CN106749303B - 一种制备鬼臼毒素和八角莲双黄酮及其类似物的方法 - Google Patents
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Abstract
八角莲是鬼臼毒素类抗癌药物的重要资源。除鬼臼毒素类化合物外，黄酮和双黄酮类化合物也是八角莲药用资源中的重要抗氧化和抗癌物质。但如何高纯度地制备和纯化这些物质，仍是一种重要的挑战。本发明提供一种新的低成本的环境友好的高产率的制备高纯度鬼臼毒素和八角莲双黄酮及其类似物的方法，包括溶剂提取和粗分等步骤，其特征在于所用分配体系中含有用来调节分配系数的糖。该方法经济实用，便于大规模应用。并且由于糖具甜味和无毒，因此该方法不仅可以得到高纯度的臼毒素和八角莲双黄酮及其类似物单体，而且可以不经除糖得到这些单体的糖制剂。
Description
技术领域
本发明涉及天然药物的制备方法，具体的说是涉及黄酮类化合物(英文名Flavones)和鬼臼毒素类化合物(英文名Podophyl lotoxins)的分离制备方法。
背景技术
八角莲是鬼臼毒素类抗癌药物的重要资源。除鬼臼毒素类化合物外，黄酮和双黄酮类化合物也是八角莲药用资源中的重要抗氧化和抗癌物质。但如何高纯度地制备和纯化这些物质，仍是一种重要的挑战。逆流色谱是一种重要的方法，但如何选择合适的溶剂体系仍是一个耗时的工作。
发明内容
本发明的目的是针对当前鬼臼毒素和八角莲双黄酮及其类似物分离制备中的困难提供一种制备鬼臼毒素和八角莲双黄酮及其类似物的方法，该方法成本低、环境友好且产率高、产物纯度高。
本发明的制备鬼臼毒素和八角莲双黄酮及其类似物的方法，包括溶剂提取、粗分和逆流色谱分离步骤，所述的逆流色谱分离步骤中采用含有糖溶液的两相溶剂作为逆流色谱溶剂，其中所述的糖用于调节分配系数K。
所述的糖是蔗糖、葡萄糖、果糖、麦芽糖、半乳糖、山梨糖、甘露糖、鼠李糖、木糖中的一种或多种组合。
所述的糖溶液为糖的水溶液，质量分数是5-30％。在所述的两相分配体系中糖浓度可以是恒定的，也可以是梯度变化的；糖的梯度变化可以是线性梯度的，也可以是台阶式梯度。
所述的含有糖溶液的两相溶剂为正己烷－乙酸乙酯－甲醇－糖的水溶液。
所述的含有糖溶液的两相溶剂为正己烷－乙酸乙酯－乙醇－糖的水溶液。
一种制备鬼臼毒素和八角莲双黄酮及其类似物的方法，具体包括如下步骤：
(1)将八角莲提取液进行柱色谱吸附和富集，然后用石油醚和乙酸乙酯体积比2:1进行洗脱，除去大极性杂质，收集洗脱液，得到八角莲粗品；
(2)将糖溶解到水中配制形成糖溶液；
(3)将(1)中所得到的八角莲粗品用正己烷、乙酸乙酯、甲醇/乙醇、糖溶液四元形成的两相体系进行逆流色谱分离，得到含糖的黄酮类化合物和鬼臼类化合物纯品；
(4)除去逆流色谱馏分—黄酮类化合物和鬼臼类化合物中的糖类，获得产物。
上述技术方案中，所述的步骤2)中糖溶液质量分数为5％-30％。
步骤3)中所述的两相体系中正己烷、乙酸乙酯、甲醇/乙醇、糖溶液四元的体积比为：4:6:4:6或4.5:5.5:4.5:5.5或5:5:5:5。
步骤(4)中脱糖的过程中，极性小的部分可以直接用乙酸乙酯干萃取，极性大的部分依次用水和甲醇分别洗脱反相C18分离柱上的化合物。
本发明的有益效果在于：
(1)糖是一种甜的、短链、可溶性的碳水化合物。作为添加剂，和盐析制备化合物的策略相比，糖析制备的策略更绿色更环保，不会产生盐腐蚀等并发症。
(2)本发明中添加糖到正己烷、乙酸乙酯、甲醇/乙醇、水的两相体系，可以改变溶剂以及化合物在两相体系中的分配，从而可以快速有效地找到合适的溶剂体系。
(3)采用正己烷、乙酸乙酯、甲醇/乙醇、糖的水溶液两相体系进行逆流色谱分离，可以实现高纯度的逆流色谱制备。
(4)当吸附有含糖的纯品的反相C18色谱柱用甲醇和水洗脱时，也可良好地实现逆流色谱和柱色谱的连用，提高单位时间的生产效率，同时也降低能耗；也可以重复进行，便于自动化生产；该方法经济实用，便于大规模应用。
(5)并且由于糖具甜味和无毒，因此该方法不仅可以得到高纯度的鬼臼毒素和八角莲双黄酮及其类似物单体，而且可以不经除糖得到这些单体的糖制剂。
附图说明
图1：八角莲粗品的HPLC及主要化合物的结构图。
图2：分配系数测定中，鬼臼毒素在不同糖类和不同浓度的两相体系中的糖析作用。
图3：逆流色谱分离过程中，八角莲粗品在质量分数为20％蔗糖的两相体系(4:6:4:6v/v)中的糖析作用。
图4：逆流色谱分离过程中，八角莲粗品在质量分数为20％和30％蔗糖的两相体系(4.5:5.5:4.5:5.5v/v)中的糖析作用，其中逆流色谱分离图(A)为20％蔗糖的糖析作用，图(B)为30％蔗糖的糖析作用。
图5：逆流色谱分离过程中，八角莲粗品在质量分数为20％和30％葡萄糖的两相体系(4.5:5.5:4.5:5.5v/v)中的糖析作用。其中逆流色谱分离图(A)为20％葡萄糖的糖析作用，图(B)为30％葡萄糖的糖析作用。
图6：逆流色谱分离过程中，八角莲粗品在质量分数为30％蔗糖和30％葡萄糖梯度变化的两相体系(4.5:5.5:4.5:5.5v/v)中的糖析作用。其中逆流色谱分离图(A)为30％蔗糖的糖析作用，图(B)为30％葡萄糖的糖析作用。
图7：八角莲粗品在质量分数为20％,葡萄糖的两相体系(4.5:5.5:4.5:5.5v/v)中经逆流色谱分离后得到典型糖制剂的化合物。液相条件和图1相同。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明的技术方案作进一步的描述。
实施例1：
黄酮类化合物和鬼臼毒素类化合物在不同体系中的分配系数测定，包括以下步骤：
1、提取和富集
首先八角莲提取液直接进行柱色谱吸附和富集，然后用石油醚和乙酸乙酯体积比2:1进行洗脱，除去大极性杂质，收集洗脱液，洗脱液用高效液相色谱(HPLC)进行分析。HPLC分析条件为：C18反相色谱柱(Zorbax SB-C18,250mm×4.6mm I.D.,5μm)，保护柱(10mm×4.6mm I.D.,5μm)；流动相为甲醇和0.1％三氟乙酸(TFA)。洗脱采用梯度模式，具体参数如下：0-5min，甲醇由10％梯度变化到30％，三氟乙酸由90％梯度变化到70％；5-35min，甲醇由30％梯度变化到70％，三氟乙酸由70％梯度变化到30％；35-45min,甲醇由70％梯度变化到100％，三氟乙酸由30％梯度变化到0％。流速为0.8mL/min，样本进样量10μL,柱温控制在30℃。洗脱物利用DAD检测器进行检测，检测波长为254nm。结果表明(图1)当石油醚和乙酸乙酯体积比2:1洗脱得到的粗产品包括亲水性的鬼臼毒素类化合物和疏水性的黄酮类化合物。
2.糖溶液配制
将蔗糖溶解到一定质量的水中配制形成质量浓度10％、20％、30％的糖溶液。
3.八角莲中化合物在不同两相体系中的分配系数的测定
将八角莲粗品加入到装有两相体系的2mL离心管中，包括正己烷、乙酸乙酯、甲醇和水或者一定蔗糖浓度的水溶液。两相溶剂平衡建立以后，分别取上相和下相进行HPLC分析。分配系数为化合物在上相的峰面积和下相的峰面积的比值。如表1所示测定了化合物在正己烷、乙酸乙酯、甲醇和水或者一定蔗糖浓度的水溶液按体积比为4：6：4：6、4.5：5.5：4.5：5.5、5：5：5：5的两相体系中的分配系数。
表1 八角莲粗品在不同溶剂体系中的分配系数测定
实施例2：
黄酮类化合物和鬼臼毒素类化合物在以不同糖为添加剂的两相体系中的分配系数测定，包括以下步骤：
1、提取和富集
同实施例1类似，首先八角莲提取液直接进行柱色谱吸附和富集，然后用石油醚和乙酸乙酯体积比2:1进行洗脱，除去大极性杂质，收集洗脱液，洗脱液用高效液相色谱(HPLC)进行分析。结果表明(图1)当石油醚和乙酸乙酯体积比2:1洗脱得到的粗产品包括亲水性的鬼臼毒素类化合物和疏水性的黄酮类化合物。
2.糖溶液配制
将蔗糖、葡萄糖、果糖、麦芽糖、半乳糖、山梨糖、甘露糖、鼠李糖、木糖溶解到一定质量的水中分别配制形成质量浓度10％、20％、30％的糖溶液。
3.八角莲中化合物在以不同糖为添加剂的两相体系中的分配系数的测定
将八角莲粗品加入到装有两相体系体积比为4.5：5.5：4.5：5.5的2mL离心管中，包括正己烷、乙酸乙酯、甲醇和水或者一定糖浓度的水溶液。两相溶剂平衡建立以后，分别取上相和下相进行HPLC分析。分配系数为化合物在上相的峰面积和下相的峰面积的比值。如表2所示测定了八角莲粗品以不同糖为添加剂的两相体系中的分配系数。并且图2展示了化合物鬼臼毒素在不同浓度和不同糖种类下的糖析作用。
表2 八角莲粗品在不同糖类和不同浓度的两相体系中分配系数测定
实施例3：
黄酮类化合物和鬼臼毒素类化合物的制备方法，包括以下步骤：
1、提取和富集
同实施例1类似，首先八角莲提取液直接进行柱色谱吸附和富集，然后用石油醚和乙酸乙酯体积比2:1进行洗脱，除去大极性杂质，收集洗脱液，洗脱液用高效液相色谱(HPLC)进行分析。结果表明(图1)当石油醚和乙酸乙酯体积比2:1洗脱得到的粗产品包括亲水性的鬼臼毒素类化合物和疏水性的黄酮类化合物，浓缩后非常适合作为进一步逆流色谱分离的样品。
2.糖溶液配制
将蔗糖溶解到一定体积的水中配制形成质量分数为20％的糖溶液。例如，将蔗糖溶解到1000mL(1000g)中，得到质量分数为20％的蔗糖溶液。
3.逆流色谱分离及纯品脱糖
将所得到的250mg八角莲粗品进行逆流色谱(900rpm，柱体积260mL)分离。溶剂体系为正己烷、乙酸乙酯、甲醇和质量分数为20％蔗糖水溶液(4:6:4:6v/v)，上相为固定相，下相为保留相，流速3mL/min。各个馏分在波长254nm检测。根据CCC洗脱图3,主峰部分收集在离心管中，并且每根离心管收集4min。逆流色谱分离后，主峰部分进一步脱糖。极性小的部分用干萃取，极性大的部分在反相C18柱上用甲醇和水洗脱分离。用HPLC和LC-MS进一步确认纯化得到的化合物。
实施例4：
1、提取和富集
同实施例1类似，首先八角莲提取液直接进行柱色谱吸附和富集，然后用石油醚和乙酸乙酯体积比2:1进行洗脱，除去大极性杂质，收集洗脱液，洗脱液用高效液相色谱(HPLC)进行分析，作为进一步逆流色谱分离的样品。
2.糖溶液配制
将蔗糖溶解到一定体积的水中配制形成质量分数为20％和30％的糖溶液。例如，将蔗糖溶解到1000mL(1000g)中，得到质量分数为20％和30％的蔗糖溶液。
3.逆流色谱分离及纯品脱糖
将所得到的250mg八角莲粗品进行逆流色谱(900rpm，柱体积260mL)分离。溶剂体系为正己烷、乙酸乙酯、甲醇和质量分数为20％蔗糖水溶液或30％蔗糖水溶液(4.5:5.5:4.5:5.5v/v)，上相为固定相，下相为保留相，流速3mL/min。各个馏分在波长254nm检测。根据CCC洗脱图,主峰部分收集在离心管中，并且每根离心管收集4min。逆流色谱分离后，主峰部分进一步脱糖。极性小的部分用干萃取，极性大的部分在反相C18柱上用甲醇和水洗脱分离。用HPLC和LC-MS进一步确认纯化得到的化合物。
实施例5：
1、提取和富集
同实施例1类似，首先八角莲提取液直接进行柱色谱吸附和富集，然后用石油醚和乙酸乙酯体积比2:1进行洗脱，除去大极性杂质，收集洗脱液，洗脱液用高效液相色谱(HPLC)进行分析，作为进一步逆流色谱分离的样品。
2.糖溶液配制
将葡萄糖或者蔗糖溶解到一定体积的水中配制形成质量分数为20％的糖溶液。例如，将葡萄糖、蔗糖分别溶解到1000mL(1000g)中，得到质量分数为20％的葡萄糖和20％的蔗糖溶液。
3.逆流色谱分离及纯品脱糖
将所得到的250mg八角莲粗品进行逆流色谱(900rpm，柱体积260mL)分离。溶剂体系为正己烷、乙酸乙酯、甲醇和质量分数为20％蔗糖水溶液或20％葡萄糖水溶液(5:5:5:5v/v)，上相为固定相，下相为保留相，流速3mL/min。各个馏分在波长254nm检测。根据CCC洗脱图5,主峰部分收集在离心管中，并且每根离心管收集4min。逆流色谱分离后，主峰部分进一步脱糖。极性小的部分用干萃取，极性大的部分在反相C18柱上用甲醇和水洗脱分离。用HPLC和LC-MS进一步确认纯化得到的化合物。
实施例6：
1、提取和富集
同实施例1类似，首先八角莲提取液直接进行柱色谱吸附和富集，然后用石油醚和乙酸乙酯体积比2:1进行洗脱，除去大极性杂质，收集洗脱液，洗脱液用高效液相色谱(HPLC)进行分析，作为进一步逆流色谱分离的样品。
2.糖溶液配制
将葡萄糖溶解到一定体积的水中配制形成质量分数为20％和30％的糖溶液。例如，将葡萄糖溶解到1000mL(1000g)中，得到质量分数为20％和30％的葡萄糖溶液。
3.逆流色谱分离及纯品脱糖
将所得到的250mg八角莲粗品进行逆流色谱(900rpm，柱体积260mL)分离。溶剂体系为正己烷、乙酸乙酯、甲醇和质量分数为20％葡萄糖水溶液或30％葡萄糖水溶液(4.5:5.5:4.5:5.5v/v)，上相为固定相，下相为保留相，流速3mL/min。各个馏分在波长254nm检测。根据CCC洗脱图6,主峰部分收集在离心管中，并且每根离心管收集4min。逆流色谱分离后，主峰部分进一步脱糖。极性小的部分用干萃取，极性大的部分在反相C18柱上用甲醇和水洗脱分离。用HPLC和LC-MS进一步确认纯化得到的化合物。
实施例7：
1、提取和富集
同实施例1类似，首先八角莲提取液直接进行柱色谱吸附和富集，然后用石油醚和乙酸乙酯体积比2:1进行洗脱，除去大极性杂质，收集洗脱液，洗脱液用高效液相色谱(HPLC)进行分析，作为进一步逆流色谱分离的样品。
2.糖溶液配制
将葡萄糖或者蔗糖溶解到一定体积的水中配制形成质量分数为30％的糖溶液。例如将葡萄糖、蔗糖分别溶解到1000mL(1000g)中，得到质量分数为30％的葡萄糖溶液和30％的蔗糖溶液。
3.逆流色谱分离及纯品脱糖
将所得到的250mg八角莲粗品进行逆流色谱(900rpm，柱体积260mL)分离。溶剂体系为正己烷、乙酸乙酯、甲醇和质量分数为30％蔗糖水溶液或30％葡萄糖水溶液(4.5:5.5:4.5:5.5v/v)，上相为固定相，下相为保留相，流速3mL/min。洗脱方式采用梯度模式，(A)不加糖的两相体系(4.5:5.5:4.5:5.5v/v)的下相和(B)加糖的两相体系(4.5:5.5:4.5:5.5v/v)的下相共同洗脱。在0-200min，不加糖的两相体系(4.5:5.5:4.5:5.5v/v)的下相梯度变化由0％到100％，加糖的两相体系(4.5:5.5:4.5:5.5v/v)的下相梯度变化由100％到0％。各个馏分在波长254nm检测。根据CCC洗脱图7,主峰部分收集在离心管中，并且每根离心管收集4min。逆流色谱分离后，主峰部分进一步脱糖。极性小的部分用干萃取，极性大的部分在反相C18柱上用甲醇和水洗脱分离。用HPLC和LC-MS进一步确认纯化得到的化合物。
Claims (4)
1.一种制备鬼臼毒素和八角莲双黄酮及其类似物的方法，包括溶剂提取、粗分和逆流色谱分离步骤，其特征在于,所述的逆流色谱分离步骤中采用含有糖溶液的两相溶剂作为逆流色谱溶剂，其中所述的糖用于调节分配系数K；所述的糖是蔗糖、葡萄糖、果糖、麦芽糖、半乳糖、山梨糖、甘露糖、鼠李糖、木糖中的一种或多种组合；所述的糖溶液为糖的水溶液，质量分数是5-30%；所述的含有糖溶液的两相溶剂为正己烷－乙酸乙酯－甲醇－糖的水溶液或者为正己烷－乙酸乙酯－乙醇－糖的水溶液。
2.一种制备如权利要求1所述的鬼臼毒素和八角莲双黄酮及其类似物的方法，其特征在于,具体包括如下步骤：
（1）将八角莲提取液进行柱色谱吸附和富集，然后用石油醚和乙酸乙酯体积比2:1进行洗脱，除去大极性杂质，收集洗脱液，得到八角莲粗品；
（2）将糖溶解到水中配制形成糖溶液；
（3）将（1）中所得到的八角莲粗品用正己烷、乙酸乙酯、甲醇/乙醇、糖溶液四元形成的两相体系进行逆流色谱分离，得到含糖的黄酮类化合物和鬼臼类化合物纯品；
（4）除去逆流色谱馏分—黄酮类化合物和鬼臼类化合物中的糖类，获得产物。
3.根据权利要求2所述的制备鬼臼毒素和八角莲双黄酮及其类似物的方法，其特征在于,所述的步骤2）中糖溶液质量分数为5%-30%。
4.根据权利要求2所述的制备鬼臼毒素和八角莲双黄酮及其类似物的方法，其特征在于,所述的步骤3）中所述的两相体系中正己烷、乙酸乙酯、甲醇/乙醇、糖溶液四元的体积比为：4:6:4:6或4.5:5.5:4.5:5.5或5:5:5:5。
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| 基于色谱分离和13C NMR模式识别联用技术在八角莲活性成分分离鉴定中的应用;杨志;《中国博士学位论文全文数据库医药卫生科技辑》;20150115;第61-64、73-75页 |
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