CN102093380A

CN102093380A - 环淫羊藿素苷元及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN102093380A
Application number: CN2011100283740A
Authority: CN
Inventors: 谢娟平; 向纪明; 王浩东
Original assignee: Ankang University
Current assignee: Ankang University
Priority date: 2011-01-26
Filing date: 2011-01-26
Publication date: 2011-06-15
Anticipated expiration: 2031-01-26
Also published as: CN102093380B

Abstract

本发明公开了结构式如下所示的环淫羊藿素苷元，其制备方法包括以下步骤：（1）将干燥的淫羊藿粉碎或切段，加水加热提取，提取物过滤得浓缩液；（2）浓缩液上大孔树脂层析提纯，待树脂充分吸附后，用水洗脱至洗脱液无色，弃去，再用20-50%甲醇或乙醇洗脱，收集洗脱液，回收甲醇或乙醇，干燥；（3）将步骤（2）所得的干燥物加入体积比为（2-6）:100的强酸甲醇或乙醇溶液，充分搅拌后加热回流，减压回收甲醇或乙醇，浓缩液用乙酸乙酯萃取，蒸去溶剂，即得环淫羊藿素苷元粗品。制备得到的环淫羊藿素苷元(含量>90%)可用于抗氧化、抗菌、改善心脑血管、抗骨质疏松、抗炎、增强免疫和改善雌激素水平。

Description

环淫羊藿素苷元及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及环淫羊藿素苷元及其制备方法和在药物、保健品制备中的应用，属于天然药物提取技术领域。

背景技术

淫羊藿药用历史悠久，中国药典现用淫羊藿有五种：淫羊藿、心叶淫羊藿、箭叶淫羊藿、朝鲜淫羊藿和巫山淫羊藿。

关于淫羊藿的药用成分研究目前主要集中在淫羊藿总苷和淫羊藿苷的研究，对于淫羊藿中主要成分的衍生物及其生物活性研究未见报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种从淫羊藿中分离提取的环淫羊藿素苷元。

本发明的另一目的在于提供上述环淫羊藿素苷元的制备方法。

本发明公开的环淫羊藿素苷元（3,5,4′—三羟基—6″,6″—二甲基二氢吡喃并〈2″,3″:7,8〉黄酮）具有如下结构，是3,5,4′ —三羟基黄酮类化合物，具有抗氧化、抗炎、抗菌等生物活性，淫羊藿总黄酮还具有改善心脑血管、抗骨质疏松、增强免疫和雌性激素样生物活性。

环淫羊藿素苷元结构分析：ESI-MS质谱给出m/z355【M+H】⁺,¹HNMR(DMSO，

400MHz，30℃) ,δ1.32（6H,s,）1.8(2H, t, J=7.4Hz,) ,2.8(2H, t, J=7.4Hz),　6.1(1H, s, H-6),6.9(2H, t, J=9.0Hz,H-3′,5′), 8.1(2H, d, J=9.0Hz, H-2′,6′), 10.3(2H, s, OH-3，OH-5) , 12.3(1H, s, OH-4′); ¹³CNMR((DMSO, 75MHz, 30℃),δ153.00 (C-2) ,136.34(C-3),176.14(C-4), 159.04(C-5), 98.40(C-6), 159.31(C-7), 99.66(C-8), 146.71 (C-9), 103.91 (C-10), 121.86 (C-1′) , 129.28 (C-2′,6′) , 115.53 (C-3′,5′) , 157.96 (C-4′), 30.97 (C-1″), 15.58 (C-2″), 76.09 (C-3″), 25.25 (C-4″,5″) 。

本发明制备的淫羊藿衍生物---环淫羊藿素苷元，其结构和现有成分的主要区别在于8位的异戊烯基成环，具有3,5,4′—三羟基，其性质活泼，结构稳定，具有较强的抗氧化、抗菌、抗炎等生物活性。

上述环淫羊藿素苷元的制备方法，包括以下步骤：

（1）将干燥的淫羊藿粉碎或切段，加6-10倍量水加热提取，提取物过滤，浓缩；

（2）将步骤（1）所得的浓缩液上大孔树脂层析提纯，静置2-3h，待树脂充分吸附后，用水洗脱至洗脱液无色，弃去，再用20-50%甲醇或乙醇水溶液洗脱，流速2-3mL/min，收集洗脱液，回收甲醇或乙醇，干燥；

（3）将步骤（2）所得的干燥物加入强酸与甲醇或乙醇体积比为（2-7）:100的强酸醇溶液，充分搅拌后加热回流，减压回收甲醇或乙醇，浓缩液用乙酸乙酯萃取，蒸去溶剂，即得环淫羊藿素苷元粗品；

（4）将步骤（3）所得的环淫羊藿素苷元粗品用乙酸乙酯或乙醇重结晶得到高纯度环淫羊藿素苷元。

所述的大孔树脂是LSA-20树脂、D101树脂、AB-8树脂、DM130树脂或聚酰胺树脂（西安蓝晓树脂股份有限公司提供）。所述的强酸为浓硫酸或浓盐酸。

从淫羊藿中提出粗提物，经酸水解得到环淫羊藿素苷元(含量>90%)，再制成药物及保健食品，两者均可用于抗氧化、抗菌、改善心脑血管、抗骨质疏松、抗炎、增强免疫和改善雌激素水平。本发明的方法操作简单可行，制得的环淫羊藿苷元纯度较高，能进行大规模生产。

本发明还涉及含环淫羊藿素苷元在50%以上的环淫羊藿素苷元提取物作为制备抗氧化药物、改善心脑血管药物、抗骨质疏松药物、增强免疫药物、改善心脑血管药物、改善雌激素水平药物、抗炎、抗菌药物及保健食品中的应用，例如含量以环淫羊藿素苷元计60%，70%，80%，90%等。

用环淫羊藿素苷元有效成分制备抗氧化、抗炎、抗菌和增强免疫的药物和保健食品，以常规制剂的形式来使用；所述的常规制剂含作为活性成分在制剂中与药学和保健食品上可接受的载体如适宜于胃肠内和胃肠外给予的有机或无机的固体或液体赋形剂混合，该制剂可以是固体形式如片剂、胶囊剂、散剂、丸剂、颗粒剂，也可以是液体形式如注射剂、乳剂等。

上述制剂中可含有辅助物质、稳定剂、润湿剂和其它常用的添加剂，如乳糖、柠檬酸、酒石酸、硬脂酸镁、石膏粉、蔗糖、玉米淀粉、滑石粉、明胶、琼脂、果胶、花生油、橄榄油、可可脂、乙二酸、抗坏血酸、甘露醇等。

附图说明

图1以样品（mg）对DPPH自由基清除率曲线；

图2为环淫羊藿素苷元MS图谱；

图3为环淫羊藿素苷元¹HNMR图谱；

图4为环淫羊藿素苷元¹³CNMR图谱；

图5为环淫羊藿素苷元对照品HPLC图谱，定量方法：面积归一法；检测波长270nm；流速1mL/min；进样20uL；色谱柱：ZORBAX-C₁₈(4.6×150mm,5um)；流动相：乙腈-水=60:40）；

图6为环淫羊藿素苷元对照品HPLC图谱，定量方法：面积归一法；检测波长270nm；流速1mL/min；进样20uL；色谱柱：ZORBAX-C₁₈(4.6×150mm,5um)；流动相：乙腈-水=70:30）；

图7为环淫羊藿素苷元对照品HPLC图谱，定量方法：面积归一法；检测波长270nm；流速1mL/min；进样20uL；色谱柱：ZORBAX-C₁₈(4.6×150mm,5um)；流动相：乙腈-水=68:32）；

图8为环淫羊藿素苷元对照品HPLC图谱，定量方法：面积归一法；检测波长270nm；流速1mL/min；进样20uL；色谱柱：ZORBAX-C₁₈(4.6×150mm,5um)；流动相：乙腈-水=60:40）。

具体实施方式

取淫羊藿干燥药材，用8～20倍量水煎煮3次，每次1小时，合并煎煮液，离心取上清液；水煎煮液上D101大孔树脂柱，每克树脂上3mL药液，大孔树脂先用水洗脱，弃去洗脱液，再用3～8倍的30-50%乙醇洗脱，收集洗脱液，回收洗脱液中的乙醇，减压抽干，得残留物，将残留物溶于浓度为4%的酸性甲醇中120℃热水解4h，回收甲醇后用乙酸乙酯萃取，回收乙酸乙酯，放置，析出结晶，过滤，得高纯度环淫羊藿素苷元（含量>90%)。

为更好的理解本发明的实质，下面将用环淫羊藿素苷元的药理实验及结果来说明其在制药和保健食品中的用途。

一、受试提取物：环淫羊藿素苷元提取物。

1.1性状: 淡黄色至黄色的固体粉末，味微苦。

1.2规格: 含环淫羊藿素苷元≥90%。

1.3溶剂: 乙醇或甲醇。

1.4储存条件：4℃，密闭保存。

二、抗氧化作用:

2.1实验材料：1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）

2.2实验方法与结果：环淫羊藿素苷元抗氧化作用

本实验以体外抗氧化体系为模型，环淫羊藿素苷元成分对DPPH自由基的抗氧化活性，揭示了环淫羊藿素苷元的保健功能。

环淫羊藿素苷元以甲醇溶解，配制为浓度约为0.448 mg/ mL的溶液，作为样品溶液。分别吸取不同量的样品溶液于5 mL容量瓶中，各加入4 mL的 0.025 mg / mL DPPH溶液，以甲醇定容至5 mL，同法制备空白对照溶液。室温下避光静置1小时后于516 nm处测定吸光值。DPPH · 的清除率通过下式计算：清除率/%=(A ₀－A _t)/A ₀×100，式中A ₀为体系中DPPH自由基的初始浓度时的吸光度值；A _t为t时刻溶液中DPPH自由基的浓度的吸光度值。

以样品（mg）/ DPPH·（mg）对DPPH自由基清除率作图，就可以得到清除50%DPPH自由基时所需样品的量，即EC₅₀值。

图1实验结果表明，环淫羊藿素苷元在试验范围内，随着样品加入量的增加，清除能力迅速增加，到达约2mg/mg(样品/DPPH)时达到最大，此后不再有显著增加，其EC₅₀值为1.014，可以看出，抗氧化能力显著高于文献所载同类植物提取物。

三、抗炎作用

3.1实验材料：Vistar健康大鼠，体重210g～230g，以上动物均由西安交通大学药理实验动物中心提供，实验期间饲以该中心提供的固体饲料，自由饮水。

3.2实验方法与结果：环淫羊藿素苷元抗炎作用

3.3.1致炎模型的制备：致炎物质：纯蛋清；阳性对照品：吲哚美辛。大鼠足趾皮下注射纯蛋清0.1mL/只，鼠爪在0.5h内出现红、热、肿、痛等早期急性炎症表现，在0.5h后开始实验观察。

3.3.2环淫羊藿素苷元对纯蛋清所致大鼠足趾肿胀的影响：取体重200g～220g的大鼠20只，随机分为4组，每组5只。分别为环淫羊藿素苷元高剂量组（0.448mg/100g）、低剂量组（0.224 mg/100g）、蒸馏水对照组、吲哚美辛对照组（1 mg/100g）。环淫羊藿素苷元前两组每次分别尾静脉注射高剂量、低剂量环淫羊藿素苷元混悬液1.0mL/100g，后两组分别尾静脉注射同容积的生理盐水和吲哚美辛。以上各组每日尾静脉注射1次，连续注射5d。在第6d尾静脉注射前，每鼠左爪正面上端用圆珠笔作一清晰横线，用排水法测鼠爪体积2次，每次间隔0.5h，两次体积的平均值为致炎前体积。然后，第1、2、3、4组按上述尾静脉注射给药，1h后在大鼠左后脚趾皮下注射纯蛋清0.1mL/只（0.25mL注射器，4号针头），第4组0.5h后注射纯蛋清0.1mL/只。然后于0.5、1、2、4、5h测鼠爪体积１次，计算鼠爪肿胀度（肿胀度=致炎后体积—致炎前体积）。所得数据进行统计学处理，结果见表1。

经统计学分析，与蒸馏水对照组相比较差异具有显著性：P<0.01，由表1可知，高剂量组与蒸馏水对照组比较，有极显著性差异（P<0.01）；低剂量组有显著性差异（P<0.05）；环淫羊藿素苷元高、低剂量组与吲哚美辛对照组比较，均无显著性差异（P>0.05）。由此可见，环淫羊藿素苷元有显著的抗炎作用，其抗炎效果与剂量有依赖关系。

四、抗菌作用

4.1实验材料：供试菌种，大肠杆菌(Escherichia coil) 由安康学院农学与生命科学学院微生物实验室提供。LS-S11 全自动立式电热压力蒸汽灭菌器，上海博迅实业有限公司医疗设备厂；GZX-9246MBE电热恒温鼓风干燥箱，上海博迅实业有限公司医疗设备厂。

4.2实验方法与结果：采用液体培养基法，取环淫羊藿素苷元，用甲醇配制成不同浓度(2-50μg/mL)的溶液，分别加入液体培养基和大肠杆菌菌悬液，同时以水和甲醇作为对照，加入大肠杆菌菌悬液，搅拌均匀，于37℃恒温振荡8小时，测定吸光值，各样品吸光值均有出现较大程度下降，结果如下：

液体菌悬液的吸光值降低，代表样品有一定的抗大肠杆菌的能力，从表２可以看出，加样菌悬液的吸光值均低于水和甲醇对照菌悬液，表明环淫羊藿素苷元对大肠杆菌有明显的抑制作用，具有一定的应用前景。

抑菌成分热稳定性实验：将环淫羊藿素苷元分别置于80、100、121℃下热处理15min，取大肠杆菌，测定其吸光值大小，结果无显著性差异，表明环淫羊藿素苷元对热稳定性良好。

五、制剂形式

可以环淫羊藿素苷元为原料，制成各种常用制剂类型如胶囊剂、片剂等。

实施例1

将干燥的淫羊藿100g粉碎或切段，以水为溶剂加热提取两次，第一次加入8倍量水加热提取2h，第二次加入6倍量水加热提取1h，提取物过滤，浓缩，上LSA-20树脂（西安蓝晓树脂股份有限公司提供）层析提纯，上柱后静置2-3h，待树脂充分吸附后，用水洗脱至洗脱液无色，弃去，再用30%乙醇洗脱，收集洗脱液，回收乙醇，干燥。向干燥物中加入500mL的盐酸甲醇溶液（485mL的甲醇溶液，15mL的38%的盐酸），水浴回流5h后。减压回收甲醇，浓缩液用乙酸乙酯萃取，蒸去溶剂，即得环淫羊藿素苷元粗品。将所得的环淫羊藿素苷元粗品加入适量乙醇，加热溶解，放置析晶，得环淫羊藿素苷元黄色粉末1.36g，ESI-MS质谱给出m/z355【M+H】⁺,¹HNMR(DMSO，400MHz，30℃) ,δ1.32（6H,s,）1.8(2H, t, J=7.4Hz,) ,2.8(2H, t, J=7.4Hz),　6.1(1H, s, H-6),6.9(2H, t, J=9.0Hz,H-3′,5′), 8.1(2H, d, J=9.0Hz, H-2′,6′), 10.3(2H, s, OH-3，OH-5) , 12.3(1H, s, OH-4′); ¹³CNMR((DMSO, 75MHz, 30℃),δ153.00 (C-2) ,136.34(C-3),176.14(C-4), 159.04(C-5), 98.40(C-6), 159.31(C-7), 99.66(C-8), 146.71 (C-9), 103.91 (C-10), 121.86 (C-1′) , 129.28 (C-2′,6′) , 115.53 (C-3′,5′) , 157.96 (C-4′), 30.97 (C-1″), 15.58 (C-2″), 76.09 (C-3″), 25.25 (C-4″,5″)。样品MS、¹HNMR、¹³CNMR图谱见附图2-4，HPLC图谱见图5。

实施例2

将干燥的淫羊藿100g粉碎或切段，以水为溶剂加热提取两次，第一次加入10倍量水加热提取2h，第二次加入8倍量水加热提取1h，提取物过滤，浓缩，上D101树脂（西安蓝晓树脂股份有限公司提供）层析提纯，上柱后静置2-3h，待树脂充分吸附后，用水洗脱至洗脱液无色，弃去，再用50%乙醇洗脱，收集洗脱液，回收乙醇，干燥。向干燥物中加入500mL的硫酸甲醇（475mL的甲醇溶液，25mL的38%的盐酸），水浴回流6h后。减压回收甲醇，浓缩液用氯仿萃取，蒸去溶剂，即得环淫羊藿素苷元粗品。将所得的环淫羊藿素苷元粗品加入适量乙酸乙酯，加热溶解，放置析晶，即得高纯度环淫羊藿素苷元1.28g，与实例1为同一化合物，经HPLC检测环淫羊藿苷元纯度高于90%，HPLC图谱见图6。

实施例3

将干燥的淫羊藿100g粉碎或切段，以水为溶剂加热提取两次，第一次加入8倍量水加热提取2h，第二次加入6倍量水加热提取1h，提取物过滤，浓缩，上聚酰胺树脂（西安蓝晓树脂股份有限公司提供）层析提纯，上柱后静置2-3h，待树脂充分吸附后，用水洗脱至洗脱液无色，弃去，再用40%乙醇洗脱，收集洗脱液，回收乙醇，干燥。向干燥物中加入500mL的硫酸甲醇（480mL甲醇溶液，20mL的98%的硫酸），水浴回流3h后。减压回收甲醇，浓缩液用氯仿萃取，蒸去溶剂，即得环淫羊藿素苷元粗品。将所得的环淫羊藿素苷元粗品加入适量乙酸乙酯，加热溶解，放置析晶，得环淫羊藿素苷元1.31g，与实例1为同一化合物，经HPLC检测环淫羊藿苷元纯度高于90%，HPLC图谱见图7。

实施例4

将干燥的淫羊藿100g粉碎或切段，以水为溶剂加热提取两次，第一次加入10倍量水加热提取2h，第二次加入8倍量水加热提取1h，提取物过滤，浓缩，上LSA-20树脂（西安蓝晓树脂股份有限公司提供）层析提纯，上柱后静置2-3h，待树脂充分吸附后，用水洗脱至洗脱液无色，弃去，再用50%甲醇洗脱，收集洗脱液，回收甲醇，干燥。向干燥物中加入500mL的硫酸乙醇（470mL的乙醇溶液，30mL98%的硫酸），水浴回流4h后。减压回收甲醇，浓缩液用乙酸乙酯萃取，蒸去溶剂，即得环淫羊藿素苷元粗品。将所得的环淫羊藿素苷元粗品加入适量乙醇，加热溶解，放置析晶，得环淫羊藿素苷元1.45g，与实例1为同一化合物，经HPLC检测环淫羊藿苷元纯度高于90%，HPLC图谱见图8。

Claims

1.下述结构式所示的环淫羊藿素苷元，

。

2.权利要求1所述的环淫羊藿素苷元的制备方法，包括以下步骤：

（1）将干燥的淫羊藿粉碎或切段，加水加热提取，提取物过滤得浓缩液；

（2）浓缩液上大孔树脂层析提纯，待树脂充分吸附后，用水洗脱至洗脱液无色，弃去，再用20-50%甲醇或乙醇洗脱，收集洗脱液，回收甲醇或乙醇，干燥；

（3）将步骤（2）所得的干燥物加入体积比为（2-7）:100强酸的甲醇或乙醇溶液，充分搅拌后加热回流，减压回收甲醇或乙醇，浓缩液用乙酸乙酯萃取，蒸去溶剂，即得环淫羊藿素苷元粗品。

3.根据权利要求2所述的环淫羊藿素苷元的提取方法，其特征在于：将步骤（3）所得的环淫羊藿素苷元粗品用乙酸乙酯或乙醇重结晶提纯。

4.根据权利要求2所述的环淫羊藿素苷元的提取方法，其特征在于：所述的树脂是LSA-20树脂、D101树脂、AB-8树脂、DM130树脂或聚酰胺树脂。

5.根据权利要求2所述的环淫羊藿素苷元的提取方法，其特征在于：所述的强酸是浓硫酸或浓盐酸。

6.一种药物组合物，其含有权利要求1中所述的环淫羊藿素苷元，以及一种或多种药物载体或赋形剂。

7.权利要求1所述的环淫羊藿素苷元在制备抗氧化、改善心脑血管药物和保健食品中的应用。

8.权利要求1所述的环淫羊藿素苷元在制备抗骨质疏松药物和保健食品中的应用。

9.权利要求1所述的环淫羊藿素苷元在制备抗炎、抗菌药物和保健食品中的应用。

10. 权利要求1所述的环淫羊藿素苷元在制备增强免疫药物和保健食品中的应用。