CN1165545C - 从栾树植物中分离提取总黄酮部位的方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及从栾树植物中分离提取总黄酮部位7的分离提取方法，总黄酮部位可以用于制造抗癌、免疫抑制等药物。

Description

从栾树植物中分离提取总黄酮部位的方法及其应用

技术领域

本发明涉及从栾树植物中分离提取总黄酮部位、两种新黄酮甙有效成分栾树酮A(paniculatonoid A)和栾树酮B(paniculatonoid B)的分离提取方法，本发明还涉及它们在抗癌药中的应用。

背景技术

无患子科栾树属(Koelreuteria Laxm)植物，全世界共有4种，中国产3种，1个变种，另一种产于斐济群岛，落叶灌木至乔木，野生于山林或栽培于庭院。其中栾树(Koelreuteria paniculata Laxm)自西南、华南至华北，辽宁广有分布，台湾栾树(Koelreuteria henryi Dummer)独产于台湾省，复羽叶栾树(Koelreuteria bipinnata Franch)产于广东、广西、华东和西南地区，俗名称为摇钱树。其中变种全缘叶栾树(Koelreuteriabipinnata var.integrifoliola(Merr)T.Chen)则常见于安徽，浙江等地。该植物资源丰富。

我国学者马广恩等曾在“中草药，1998.29：84”中报道了从栾树的乙酸乙酯提取物中得到总没食子酸类化合物，并阐明总没食子酸类化合物具有抗肿瘤活性，但对其中的黄酮类化合物、特别是栾树酮A和B的抗肿瘤活性没有报道。

无患子科栾树属植物具有一定的药物价值。《神农本草经》(陈修圆著(清)，1959年，人民卫生出版社出版)中记载其“主目痛，泪出伤眦，消目肿”；《唐本草》(苏氏(唐)著，1981年，合肥科学技术出版社出版)记载“和黄连共煎，疗目赤烂”，民间用来“疏风清热，解毒杀虫”。有关该属植物的化学与生物活性研究，国内外均少报道。Chirva，V.Ya等在Khim.Prir.soedin，1970，6，p.328中报道了从种子中分离到栾树皂甙A和B，并测定其化学结构为三萜皂甙。Carlson，H.J.等人在Antibiotics andChemotheropy，1951，1，p.431中报道，发现栾树叶中含有没食子酸甲酯，对多种菌尤其是真菌有一定抑制作用。陈国联等在陕西中医，1985，6(3)，p.144中进一步证实了该植物叶的水性提取物对金黄色葡萄球菌、白色葡萄球菌和变形杆菌具有一定的抑制作用，但未见有效成分的报道。日本人hutano，T.等在Planta Medica，1991，57(1)，p83中报道，在栾树中发现了对黄嘌呤氧化酶(XOD)自由基具有清除作用的没食子酰槲皮甙。Abou-Shoer.M.等在J.Nat.Prod，1993，56(6)，p.967报道，从台湾栾树枝叶中分离到对与癌症有关的酪氨酸蛋白激酶(PTK)有抑制作用的黄酮类化合物。Song YN等在Chang C.J.，J.Nat.Prod.，1994，57(12)，p.1670中报道，从台湾栾树醇提取物的弱极性部位分离到3种体外对人肺癌(A-549)、人乳腺癌(MCF-7)和大肠腺癌(HT-29)等8种细胞株有细胞毒作用和微管聚合酶抑制作用的环木质素类化合物，与抗癌鬼臼毒素相近，但均属脂溶性的木质素类化合物，开发有限。

本发明克服了现有技术中的不足，提供了从栾树植物中分离提取总黄酮部位、两种新黄酮甙有效成分栾树酮A和栾树酮B的方法，以及它们在抗肿瘤药物和免疫抑制作用药物中的应用。

发明内容

本发明从栾树植物中分离提取总黄酮部位的方法和步骤如下：

1.取原料药材栾树的枝叶、花、果实干品或新鲜物，加入溶媒回流提取或浸泡渗漉提取3-4次，每次回流提取或浸泡渗漉提取时新鲜枝叶与溶媒的重量比为1∶2-6、干燥枝叶与溶媒重量比为1∶4-12、新鲜花与溶媒的重量比为1∶2-6、干燥花与溶媒的重量比为1∶4-12、新鲜果实与溶媒的重量比为1∶2-6、干燥果实与溶媒的重量比为1∶4-12，每次回流提取时间每次1-3小时，每次浸泡渗漉提取时间为2-8天，然后控温低于60℃、对提取液进行减压浓缩除去溶媒，减压浓缩至浓缩物比重为1.2-1.4，得提取物A；

所述溶媒纯度为95％乙醇或含有体积百分比10-80％水的C1-4醇或纯丙酮或含有体积百分比70-80％丙酮水溶液。

2.将步骤1中得到的提取物A溶解于水得到水溶液，提取物A的重量公斤数与水的体积升数之比＝1∶2-6，所得水溶液再用有机溶媒萃取一次或多次，每次有机溶媒与水溶液的体积比为1∶1-4，静置分层后，分离弃去有机溶媒层，保留水液；

所述有机溶媒为石油醚或C6-C7的烷烃。

3.对步骤2中得到的水溶液，在低于60℃条件下进行减压浓缩，浓缩至比重为1.2-1.4，然后加95％乙醇至醇度在80％-90％范围，在4-5℃醇沉5-24小时，过滤，弃沉淀物；上清液在低于60℃条件下减压浓缩至比重为1.2-1.4，重复上述醇沉操作1-3次；过滤，然后将上清液，在低于60℃条件下减压浓缩，完全除去醇和水，得固体提取物B；

4.将步骤3中得到的固体提取物B，进一步用4％-10％的盐酸、硫酸或醋酸溶解，然后过滤，再用氢氧化钠或碳酸钠将滤液中和至pH值为7，过滤后，滤液再用氢氧化钠或碳酸钠中和至pH值为8，然后过滤，滤液再用氢氧化钠或碳酸钠中和至pH值为9，然后过滤，合并收集固体物得C，水液进一步用正丁醇萃取1至3次，每次水液和正丁醇的体积比为2∶1-1∶2，分离收集正丁醇溶液，在低于60℃条件下减压浓缩或温度不高于-40℃条件下真空干燥或温度不高于100℃条件下喷雾干燥，得到干燥物D，干燥物D和固体物C可以合并保存，也可以分别保存，它们统称为总黄酮部位。

本发明的总黄酮有效部位的可测总黄酮成分大于50％。

所得到的总黄酮的成分主要有：

2”-没食子酰基槲皮苷1(quercitrin-2”-gallate)；槲皮苷2(quercitrin)；金丝桃甙3，山奈酚-3-O-鼠李糖苷4(kaempferol-3-O-rhamnoside)，2”-没食子酰金丝桃甙5，山奈酚6(kaempferol)，儿茶素7，三没食子酰儿茶素8；槲皮素-3-α-L-阿拉伯糖苷9；槲皮素-3-β-D-葡萄糖-7-鼠李糖苷10；槲皮素-7-鼠李糖昔11；3，4-二羟基苯丙烯醇12：3’-甲氧基槲皮素13。

本发明栾树酮A和栾树酮B的分离提取方法和步骤如下：

1.取干燥的栾树种子，将其磨成粗粉，用石油醚或环己烷回流1-3次，每次1-3小时，每次粗干粉的重量公斤数∶石油醚或环己烷体积升数＝1∶6-12；将残渣用溶媒回流1-3小时或用溶媒冷浸不超过一星期，回流或冷浸的次数为2-4次，溶媒是指95％乙醇或含有10-80％(体积比)水的C1-4醇或纯丙酮或含有20-30％(体积比)水的丙酮或水，每次溶媒的加入量按药材粗干粉量计算，粗干粉的重量公斤数∶溶媒体积升数＝1∶4-10；然后将提取液在低于60℃条件下进行减压浓缩至比重为1.2-1.4的浸膏，即浓缩物AA。

2.将步骤1得到的浓缩物AA，用色谱法进行一次或多次的同种或不同种的层析法纯化，得到纯品栾树酮A和栾树酮B；色谱法层析纯化的具体步骤为：取层析柱，用填料装柱，用洗脱液洗脱，分别收集含栾树酮A和栾树酮B的部位，得到纯化了的栾树酮A或栾树酮B；对于色谱法中使用的不同填料，采取不同的条件，具体为：1)硅胶层析柱：取常压玻璃层析柱，以60-400目硅胶为填料，提取浓缩物AA与硅胶重量份数比在1∶10-1∶300之间，以体积比为氯仿∶甲醇＝5-1∶1或二氯甲烷∶甲醇＝5-1∶1或二氯甲烷∶异丙醇＝10-1∶1或环己烷∶丙酮＝2∶2-6的混合液为等梯度洗脱液进行等梯度洗脱，或以体积比为氯仿∶甲醇＝5-1∶1的混合液为梯度洗脱液即依次以5∶1、4∶1、3∶1、2∶1、1∶1的混合液为梯度洗脱液，进行梯度洗脱，每次洗脱到洗脱流出液中不含有样品成分为止，再增加极性梯度进行下一次洗脱，分别收集含栾树酮A和栾树酮B的流份，再在低于50℃温度下分别减压浓缩成固体；2)D101大孔树脂层析柱：取常压玻璃层析柱，以D101大孔树脂为填料，提取浓缩物AA与填料的重量份数比在1∶20-1∶200之间，先用水溶解浓缩物AA，浓缩物AA的重量公斤数与水的体积升数之比＝2∶5，将水溶液过滤，滤液加于大孔树脂上，依次以体积百分比在0-100％之间的乙醇水溶液为梯度洗脱液，每次增加10％的比例进行梯度洗脱，每次洗脱到洗脱流出液中不含有样品成分为止，再增加极性梯度进行下一次洗脱，分别将收集到的栾树酮A和栾树酮B的流份，再在低于60℃温度下分别减压浓缩成固体；3)中性氧化铝层析柱：取常压或真空玻璃层析柱，以60-300目中性氧化铝为填料，提取浓缩物AA与中性氧化铝的重量份数比在1∶20-1∶200之间，以体积比在1∶0.5-1∶5之间的二氯甲烷和甲醇的混合溶剂或二氯甲烷和异丙醇的混合溶剂为梯度洗脱液，即依次以2∶1、1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5的混合液为梯度洗脱液，进行梯度洗脱，每次洗脱到洗脱流出液中不含有样品成分为止，再增加极性梯度进行下一次洗脱，分别收集含栾树酮A和栾树酮B的洗脱液，控制温度低于60℃分别减压浓缩成固体；4)聚酰胺层析柱：取常压玻璃层析柱，以60-300目聚酰胺为填料，提取浓缩物AA与聚酰胺的重量份数比在1∶20-1∶200之间，以体积比在1∶1-1∶10之间的二氯甲烷和异丙醇的的混合溶剂为梯度洗脱液即依次以1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6、1∶7、1∶8、1∶9、1∶10的混合液为梯度洗脱液，或以体积比在1∶0.5-10之间的二氯甲烷和甲醇的混合溶剂为梯度洗脱液即依次以2∶1、1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6、1∶7、1∶8、1∶9、1∶10的混合液为梯度洗脱液，进行梯度洗脱，每次洗脱到洗脱流出液中不含有样品成分为止，再增加极性梯度进行下一次洗脱，或用丙酮为洗脱液进行等梯度洗脱，分别收集含栾树酮A和栾树酮B的流份，控制温度低于60℃，将收集到的含栾树酮A和栾树酮B的洗脱液分别减压浓缩成固体；5)反相硅胶层析柱：取常压柱或包括Lobar柱在内的制备型加压柱，以100-300目反相硅胶C-18或C-8为填料，提取浓缩物AA与反相硅胶C-18或C-8的重量份数比在1∶20-1∶200之间，以体积百分比在0-100％之间的甲醇水溶液为梯度洗脱液，进行梯度洗脱，每次洗脱液增加10％梯度，每次洗脱到洗脱流出液中不含有样品成分为止，再增加极性梯度进行下一次洗脱，分别收集含栾树酮A和栾树酮B的洗脱液，然后控制温度低于60℃、将收集到的洗脱液分别减压浓缩成固体；6)sephedex LH20柱层析：提取浓缩物AA与sephedex LH20的重量份数比在1∶20-1∶200之间，以体积百分比为40-80％丙酮水溶液或二氯甲烷∶甲醇＝10-1∶1(体积比)或丙酮∶水＝5∶1-20(体积比)或环己烷∶丙酮＝2∶2-6(体积比)的混合液为洗脱液，分别收集含栾树酮A和栾树酮B的流份，或对于ODS柱层析，用体积百分比为10％-90％的乙氰水溶液为梯度洗脱液进行梯度洗脱，每次洗脱液增加10％梯度，每次洗脱到洗脱流出液中不含有样品成分为止，再增加极性梯度进行下一次洗脱，分别收集含栾树酮A和栾树酮B的洗脱液，  然后分别控制温度低于60℃、分别将收集到的洗脱液减压浓缩成固体；

上述方法得到的栾树酮A和栾树酮B的纯度不低于95％。

本发明的栾树酮A和栾树酮B的波谱特征和化学结构分别为：栾树酮A：浅黄色固体，TOF-MS给出分子离子峰为m/z1210(M+)，分子组成为C₅₄H₆₆O₃₁。Mp.210-212℃，IR(KBr)cm-1：3392，2923，1701，1652，1602，1511，1490，1445，1349，1261，1206，1170，1072，1027，892，830，625，521。13C NMR谱：156.10(s)，134.86(s)，177.86(s)，161.91(s)，99.54(d)，160.98(s)，94.51(d)，156.01(s)，105.84(s)，120.28(s)，130.82(d)，115.65(d)，160.56(s)，115.65(d)，130.82(d)，98.66(d)，70.51(d)，70.53(d)，69.02(d)，69.32(d)，17.69(q)，103.89(d)，73.92(d)，76.74(d)，77.12(d)，74.27(d)，64.17(t)，102.73(d)，74.54(d)，76.74(d)，78.66(d)，76.74(d)，60.59(t)，100.64(d)，71.85(d)，70.98(d)，80.17(d)，70.09(d)，18.13(q)，105.84(d)，74.54(d)，76.74(d)，70.18(d)，76.74(d)，61.54(t)，166.74(s)，113.68(d)，144.95(d)，124.73(s)，129.54(d，2C)，115.44(d，2C)，159.74(s).1HNMR数据：6.37，d，J＝2Hz，1H(H6)；6.57，d，J＝2Hz，1H(H8)；7.78，d，J＝8Hz，2H，(H2’，6’)；6.91，d，J＝8Hz，2H(H3’，5’)；6.17，d，J＝15Hz，1H(coumaryl：H2)；7.42，d，J＝15Hz，1H(coumaryl：H3)；7.08，d，J＝7.8Hz，2H(coumaryl：H5，9)；6.35，d，J＝8Hz，2H(coumaryl：H6，8)；5.51，d，J＝2Hz，1H(Rha：H1”)；5.39，d，J＝2Hz，1H(Rha：H1’’’’’)；4.65，d，J＝8Hz，1H(Glu：H1)，4.54，d，J＝7Hz，1H(Glu：H1””)；4.25，d，J＝8Hz，1H(Glu：H1)；4.43，t，J＝7Hz，1H(Glu：H6)；4.30，t，J＝7Hz，1H(Glu：H6)；0.94，d，J＝6Hz，1H(Rha：H6”)；1.14，d，J＝6Hz，1H(Rha：H6’’’’’)；3.0-4.0，m，suger H；

                           栾树酮A

栾树酮B：浅黄色固体，mp200-201℃，TOF-MS给出分子离子峰为m/z1356(M+)，分子组成为C₆₃H₇₂O₃₃，IR(KBr)cm-1：3401，2919，1688，1647，1602，1511，1490，1347，1259，1204，1169，1072，1026，829，627，518。13CNMR谱：155.70(s)，134.57(s)，177.55(s)，161.66(s)，99.26(d)，160.80(s)，94.22(d)，155.70(s)，105.64(s)，120.01(s)，130.47(d)，115.57(d)，160.33(s)，115.57(d)，130.47(d)，98.60(d)，70.33(d)，70.11(d)，70.32(d)，69.55(d)，17.82(q)，103.74(d)，73.70(d)，76.55(d)，76.90(d)，73.82(d)，63.92(t)，102.50(d)，74.30(d)，76.55(d)，78.48(d)，73.82(d)，62.82(t)，100.21(d)，71.67(d)，70.32(d)，80.36(d)，68.84(d)，18.03(q)，105.10(d)，74.30(d)，76.55(d)，70.32(d)，76.55(d)，61.39(t)，166.42(s)，113.89(d)，144.69(d)，124.89(s)，129.34(d，2C)，115.35(d，2C)，159.53(s)，166.23(s)，113.45(d)，144.47(d)，124.52(s)，129.90(d，2C)，115.25(d，2C)，159.69(s).1HNMR数据：6.36，d，J＝2Hz，1H(H6)；6.46，d，J＝2Hz，1H(H8)；7.70，d，J＝8Hz，2H，(H2’，6’)；6.89，d，J＝8Hz，2H(H3’，5’)；6.17，d，J＝15Hz，1H(coumaryl：H2)；7.38，d，J＝15Hz，1H(coumaryl：H3)；7.07，d，J＝9Hz，2H(coumaryl：H5，9)；6.35，d，J＝9Hz，2H(coumaryl：H6，8)；6.16，d，J＝15.6Hz，1H(coumaryl：H2’)，7.35，d，J＝15.6Hz，1H(coumaryl：H3’)；7.07，d，J＝7.8Hz，2H(coumaryl：H5’，9’)；6.32，d，J＝8Hz，2H(coumaryl：H6’，8’)；5.47，d，J＝2Hz，1H(Rha：H1”)；5.40，d，J＝2Hz，1H(Rha：H1’’’’’)；4.65，d，J＝8Hz，1H(Glu：H1)，4.54，d，J＝7Hz，1H(Glu：H1””)；4.28，d，J＝8Hz，1H(Glu：H1)；4.36，m，2H(Glu：H6，6””)；4.06，m，2H(Glu：H6，6””)；0.97，d，J＝6Hz，1H(Rha：H6”)，1.14，d，J＝6Hz，1H(Rha：H6’’’’’)；3.0-4.0，m，suger H

                         栾树酮B

使用本发明所述的栾树总黄酮部位、黄酮成分栾树酮A和栾树酮B，按照现有技术制剂工艺的要求制成临床上常用的药剂。药剂中含有0.01-99.9％重量份的所述栾树总黄酮部位或栾树酮A或栾树酮B，优选含有30-90％重量份，进一步优选含有60-80％重量份。

上述药物的制备过程中，根据剂型和临床使用的需要，可以加入各种赋性剂，例如：粘合剂、崩解剂、填充剂、湿润剂、溶剂、娇味剂、乳化剂、防腐剂等。

本发明所说的药物剂型，可以是片剂、丸剂、胶囊剂、冲剂、喷雾剂、口服液、混悬液、透皮吸收制剂或注射剂等。

本发明药物具有抗肿瘤作用、免疫抑制作用、抗病毒作用和自由基清除作用。

一、栾树总黄酮提取物、栾树酮A和栾树酮B纯品和其它提取部位的抗肿瘤作用实验及结果为：

材料和方法

实验动物：C57/BL小鼠由中国科学院上海实验动物中心提供，中国动管会合格证：005。

瘤种：S180实体瘤。

药物：总黄酮为淡黄色粉末，用DMSO、吐温-80级生理盐水配成混悬剂备用。

方法：小鼠接种肿瘤后，随机分组，于次日开始腹腔注射治疗，连续给药10天，停药后次日解剖称肿瘤重量，并与对照小鼠比较，计算给药组肿瘤抑制率。

待测药物用95％乙醇助溶后用蒸馏水稀释成混悬液备用。治疗剂量分别为高70mg/kg、中35mg/kg、低17.5mg/kg。

实验方法：小鼠于右腋皮下接种肿瘤后，随机分组，于次日进行腹腔治疗，0.5ml/只/次，连续给药10天。带瘤对照组注射蒸馏水，阳性对照组注射5FU20mg/kg，方法同上。停药后次日解剖称瘤重，计算各治疗组抑瘤率。结果见表1

                       表.1  总黄酮、栾树酮A、栾树酮B对小鼠体内抑瘤作用

组别	动物数(只)开始      最后		体重(g)开始     最后		瘤重(g)X±SD	抑瘤率	P值
								带瘤对照组	10	10	23.0	26.63	1.64±0.79
阳性对照组	10	10	23.0	24.94	0.95±0.52	42.07	*＜0.05
								总黄酮70mg/kg治疗组	10	10	23.0	27.24	0.71±0.63	56.70	*＜0.05
总黄酮35mg/kg治疗组	10	10	23.0	27.33	0.78±0.71	52.44	*＜0.05
								总黄酮17.5mg/kg治疗组	10	10	23.0	26.29	1.06±0.64	35.37	*＜0.05
栾树酮A70mg/kg治疗组	10	0
								栾树酮A35mg/kg治疗组	10	6	23.0	22.55	0.78±0.39	52.44
栾树酮A17.5mg/kg治疗组	10	10	23.0	24.83	1.06±0.62	35.37	＞0.05
								栾树酮B70mg/kg治疗组	10	10	23.0	25.66	0.90±0.42	45.12	*＜0.05
栾树酮B35mg/kg治疗组	10	10	23.0	27.26	0.98±0.56	40.24	*＜0.05
								栾树酮B17.5mg/kg治疗组	10	10	23.0	26.59	0.91±0.51	44.51	*＜0.05

结论：栾树中总黄酮，栾树酮A，栾树酮B都有较强的抗肿瘤作用，而且呈一定的量效关系。其中在给药剂量70mg/kg时，总黄酮对小鼠肿瘤抑制率在55％以上。用总黄酮制成的药物，药效作用较纯黄酮化合物栾树酮A、栾树酮B明显。

二.总黄酮部位、栾树酮A、栾树酮B的体外抗肿瘤活性实验及结果为：

1.总黄酮部位、栾树酮A、栾树酮B体外对KB细胞、HCT-8细胞、BGC-823人癌细胞株的抗肿瘤活性

方法：常规药理实验方法(见《药理实验方法学》，徐叔云主编，人民卫生出版社，1994，第1440-1445页)

结果：体外MTT法检测发现：总黄酮部位、栾树酮A在浓度10ug/ml对上述几种癌细胞抑制作用大于50％，栾树酮B在浓度为100ug/ml表现强细胞毒活性。

2.利用饲料混毒法对夜蛾科棉铃虫(EGYPT COTTON WORM)的活性：

方法：该方法的基本原理是将待测样品和试虫人工饲料或半人工饲料混合，接入初养幼虫饲养7天，期间观察试虫的反应症状(如存活、爬行、取食、蜕皮、个体大小等)，并分别于接虫后1天、3天、7天检查死亡率，第7天称重活虫的重量，并与对照组比较。

结果：实验结果表明，与对照组比较，栾树酮A在浓度为500ug/g饲料时，对棉铃虫有杀伤活性，对棉铃虫有100％的杀伤活性，其余部分均未表现出活性。

三.自由基清除作用实验结果为：

国际上自由给与癌及衰老关系密切的学说，已广泛接受并应用于临床。在抗癌治疗中不仅抑制细胞的生长至关重要，同时保护正常细胞和组织不受损害也是至关重要的。栾树提取物在实验中对氧自由基和羟基自由基的清除作用很明显，其对超氧阴离子和羟基自由基清除的最低有效浓度分别为12ng/ml和1.7ng/ml。

四.抑制肿瘤生长因子PTK作用的实验及结果为：

以肿瘤生长因子PTK p56为活性筛选模型，测定总黄酮部位、栾树酮

          表2

药物	IC50(μg/ml)
		总黄酮栾树酮A栾树酮B山奈酚槲皮素	56877

A、栾树酮B和其它黄酮体对PTK抑制活性，实验表明，它们都具有较强的抑制活性。具体见表2。研究表明黄酮类化合物的B环上的4^*-OH为活性的重要官能团。在PTK的结合位点中口袋部分的系列ASP-ASN-ARG-ASP-SER-GLY-LYS-GLY-ILE-VAL-LYS-TYR-PHE-MET-LEU-SER为与黄酮结合的氨基酸系列。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明进行进一步的说明。

实施例1

分离提取栾树总黄酮的方法和步骤为：

1.取晒干原料药材栾树的枝叶1公斤，以粉碎机粉碎成20目，装入20升的加热回流罐中，再加95％乙醇8升，升温至90℃回流2小时，冷却至温度40℃，放出并收集乙醇提取液。重复上述提取过程3次，第2、3次的95％的乙醇量各为6升和4升，提取温度与第1次相同，提取时间各为1.5小时和1小时，合并3次提取液，在旋转蒸发仪上真空减压浓缩，控温45℃，浓缩至浓缩物比重在1.3，得提取物A 200克；

2.将步骤1中得到的提取物A 200克混悬溶解于500毫升的水中，再用石油醚萃取，石油醚与水溶液的体积比每次为1∶2，重复萃取3次，静置分层后在分液容器中分离，弃去石油醚层，保留水液；

3.在45-60℃条件下对步骤2中得到的水溶液进行减压浓缩，除尽水，得比重为1.4的提取物浸膏140克，往得到的固体提取物中加95％乙醇至醇度到85％，置于4℃冰箱中24小时使其低温沉淀。减压过滤，弃沉淀物，乙醇液在旋转蒸发仪上在低于60℃条件下减压浓缩至固体物，约90克，重复上述醇沉操作2次，浓缩得提取物B 85克；

4.将得到的提取物B，进一步用300毫升10％的盐酸溶解，然后减压过滤，滤液再用饱和氢氧化钠中和至PH值为7，然后于布氏漏斗中减压过滤，收集固体物；滤液再用饱和氢氧化钠中和至PH值为8，然后于布氏漏斗中减压过滤，收集固体物；滤液再用饱和氢氧化钠中和至PH值为9，然后于布氏漏斗中减压过滤，收集固体物；合并3次收集固体物为C，水液进一步用正丁醇各用200毫升萃取3次，分液容器中分离收集正丁醇溶液，合并3次正丁醇萃取液，减压浓缩后再控制温度不超过-50℃、用真空干燥器干燥，得到干燥物D，干燥物D和固体物C统称为总黄酮部位，共约15克。

实施例2：

本实施例的方法和步骤，除了步骤2与实施例1中略有不同外，其余都相同。本实施例与实施例1的不同之处在于将实施例1步骤2中的石油醚改成环己烷。

实施例3：

本实施例从干燥的栾树花中分离提取总黄酮，方法和用量与实施例1相同，得到总黄酮部位共约3.5克。

实施例4：

本实施例从干燥的栾树果实中分离提取总黄酮，方法和用量与实施例1相同，得到总黄酮部位共约17.5克。

实施例5：

本实施例从栾树中分离提取栾树酮A和栾树酮B，其分离方法和步骤为：

1.取干燥的栾树种子1公斤，将其磨成10目粗粉，加入石油醚8升回流提取2小时，冷却至约40℃，滤出石油醚提取液，再用6升石油醚回流提取1.5小时，冷却至约40℃，滤出石油醚提取液；再用6升石油醚回流提取1小时，冷却至约40℃，滤出石油醚提取液；将残渣用95％乙醇8升回流2小时，收集乙醇液，再分别用6升和4升95％乙醇再回流提取2次，每次2小时，合并乙醇提取液，控制45℃条件，将乙醇提取液在旋转蒸发仪上减压浓缩，得比重为1.4的膏状浓缩物AA。

2.将90克浓缩物AA用硅胶柱色谱层析，硅胶色谱柱为20×100厘米，硅胶量为400克，湿法装柱，浓缩物AA用20毫升氯仿∶甲醇体积比例5∶1的溶液溶解，滴加于硅胶上方，再以氯仿∶甲醇体积比例5∶1洗脱，洗脱速度为10毫升/分钟，用HF硅胶薄层色谱TLC检测，展开剂为氯仿-甲醇体积比例5∶1，用50毫升三角瓶收集，分别合并在TLC展开中Rf值在0.4和0.3并在254纳米出现亮黑色斑点的流份，即得到化合物栾树酮A和栾树酮B的粗品，分别收集含栾树酮A和栾树酮B的流份，然后减压浓缩成固体。再分别将栾树酮A和栾树酮B分别溶解于适量的无水甲醇中，于冰箱中静置2天，析出黄色结晶，得7.0克栾树酮A和3克栾树酮B，纯度＞95％。

实施例6：

本实施例是用总黄酮部位做为有效成分，制备胶囊制剂的制备工艺。

根据总黄酮的药效学和急毒结果，建议临床的日推荐用量为350毫克，制备方法：取35克，加5克药用淀粉，硬脂酸镁0.1克，混合均匀，制成微粒，过60目筛，装入1号胶囊，制成100粒胶囊，使每粒胶囊含400毫克，其中总黄酮含350毫克，成人每日口服1次，每次1粒，或遵医嘱。

Claims (3)

1.一种从栾树植物中分离提取总黄酮部位的方法，其特征在于该方法和步骤为：

(1)取原料药材栾树的枝叶、花、果实干品或新鲜物，加入溶媒回流提取或浸泡渗漉提取3-4次，每次回流提取或浸泡渗漉提取时新鲜枝叶与溶媒的重量比为1∶2-6、干燥枝叶与溶媒重量比为1∶4-12、新鲜花与溶媒的重量比为1∶2-6、干燥花与溶媒的重量比为1∶4-12、新鲜果实与溶媒的重量比为1∶2-6、干燥果实与溶媒的重量比为1∶4-12，每次回流提取时间为1-3小时，每次浸泡渗漉提取时间为2-8天，然后控温低于60℃、对提取液进行减压浓缩以除去溶媒，浓缩至浓缩物比重为1.2-1.4，得提取物A；

所述溶媒为纯度95％的乙醇或含有体积百分比10-80％水的C1-4醇或纯丙酮或含有体积百分比70-80％丙酮的水溶液；

(2)将步骤(1)中得到的提取物A溶解于水得到水溶液，提取物A的重量公斤数与水的体积升数之比＝1∶2-6，所得水溶液再用有机溶媒萃取一次或多次，每次有机溶媒与水溶液的体积比为1∶1-4，分离弃去有机溶媒层，保留水液；

所述有机溶媒为石油醚或C6-C7的烷烃；

(3)对步骤(2)中得到的水溶液，在低于60℃条件下进行减压浓缩，浓缩至比重为1.2-1.4，然后加95％乙醇至醇度在80％-90％范围，在4-5℃醇沉5-24小时，过滤，弃沉淀物，上清液在低于60℃温度下减压浓缩至比重为1.2-1.4，重复上述醇沉操作1-3次；过滤，然后将上清液在低于60℃条件下减压浓缩，完全除去醇和水，得固体提取物B；

(4)将步骤(3)中得到的固体提取物B，进一步用4％-10％的盐酸、硫酸或醋酸溶解，然后过滤，再用氢氧化钠或碳酸钠将滤液中和至pH值为7，过滤后，滤液再用氢氧化钠或碳酸钠中和至pH值为8，然后过滤，滤液再用氢氧化钠或碳酸钠中和至pH值为9，然后过滤，合并收集固体物得C，水液进一步用正丁醇萃取1至3次，每次水液和正丁醇的体积比为2∶1-1∶2，分离收集正丁醇溶液，在低于60℃条件下减压浓缩或温度不高于-40℃条件下真空干燥或温度不高于100℃条件下喷雾干燥，得到干燥物D，干燥物D和固体物C统称为总黄酮部位。

2.根据权利要求1的方法制备得到的栾树总黄酮部位在制备抗肿瘤药物中的应用。

3.根据权利要求1的方法制备得到的栾树总黄酮部位在制备免疫抑制药物中的应用。