有协同增效作用，不仅可以解决废弃资源的再利用问题，实现变废为宝，保护环境，而且具有较好的经济、社会、生态效益。而目前国内外对利用茶汤提取竹荪菌托中具有抗氧化活性多糖的技术研究还未见报道。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提出了一种具有抗氧化活性的竹荪菌托多糖的制备方法。
具体是通过以下技术方案来实现的：
一种具有抗氧化活性的竹荪菌托多糖的制备方法，包括脱脂、粉碎、提取、分离、除蛋白、纯化步骤，所述提取是以pH4.5-5.5的富硒茶汤为溶剂对竹荪菌托进行恒温提取。
所述富硒茶汤，其制备方法为：挑选干燥的富硒茶老叶，去除杂草等异物，按料液重量比1:30～50加入纯净水，煮沸40～60min，经40目筛网过滤得茶汤，用1～3％食品级柠檬酸溶液调节茶汤pH4.5～5.5，备用。
所述恒温提取，其温度为50-80℃。
进一步地优选，前述具有抗氧化活性的竹荪菌托多糖的制备方法，具体包括如下步骤：
(1)竹荪菌托预处理：将烘干的竹荪菌托用酒精浸泡后，置于45℃条件下烘干至恒重，粉碎过40目筛网，备用；
(2)竹荪菌托多糖的提取：将以上竹荪菌托干粉按料液质量比1:20～60加入富硒茶汤，于50～80℃恒温提取2～5h；
(3)竹荪菌托多糖的分离：步骤(2)所得提取液经40目筛网过滤、4000～5000r/min离心30～40min，上清液真空减压浓缩至1/3体积，再醇沉12h以上，经40目筛网过滤；
(4)竹荪菌托多糖除蛋白：以上过滤后的沉淀用纯净水充分溶解，加入等体积的Sevage试剂，搅拌1～2h，3000r/min离心15min，使游离蛋白质充分沉淀脱除，上清液真空减压浓缩至1/3体积，再醇沉12h以上，3000～4000r/min离心10～20min，弃去上清液，将沉淀真空冷冻干燥，得到竹荪菌托粗多糖；
(5)竹荪菌托多糖的纯化：将竹荪菌托粗多糖溶于水，采用离子交换层析柱进行纯化，用蒸馏水、0.1～0.5mol/L NaCl溶液进行洗脱，收集洗脱液，再用凝胶色谱柱纯化，以0.1～0.5mol/L NaCl溶液为洗脱剂，收集洗脱液，浓缩，真空冷冻干燥，得到竹荪菌托多糖。
所述酒精为75％食品级酒精。
所述醇沉是采用95％食品级乙醇对浓缩液进行沉淀，其用量为浓缩液体积的3倍。
所述Sevage试剂中氯仿：异戊醇＝3:1。
所述离子交换层析柱为DEAE-52纤维素离子交换层析柱。
所述凝胶色谱柱为Sephadex G-200葡聚糖凝胶色谱柱。
有益效果：
1、本发明利用富硒茶汤来提取竹荪菌托多糖，对所提取多糖的抗氧化功能有协同增效作用，所提取多糖比用纯净水提取的竹荪菌托多糖在抗氧化、清除自由基方面功效更强。
2、本发明利用富硒茶汤来提取竹荪菌托多糖，对多糖提取有促进作用，能提高多糖提取率。本发明在研究中对富硒茶叶新叶和老叶中硒含量进行了研究，其中新叶中硒含量1.88～2.03mg/kg，老叶中为3.50mg/kg以上。用新叶制备茶汤提取菌托多糖的数据为：多糖提取率9.81％，对·OH清除率48.33％，对DPPH·清除率37.52％，对Fe3+总还原力1.18，但新叶提取的4项指标虽然比其他对照组高，但无显著性差异，而用老叶茶汤作为溶剂，前述4项指标均优于新叶提取。同时，我们也利用硒浓度3.5mg/L的无机硒溶液以及硒浓度5.0mg/L的有机硒溶液作为溶剂，其结果发现：在多糖提取率、清除率和三价铁还原力方面均弱于新叶茶汤的效果。为了研究硒元素与茶汤组分之间的关系，我们分别将毛尖茶、红茶、普洱茶进行冲泡，并将各组冲泡的茶汤分为4组，设置为“毛尖茶汤+3.5mg/L无机硒”、“毛尖茶汤+3.5mg/L有机硒”、“毛尖茶汤+5.0mg/L无机硒”、“毛尖茶汤+5.0mg/L有机硒”、“红茶汤+3.5mg/L无机硒”、“红茶汤+3.5mg/L有机硒”、“红茶汤+5.0mg/L无机硒”、“红茶汤+5.0mg/L有机硒”、“普洱茶汤+3.5mg/L无机硒”、“普洱茶汤+3.5mg/L有机硒”、“普洱茶汤+5.0mg/L无机硒”、“普洱茶汤+5.0mg/L有机硒”组，结果显示：各组效果不及富硒新叶茶汤组。
3、本发明公开的抗氧化活性竹荪菌托多糖制备工艺简单，产品安全，可规模化生产。
4、本发明利用茶叶种植的废弃物老叶和竹荪栽培的废弃物菌托提取具有抗氧化活性的多糖，实现变废为宝，保护环境，具有较好的经济、社会、生态效益。
具体实施方式
下面对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明，但本发明并不局限于这些实施方式，任何在本实施例基本精神上的改进或代替，仍属于本发明权利要求所要求保护的范围。
一种具有抗氧化活性的竹荪菌托多糖的制备方法，包括如下步骤：
(1)茶汤的制备：挑选干燥的富硒茶老叶，去除杂草等异物，按料液重量比1:30加入纯净水，煮沸50分钟，40目筛网过滤得茶汤,用3％食品级柠檬酸溶液调节茶汤pH4.5，备用。
(2)竹荪菌托预处理：将烘干的竹荪菌托用75％食品级酒精浸泡脱脂48小时，45℃烘干至恒重，粉碎过40目筛网，备用；
(3)竹荪菌托多糖的提取：将以上竹荪菌托干粉按料液质量比1:30加入茶汤，于60℃恒温提取3小时；
(4)竹荪菌托多糖的分离：提取液40目筛网过滤、4000r/min离心40min，上清液真空减压浓缩至1/3体积,加入浓缩液3倍体积的95％食品级乙醇,沉淀12小时以上，40目筛网过滤；
(5)竹荪菌托多糖除蛋白：以上过滤后的沉淀用纯净水充分溶解，加入相同体积的Sevage试剂(氯仿：异戊醇＝3:1)，搅拌1小时，3000r/min离心15min，使游离蛋白质充分沉淀脱除，上清液真空减压浓缩至1/3体积,再加入浓缩液3倍体积的95％食品级乙醇沉淀12小时以上，3000r/min离心20min，弃去上清液，将沉淀真空冷冻干燥，得到竹荪菌托粗多糖；
(6)竹荪菌托多糖的纯化：将竹荪菌托粗多糖溶于水，用DEAE-52纤维素离子交换层析柱纯化，用蒸馏水、0.1mol/L NaCl溶液进行洗脱，收集洗脱液，再用Sephadex G-200葡聚糖凝胶色谱柱纯化，以0.2mol/L NaCl溶液为洗脱剂，收集洗脱液，浓缩，真空冷冻干燥，得到竹荪菌托多糖。
实施例2
一种具有抗氧化活性的竹荪菌托多糖的制备方法，包括如下步骤：
(1)茶汤的制备：挑选干燥的富硒茶老叶，去除杂草等异物，按料液重量比1:40加入纯净水，煮沸40分钟，40目筛网过滤得茶汤,用2％食品级柠檬酸溶液调节茶汤pH5.0，备用。
(2)竹荪菌托预处理：将烘干的竹荪菌托用75％食品级酒精浸泡脱脂48小时，45℃烘干至恒重，粉碎过40目筛网，备用；
(3)竹荪菌托多糖的提取：将以上竹荪菌托干粉按料液质量比1:50加入茶汤，于70℃恒温提取2小时；
(4)竹荪菌托多糖的分离：提取液40目筛网过滤、4500r/min离心35min，上清液真空减压浓缩至1/3体积,加入浓缩液3倍体积的95％食品级乙醇,沉淀12小时以上，40目筛网过滤；
(5)竹荪菌托多糖除蛋白：以上过滤后的沉淀用纯净水充分溶解，加入相同体积的Sevage试剂(氯仿：异戊醇＝3:1)，搅拌1.5小时，3000r/min离心15min，使游离蛋白质充分沉淀脱除，上清液真空减压浓缩至1/3体积,再加入浓缩液3倍体积的95％食品级乙醇沉淀12小时以上，3500r/min离心15min，弃去上清液，将沉淀真空冷冻干燥，得到竹荪菌托粗多糖；
(6)竹荪菌托多糖的纯化：将竹荪菌托粗多糖溶于水，用DEAE-52纤维素离子交换层析柱纯化，用蒸馏水、0.3mol/L NaCl溶液进行洗脱，收集洗脱液，再用Sephadex G-200葡聚糖凝胶色谱柱纯化，以0.3mol/L NaCl溶液为洗脱剂，收集洗脱液，浓缩，真空冷冻干燥，得到竹荪菌托多糖。
实施例3
一种具有抗氧化活性的竹荪菌托多糖的制备方法及其应用，包括如下步骤：
(1)茶汤的制备：挑选干燥的富硒茶老叶，去除杂草等异物，按料液重量比1:50加入纯净水，煮沸60分钟，40目筛网过滤得茶汤,用1％食品级柠檬酸溶液调节茶汤pH5.5，备用。
(2)竹荪菌托预处理：将烘干的竹荪菌托用75％食品级酒精浸泡脱脂48小时，45℃烘干至恒重，粉碎过40目筛网，备用；
(3)竹荪菌托多糖的提取：将以上竹荪菌托干粉按料液质量比1:40加入茶汤，于80℃恒温提取4小时；
(4)竹荪菌托多糖的分离：提取液40目筛网过滤、5000r/min离心30min，上清液真空减压浓缩至1/3体积,加入浓缩液3倍体积的95％食品级乙醇,沉淀12小时以上，40目筛网过滤；
(5)竹荪菌托多糖除蛋白：以上过滤后的沉淀用纯净水充分溶解，加入相同体积的Sevage试剂(氯仿：异戊醇＝3:1)，搅拌2小时，3000r/min离心15min，使游离蛋白质充分沉淀脱除，上清液真空减压浓缩至1/3体积,再加入浓缩液3倍体积的95％食品级乙醇沉淀12小时以上，4000r/min离心10min，弃去上清液，将沉淀真空冷冻干燥，得到竹荪菌托粗多糖；
(6)竹荪菌托多糖的纯化：将竹荪菌托粗多糖溶于水，用DEAE-52纤维素离子交换层析柱纯化，用蒸馏水、0.5mol/L NaCl溶液进行洗脱，收集洗脱液，再用Sephadex G-200葡聚糖凝胶色谱柱纯化，以0.5mol/L NaCl溶液为洗脱剂，收集洗脱液，浓缩，真空冷冻干燥，得到竹荪菌托多糖。
本发明达到的技术效果：通过对照例和实验例进行效果对比。
对照例1
竹荪菌托预处理后，用纯净水代替茶汤，按照本发明的方法步骤(2)～(6)提取竹荪菌托多糖。
对比例1
与实施例1的区别在于：富硒茶汤替换为毛尖茶茶汤。
对比例2
与实施例2的区别在于：富硒茶汤替换为红茶汤。
对比例3
与实施例3的区别在于：富硒茶汤替换为普洱茶茶汤。
对比例4
与实施例1的区别在于：所述富硒茶汤的pH为4.3。
对比例5
与实施例2的区别在于：所述富硒茶汤的pH为5.8。
对比例6
与实施例3的区别在于：所述富硒茶汤的pH为7.0。
实验例
分别按照实施例1～3，对比例1-6、对照组的方法提取竹荪菌托多糖；
分别计算各组多糖提取率，并测定对照例和实施例样品对·OH清除率、对DPPH·清除率、对Fe3+总还原力，评价对照例和实施例多糖的抗氧化功效。结果见表1、表2、表3、表4。
(1)多糖提取率
多糖提取率(％)＝冻干样品质量(g)/菌托干粉质量(g)×100 式(1)
表1对照例和实验例多糖提取率比较
样品 对照例 实施例1 实施例2 实施例3 对比例1
多糖提取率(％) 8.57 11.31 11.52 11.25 9.03
样品 对比例2 对比例3 对比例4 对比例5 对比例6
多糖提取率(％) 9.05 8.92 9.01 9.03 9.00
(2)对·OH清除率
采用水杨酸显色法进行测定。反应体系为1mL、8mmol/L FeSO4，1mL、8mmol/L H2O2，1mL、8mmol/L水杨酸，1mL蒸馏水，1mL相应浓度的被试样品溶液。反应体系体积共计5mL，将混合体系摇匀后置于37℃恒温水浴锅中加热反应30min，后于510nm处测定混合体系的吸光值(A1)，用1mL的蒸馏水代替反应体系中的水杨酸测得样品本底吸光值(A2)，用1mL的蒸馏水代替反应体系中的样品测得空白吸光值(A0)。每组实验做三个平行，最终值取三次的平均值，清除率计算公式见(2)式。
清除率(％)＝[1-(A1-A2)/A0]×100 式(2)
表2对照例和实验例对·OH清除率比较
样品 对照例 实施例1 实施例2 实施例3 对比例1
·OH清除率(％) 43.34 66.72 67.63 67.41 44.03
样品 对比例2 对比例3 对比例4 对比例5 对比例6
·OH清除率(％) 44.31 44.68 45.26 45.32 45.68
(3)对DPPH·清除率
反应体系由1mL不同浓度的被试样溶液，1mL、0.2mmol/L DPPH·溶液和2mL蒸馏水组成。将反应组合摇匀后置于25℃恒温水浴锅中避光加热反应15min，后于517nm处测定混合反应体系的吸光值(A1)。用1mL的蒸馏水代替1mL的DPPH·溶液，其余成分相同，测得样品的本底吸光值(A2)，用1mL的蒸馏水代替1mL的样品溶液，其余成分相同，测得空白吸光值(A0)。每组实验做三个平行，最终值取三次值的平均值，清除率计算公式见(3)式。
清除率(％)＝[1-(A1-A2)/A0]×100 式(3)
表3对照例和实验例对DPPH·清除率比较
样品 对照例 实施例1 实施例2 实施例3 对比例1
DPPH·清除率(％) 34.35 48.21 48.76 48.87 34.58
样品 对比例2 对比例3 对比例4 对比例5 对比例6
DPPH·清除率(％) 35.02 35.11 35.25 35.21 34.98
(4)对Fe3+总还原力
采用铁氰化钾显色法测定。取各不同浓度被试样品1mL，加入pH 6.8的PBS缓冲液1mL及1％的铁氰化钾溶液1mL，摇匀后置于50℃恒温水浴锅中加热反应30min。加热反应结束后取出并急速冷却后，加入已配置好的10％的三氯乙酸溶液1mL，充分混匀后4000r/min离心10min，取上清液1mL并加入0.1％的三氯化铁溶液1mL，随后加入3mL的蒸馏水，混匀后于700nm处测定此反应体系的吸光值(A1)，以1mL的蒸馏水代替不同浓度的试样品，其他操作相同，在700nm处测得空白吸光值(A0)。以(A1-A0)的值来衡量样品还原能力的强弱，还原力的强弱与吸光值的大小成正相关。每组实验做三个平行，最终值取三次的平均值。
表4对照例和实验例对Fe3+总还原力比较
样品 对照例 实施例1 实施例2 实施例3 对比例1
对Fe<sup>3+</sup>总还原力 1.08 1.35 1.33 1.38 1.12
样品 对比例2 对比例3 对比例4 对比例5 对比例6
对Fe<sup>3+</sup>总还原力 1.09 1.12 1.15 1.09 1.10

Claims (4)

1.一种具有抗氧化活性的竹荪菌托多糖的制备方法，其特征在于，具体包括如下步骤：
(1)茶汤的制备：挑选干燥的富硒茶老叶，去除杂草等异物，按料液重量比1:30～50加入纯净水，煮沸40～60min，经40目筛网过滤得茶汤，用1～3％食品级柠檬酸溶液调节茶汤pH4.5～5.5，备用；
(2)竹荪菌托预处理：将烘干的竹荪菌托用酒精浸泡后，置于45℃条件下烘干至恒重，粉碎过40目筛网，备用；
(3)竹荪菌托多糖的提取：将以上竹荪菌托干粉按料液质量比1:20～60加入至富硒茶汤，于50～80℃恒温提取2～5h；
(4)竹荪菌托多糖的分离：步骤(3)所得提取液经40目筛网过滤、4000～5000r/min离心30～40min，上清液真空减压浓缩至1/3体积，再醇沉12h以上，经40目筛网过滤；
(5)竹荪菌托多糖除蛋白：以上过滤后的沉淀用纯净水充分溶解，加入等体积的Sevage试剂，搅拌1～2h，3000r/min离心15min，使游离蛋白质充分沉淀脱除，上清液真空减压浓缩至1/3体积，再醇沉12h以上，3000～4000r/min离心10～20min，弃去上清液，将沉淀真空冷冻干燥，得到竹荪菌托粗多糖；
(6)竹荪菌托多糖的纯化：将竹荪菌托粗多糖溶于水，采用DEAE-52纤维素离子交换层析柱进行纯化，用蒸馏水、0.1～0.5mol/LNaCl溶液进行洗脱，收集洗脱液，再用SephadexG-200葡聚糖凝胶色谱柱纯化，以0.1～0.5mol/LNaCl溶液为洗脱剂，收集洗脱液，浓缩，真空冷冻干燥，得到竹荪菌托多糖。
2.如权利要求1所述的一种具有抗氧化活性的竹荪菌托多糖的制备方法，其特征在于，步骤（2）中所述酒精为75％食品级酒精。
3.如权利要求1所述的一种具有抗氧化活性的竹荪菌托多糖的制备方法，其特征在于，步骤(4)和步骤(5)中所述的醇沉是采用95％食品级乙醇对浓缩液进行沉淀，其用量为浓缩液体积的3倍。
4.如权利要求1所述的一种具有抗氧化活性的竹荪菌托多糖的制备方法，其特征在于，所述Sevage试剂中氯仿：异戊醇＝3:1。
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