CN102417544B - 一种紫阳富硒绿茶含硒多糖及其制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种紫阳富硒绿茶含硒多糖，该含硒多糖的组成按质量百分比计为：硒1.5ppm～8.5ppm，余量为杂多糖；所述杂多糖的组成按摩尔百分比计为：甘露糖3.3％～5.3％，核糖1％～2％，鼠李糖3.5％～5％，葡萄糖醛酸2％～3.5％，半乳糖醛酸2.6％～3.8％，葡萄糖30％～34.2％，木糖3.6％～5.6％，半乳糖19.8％～23.2％，阿拉伯糖21.5％～25.6％。本发明还提供了紫阳富硒绿茶含硒多糖的制备方法以及用途。本发明制备方法简便，成本低廉，适于推广使用，该含硒多糖具有增强免疫力的作用；对于肿瘤细胞，特别是结肠癌细胞生长有明显的抑制作用；对肝损伤亦有明显的保护作用。

Description

一种紫阳富硒绿茶含硒多糖及其制备方法和用途

技术领域

本发明属于茶制品与生物工程技术领域，具体涉及一种紫阳富硒绿茶硒多糖及其制备方法和用途。

背景技术

茶叶可分为三大类：绿茶(未发酵茶)、乌龙茶(半发酵茶)和红茶(发酵茶)。其中，绿茶因具有香高、味醇、形美、耐冲泡等特点，是我国产量最多的一类茶叶，其花色品种之多居世界首位，每年出口数万吨，占世界茶叶市场贸易量的70％左右。现代科学研究表明，绿茶在诸多疾病的预治中发挥着重要作用，特别是在心血管疾病、肿瘤发生等慢性疾病的防治中作用尤为突出。20世纪70年代末，产自高硒地区的天然富硒茶引起人们的广泛关注，其主要产自高硒地区，例如陕西紫阳和湖北恩施。富硒绿茶被认为有非常高的价值，主要是硒一直被看作是重要的食物源抗氧化剂(比维生素高500倍)，其摄入与免疫、肿瘤等疾病的防治密切相关。现代流行病学调查结果也认为适量补硒有益人体健康。硒通常在动植物体内能以硒酶、硒蛋白等有机硒的形态存在，在维持细胞膜的完整性和保护脂肪、脂蛋白和DNA免受氧化损伤中发挥者十分重要的作用。一些研究结果表明，富硒绿茶生物活性显著高于普通绿茶，且发现有机硒较无机硒有更高的生物利用度和更低的毒性。但是，有关富硒茶叶中硒的化学存在形态的鉴定仍然是一个尚未解决的挑战性难题。

目前，对于富硒茶的研究主要集中在人工栽培，富硒茶的人工栽培方法，授权公告号：CN1024388C；富硒茶的生产方法，公开号：CN1568655；一种富硒茶叶的生产调节剂及其用法，授权公告号：CN1225984C层面上，活性评价也仅限于原茶材料或水提物水平(抗肿瘤活性纳米富硒绿茶的制备方法及其产品，公开号：CN101142951)。而对天然富硒茶功能因子的深入研究报导却很少，尤其是天然富硒茶多糖几乎没有报道。

紫阳富硒绿茶，在医药领域被称为“抗癌之王”与“抗衰老明星”，被营养学界誉为21世纪健康佳品和绿色保健饮料，是具有广阔前景的保健食品，尤其对人体硒的摄入有益。更值得注意的是，在众多茶多酚(活性类黄酮)、皂苷、酶、蛋白、多糖等潜在活性成分中，绿茶中水溶性酶、蛋白、多糖等大分子成分较脂溶性类黄酮、皂苷等小分子成分更容易进入茶饮水中，作为绿茶的功效成分被人体摄入，而且生物大分子成分通常是微量元素硒的理想载体，易与硒复合为有机硒呈现重要的生物活性。特别是，近年来随着蛋白质与核酸研究的深入以及对糖类参与组织细胞功能活动机制的阐明，天然多糖作为一类重要的生物效应调节剂，倍受研究者的关注。但是，目前已报导的硒多糖主要是通过人工合成获取。如硒化角叉菜胶、硒化箬叶多糖、硒化葡聚糖和硒化黄芪多糖等。可见，绿茶硒多糖的研究已成为食品药品领域中的一个新的增长点，如何开发新型硒多糖食品功能因子或药品具有重要的科学意义，并发挥其潜在的巨大经济与社会效益。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术中的不足，提供一种成本低廉，适于推广使用，具有增强免疫力的作用，对于肿瘤细胞，特别是结肠癌细胞生长有明显的抑制作用，同时对肝损伤亦有明显的保护作用的紫阳富硒绿茶含硒多糖。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种紫阳富硒绿茶含硒多糖，其特征在于，该含硒多糖的组成按质量百分比计为：硒1.5ppm～8.5ppm，余量为杂多糖；所述杂多糖的组成按摩尔百分比计为：甘露糖3.3％～5.3％，核糖1％～2％，鼠李糖3.5％～5％，葡萄糖醛酸2％～3.5％，半乳糖醛酸2.6％～3.8％，葡萄糖30％～34.2％，木糖3.6％～5.6％，半乳糖19.8％～23.2％，阿拉伯糖21.5％～25.6％。

上述的一种紫阳富硒绿茶含硒多糖，该含硒多糖的组成按质量百分比计为：硒3ppm～7ppm，余量为杂多糖；所述杂多糖的组成按摩尔百分比计为：甘露糖4.1％～4.9％，核糖1.2％～1.8％，鼠李糖4.0％～4.5％，葡萄糖醛酸2.3％～2.9％，半乳糖醛酸2.8％～3.4％，葡萄糖31％～33.5％，木糖4％～5％，半乳糖20.3％～22.6％，阿拉伯糖22.5％～24.7％。

上述的一种紫阳富硒绿茶含硒多糖，该含硒多糖的组成按质量百分比计为：硒5ppm，余量为杂多糖；所述杂多糖的组成按摩尔百分比计为：甘露糖4.5％，核糖1.6％，鼠李糖4.3％，葡萄糖醛酸2.7％，半乳糖醛酸3.2％，葡萄糖32.7％，木糖4.6％，半乳糖22.4％，阿拉伯糖24％。

本发明还提供了一种紫阳富硒绿茶含硒多糖的制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

(1)将紫阳富硒绿茶茶叶在自然条件下晾晒干或烘干，然后粉碎成茶叶粉末；

(2)向步骤(1)中所述茶叶粉末中加入所述茶叶粉末质量10～15倍且温度为80℃的蒸馏水，浸提2h后过滤；

(3)重复步骤(2)2～3次，合并滤液后浓缩至滤液体积的1/4；

(4)向步骤(3)中浓缩后的滤液中加入3～5倍体积的无水乙醇浸泡，离心后收集沉淀；

(5)重复步骤(4)三次后向收集的沉淀中加入所述沉淀质量3～5倍的蒸馏水，反复冻融8～10次除去蛋白，离心，弃沉淀，将上清液用蒸馏水透析72h后冷冻干燥，得到紫阳富硒绿茶含硒多糖。

另外，本发明还提供了紫阳富硒绿茶含硒多糖作为功能性保健食品的用途，尤其是作为增强免疫保健食品或护肝保健食品的用途；紫阳富硒绿茶含硒多糖在制备免疫增强剂药物中的用途；紫阳富硒绿茶含硒多糖在制备治疗肿瘤的药物中的用途，尤其是在制备治疗结肠癌的药物中的用途；紫阳富硒绿茶含硒多糖在制备治疗肝损伤的药物中的用途。

本发明的紫阳富硒绿茶含硒多糖可作为保健食品(免疫增强保健食品和护肝保健食品)直接服用，也可作为食品添加剂用于制作保健食品，另外，还可采用常规方法将紫阳富硒绿茶含硒多糖制备成胶囊剂、片剂、颗粒剂或口服液剂等剂型的保健食品。

本发明的紫阳富硒绿茶含硒多糖制备免疫增强药物、抗肿瘤药物和治疗肝损伤的药物的方法为：

胶囊剂的制备方法：将紫阳富硒绿茶含硒多糖按常规制胶囊的方法制成胶囊，载体为常规药用胶囊载体，每粒胶囊0.15g～0.25g，每粒胶囊含紫阳富硒绿茶含硒多糖100mg～160mg。该胶囊剂的用法用量为：每日3次，每次3～5粒。

片剂的制备方法：将紫阳富硒绿茶含硒多糖按常规制片剂的方法制成片剂，辅料为常规药学上可接受的辅料(如淀粉、硬脂酸镁、糊精等)，每片0.25g～0.5g，每片含紫阳富硒绿茶含硒多糖100mg～160mg。该片剂的用法用量为：每日3次，每次3～5片。

口服液的制备方法：将紫阳富硒绿茶含硒多糖溶解于无菌水中，按常规制口服液的方法加药学上可接受的辅助性成分(如调味剂)制成口服液，每瓶10mL，每瓶含紫阳富硒绿茶含硒多糖100mg～160mg。该口服液的用法用量为：每日3次，每次1～2瓶。

本发明采用氢化物原子荧光光谱法(HG-AFS)进行紫阳富硒绿茶含硒多糖中硒含量的测定：1、标准曲线绘制：将硒标准应用液(1μg/mL)分别取0.0、0.1mL、0.2mL、0.4mL、0.8mL、1.6mL、3.2mL于一系列100mL容量瓶中，加5mL盐酸混匀，并用去离子水定容100mL，采用AFS-3100型全自动双道原子荧光光度计测量绘制标准曲线；2、样品(紫阳富硒绿茶含硒多糖)测定：称取一定量样品于消化管内，加入10mL混合酸(HNO₃∶HClO₄＝4∶1)冷消化过夜，次日，加入几粒玻璃珠，于175℃加热消化5h～6h，当消化液变为澄清无色溶液并有白烟产生时，再继续加热至管内液体体积剩余2mL左右，停止加热，不可蒸干，冷却后再加5mL盐酸，于150℃至溶液清亮，样品中的Se⁶⁺还原成Se⁴⁺，用硼氢化钠(NaBH4)作还原剂，将Se⁴⁺在盐酸介质中还原成SeH₂。将消化液转移至50mL容量瓶中，加2.5mL浓盐酸后定容，同时做空白对照；采用AFS-3100型全自动双道原子荧光光度计测定样品；仪器参数设定为：负高压300V，总电流80mA，原子化器高度8mm，原子化温度800℃，载气流速400mL/min，屏蔽气流量900mL/min，延迟时间1s，读数时间10s，加液时间6s，上样量2mL。结果显示，紫阳富硒绿茶含硒多糖中硒含量为1.5μg/g～8.5μg/g，显著高于茶叶中硒含量(0.57μg/g)。

本发明采用傅里叶红外光谱(IR)法测定紫阳富硒绿茶含硒多糖红外特征，结果如图1所示，从图中可以看出，在3431cm^-1左右有羟基的强特征吸收峰，在2852-2958cm^-1处有C-H伸缩吸收峰，在1039-1145cm^-1附近的吸收峰显示亚硒酸酯中Se-H弱吸收峰，在1629cm^-1处有-COOH的弱吸收峰，表明紫阳富硒绿茶多糖为含硒酸性多糖。

本发明采用化学水解法(三氟乙酸法)水解释放含硒多糖的成分组成并采用PMP柱前衍生化高效液相色谱(HPLC)法分析成分组成。分别取标准品[D-甘露糖(Man)，D-核糖(Rib)，L-鼠李糖(Rha)，D-葡萄糖醛酸(GlcUA)，D-半乳糖醛酸(GalUA)，D-葡萄糖(Glc)，D-木糖(Xyl)，D-半乳糖(Gal)，L-阿拉伯糖(Ara)，D-岩藻糖(Fuc)均购自美国Sigma公司]和待测多糖水解样品溶液50μL于具塞试管中，向其中分别加入0.3M NaOH溶液50μL和0.5M PMP甲醇溶液60μL，混匀后置于70℃水浴反应30min，取出，冷却至室温后，加入0.3M HCl溶液50μL，得还原糖的PMP标记溶液，对该溶液进行HPLC进样分析。分析采用Shimadzu LC-2010A液相色谱系统，紫外检测波长250nm，色谱柱采用Xterra-C₁₈分析柱(250×4.6mm i.d.，5μm，美国Waters)或Venusil C₁₈柱(250×4.6mm i.d.，5μm，USA)。流动相为A：乙腈；B：0.045％的KH₂PO₄水溶液(用KOH调节pH至系列测试值)，采用不同梯度分离模式，进样体积10μL，流速为1.0mL/min。结果表明，紫阳富硒绿茶含硒多糖是杂多糖，该杂多糖由甘露糖、核糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、木糖、半乳糖和阿拉伯糖九种成分组成，其摩尔百分含量分别为甘露糖3.3％～5.3％，核糖1％～2％，鼠李糖3.5％～5％，葡萄糖醛酸2％～3.5％，半乳糖醛酸2.6％～3.8％，葡萄糖30％～34.2％，木糖3.6％～5.6％，半乳糖19.8％～23.2％，阿拉伯糖21.5％～25.6％。

本发明与现有技术相比具有以下优点：本发明采用水提取乙醇沉淀、反复冻融、透析方法获得高纯度含硒多糖，方法简便，成本低廉，适于推广使用，该含硒多糖具有明显的免疫调节功效，对于肿瘤细胞，特别是结肠癌细胞生长有明显的抑制作用，同时对肝损伤亦有明显的保护作用。

下面结合附图和实施例，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。

附图说明

图1为本发明紫阳富硒绿茶含硒多糖的傅里叶红外光谱(IR)图。

图2为本发明实施例3制备的紫阳富硒绿茶含硒多糖的HPLC色谱图。

图3为本发明抗氧化实验中总还原能力测定结果。

图4为本发明抗氧化实验中清除超氧阴离子活性测定结果。

图5为本发明抗氧化实验中羟自由基清除作用的测定结果。

图6为本发明抗氧化实验中DPPH自由基清除作用的测定结果。

图7为本发明抗肿瘤实验中对结肠癌细胞(LoVo)周期影响的测定结果。

图8为本发明抗肿瘤实验中对照组对结肠癌细胞(LoVo)周期影响的测定结果。

图9为本发明抗肿瘤实验中紫阳富硒绿茶含硒多糖浓度为100μg/mL时对结肠癌细胞(LoVo)周期影响的测定结果。

图10为本发明抗肿瘤实验中紫阳富硒绿茶含硒多糖浓度为500μg/mL时对结肠癌细胞(LoVo)周期影响的测定结果。

图11为本发明抗肿瘤实验中对照组对结肠癌细胞(LoVo)凋亡作用的测定结果。

图12为本发明抗肿瘤实验中5-Fu浓度为100μg/mL时对结肠癌细胞(LoVo)凋亡作用的测定结果。

图13为本发明抗肿瘤实验中紫阳富硒绿茶含硒多糖浓度为100μg/mL时对结肠癌细胞(LoVo)凋亡作用的测定结果。

图14为本发明抗肿瘤实验中紫阳富硒绿茶含硒多糖浓度为500μg/mL时对结肠癌细胞(LoVo)凋亡作用的测定结果。

具体实施方式

实施例1

本实施例的一种紫阳富硒绿茶含硒多糖，该含硒多糖的组成按质量百分比计为：硒8.5ppm，余量为杂多糖；所述杂多糖的组成按摩尔百分比计为：甘露糖5.3％，核糖2％，鼠李糖5％，葡萄糖醛酸3.5％，半乳糖醛酸3.8％，葡萄糖30％，木糖5.2％，半乳糖23.2％，阿拉伯糖22％。

其制备方法包括以下步骤：

(1)将紫阳富硒绿茶茶叶在自然条件下晾晒干，然后粉碎成茶叶粉末；

(2)向步骤(1)中所述茶叶粉末中加入所述茶叶粉末质量的10倍且温度为80℃的蒸馏水，浸提2h后过滤；

(3)重复步骤(2)2次，合并滤液后浓缩至滤液体积的1/4；

(4)向步骤(3)中浓缩后的滤液中加入5倍体积的无水乙醇浸泡，离心后收集沉淀；

(5)重复步骤(4)三次后向收集的沉淀中加入所述沉淀质量的3倍的蒸馏水，反复冻融8次除去蛋白，离心，弃沉淀，将上清液用蒸馏水透析72h后冷冻干燥，得到紫阳富硒绿茶含硒多糖。

采用氢化物原子荧光光谱法(HG-AFS)测定制备的紫阳富硒绿茶含硒多糖中的硒含量(按质量含量计)为8.5ppm；采用化学水解法(三氟乙酸法)水解释放含硒多糖中杂多糖的成分，进行HPLC进样分析，得到杂多糖组成(按摩尔百分比计)为甘露糖5.3％，核糖2％，鼠李糖5％，葡萄糖醛酸3.5％，半乳糖醛酸3.8％，葡萄糖30％，木糖5.2％，半乳糖23.2％，阿拉伯糖22％。

实施例2

本实施例的一种紫阳富硒绿茶含硒多糖，该含硒多糖的组成按质量百分比计为：硒1.5ppm，余量为杂多糖；所述杂多糖的组成按摩尔百分比计为：甘露糖5.3％，核糖1％，鼠李糖3.5％，葡萄糖醛酸2％，半乳糖醛酸2.6％，葡萄糖34.2％，木糖3.6％，半乳糖22.2％，阿拉伯糖25.6％。

其制备方法包括以下步骤：

(1)将紫阳富硒绿茶茶叶在自然条件下晾晒干，然后粉碎成茶叶粉末；

(2)向步骤(1)中所述茶叶粉末中加入所述茶叶粉末质量的15倍且温度为80℃的蒸馏水，浸提2h后过滤；

(3)重复步骤(2)2次，合并滤液后浓缩至滤液体积的1/4；

(4)向步骤(3)中浓缩后的滤液中加入3倍体积的无水乙醇浸泡，离心后收集沉淀；

(5)重复步骤(4)三次后向收集的沉淀中加入所述沉淀质量的4倍的蒸馏水，反复冻融10次除去蛋白，离心，弃沉淀，将上清液用蒸馏水透析72h后冷冻干燥，得到紫阳富硒绿茶含硒多糖。

采用氢化物原子荧光光谱法(HG-AFS)测定制备的紫阳富硒绿茶含硒多糖中的硒含量(按质量含量计)为1.5ppm；采用化学水解法(三氟乙酸法)水解释放含硒多糖中杂多糖的成分，进行HPLC进样分析，得到杂多糖组成(按摩尔百分比计)为甘露糖5.3％，核糖1％，鼠李糖3.5％，葡萄糖醛酸2％，半乳糖醛酸2.6％，葡萄糖34.2％，木糖3.6％，半乳糖22.2％，阿拉伯糖25.6％。

实施例3

本实施例的一种紫阳富硒绿茶含硒多糖，该含硒多糖的组成按质量百分比计为：硒5ppm，余量为杂多糖；所述杂多糖的组成按摩尔百分比计为：甘露糖4.9％，核糖1.2％，鼠李糖4％，葡萄糖醛酸2.9％，半乳糖醛酸3.4％，葡萄糖33.5％，木糖5％，半乳糖21.8％，阿拉伯糖23.3％。

其制备方法包括以下步骤：

(1)将紫阳富硒绿茶茶叶烘干，然后粉碎成茶叶粉末；

(2)向步骤(1)中所述茶叶粉末中加入所述茶叶粉末质量的12倍且温度为80℃的蒸馏水，浸提2h后过滤；

(3)重复步骤(2)3次，合并滤液后浓缩至滤液体积的1/4；

(4)向步骤(3)中浓缩后的滤液中加入4倍体积的无水乙醇浸泡，离心后收集沉淀；

(5)重复步骤(4)三次后向收集的沉淀中加入所述沉淀质量的5倍的蒸馏水，反复冻融9次除去蛋白，离心，弃沉淀，将上清液用蒸馏水透析72h后冷冻干燥，得到紫阳富硒绿茶含硒多糖。

采用氢化物原子荧光光谱法(HG-AFS)测定制备的紫阳富硒绿茶含硒多糖中的硒含量(按质量含量计)为5ppm；采用化学水解法(三氟乙酸法)水解释放含硒多糖中杂多糖的成分，进行HPLC进样分析，结果如图2所示，图中1为甘露糖，2为核糖，3为鼠李糖，4为葡萄糖醛酸，5为半乳糖醛酸，6为葡萄糖，7为木糖，8为半乳糖，9为阿拉伯糖，10为岩藻糖(内标)，得到杂多糖组成(按摩尔百分比计)为甘露糖4.9％，核糖1.2％，鼠李糖4％，葡萄糖醛酸2.9％，半乳糖醛酸3.4％，葡萄糖33.5％，木糖5％，半乳糖21.8％，阿拉伯糖23.3％。

实施例4

本实施例的一种紫阳富硒绿茶含硒多糖，该含硒多糖的组成按质量百分比计为：硒3ppm，余量为杂多糖；所述杂多糖的组成按摩尔百分比计为：甘露糖3.3％，核糖1.8％，鼠李糖4.5％，葡萄糖醛酸2.3％，半乳糖醛酸2.8％，葡萄糖31％，木糖5.6％，半乳糖23.1％，阿拉伯糖25.6％。

其制备方法包括以下步骤：

(1)将紫阳富硒绿茶茶叶在自然条件下晾晒干或烘干，然后粉碎成茶叶粉末；

(2)向步骤(1)中所述茶叶粉末中加入所述茶叶粉末质量的14倍且温度为80℃的蒸馏水，浸提2h后过滤；

(3)重复步骤(2)2次，合并滤液后浓缩至滤液体积的1/4；

(4)向步骤(3)中浓缩后的滤液中加入5倍体积的无水乙醇浸泡，离心后收集沉淀；

(5)重复步骤(4)三次后向收集的沉淀中加入所述沉淀质量的3倍的蒸馏水，反复冻融8次除去蛋白，离心，弃沉淀，将上清液用蒸馏水透析72h后冷冻干燥，得到紫阳富硒绿茶含硒多糖。

采用氢化物原子荧光光谱法(HG-AFS)测定制备的紫阳富硒绿茶含硒多糖中的硒含量(按质量含量计)为3ppm；采用化学水解法(三氟乙酸法)水解释放含硒多糖中杂多糖的成分，进行HPLC进样分析，得到杂多糖组成(按摩尔百分比计)为甘露糖3.3％，核糖1.8％，鼠李糖4.5％，葡萄糖醛酸2.3％，半乳糖醛酸2.8％，葡萄糖31％，木糖5.6％，半乳糖23.1％，阿拉伯糖25.6％。

实施例5

本实施例的一种紫阳富硒绿茶含硒多糖，该含硒多糖的组成按质量百分比计为：硒7ppm，余量为杂多糖；所述杂多糖的组成按摩尔百分比计为：甘露糖4.1％，核糖1.8％，鼠李糖4.5％，葡萄糖醛酸2.9％，半乳糖醛酸3.4％，葡萄糖33.2％，木糖5％，半乳糖22.6％，阿拉伯糖22.5％。

其制备方法包括以下步骤：

(1)将紫阳富硒绿茶茶叶在自然条件下晾晒干，然后粉碎成茶叶粉末；

(2)向步骤(1)中所述茶叶粉末中加入所述茶叶粉末质量的10倍且温度为80℃的蒸馏水，浸提2h后过滤；

(3)重复步骤(2)3次，合并滤液后浓缩至滤液体积的1/4；

(4)向步骤(3)中浓缩后的滤液中加入5倍体积的无水乙醇浸泡，离心后收集沉淀；

(5)重复步骤(4)三次后向收集的沉淀中加入所述沉淀质量的4倍的蒸馏水，反复冻融10次除去蛋白，离心，弃沉淀，将上清液用蒸馏水透析72h后冷冻干燥，得到紫阳富硒绿茶含硒多糖。

采用氢化物原子荧光光谱法(HG-AFS)测定制备的紫阳富硒绿茶含硒多糖中的硒含量(按质量含量计)为7ppm；采用化学水解法(三氟乙酸法)水解释放含硒多糖中杂多糖的成分，进行HPLC进样分析，得到杂多糖组成(按摩尔百分比计)为甘露糖4.1％，核糖1.8％，鼠李糖4.5％，葡萄糖醛酸2.9％，半乳糖醛酸3.4％，葡萄糖33.2％，木糖5％，半乳糖22.6％，阿拉伯糖22.5％。

实施例6

本实施例的一种紫阳富硒绿茶含硒多糖，该含硒多糖的组成按质量百分比计为：硒5ppm，余量为杂多糖；所述杂多糖的组成按摩尔百分比计为：甘露糖4.5％，核糖1.6％，鼠李糖4.3％，葡萄糖醛酸2.7％，半乳糖醛酸3.2％，葡萄糖32.7％，木糖4.6％，半乳糖22.4％，阿拉伯糖24％。

其制备方法包括以下步骤：

(1)将紫阳富硒绿茶茶叶在自然条件下晾晒干，然后粉碎成茶叶粉末；

(2)向步骤(1)中所述茶叶粉末中加入所述茶叶粉末质量的13倍且温度为80℃的蒸馏水，浸提2h后过滤；

(3)重复步骤(2)2次，合并滤液后浓缩至滤液体积的1/4；

(4)向步骤(3)中浓缩后的滤液中加入4倍体积的无水乙醇浸泡，离心后收集沉淀；

(5)重复步骤(4)三次后向收集的沉淀中加入所述沉淀质量的4倍的蒸馏水，反复冻融10次除去蛋白，离心，弃沉淀，将上清液用蒸馏水透析72h后冷冻干燥，得到紫阳富硒绿茶含硒多糖。

采用氢化物原子荧光光谱法(HG-AFS)测定制备的紫阳富硒绿茶含硒多糖中的硒含量(按质量含量计)为5ppm；采用化学水解法(三氟乙酸法)水解释放含硒多糖中杂多糖的成分，进行HPLC进样分析，得到杂多糖组成(按摩尔百分比计)为甘露糖4.5％，核糖1.6％，鼠李糖4.3％，葡萄糖醛酸2.7％，半乳糖醛酸3.2％，葡萄糖32.7％，木糖4.6％，半乳糖22.4％，阿拉伯糖24％。

实施例7

本实施例的一种紫阳富硒绿茶含硒多糖，该含硒多糖的组成按质量百分比计为：硒6ppm，余量为杂多糖；所述杂多糖的组成按摩尔百分比计为：甘露糖5.3％，核糖2％，鼠李糖5％，葡萄糖醛酸3.5％，半乳糖醛酸3.8％，葡萄糖33.5％，木糖5.6％，半乳糖19.8％，阿拉伯糖21.5％。

其制备方法包括以下步骤：

(1)将紫阳富硒绿茶茶叶烘干，然后粉碎成茶叶粉末；

(2)向步骤(1)中所述茶叶粉末中加入所述茶叶粉末质量的12倍且温度为80℃的蒸馏水，浸提2h后过滤；

(3)重复步骤(2)3次，合并滤液后浓缩至滤液体积的1/4；

(4)向步骤(3)中浓缩后的滤液中加入3倍体积的无水乙醇浸泡，离心后收集沉淀；

(5)重复步骤(4)三次后向收集的沉淀中加入所述沉淀质量的5倍的蒸馏水，反复冻融10次除去蛋白，离心，弃沉淀，将上清液用蒸馏水透析72h后冷冻干燥，得到紫阳富硒绿茶含硒多糖。

采用氢化物原子荧光光谱法(HG-AFS)测定制备的紫阳富硒绿茶含硒多糖中的硒含量(按质量含量计)为6ppm；采用化学水解法(三氟乙酸法)水解释放含硒多糖中杂多糖的成分，进行HPLC进样分析，得到杂多糖组成(按摩尔百分比计)为甘露糖5.3％，核糖2％，鼠李糖5％，葡萄糖醛酸3.5％，半乳糖醛酸3.8％，葡萄糖33.5％，木糖5.6％，半乳糖19.8％，阿拉伯糖21.5％。

实施例8

本实施例的一种紫阳富硒绿茶含硒多糖，该含硒多糖的组成按质量百分比计为：硒6ppm，余量为杂多糖；所述杂多糖的组成按摩尔百分比计为：甘露糖4.9％，核糖1.8％，鼠李糖4.5％，葡萄糖醛酸2.9％，半乳糖醛酸3.4％，葡萄糖33.5％，木糖4％，半乳糖20.3％，阿拉伯糖24.7％。

其制备方法包括以下步骤：

(1)将紫阳富硒绿茶茶叶在自然条件下晾晒干或烘干，然后粉碎成茶叶粉末；

(2)向步骤(1)中所述茶叶粉末中加入所述茶叶粉末质量的15倍且温度为80℃的蒸馏水，浸提2h后过滤；

(3)重复步骤(2)3次，合并滤液后浓缩至滤液体积的1/4；

(4)向步骤(3)中浓缩后的滤液中加入3倍体积的无水乙醇浸泡，离心后收集沉淀；

(5)重复步骤(4)3次后向收集的沉淀中加入所述沉淀质量的5倍的蒸馏水，反复冻融9次除去蛋白，离心，弃沉淀，将上清液用蒸馏水透析72h后冷冻干燥，得到紫阳富硒绿茶含硒多糖。

采用氢化物原子荧光光谱法(HG-AFS)测定制备的紫阳富硒绿茶含硒多糖中的硒含量(按质量含量计)为6ppm；采用化学水解法(三氟乙酸法)水解释放含硒多糖中杂多糖的成分，进行HPLC进样分析，得到杂多糖组成(按摩尔百分比计)为甘露糖4.9％，核糖1.8％，鼠李糖4.5％，葡萄糖醛酸2.9％，半乳糖醛酸3.4％，葡萄糖33.5％，木糖4％，半乳糖20.3％，阿拉伯糖24.7％。

实施例9

以紫阳富硒绿茶含硒多糖为活性成分的免疫增强药物的制备方法：

胶囊剂的制备方法：将紫阳富硒绿茶含硒多糖按常规制胶囊的方法制成胶囊，载体为常规药用胶囊载体，每粒胶囊0.15g～0.25g，每粒胶囊含紫阳富硒绿茶含硒多糖100mg～160mg。该胶囊剂的用法用量为：每日3次，每次3～5粒。

片剂的制备方法：将紫阳富硒绿茶含硒多糖按常规制片剂的方法制成片剂，辅料为常规药学上可接受的辅料(如淀粉、硬脂酸镁、糊精等)，每片0.25g～0.5g，每片含紫阳富硒绿茶含硒多糖100mg～160mg。该片剂的用法用量为：每日3次，每次3～5片。

口服液的制备方法：将紫阳富硒绿茶含硒多糖溶解于无菌水中，按常规制口服液的方法加药学上可接受的辅助性成分(如调味剂)制成口服液，每瓶10mL，每瓶含紫阳富硒绿茶含硒多糖100mg～160mg。该口服液的用法用量为：每日3次，每次1～2瓶。

实施例10

以紫阳富硒绿茶含硒多糖为活性成分的治疗肿瘤药物的制备方法：

胶囊剂的制备方法：将紫阳富硒绿茶含硒多糖按常规制胶囊的方法制成胶囊，载体为常规药用胶囊载体，每粒胶囊0.15g～0.25g，每粒胶囊含紫阳富硒绿茶含硒多糖100mg～160mg。该胶囊剂的用法用量为：每日3次，每次3～5粒。

片剂的制备方法：将紫阳富硒绿茶含硒多糖按常规制片剂的方法制成片剂，辅料为常规药学上可接受的辅料(如淀粉、硬脂酸镁、糊精等)，每片0.25g～0.5g，每片含紫阳富硒绿茶含硒多糖100mg～160mg。该片剂的用法用量为：每日3次，每次3～5片。

口服液的制备方法：将紫阳富硒绿茶含硒多糖溶解于无菌水中，按常规制口服液的方法加药学上可接受的辅助性成分(如调味剂)制成口服液，每瓶10mL，每瓶含紫阳富硒绿茶含硒多糖100mg～160mg。该口服液的用法用量为：每日3次，每次1～2瓶。

实施例11

以紫阳富硒绿茶含硒多糖为活性成分的治疗肝损伤的药物的制备方法：

胶囊剂的制备方法：将紫阳富硒绿茶含硒多糖按常规制胶囊的方法制成胶囊，载体为常规药用胶囊载体，每粒胶囊0.15g～0.25g，每粒胶囊含紫阳富硒绿茶含硒多糖100mg～160mg。该胶囊剂的用法用量为：每日3次，每次3～5粒。

片剂的制备方法：将紫阳富硒绿茶含硒多糖按常规制片剂的方法制成片剂，辅料为常规药学上可接受的辅料(如淀粉、硬脂酸镁、糊精等)，每片0.25g～0.5g，每片含紫阳富硒绿茶含硒多糖100mg～160mg。该片剂的用法用量为：每日3次，每次3～5片。

口服液的制备方法：将紫阳富硒绿茶含硒多糖溶解于无菌水中，按常规制口服液的方法加药学上可接受的辅助性成分(如调味剂)制成口服液，每瓶10mL，每瓶含紫阳富硒绿茶含硒多糖100mg～160mg。该口服液的用法用量为：每日3次，每次1～2瓶。

本发明对紫阳富硒绿茶含硒多糖抗氧化功能、免疫调节功能、抗肿瘤功能和治疗肝损伤的功能进行了研究。

一、抗氧化实验

用生理盐水将紫阳富硒绿茶含硒多糖配制成不同浓度的样品液。

①总还原力测定：取1mL不同浓度的样品液分别与2.5mL磷酸盐缓冲液(pH 6.6)及2.5mL铁氰化钾(1wt％)混合，将混合物在50℃水浴中孵育20min，然后加入2.5mL的TCA(10wt％)终止反应，离心10min，取上清液2.5mL，依次加入2.5mL无水乙醇和0.5mLFeCl₃(0.1wt％)，混匀后于700nm波长处测定吸光度，以蒸馏水作空白对照，以维生素C(Vc)作阳性对照。对测定结果进行统计学处理，结果见图3，从图中可以看出，当浓度为40μg/mL时，Vc管700nm吸光度为0.482±0.034，紫阳富硒绿茶含硒多糖(Se-TPS)管吸光度为0.119±0.027。

②清除超氧阴离子活性测定：取1mL不同浓度的Se-TPS样品液于试管中，依次加入1mL浓度为0.078mol/L的NBT，1mL浓度为0.468mol/L的NADH，最后加入0.4mL浓度为0.06mol/L的PMS溶液，室温摇匀后静置5min，于560nm波长处测定吸光度(A_i)，调零孔用不同浓度样品液1mL，0.4mL蒸馏水代替PMS溶液调零，用蒸馏水作阴性对照(A_j)，Vc和BHT作阳性对照，清除率＝[1-A_i/A_j]×100％。对测定结果进行统计学处理，结果见图4，从图中可以看出，浓度为100μg/mL时，相对Vc的清除活性(47.8±3.2)％，Se-TPS清除活性达(78.0±2.2)％。

③对羟自由基清除作用的测定：取1mL不同浓度的样品液，先后加入1.5mL反应液[含0.1mM EDTA、0.1mM FeCl₃和2.8mM DR的磷酸盐缓冲液(pH 7.4)]，0.35mL H₂O₂(20mM)，37℃恒温水浴作用40min后，终止反应，于532nm波长处测定吸光度(A_i)，蒸馏水为阴性对照(A_j)，Vc为阳性对照，清除率＝[1-A_i/A_j]×100％。对测定结果进行统计学处理，结果见图5，从图中可以看出，浓度从250μg/mL增至1000μg/mL，清除活性由0.1±2.2％增至18.5±4.3％。

④对DPPH自由基清除作用的测定：取1mL不同浓度的样品液于试管中，然后依次加入3mL质量浓度为0.004％的DPPH甲醇溶液，充分混匀，避光静置20min后，以甲醇作空白对照，517nm波长测吸光度(A_i)，以蒸馏水代替样品液作阴性对照(A_j)，Vc作阳性对照，清除率＝[1-A_i/A_j]×100％。对测定结果进行统计学处理，结果见图6，从图中可以看出，浓度由5μg/mL增至20μg/mL，Se-TPS的清除活性由1.8±3.2％剧增至30.0±3.3％。

综上所述，紫阳富硒绿茶含硒多糖的总还原能力、对羟自由基的清除活性和对DPPH自由基的清除活性均低于同浓度的强效抗氧化剂Vc，但在相同的数量级范围；而对超氧自由基的清除活性，Se-TPS则显著高于Vc，而且都呈现一定的剂量依赖关系。说明紫阳富硒绿茶含硒多糖具有强的抗氧化功能，是潜在的抗氧化剂。

二、免疫调节实验

将健康小鼠40只随机分成4组，每组10只小鼠，并将4组分为低剂量组、中剂量组、高剂量组和对照组。对低剂量组、中剂量组和高剂量组小鼠分别灌胃紫阳富硒绿茶含硒多糖Se-TPS，灌胃剂量分别为50mg/kg.bw、100mg/kg.bw、300mg/kg.bw，每天一次，连续灌胃30天，对对照组小鼠灌胃蒸馏水，每天一次，连续灌胃30天，进行以下试验：

①小鼠碳粒廓清试验：按顺序给各组小鼠尾静脉注射印度墨汁(4倍稀释)0.1mL/10g.bw，每鼠均于注射墨汁后2min及10min分别准时内眦采血20μL，并将血迅速加入到2mL 0.1％碳酸钠溶液摇匀，以752-C紫外可见分光光度计600nm波长处测光密度值(OD)，同样取小鼠肝、脾称重，计算吞噬指数，结果见表1。

②小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞试验：各组小鼠均腹腔注射20％鸡红细胞悬液1mL，间隔30min处死小鼠，腹腔注入生理盐水2mL，振摇一分钟后取腹腔洗液制片，37℃温育30min，漂洗、固定后染色镜检，计数吞噬鸡红细胞的巨噬细胞数和巨噬细胞吞噬鸡红细胞数，以吞噬率和吞噬指数进行方差分析，结果见表1。

③小鼠迟发型变态反应(DTH)测定：灌胃第26天给小鼠腹腔注射2％绵羊红细胞(SRBC)0.2mL，于免疫后第4天每鼠左后足趾部皮下注射2％SRBC(20μL/只)进行攻击，并于攻击前和攻击后24h测量每鼠左后足趾同一部位厚度，计算攻击前、后的差值，结果与对照组比较进行方差分析，见表1。

表1小鼠碳粒廓清试验(A)、腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞试验(B)、迟发性变态反应试验结果

组别	吞噬指数(A)	吞噬指数(B)	足趾厚度差值(mm)
				对照组	2.1728±0.4029	0.86±0.12	0.1236±0.0632
低剂量组	2.8911±0.6234	0.92±0.14	0.1977±0.1276
				中剂量组	3.2378±0.3267	0.99±0.11	0.2687±0.0832
高剂量组	3.7689±0.4216	1.06±0.12	0.3254±0.1352

从表1可以看出，与对照组相比，小鼠灌胃紫阳富硒绿茶含硒多糖后，低、中、高剂量组小鼠碳廓清吞噬指数(A)增加33.06％(p＜0.05)、49.02％(p＜0.05)和73.46％(p＜0.05)；小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞试验中，低、中、高剂量组小鼠巨噬细胞吞噬鸡红细胞吞噬指数(B)依次增加6.98％(p＜0.05)、15.12％(p＜0.05)和23.26％(p＜0.05)；在小鼠迟发性变态反应实验中，低、中、高剂量组用SRBC攻击前后足趾厚度差值增加59.96％(p＜0.05)、117.39％(p＜0.05)和163.27％(p＜0.01)。

④抗体生成细胞(PFC)检测试验：于灌胃第25天给小鼠腹腔注射2％SRBC 0.2mL，于免疫后第5天处死，解剖取脾制备脾细胞悬液，用RPMI 1640完全培养液调整细胞浓度为5×10⁶个/mL，按程序方法制备琼脂糖玻片，在二氧化碳培养箱中孵育(37℃、5％CO₂)1.5h后加补体，再温育1.5h。计数每张琼脂薄层板上形成的溶血空斑数，结果见表2。

⑤血清溶血素测定：于灌胃第25天给小鼠腹腔注射2％SRBC(0.2mL/只)，于免疫后第5天摘小鼠眼球取血，分离血清并在微量血凝板上进行血清溶血素测定，37℃孵育3h后，统计血球凝集度，计算相应抗体积数，结果与对照组比较进行方差分析，见下表：

表2抗体生成细胞检测试验和血清溶血素测定结果

从表2可以看出，与对照组相比，小鼠灌胃紫阳富硒绿茶含硒多糖(Se-TPS)后，各剂量组PFC均高于对照组，低剂量处理组小鼠溶血空斑数增加29.25％(p＜0.05)；在血清溶血素测定试验中，各剂量组抗体体积均高于对照组，低剂量组抗体积数增加44.99％，差异显著(p＜0.05)。

⑥ConA诱导小鼠脾淋巴细胞转化试验(MTT)测定：对各组小鼠无菌取脾，制脾细胞悬液，用RPMT1640完全培养液调整脾细胞浓度为2×10⁶个/mL，按照MTT法进行淋巴细胞增殖反应，最后在752-C紫外可见分光光度计570nm波长处测其光密度值(OD)，计算ConA⁺与ConA^-各孔的光密度值差，结果见表3。

表3ConA诱导小鼠脾淋巴细胞转化试验(MTT)测定结果

从表3可以看出，与对照组相比，小鼠灌胃紫阳富硒绿茶含硒多糖(Se-TPS)后，低、中、高剂量组ConA⁺与ConA^-各孔的光密度值差分别增加39.73％(p＜0.05)、97.77％(p＜0.05)和258.93％(p＜0.05)，表明Se-TPS显著促进ConA诱导小鼠淋巴细胞的增殖，刺激脾细胞的免疫应答。

⑦脏/体比值测定：解剖各组小鼠取胸腺、脾脏称重，计算胸腺/体比值及脾/体比值，结果进行统计分析(t检验)，见下表：

表4脏/体比值测定结果

从表4中可以看出，与对照组相比，小鼠灌胃紫阳富硒绿茶含硒多糖后，各剂量组胸腺/体比值依次增加23.74％、36.33％和40.65％；脾/体比值依次增加11.34％、39.69％和53.87％，存在显著差异。

综合上述试验结果，小鼠经灌胃紫阳富硒绿茶含硒多糖，对小鼠体重无明显影响。该含硒多糖明显增强小鼠的碳廓清率力和提高小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬能力，可明显提高小鼠的血清溶血素含量，增加脾细胞的溶血空斑数，促进小鼠的迟发性超敏反应，促进ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化能力。因此，紫阳富硒绿茶含硒多糖对机体具有免疫调节作用。

三、抗肿瘤实验

将紫阳富硒绿茶含硒多糖配制成浓度为50μg/mL、100μg/mL、250μg/mL和500μg/mL的样品溶液，进行体外抗肿瘤实验。

①MTT比色法检测细胞增殖：取对数生长期的人结肠癌细胞LoVo、人乳腺癌细胞MCF-7和人肺癌细胞A549细胞，将LoVo、MCF-7和A549细胞分别制成细胞浓度为5×10⁴～1×10⁵个/mL的细胞悬液，接种于96孔培养板，每孔加100μL细胞悬液，置37℃，5％CO₂细胞培养箱中培养24h后，吸弃培养液，重新加入90μL细胞培养液，同时分别加入10μL不同浓度的样品溶液、或100μg/mL 5-氟尿嘧啶(5-Fu，阳性对照)或生理盐水(阴性对照)，继续培养44h，加入20μL浓度为5mg/mL的MTT，4h后加入三联溶解液(10％SDS、5％异丁醇、0.012mol/LHCl)终止反应，在酶标分析仪570nm处测定吸光值，按以下公式计算细胞生长抑制率：细胞生长抑制率(％)＝(阴性对照孔A₅₇₀-实验孔A₅₇₀)/对照孔A₅₇₀×100％。对测定结果进行统计学处理，结果见下表：

表5紫阳富硒绿茶含硒多糖对不同肿瘤细胞生长的抑制作用

从表中可以看出，紫阳富硒绿茶含硒多糖对不同的肿瘤细胞系(MCF-7、A549、LoVo)的生长抑制作用呈现良好的剂量-效应关系，同时其抑制率接近于同浓度的临床药物5-氟尿嘧啶(5-Fu：100μg/mL)。对于肺腺癌A549细胞，在紫阳富硒绿茶含硒多糖剂量为50，100，250和500μg/mL时，药物处理24h后抑制率分别为11.8％，25.9％，47.8％和65.2％；药物处理48h后对细胞增值的抑制率分别为15.8％，33.5％，53.8％和71.7％(p＜0.05 vs Control)。而阳性药物5-Fu在不同时间的抑制率为34.9％和43.5％，略高于同浓度的紫阳富硒绿茶含硒多糖。对于结肠癌LoVo细胞系，在紫阳富硒绿茶含硒多糖不同剂量时，给药24h后的抑制率分别为13.8％，35.9％，67.8％，79.8％；给药48h后的抑制率分别为18.8％，43.5％，77.8％，87.7％。对于乳腺癌MCF-7细胞，在紫阳富硒绿茶含硒多糖剂量为50，100，250和500μg/mL时，给药24h后的抑制率分别为21.8％，44.9％，77.8％，86.8％；给药48h后对其抑制率分别为28.8％，53.5％，82.8％和91.7％，而100μg/mL阳性药物在不同时间的抑制率分别为52.9％和64.4％，略高于同浓度的试验药物。

②流式细胞仪(FCM)测定细胞周期：取对数生长期的LoVo细胞，加入适量0.25％胰蛋白酶液消化细胞，使贴壁细胞脱落，用含10％胎牛血清的培养基制备成浓度为3×10⁵个/mL的细胞悬液，于6孔板中每孔接种1mL，置于37℃，5％CO₂培养箱培养24h，分别加入100和500μg/mL紫阳富硒绿茶含硒多糖溶液或100μg/mL 5-Fu或生理盐水，24h后细胞用胰酶消化，离心收集细胞，细胞沉淀用70％乙醇悬浮，在4℃冰箱固定12h以上，固定后的细胞用PBS洗两遍并悬浮，加入PI染液(终浓度为50μg/mL)，37℃避光温育30min，300目尼龙网滤过，流式细胞仪上计数20000个细胞，测定细胞各期DNA水平，分析细胞周期分布(激发波长488nm，发射波长525nm，激光功率260mm)。对测定结果进行统计学处理，结果分别见图7，图8，图9和图10。从图中可以看出，亚G1期(细胞凋亡率)呈现上升趋势，G0/G1期DNA含量逐渐降低，S期呈现较大幅度上升趋势，而G2/M期的变化则不明显。在紫阳富硒绿茶含硒多糖的浓度为100μg/mL时，G0/G1期DNA含量从57.6％下降到45.4％，S期则由31.5％上升至44.4％，G2/M期变化不大；在紫阳富硒绿茶含硒多糖的浓度为500μg/mL时，G0/G1期DNA含量从57.6％下降到41.1％，S期则由31.5％上升至49.5％，G2/M期由10.9％下降为9.4％，下降幅度几乎可以忽略不计，这说明紫阳富硒绿茶含硒多糖将LoVo细胞的生长阻滞在S期，使其正常的细胞生长周期无法进行到G2/M期，继而实现对肿瘤细胞生长的抑制作用。

③流式细胞仪(FCM)测定细胞凋亡率：细胞处理同②，48h后细胞用胰酶消化，离心收集细胞，然后按Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒说明进行操作，随后再用流式细胞仪计数10000个细胞，计算细胞凋亡率(激发波长488nm，发射波长525nm，激光功率260mm)。对测定结果进行统计学处理，结果分别见图11，图12，图13和图14。图11为加入生理盐水对细胞凋亡的影响，图12为加入100μg/mL 5-Fu对细胞凋亡的影响，图13为加入100μg/mL紫阳富硒绿茶含硒多糖溶液对细胞凋亡的影响，图14为加入500μg/mL紫阳富硒绿茶含硒多糖溶液对细胞凋亡的影响，从图中可以看出，加入生理盐水的细胞凋亡率为0.1％，紫阳富硒绿茶含硒多糖诱导细胞凋亡的凋亡率分别为13.43％(100μg/mL)和25.14％(500μg/mL)，而5-Fu(100μg/mL)的凋亡率18.0％，略高于同浓度的紫阳富硒绿茶含硒多糖处理组，与周期分析过程中亚G1期的比例相当，而当紫阳富硒绿茶含硒多糖的浓度升高时，细胞凋亡率明显增加，说明紫阳富硒绿茶含硒多糖具有明显的诱导结肠癌细胞凋亡的作用。

综合上述试验结果，通过MTT法初步确定紫阳富硒绿茶含硒多糖对A549，LoVo和MCF-7细胞增值均有较好的抑制作用。进一步采用流式细胞术研究发现紫阳富硒绿茶含硒多糖将LoVo细胞增值阻滞在S期，而且有较明显的诱导LoVo细胞凋亡作用，揭示紫阳富硒绿茶含硒多糖的抑瘤功效，特别是对结肠癌细胞的抑制作用。

四、治疗肝损伤实验

将健康成年二级昆明种雄性小鼠(由第四军医大学实验动物中心提供)72只随机分成6组，每组12只小鼠，其中一组为正常组(未接受CCl₄腹腔注射，灌胃生理盐水)，对其余五组小鼠腹腔注射CCl₄建立小鼠急性肝损伤模型组，并将五组编号为模型组(灌胃生理盐水)，阳性药物组(灌胃联苯双酯，灌胃剂量为200mg/kg.bw)，低剂量组(灌胃紫阳富硒绿茶含硒多糖Se-TPS，灌胃剂量为100mg/kg.bw)，中剂量组(Se-TPS，灌胃剂量为200mg/kg.bw)，高剂量组(Se-TPS，灌胃剂量为400mg/kg.bw)，对六组小鼠按上述方案每天灌胃一次，连续灌胃10天后，绝食一天，称量小鼠体重和肝重，并在小鼠眼球采血，随后进行各项指标的测定，测定方法如下：

1、小鼠肝指数测定：称量小鼠体重及肝重，计算肝指数(小鼠肝指数＝小鼠肝重/小鼠体重×100％)；结果见下表：

表6各组小鼠肝指数

组别

正常组

模型组

阳性组

低剂量组

中剂量组

高剂量组

肝指数

4.99±0.57

5.80±0.29

5.14±0.14

5.62±0.73

5.42±0.48

5.27±0.33

从表中可以看出，模型损伤组的小鼠肝指数明显下降，而灌胃护肝药物联苯双酯和紫阳富硒绿茶含硒多糖的小鼠肝指数与正常组相比无显著差异，说明紫阳富硒绿茶含硒多糖对小鼠急性肝损伤有保护作用。

2、小鼠血清各项活性指标测定：按照谷丙转氨酶(ALT)测定试剂盒使用说明书测定小鼠血清ALT活性；按照谷草转氨酶(AST)测定试剂盒使用说明书测定小鼠血清AST活性；按照乳酸脱氢酶(LDH)测定试剂盒使用说明书测定小鼠LDH活性；结果见下表：

表7各组小鼠血清各项指标活性测定结果

从表中可以看出，ALT、AST和LDH的测定结果均为阳性。与正常组相比，模型CCl₄损伤组血清ALT、AST和LDH活性依次增加136.25％、97.32％和88.85％，存在差异显著(p＜0.05)；与模型CCl₄损伤组相比，阳性药物组ALT、AST和LDH活性依次降低43.08％、40.64％、41.66％，差异显著(p＜0.05)；低、中、高剂量Se-TPS灌胃处理小鼠ALT活性分别降低30.21％(p＜0.05)、31.06％(p＜0.05)和42.62％(p＜0.05)；AST活性分别降低11.05％(p＜0.05)、27.32％(p＜0.05)和41.03％(p＜0.05)；LDH活性降低5.18％(p＞0.05)、16.68％(p＜0.05)和38.76％(p＜0.05)。可见，紫阳富硒绿茶含硒多糖对CCl₄所致急性肝损伤具有明显的治疗作用。

3、小鼠肝组织匀浆各项活性指标测定：按照T-SOD测定试剂盒使用说明书测定小鼠肝组织匀浆总超氧化物歧化酶活性；按照GSH-Px测定试剂盒使用说明书测定小鼠肝组织匀浆谷胱甘肽过氧化物酶活性；按照MDA测定试剂盒使用说明书测定小鼠肝组织匀浆丙二醛活性。结果见下表：

表8各组小鼠肝组织匀浆各项指标活性测定结果

从表中可以看出，与正常组相比，模型组肝组织匀浆GSH-Px、SOD活性分别降低44.17％和29.44％，而MDA浓度升高20.83％，差异均有显著性(p＜0.05)；与模型损伤组相比，阳性药物组GSH-Px和SOD活性分别升高64.23％和31.37％，而MDA降低16.81％，差异均有显著性(p＜0.05)；中、低、高剂量组肝组织匀浆GSH-Px活性分别升高46.42％、21.63％和56.28％，SOD活性分别升高7.65％、14.16％和21.40％，而MDA含量分别降低6.71％、4.74％和9.91％，存在显著差异(p＜0.05，p＜0.01)。可见，紫阳富硒绿茶含硒多糖对CCl₄所致急性肝损伤具有显著的治疗作用。

综合以上实验结果，紫阳富硒绿茶含硒多糖能显著降低小鼠血清ALT、AST和LDH的活性，提高肝组织GSH-Px和SOD活性而降低MDA水平，对CCl₄诱导小鼠肝损伤有明显的保护功效，揭示了紫阳富硒绿茶含硒多糖具有治疗肝损伤的作用。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明做任何限制，凡是根据发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效结构变化，均仍属于本发明技术方案的保护范围内。

Claims (10)

1.一种紫阳富硒绿茶含硒多糖，其特征在于，该含硒多糖的组成按质量含量计为：硒1.5ppm～8.5ppm，余量为杂多糖；所述杂多糖的组成按摩尔百分比计为：甘露糖3.3%～5.3%，核糖1%～2%，鼠李糖3.5%～5%，葡萄糖醛酸2%～3.5%，半乳糖醛酸2.6%～3.8%，葡萄糖30%～34.2%，木糖3.6%～5.6%，半乳糖19.8%～23.2%，阿拉伯糖21.5%～25.6%。

2.根据权利要求1所述的一种紫阳富硒绿茶含硒多糖，其特征在于，该含硒多糖的组成按质量含量计为：硒3ppm～7ppm，余量为杂多糖；所述杂多糖的组成按摩尔百分比计为：甘露糖4.1%～4.9%，核糖1.2%～1.8%，鼠李糖4.0%～4.5%，葡萄糖醛酸2.3%～2.9%，半乳糖醛酸2.8%～3.4%，葡萄糖31%～33.5%，木糖4%～5%，半乳糖20.3%～22.6%，阿拉伯糖22.5%～24.7%。

3.根据权利要求2所述的一种紫阳富硒绿茶含硒多糖，其特征在于，该含硒多糖的组成按质量含量计为：硒5ppm，余量为杂多糖；所述杂多糖的组成按摩尔百分比计为：甘露糖4.5%，核糖1.6%，鼠李糖4.3%，葡萄糖醛酸2.7%，半乳糖醛酸3.2%，葡萄糖32.7%，木糖4.6%，半乳糖22.4%，阿拉伯糖24%。

4.一种制备如权利要求1、2或3所述紫阳富硒绿茶含硒多糖的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

（1）将紫阳富硒绿茶茶叶在自然条件下晾晒干或烘干，然后粉碎成茶叶粉末；

（2）向步骤（1）中所述茶叶粉末中加入所述茶叶粉末质量10～15倍且温度为80℃的蒸馏水，浸提2h后过滤；

（3）重复步骤（2）2～3次，合并滤液后浓缩至滤液体积的1/4；

（4）向步骤（3）中浓缩后的滤液中加入3～5倍体积的无水乙醇浸泡，离心后收集沉淀；

（5）重复步骤（4）三次后向收集的沉淀中加入所述沉淀质量3～5倍的蒸馏水，反复冻融8～10次除去蛋白，离心，弃沉淀，将上清液用蒸馏水透析72h后冷冻干燥，得到紫阳富硒绿茶含硒多糖。

5.一种如权利要求1所述紫阳富硒绿茶含硒多糖作为功能性保健食品的用途。

6.根据权利要求5所述的用途，其特征在于，所述功能性保健食品为增强免疫保健食品或护肝保健食品。

7.一种如权利要求1所述紫阳富硒绿茶含硒多糖在制备免疫增强剂药物中的用途。

8.一种如权利要求1所述紫阳富硒绿茶含硒多糖在制备治疗肿瘤的药物中的用途。

9.根据权利要求8所述的用途，其特征在于，所述治疗肿瘤的药物为治疗结肠癌的药物。

10.一种如权利要求1所述紫阳富硒绿茶含硒多糖在制备治疗肝损伤的药物中的用途。

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