CN102133255B

CN102133255B - 一种抗肿瘤的鬼臼类中药提取物及其制备方法与应用

Info

Publication number: CN102133255B
Application number: CN 201110054142
Authority: CN
Inventors: 江仁望; 李娟�; 姜飞; 田海妍
Original assignee: Jinan University
Current assignee: Jinan University
Priority date: 2011-03-08
Filing date: 2011-03-08
Publication date: 2013-03-13
Anticipated expiration: 2031-03-08
Also published as: CN102133255A

Abstract

本发明公开了一种抗肿瘤的鬼臼类中药提取物及其制备方法与应用。该抗肿瘤的鬼臼类中药提取物含有鬼臼毒素类化合物与黄酮类化合物。本发明通过将鬼臼类植物干燥，粉碎，过筛，用醇溶液进行提取，过滤，得到醇总提取液；再将醇总提取液依次用乙酸乙酯、正丁醇萃取，分别得到的乙酸乙酯提取液和正丁醇提取液；醇总提取液、乙酸乙酯提取液和正丁醇提取液的浓缩物均为抗肿瘤的鬼臼类中药提取物。本发明证实含有鬼臼毒素类和黄酮类化合物的鬼臼类中药提取物具有较好的抗肿瘤作用，特别是乙酸乙酯萃取部位。而且本发明所述的鬼臼类中药提取物对正常细胞毒性低。将该鬼臼类中药提取物应用于制备抗肿瘤药物，高效低毒，符合药物发展的要求。

Description

一种抗肿瘤的鬼臼类中药提取物及其制备方法与应用

技术领域

本发明属于天然药物化学领域，特别涉及一种抗肿瘤的鬼臼类中药提取物及其制备方法与应用。该抗肿瘤的鬼臼类中药提取物含有鬼臼毒素类化合物与黄酮类化合物。

背景技术

恶性肿瘤是严重威胁人类健康的疾病，其死亡率仅次于心血管疾病。近年来，随着环境污染的加剧和饮食结构的变化，癌症发病率呈逐年上升的趋势。据世界卫生组织报告，全球60多亿人口中，每年新增的癌症患者约为900万人，因癌症而死亡的病例约700万人，约占总死亡率的五分之一。虽然目前癌症的治疗采用了外科手术、化疗、放疗、基因治疗等综合手段，但其临床疗效仍然难以令人满意。在抗癌药物中，常用的西药占据了主导地位，但这些西药毒性很大，在治疗肿瘤的同时，给患者带来严重的副作用。因此需要继续寻找新的高效低毒的抗癌药物。中药及天然药物是抗肿瘤药物的重要源泉，据统计目前临床上使用抗肿瘤药物，60％以上是直接或间接来源于天然产物。我国有丰富的药用植物资源，并且有几千年的用药经验。因此，从抗癌中草药寻找有效地抗肿瘤药物是一条有效途径。

鬼臼类中药，应用历史悠久，早在《神农本草经》中就有记载，其具有祛风湿、活血止痛、镇咳平喘、祛痰等功能，可用于毒蛇咬伤、痈疖肿毒、跌打损伤、风湿筋骨痛、胃痛、气管炎等。我国目前所用鬼臼类中药，属于小檗科，包括八角莲属(Dysosma versipellis)的八角莲及六角莲(Dysosma pleiantha)、桃儿七属的桃儿七(Sinopodophyllum emodi)三种植物的根和根茎，分布较广，产我国浙江、安徽、江西、湖北等省。

虽然，鬼臼类中药有三个来源，但主要成分相同，均为鬼臼毒素类化合物和黄酮类化合物。其中，鬼臼毒素类化合物属环木脂内酯型木脂素，具有强大的抗肿瘤作用，其作用靶标为α-tubulin，作用位点与秋水仙碱相同，通过抑制微管蛋白聚合，影响了纺锤体的形成，从而使细胞的有丝分裂停止。然而，鬼臼毒素对正常细胞的微管蛋白亦具有毒性，因而这类化合物具有强烈的副作用，如恶心、呕吐、腹泻、肝脏及神经系统损伤等。黄酮类化合物对人体的毒性低，而且具有保健功效。有学者进行过流行病学调查，发现黄酮的摄取量越高，患心脏病及癌症的几率降低。近年的研究发现，黄酮不但对多种癌细胞均具有杀伤作用，而且能减轻抗癌药的毒性。

长期以来，人们只是关注鬼臼毒素的抗肿瘤作用而忽视其中黄酮的作用。目前，尚未有关于用鬼臼类中药中提取的鬼臼毒素类化合物与黄酮类化合物搭配使用应用于抗癌的报道。

发明内容

本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种抗肿瘤的鬼臼类中药提取物。

本发明的另一目的在于提供所述的抗肿瘤的鬼臼类中药提取物的制备方法。

本发明的再一目的在于提供所述的抗肿瘤的鬼臼类中药提取物在抗肿瘤药物制备中的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：一种抗肿瘤的鬼臼类中药提取物，其含有鬼臼毒素类化合物与黄酮类化合物；

所述的鬼臼毒素类化合物优选为鬼臼毒素葡萄糖苷或鬼臼毒素中的一种或两种；

所述的黄酮类化合物优选为山奈黄素-3-β-D-葡萄糖苷或山萘酚中的一种或两种；

所述的抗肿瘤的鬼臼类中药提取物的制备方法，优选包含如下步骤：将鬼臼类植物的根或/和根茎干燥，粉碎，过筛，用醇溶液进行提取，过滤，得到醇总提取液，浓缩，得到鬼臼类中药提取物；

所述的鬼臼类植物包括：八角莲、六角莲、桃儿七三种；

所述的醇溶液优选为乙醇溶液或甲醇溶液；

所述的乙醇溶液优选的浓度为体积百分比为50～100％；

所述的甲醇溶液优选的浓度为体积百分比为50～100％；

所述的提取的方式为渗漉、超声或加热回流中的一种；

所述加热回流的条件优选为在70～80℃进行；

所述的提取优选至少提取3次，每次提取0.5～1h；

所述的抗肿瘤的鬼臼类中药提取物的制备方法，还包含如下步骤：将醇总提取液依次用乙酸乙酯、正丁醇萃取，得到的乙酸乙酯提取液和正丁醇提取液分别浓缩，得到鬼臼类中药提取物；

所述的浓缩的方式优选为减压浓缩至恒重；

所述的抗肿瘤的鬼臼类中药提取物在抗肿瘤药物制备中的应用；

所述的抗肿瘤的鬼臼类中药提取物优选通过包含如下步骤的方法制备得到：将鬼臼类植物的根或/和根茎干燥，粉碎，过筛，用醇溶液进行提取，过滤，得到醇总提取液，浓缩，得到鬼臼类中药提取物；

所述的鬼臼类植物包括：八角莲、六角莲和桃儿七三种；

所述的醇溶液优选为乙醇溶液或甲醇溶液；

所述的乙醇溶液优选的浓度为体积百分比为50～100％；

所述的甲醇溶液优选的浓度为体积百分比为50～100％；

所述的提取的方式为渗漉、超声或加热回流中的一种；

所述加热回流的条件优选为在70～80℃进行；

所述的提取优选至少提取3次，每次提取0.5～1h；

所述的抗肿瘤的鬼臼类中药提取物的制备方法，还包含如下步骤：将醇总提取液依次用乙酸乙酯、正丁醇萃取，得到的乙酸乙酯提取液和正丁醇提取液分别浓缩，均得到鬼臼类中药提取物；

所述的抗肿瘤的鬼臼类中药提取物特别优选为乙酸乙酯萃取部位的鬼臼类中药提取物；

所述的肿瘤包括前列腺癌、肝癌、乳腺癌、宫颈癌和神经胶质瘤等。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

(1)发明人发现含有鬼臼毒素类和黄酮类化合物的鬼臼类中药提取物具有较好的抗肿瘤作用，特别是乙酸乙酯萃取部位具有强大的抗肝癌、前列腺癌、宫颈癌、乳腺癌等多种癌症活性。而且含有鬼臼毒素类和黄酮类化合物的鬼臼类中药提取物对正常细胞毒性低。本发明所述的鬼臼类中药提取物制备方法简单。

(2)将含有鬼臼毒素类和黄酮类化合物的鬼臼类中药提取物应用于制备抗肿瘤药物，高效低毒，符合药物发展的要求。

附图说明

图1是实施例1得到的八角莲提取物的HPLC色谱图，其中：

A～D依次分别为实施例1制备的醇总提取物、乙酸乙酯提取物、正丁醇提取物及水提物的HPLC色谱图；

1为山奈黄素-3-β-D-吡喃葡萄糖苷、2为鬼臼毒素葡萄糖苷、3为鬼臼毒素、4为山萘酚。

图2是提取物抑制前列腺癌细胞PC3增殖的活性图，其中：

A为醇总提取物抑制前列腺癌细胞PC3增殖的活性图；

B为乙酸乙酯提取物抑制前列腺癌细胞PC3增殖的活性图；

C为正丁醇提取物抑制前列腺癌细胞PC3增殖的活性图；

D为水提物抑制前列腺癌细胞PC3增殖的活性图。

图3是提取物抑制前列腺癌细胞DU145增殖的活性图，其中：

A为醇总提取物抑制前列腺癌细胞DU145增殖的活性图；

B为乙酸乙酯提取物抑制前列腺癌细胞DU145增殖的活性图；

C为正丁醇提取物抑制前列腺癌细胞DU145增殖的活性图；

D为水提物抑制前列腺癌细胞DU145增殖的活性图。

图4是提取物抑制肝癌细胞HepG2增殖的活性图，其中：

A为醇总提取物抑制肝癌细胞HepG2增殖的活性图；

B为乙酸乙酯提取物抑制肝癌细胞HepG2增殖的活性图；

C为正丁醇提取物抑制肝癌细胞HepG2增殖的活性图；

D为水提物抑制肝癌细胞HepG2增殖的活性图。

图5是提取物抑制乳腺癌细胞MCF7增殖的活性图，其中：

A为醇总提取物抑制乳腺癌细胞MCF7增殖的活性图；

B为乙酸乙酯提取物抑制乳腺癌细胞MCF7增殖的活性图；

C为正丁醇提取物抑制乳腺癌细胞MCF7增殖的活性图；

D为水提物抑制乳腺癌细胞MCF7增殖的活性图。

图6是提取物抑制宫颈癌细胞HeLa增殖的活性图，其中：

A为醇总提取物抑制宫颈癌细胞HeLa增殖的活性图；

B为乙酸乙酯提取物抑制宫颈癌细胞HeLa增殖的活性图；

C为正丁醇提取物抑制宫颈癌细胞HeLa增殖的活性图；

D为水提物抑制宫颈癌细胞HeLa增殖的活性图。

图7是提取物抑制神经胶质瘤细胞BV2增殖的活性图，其中：

A为醇总提取物抑制神经胶质瘤细胞BV2增殖的活性图；

B为乙酸乙酯提取物抑制神经胶质瘤细胞BV2增殖的活性图；

C为正丁醇提取物抑制神经胶质瘤细胞BV2增殖的活性图；

D为水提物抑制神经胶质瘤细胞BV2增殖的活性图。

图8是三种鬼臼类中药八角莲、桃儿七及六角莲化学成分的比较，其中：

A为八角莲甲醇提取物的HPLC色谱图；

B为桃儿七甲醇提取物的HPLC色谱图；

C为六角莲甲醇提取物的HPLC色谱图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1

(1)预防和治疗癌症的含鬼臼毒素及黄酮提取物的制备

将八角莲原药材(根茎部分，5.8kg)干燥，粉碎，过100目筛，用95％(v/v)乙醇溶液在常温下进行渗漉提取3次，每次1小时，过滤，得到总提取液；将总提取液减压浓缩至干燥得总提物(680g)，将此总提物混悬于水中，依次用乙酸乙酯、正丁醇萃取，分别得到乙酸乙酯提取液，正丁醇提取液，剩下部分即为水溶液；然后将这些萃取液减压浓缩至恒重，得到浆状物，即为乙酸乙酯提取物(508g)、正丁醇提取物(68g)及水提取物(104g)。

(2)对步骤(1)得到的提取物进行分析

将步骤(1)得到的各提取物溶于甲醇，配成10mg/ml的溶液，用HPLC进行色谱分析，色谱条件是：C18反相半制备柱(5μm，9.4×250mm)，紫外检测波长为254nm，流速为1ml/min，梯度系统为：A：水，B：乙腈；0～10min，10％(v/v)的乙腈溶液；10～50min，10％→100％的乙腈溶液；50～55min：100％的乙腈溶液；55～60min：100％→10％的乙腈溶液；分别得到总提取物(见图1A)、乙酸乙酯、正丁醇、水提取物的指纹图谱(见图1)。指纹图谱中的四个特征峰，用波谱分析法分别鉴定为山奈黄素-3-β-D-吡喃葡萄糖苷(图中标注为“1”)、鬼臼毒素葡萄糖苷(图中标注为“2”)、鬼臼毒素(图中标注为“3”)、山萘酚(图中标注为“4”)，其中化合物1及4为黄酮类化合物，化合物2及3为鬼臼毒素类化合物波谱学数据如下：

化合物1：黄色针晶，mp 171-188℃；ESI-MS m/z：447[M-H]^-；¹H-NMR(400MHz，CD₃OD)δ_H 6.21(1H，d，J＝1.0Hz，H-6)，6.43(1H，d，J＝1.0Hz，H-8)，8.03(2H，d，J＝8.0Hz，H-2′，6′)，6.88(2H，d，J＝8.0Hz，H-3′，5′)；Glu：5.45(1H，d，J＝8.0Hz，H-1″)，3.54(1H，dd，J＝10.1，2.5Hz，H-6″)，3.20(1H，dd，J＝10.1，2.5Hz，H-6″)，3.29(4H，m，H-2″～5″)；¹³C-NMR(100MHz，CD₃OD)δ_C 143.1(C-2)，133.2(C-3)，177.4(C-4)，159.9(C-5)，98.7(C-6)，164.4(C-7)，93.7(C-8)，156.2(C-9)，103.9(C-10)，121.0(C-1′)，130.9(C-2′，6′)，115.1(C-3′，5′)，156.4(C-4′)；Glu：100.9(C-1″)，74.2(C-2″)，76.3(C-3″)，77.5(C-5″)，69.8(C-4″)，60.8(C-6″)。鉴定化合物1为山奈黄素-3-β-D-葡萄糖苷(kaempferol-3-O-β-D-glucoside)。

化合物2：白色晶体，mp 221～223℃；ESI-MS m/z：599[M+Na]⁺；¹H-NMR(400MHz，CD₃OD)δ_H 4.54(1H，d，J＝4.0Hz，H-1)，3.00(1H，dd，J＝13.5，4.0Hz，H-2)，2.95(1H，m，H-3)，5.05(1H，d，J＝9.0Hz，H-4)，7.37(1H，s，H-5)，6.43(1H，s，H-8)，4.69(1H，dd，J＝8.5，6.5Hz，H-11α)，4.21(1H，dd，J＝8.5，6.5Hz，H-11β)，6.42(2H，s，H-2′，6′)，5.92(2H，s，OCH₂O)，3.71(9H，s，3′，4′，5′-OCH₃)；Glu：4.39(1H，d，J＝7.2Hz，H-1″)，3.89(1H，dd，J＝10.8，1.8Hz，H-6″)，3.75(1H，dd，J＝10.8，1.8Hz，H-6″)，3.36(4H，m，H-2″～5″)；¹³C-NMR(100MHz，CD₃OD)δ_C 43.8(C-1)，44.9(C-2)，39.2(C-3)，78.9(C-4)，108.3，108.7(C-5，8)，147.7(C-6)，147.3(C-7)，131.7，131.3(C-9，10)，70.1(C-11)，175.5(C-12)，136.8(C-1′)，108.3(C-2′，6′)，152.4(C-3′，5′)，136.4(C-4′)，101.3(OCH₂O)，59.7(3′，5′-OCH₃)，61.4(4′-OCH₃)；Glu：102.3(C-1″)，73.8(C-2″)，76.8(C-3″，5″)，70.1(C-4″)，61.4(C-6″)。鉴定化合物2为鬼臼毒素葡萄糖苷(podophyllotoxin-4-O-β-D-glucoside)。

化合物3：白色晶体，mp 158～160℃；ESI-MS m/z：413[M-H]^-；¹H-NMR(400MHz，CD₃OD)δ_H 4.73(1H，d，J＝1.5Hz，H-1)，2.99(1H，dd，J＝1.5，4.5Hz，H-2)，2.73(1H，m，H-3)，4.71(1H，d，J＝8.5Hz，H-4)，7.11(1H，s，H-5)，6.42(1H，s，H-8)，4.50～4.56(1H，m，H-11α)，4.10(1H，dd，J＝9.5，9.0Hz，H-11β)，6.43(2H，s，H-2′，6′)，5.92(2H，s，OCH₂O)，3.72(6H，s，3′，5′-OCH₃)，3.71(3H，s，4′-OCH₃)；¹³C-NMR(100MHz，CD₃OD)δ_C 45.5(C-1)，46.2(C-2)，42.0(C-3)，73.0(C-4)，107.4(C-5)，148.9(C-6，7)，110.5(C-8)，135.5(C-9)，132.5(C-10)，72.8(C-11)，177.2(C-12)，138.2(C-1′)，109.8(C-2′，6′)，153.8(C-3′，5′)，138.0(C-4′)，102.7(OCH₂O)，61.1(4′-OCH₃)，56.6(3′，5′-OCH₃)。鉴定化合物3为鬼臼毒素(podophyllotoxin)。

化合物4黄色粉末，mp 300～302℃；ESI-MS m/z：303[M+H]⁺；¹H-NMR(400MHz，DMSO-d₆)δ_H 6.31(1H，d，J＝1.0Hz，H-6)，6.55(1H，d，J＝1.0Hz，H-8)，8.17(2H，d，J＝10.0Hz，H-2′，6′)，7.05(2H，d，J＝10.0Hz，H-3′，5′)，9.52(1H，br.s，3-OH)，12.8(1H，br.s，5-OH)，11.1(1H，br.s，7-OH)，10.5(1H，br.s，4′-OH)；¹³C-NMR(100MHz，DMSO-d6)δ_C 146.6(C-2)，136.0(C-3)，175.2(C-4)，160.3(C-5)，98.4(C-6)，163.9(C-7)，94.2(C-8)，157.3(C-9)，103.7(C-10)，121.1(C-1′)，129.6(C-2′，6′)，115.6(C-3′，5′)，159.7(C-4′)。鉴定化合物4为山萘酚(kaempferol)。

化合物1-4的结构式如下：

(3)对步骤(1)得到的含鬼臼毒素及黄酮提取物的抗肿瘤活性进行检测

①采用MTT法检测步骤(1)得到的八角莲总提取物、乙酸乙酯提取物、正丁醇提取物、水提取物分别对前列腺癌细胞PC3(购自美国模式培养物保藏所ATCC)增殖的抑制作用。取单层培养的PC3细胞(RPMI 1640，含有10％v/v胎牛血清)，用质量体积比0.25％的胰蛋白酶溶液消化，并接种于96孔板上(每孔加入细胞悬浮液100μl，细胞数为3000个)。接种24小时后，加入不同浓度待测样品，并以相同体积比DMSO作为对照。培养72小时后，每孔加入20μl MTT溶液(5mg/ml)，4小时后离心弃上清液，加入DMSO(100μl/孔)，振荡15min左右，置酶标仪测定OD值，波长为570nm，并计算细胞存活率，同时作图并用SPSS 18.0软件求得半数抑制浓度(IC₅₀)。

结果如图2所示，随着八角莲总提取物、乙酸乙酯提取物、正丁醇提取物浓度的升高，癌细胞PC-3的抑制率明显升高，其IC₅₀值分别为：0.039、0.019、9.882μg/mL，而水提取物无活性。八角莲总提取物、乙酸乙酯提取物的IC₅₀值低，其抗前列腺癌活性非常显著。与对照相比，八角莲总提取物在浓度≥0.005μg/ml时，处理组与对照组有显著性差异(P＜0.01)；乙酸乙酯提取物在浓度≥0.00125μg/ml时，处理组与对照组亦有显著性差异(P＜0.01)。

②采用MTT法检测步骤(1)得到的八角莲总提取物、乙酸乙酯提取物、正丁醇提取物、水提取物对前列腺癌细胞DU145(购自美国模式培养物保藏所ATCC)增殖的抑制作用。取单层培养的DU145细胞(RPMI 1640，含有10％v/v胎牛血清)，用质量体积比0.25％的胰蛋白酶溶液消化，并接种于96孔板上(每孔加入细胞悬浮液100μl，细胞数为3000个)。接种24小时后，加入不同浓度待测样品，并以相同体积比DMSO作为对照。培养72小时后，每孔加入20μl MTT溶液(5mg/ml)，4小时后离心弃上清液，加入DMSO(100μl/孔)，振荡15min左右，置酶标仪测定OD值，波长为570nm，并计算细胞存活率，同时作图并用SPSS 18.0软件求得半数抑制浓度(IC₅₀)。

结果如图3所示，随着八角莲总提取物、乙酸乙酯提取物、正丁醇提取物浓度的升高，癌细胞DU145的抑制率明显升高，其IC₅₀值分别为：0.020、0.026、6.7μg/mL而水提取物无活性。八角莲总提取物、乙酸乙酯提取物的IC₅₀值低，其抗前列腺癌活性非常显著。与对照相比，八角莲总提取物在浓度≥0.0025μg/ml时，处理组与对照组有显著性差异(P＜0.01)；乙酸乙酯提取物在浓度≥0.0013μg/ml时，处理组与对照组有显著性差异(P＜0.01)；正丁醇提取物在浓度≥0.625μg/ml时，处理组与对照组亦有显著性差异(P＜0.01)。

③采用MTT法检测步骤(1)得到的八角莲总提取物、乙酸乙酯提取物、正丁醇提取物、水提取物对肝癌细胞HepG2(购自美国模式培养物保藏所ATCC)增殖的抑制作用。取单层培养的HepG2细胞(RPMI 1640，含有10％v/v胎牛血清)，用质量体积比0.25％的胰蛋白酶溶液消化，并接种于96孔板上(每孔加入细胞悬浮液100μl，细胞数为3000个)。接种24小时后，加入不同浓度待测样品，并以相同体积比DMSO作为对照。培养72小时后，每孔加入20μl MTT溶液(5mg/ml)，4小时后离心弃上清液，加入DMSO(100μl/孔)，振荡15min左右，置酶标仪测定OD值，波长为570nm，并计算细胞存活率，同时作图并用SPSS 18.0软件求得半数抑制浓度(IC₅₀)。

结果如图4所示，随着八角莲总提取物、乙酸乙酯提取物、正丁醇提取物浓度的升高，癌细胞HepG2的抑制率明显升高，其IC₅₀值分别为：0.009、0.009、3.222μg/mL而水提取物无活性。八角莲总提取物、乙酸乙酯提取物的IC₅₀值低，其抗肝癌活性非常显著。与对照相比，八角莲总提取物在浓度≥0.0025μg/ml时，处理组与对照组有显著性差异(P＜0.01)；乙酸乙酯提取物在浓度≥0.0013μg/ml时，处理组与对照组有显著性差异(P＜0.01)；正丁醇提取物在浓度≥0.625μg/ml时，处理组与对照组亦有显著性差异(P＜0.01)。

④采用MTT法检测步骤(1)得到的八角莲总提取物、乙酸乙酯、正丁醇、水提取物对乳腺癌细胞MCF7(购自美国模式培养物保藏所ATCC)增殖的抑制作用。取单层培养的MCF7细胞(RPMI 1640，含有10％v/v胎牛血清)，用质量体积比0.25％的胰蛋白酶溶液消化，并接种于96孔板上(每孔加入细胞悬浮液100μl，细胞数为3000个)。接种24小时后，加入不同浓度待测样品，并以相同体积比DMSO作为对照。培养72小时后，每孔加入20μl MTT溶液(5mg/ml)，4小时后离心弃上清液，加入DMSO(100μl/孔)，振荡15min左右，置酶标仪测定OD值，波长为570nm，并计算细胞存活率，同时作图并用SPSS 18.0软件求得半数抑制浓度(IC₅₀)。

结果如图5所示，随着八角莲总提取物、乙酸乙酯提取物、正丁醇提取物浓度的升高，癌细胞MCF7的抑制率明显升高，其IC₅₀值分别为：0.011、0.009、12.294μg/mL而水提取物无活性。八角莲总提取物、乙酸乙酯提取物的IC50值低，其抗乳腺腺癌活性非常显著。与对照相比，八角莲总提取物在浓度≥0.0025μg/ml时，处理组与对照组有显著性差异(P＜0.01)；乙酸乙酯提取物在浓度≥0.0025μg/ml时，处理组与对照组有显著性差异(P＜0.01)；正丁醇提取物在浓度≥1.25μg/ml时，处理组与对照组亦有显著性差异(P＜0.01)。

⑤采用MTT法检测步骤(1)得到的八角莲总提取物、乙酸乙酯提取物、正丁醇提取物、水提取物对宫颈癌细胞HeLa(购自美国模式培养物保藏所ATCC)增殖的抑制作用。取单层培养的HeLa细胞(RPMI 1640，含有10％胎牛血清)，用质量体积比0.25％的胰蛋白酶溶液消化，并接种于96孔板上(每孔加入细胞悬浮液100μl，细胞数为3000个)。接种24小时后，加入不同浓度待测样品，并以相同体积比DMSO作为对照。培养72小时后，每孔加入20μl MTT溶液(5mg/ml)，4小时后离心弃上清液，加入DMSO(100μl/孔)，振荡15min左右，置酶标仪测定OD值，波长为570nm，并计算细胞存活率，同时作图并用SPSS 18.0软件求得半数抑制浓度(IC50)。

结果如图6所示，随着八角莲总提取物、乙酸乙酯提取物、正丁醇提取物浓度的升高，癌细胞HeLa的抑制率明显升高，其IC50值分别为：0.07、0.001、19.152μg/mL而水提取物无活性。八角莲总提取物、乙酸乙酯提取物的IC50值低，其抗宫颈癌活性非常显著。与对照相比，八角莲总提取物在浓度≥0.02μg/ml时，处理组与对照组有显著性差异(P＜0.01)；乙酸乙酯提取物在浓度≥0.0025μg/ml时，处理组与对照组有显著性差异(P＜0.01)；正丁醇提取物在浓度≥5.0μg/ml时，处理组与对照组亦有显著性差异(P＜0.01)。

⑥采用MTT法检测步骤(1)得到的八角莲总提取物、乙酸乙酯提取物、正丁醇提取物、水提取物对神经胶质瘤细胞BV2(购自美国模式培养物保藏所ATCC)增殖的抑制作用。取单层培养的BV2细胞(RPMI 1640，含有10％v/v胎牛血清)，用质量体积比0.25％的胰蛋白酶溶液消化，并接种于96孔板上(每孔加入细胞悬浮液100μl，细胞数为3000个)。接种24小时后，加入不同浓度待测样品，并以相同体积比DMSO作为对照。培养72小时后，每孔加入20μl MTT溶液(5mg/ml)，4小时后离心弃上清液，加入DMSO(100μl/孔)，振荡15min左右，置酶标仪测定OD值，波长为570nm，并计算细胞存活率，同时作图并用SPSS 18.0软件求得半数抑制浓度(IC50)。

结果如图7所示，随着八角莲总提取物、乙酸乙酯、正丁醇提取物浓度的升高，癌细胞BV2的抑制率明显升高，其IC50值分别为：0.002、0.001、32.22μg/mL而水提取物无活性。八角莲总提取物、乙酸乙酯提取物的IC50值低，其抗神经胶质瘤活性非常显著。与对照相比，八角莲总提取物在浓度≥0.0025μg/ml时，处理组与对照组有显著性差异(P＜0.01)；乙酸乙酯提取物在浓度≥0.00125μg/ml时，处理组与对照组有显著性差异(P＜0.01)；正丁醇提取物在浓度≥28.889μg/ml时，处理组与对照组亦有显著性差异(P＜0.01)。

对比实施例1

(1)预防和治疗癌症的含鬼臼毒素及黄酮提取物的制备

同实施例1步骤(1)。

(2)对步骤(1)得到的提取物进行分析

同实施例1步骤(2)。

(3)对步骤(1)得到的提取物对正常细胞毒性的检测

采用MTT法检测步骤(1)得到的八角莲总提取物、乙酸乙酯提取物、正丁醇提取物、水提取物对绿猴肾细胞VERO(购自美国模式培养物保藏所ATCC)增殖的抑制作用。取单层培养的VERO细胞(DMEM，含有10％v/v胎牛血清)，用质量体积比0.25％的胰蛋白酶溶液消化，并接种于96孔板上(每孔加入细胞悬浮液100μl，细胞数为3000个)。接种24小时后，加入10μg/ml待测样品，并以相同体积比DMSO作为对照。培养72小时后，每孔加入20μl MTT溶液(5mg/ml)，4小时后离心弃上清液，加入DMSO(100μl/孔)，振荡15min左右，置酶标仪测定OD值，波长为570nm，并计算细胞存活率。

总提取物、乙酸乙酯提取物、正丁醇提取物、水提取物在10μg/ml的浓度下对VERO细胞的抑制率分别为：34.51％、48.44％、18％、15.65％。因此，在超过对上述癌细胞IC₅₀值100倍的浓度下。八角莲总提取物、乙酸乙酯提取物对于正常细胞的毒性未达到50％，相对于其抗癌活性而言，其对正常细胞的毒性不大。

对比实施例2

三种鬼臼类中药八角莲、桃儿七及六角莲化学成分的比较

(1)样品制备

分别取八角莲、六角莲及桃儿七药材(均为根茎部分)各0.5g，用10ml甲醇超声提取1小时，提取液用0.22μm微孔滤膜过滤，滤液取20μl注入HPLC进行分析。

(2)分析条件

采用HP 1100仪器系统，反相色谱柱(150×4.6mm，3μm；Alltech，USA)，流动相：water(A)and CH3CN(B).梯度洗脱系统：：0-15min：15％→30％B；15-30min：30％→60％B；30-35min，60％B；35-40min，60％→15％B，流速：0.8ml/min；检测波长：236nm。

(3)分析条件

结果如图8所示，三种鬼臼类中药八角莲、桃儿七及六角莲的主要色谱峰的保留时间一致，说明它们的化学成分非常接近。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种抗肿瘤的鬼臼类中药提取物，其特征在于其含有鬼臼毒素类化合物与黄酮类化合物；所述的鬼臼毒素类化合物为鬼臼毒素葡萄糖苷，或鬼臼毒素葡萄糖苷和鬼臼毒素形成的混合物；

所述的黄酮类化合物为山奈黄素-3-β-D-葡萄糖苷，山奈黄素-3-β-D-葡萄糖苷和山萘酚形成的混合物；

所述的鬼臼类植物为八角莲、六角莲或桃儿七中的至少一种；

所述的抗肿瘤的鬼臼类中药提取物通过如下制备方法得到：将鬼臼类植物的根或/和根茎干燥，粉碎，过筛，用醇溶液进行提取，过滤，得到醇总提取液，接着浓缩至干燥得总提物，将此总提物混悬于水中，依次用乙酸乙酯、正丁醇萃取，将醇总提取液、乙酸乙酯萃取液和正丁醇萃取液分别浓缩，得到鬼臼类中药提取物；

所述的醇溶液为乙醇溶液或甲醇溶液；

所述的乙醇溶液的浓度为体积百分比为50～100%；

所述的甲醇溶液的浓度为体积百分比为50～100%；

所述的提取的方式为渗漉、超声或加热回流中的一种。

2.权利要求1所述的抗肿瘤的鬼臼类中药提取物的制备方法，其特征在于包含如下步骤：将鬼臼类植物的根或/和根茎干燥，粉碎，过筛，用醇溶液进行提取，过滤，得到醇总提取液，接着浓缩至干燥得总提物，将此总提物混悬于水中，依次用乙酸乙酯、正丁醇萃取，将醇总提取液、乙酸乙酯萃取液和正丁醇萃取液分别浓缩，得到鬼臼类中药提取物；

所述的醇溶液为乙醇溶液或甲醇溶液；

所述的乙醇溶液的浓度为体积百分比为50～100%；

所述的甲醇溶液的浓度为体积百分比为50～100%；

所述的提取的方式为渗漉、超声或加热回流中的一种。

3.根据权利要求2所述的抗肿瘤的鬼臼类中药提取物的制备方法，其特征在于：所述加热回流的条件为在70～80℃进行。

4.权利要求1所述的抗肿瘤的鬼臼类中药提取物在抗肿瘤药物制备中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述的抗肿瘤的鬼臼类中药提取物通过包含如下步骤的方法制备得到：

（1）将鬼臼类植物的根或/和根茎干燥，粉碎，过筛，用醇溶液进行提取，过滤，得到醇总提取液；接着浓缩至干燥得总提物；

（2）将步骤（1）得到的总提物混悬于水中依次用乙酸乙酯、正丁醇萃取，分别得到的乙酸乙酯提取液和正丁醇提取液；

步骤（1）得到的醇总提取液以及步骤（2）得到的乙酸乙酯提取液和正丁醇提取液分别进行减压浓缩，得到的浓缩物均为抗肿瘤的鬼臼类中药提取物。

6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述的肿瘤为前列腺癌、肝癌、乳腺癌、宫颈癌或神经胶质瘤。