CN102617656A - 从对萼猕猴桃叶中分离制备高纯度黄酮苷类化合物的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种从对萼猕猴桃叶中分离制备高纯度黄酮苷类化合物的方法，包括药材提取工序、粗提物制备工序和单体化合物分离纯化工序，药材提取工序中，将对萼猕猴桃叶用体积浓度为50％～80％的乙醇回流提取2-4次，减压回收乙醇后得提取液；粗提物制备工序中，提取液过大孔吸附树脂，用水、体积浓度为20％～30％的乙醇及体积浓度为50％～60％的乙醇洗脱，收集体积浓度为50％～60％的乙醇洗脱液，浓缩干燥后得到粗提物；单体化合物分离纯化工序中，采用高速逆流色谱法对所得粗提物进行分离纯化，包括配制构成固定相、流动相的溶剂体系，使逆流色谱仪柱子中充满固定相，然后使柱子转动，再将流动相泵入柱内，将制备好的粗提物进入进样阀，根据检测图谱接收目标流份。

Description

从对萼猕猴桃叶中分离制备高纯度黄酮苷类化合物的方法

技术领域

本发明涉及一种从对萼猕猴桃叶分离制备黄酮苷类化合物，即山柰酚-3-O-α-L-鼠李糖基-(1→3)-α-L-鼠李糖基-(1→6)-β-D-吡喃半乳糖苷、山柰酚-3-O-α-L-鼠李糖基-(1→3)-(4-O-乙酰基-α-L-鼠李糖基)-(1→6)-β-D-吡喃半乳糖苷和山柰酚-3-O-α-L-鼠李糖基-(1→3)-(2，4-二-O-乙酰基-α-L-鼠李糖基)-(1→6)-β-D-吡喃半乳糖苷的工艺方法。

背景技术

对萼猕猴桃(Actinidia valvata Dunn)为猕猴桃科猕猴桃属植物，主要分布于安徽、浙江、江西等华东地区，其根为猫人参，为华东地区常用的抗肿瘤中药。近年来，发明人投入大量精力对该药用植物进行了系列药学研究[H.L.Xin，Y.C.Wu，Y.F.Xu，et al.Chin J Nat Med.，2010，8：260；H.L.Xin，X.Q.Yue，Y.F.Xu，et al.Helv.Chim.Acta，2008，91：575；Y.F Xu，R.L.Ge，J.Du，et al.Cancer Lett，2009，284：229；张亚妮，刘岭，凌昌全.中国中药杂志，2006，36：918.]，所获研究成果处于该领域先进水平。由于长期以来对萼猕猴桃以根入药，自然更新缓慢，野生资源急剧减少。为扩大该药用植物的药用部位，发明人还对其叶的化学成分、药理作用进行了深入研究，是该领域中最早开展此项研究工作的学者。经研究发现其叶中主要含有皂苷、黄酮类化学成分等[H.L.Xin，Y.C.Wu，Y.F.Xu，et al.Chin J Nat Med.，2010，8：260；H.L.Xin，Y.C.Wu，Y.H.Su，et al.Planta Med.，2011，77：70.]，其中山柰酚-3-O-α-L-鼠李糖基-(1→3)-(4-O-乙酰基-α-L-鼠李糖基)-(1→6)-β-D-吡喃半乳糖苷和山柰酚-3-O-α-L-鼠李糖基-(1→3)-(2，4-二-O-乙酰基-α-L-鼠李糖基)-(1→6)-β-D-吡喃半乳糖苷系由本发明人通过采用经典硅胶柱色谱法首次从对萼猕猴桃叶中制备得到，纯度在98％以上[H.L.Xin，Y.C.Wu，Y.H.Su，et al.Planta Med.，2011，77：70.]，它们具有显著的抗氧化、抗心肌缺血的药理作用，并分别就其化学结构、药理作用申请了中国专利(申请号：CN201010138085.1、CN201110271050.X)。化合物山柰酚-3-O-α-L-鼠李糖基-(1→3)-α-L-鼠李糖基-(1→6)-β-D-吡喃半乳糖苷，与上述两个化合物结构相似，该单体已有报道从山茶及蛇莓中分离制备得到[许文东，林厚文，邱峰，等.沈阳药科大学学报，2007，24：402；C.Lakenbrink，T.M.L.Lam，U.H.Engelhardt，et al.Nat.Prod.Lett.，2000，14：233.]。前述三种黄酮苷类化合物的化学结构式如下：

(I)山柰酚-3-O-α-L-鼠李糖基-(1→3)-α-L-鼠李糖基-(1→6)-β-D-吡喃半乳糖苷

(II)山柰酚-3-O-α-L-鼠李糖基-(1→3)-(4-O-乙酰基-α-L-鼠李糖基)-(1→6)-β-D-吡喃半乳糖苷

(III)山柰酚-3-O-α-L-鼠李糖基-(1→3)-(2，4-二-O-乙酰基-α-L-鼠李糖基)-(1→6)-β-D-吡喃半乳糖苷。

尽管上述三种黄酮苷类化合物可采用传统的柱色谱法分离得到，然而费事费力，污染环境，而且所用固定相对样品会有不可逆的吸附作用，造成样品的回收率下降。

高速逆流色谱(High-speed counter-current chromatography，HSCCC)是一种液液分配色谱技术，它不用任何固体支撑体或载体，因而克服了传统分离方法对样品的不可逆性吸附的弊端，样品回收率高，同时还具有应用范围广、仪器操作简单、制备量大等优点，已被广泛应用于天然产物的分离制备中。

发明内容

针对上述三种化合物采用传统的柱色谱法分离费事费力，污染环境，而且所用固定相对样品会有不可逆的吸附作用，造成样品的回收率下降等缺陷，本发明所要解决的技术问题是提供了一种新的快速、简便、高效的从对萼猕猴桃叶中分离此三种黄酮苷类化合物的制备工艺，以克服现有技术中存在的上述缺陷。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种从对萼猕猴桃叶中分离制备高纯度山柰酚-3-O-α-L-鼠李糖基-(1→3)-α-L-鼠李糖基-(1→6)-β-D-吡喃半乳糖苷、山柰酚-3-O-α-L-鼠李糖基-(1→3)-(4-O-乙酰基-α-L-鼠李糖基)-(1→6)-β-D-吡喃半乳糖苷、山柰酚-3-O-α-L-鼠李糖基-(1→3)-(2，4-二-O-乙酰基-α-L-鼠李糖基)-(1→6)-β-D-吡喃半乳糖苷的方法，具体包括：药材提取、粗提物制备及粗提物分离纯化三道工序，(1)药材提取工序中，将对萼猕猴桃叶用体积浓度为50％～80％的乙醇回流提取，减压回收乙醇后得到提取液；(2)粗提物制备工序中，提取液过大孔吸附树脂，分别用水、体积浓度为20％～30％的乙醇和体积浓度为50％～60％的乙醇洗脱，收集体积浓度为50％～60％的乙醇洗脱液，浓缩干燥后得到粗提物；(3)单体化合物分离纯化工序中，采用高速逆流色谱对所得粗提物进行分离纯化，包括配制构成固定相、流动相的溶剂体系，使逆流色谱仪中充满固定相，然后使柱子转动，再将流动相泵入柱内，制备好的粗提物样品进入进样阀，根据检测图谱接收目标流份。

本发明药材提取工序中：取对萼猕猴桃叶用体积浓度为50％～80％乙醇回流提取2～4次，每次2小时，过滤，合并滤液，减压浓缩至无醇味，得提取液。

本发明粗提物制备工序中：取浓缩的提取液加等量的水混悬后，过大孔吸附树脂，用水、体积浓度为20％～30％乙醇和体积浓度为50％～60％乙醇洗脱，收集体积浓度为50％～60％乙醇洗脱液，减压浓缩干燥后得到待分离的粗提物。

本发明单体化合物分离纯化工序中：应用高速逆流色谱对粗提物进行分离纯化，它包括配制构成固定相、流动相的溶剂体系，使逆流色谱仪中充满固定相，然后使柱子转动，再将流动相泵入柱内，所用溶剂体系是由乙酸乙酯、正丁醇和水组成，上相为固定相，下相为流动相，制备好的粗提物样品进入进样阀，根据检测图谱接收目标流份I、II、III。此法可制备纯度高于95％的山柰酚-3-O-α-L-鼠李糖基-(1→3)-α-L-鼠李糖基-(1→6)-β-D-吡喃半乳糖苷(I)、山柰酚-3-O-α-L-鼠李糖基-(1→3)-(4-O-乙酰基-α-L-鼠李糖基)-(1→6)-β-D-吡喃半乳糖苷(II)、山柰酚-3-O-α-L-鼠李糖基-(1→3)-(2，4-二-O-乙酰基-α-L-鼠李糖基)-(1→6)-β-D-吡喃半乳糖苷(III)。

相对于现有技术，本发明采用高速逆流色谱对中药粗提物进行分离纯化、简便快速，克服了传统制备方法分离周期长、操作繁琐等缺点，具有制备量大、回收率高、产品纯度好的优点，易于推广使用。

附图说明

图1为对萼猕猴桃叶粗提物制备流程图。

图2-A为对萼猕猴桃叶加热回流提取后提取物的HPLC图。

图2-B为过HPD-300型大孔树脂柱后对萼猕猴桃叶粗提物的HPLC图。

图2-C和2-D为溶剂体系为乙酸乙酯-正丁醇-水＝2∶1∶3时，HSCCC所得流份I和II的HPLC图。

图2-E和2-F为溶剂体系为乙酸乙酯-正丁醇-水＝4∶1∶5时，HSCCC所得流份II和III的HPLC图。

图2-G为化合物II和III的标准品HPLC图。

图3-A为溶剂体系为乙酸乙酯-正丁醇-水＝2∶1∶3时，对萼猕猴桃叶粗提物的HSCCC色谱图。

图3-B为溶剂体系为乙酸乙酯-正丁醇-水＝4∶1∶5时，对萼猕猴桃叶粗提物的HSCCC色谱图。

图4-A、4-B和4-C为HSCCC所得流份I、II和III的紫外图。

图5-A、5-B和5-C为HSCCC所得流份I、II和III的质谱图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例应理解为仅用于说明本发明而不用于限制本发明的保护范围。在阅读了本发明记载的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等效变化和修饰同样落入本发明权利要求所限定的范围。

本发明以下实施例中，对萼猕猴桃叶粗提物制备流程如图1所示。

实施例1

1、药材提取：称取对萼猕猴桃叶600g，用6倍量体积浓度为70％的乙醇回流提取2次，每次2小时，过滤，合并滤液，50℃减压浓缩至无醇味，得浓缩后的提取液。

2、粗提物制备：取浓缩后的提取液1000ml，加等量水混悬后，加入装有500g经处理过的HPD-300型大孔吸附树脂的层析柱上，上样完毕后吸附1小时，用2500ml水洗脱，然后分别用3000ml体积浓度为20％的乙醇和4000ml体积浓度为60％的乙醇洗脱，收集体积浓度为60％的乙醇洗脱溶液，减压浓缩，真空干燥得粗提物粉末28.9g，提取得率为4.82％。

3、单体化合物的分离纯化：

应用高速逆流色谱分离纯化粗提物。溶剂体系为乙酸乙酯-正丁醇-水，上相为固定相，下相为流动相，该体系体积比为2∶1∶3时，固定相保留率49％，用于分离山柰酚-3-O-α-L-鼠李糖基-(1→3)-α-L-鼠李糖基-(1→6)-β-D-吡喃半乳糖苷(I)、山柰酚-3-O-α-L-鼠李糖基-(1→3)-(4-O-乙酰基-α-L-鼠李糖基)-(1→6)-β-D-吡喃半乳糖苷(II)；该体系体积比为4∶1∶5时，固定相保留率55％，用于分离山柰酚-3-O-α-L-鼠李糖基-(1→3)-(4-O-乙酰基-α-L-鼠李糖基)-(1→6)-β-D-吡喃半乳糖苷(II)和山柰酚-3-O-α-L-鼠李糖基-(1→3)-(2，4-二-O-乙酰基-α-L-鼠李糖基)-(1→6)-β-D-吡喃半乳糖苷(III)。两个不同体积比的高速逆流色谱其它条件相同，均如下：流速1.5ml/min，转速800rpm，检测波长254nm，取粗提物粉末100mg溶解于20ml等量上下相中，进样后的HSCCC色谱图见图3-A和图3-B。

具体操作步骤是：按上述体积比配制溶剂体系，在分液漏斗中充分振摇后静止分层，分取上下相，上相为固定相，下相为流动相，先将固定相泵入逆流色谱仪中，待其充满柱子后，使主机转动，转速800rpm，再泵入流动相，由进样阀进样，根据检测器谱图接收目标流份I、II、III。

目标流份的纯度检测：对流份I采用HPLC峰面积归一化法进行纯度检测；对流份II和III采用外标法进行纯度检测。

HPLC分析条件：色谱柱RP-C₁₈(4.6mm×250mm，5μm，DIKMA，INC)；流动相：乙腈-水系统，0-30min，10％-40％的乙腈，流速：1.0ml/min，柱温：30℃，检测波长：254nm。在此条件下，对萼猕猴桃叶加热回流提取后提取物的HPLC图见图2-A，过HPD-300型大孔树脂柱后对萼猕猴桃叶粗提物的HPLC图见图2-B；溶剂体系为乙酸乙酯-正丁醇-水＝2∶1∶3时，HSCCC所得流份I和II的HPLC图见图2-C和2-D；溶剂体系为乙酸乙酯-正丁醇-水＝4∶1∶5时，HSCCC所得流份II和III的HPLC图见图2-E和2-F；图2-G为化合物II和III的标准品HPLC图。

经HPLC分析流份I、II、III为单一色谱峰，I和II(2∶1∶3溶剂体系制备所得)纯度分别为95.76％和97.36％，II和III(4∶1∶5溶剂体系制备所得)纯度分别为97.82％和98.21％。从HPLC图(2-E和2-F)可以看出，流份II和III的色谱峰保留时间与图2-G中两个标准品的保留时间一致。

目标流份的结构鉴定：对流份I挥干溶剂后进行UV、MS、¹HNMR和¹³CNMR分析；对流份II和III与标准品(实验室自制，纯度＞98％，相关内容已发表在Planta Med.，2011，77：70)进行色谱峰保留时间的比对，挥干溶剂后进行UV、MS分析，根据所得数据(UV分析数据如图4-A、4-B和4-C所示；MS分析数据如图5-A、5-B和5-C所示)进行结构确认。数据如下：

流份I，黄色粉末，ESI-MS：739.2[M-H]^-.¹H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ：6.24(1H，d，J＝1.9Hz，H-6)，6.51(1H，d，J＝1.9Hz，H-8)，8.04(2H，d，J＝8.8Hz，H-2′，6′)，6.88(2H，d，J＝8.8Hz，H-3′，5′)，5.30(1H，d，J＝7.7Hz，H-1″)，4.39(1H，s，H-1″′)，1.05(3H，d，J＝6.1Hz，H-6″′)，4.71(1H，s，H-1″″)，0.97(3H，d，J＝6.2Hz，H-6″″).¹³C NMR(100MHz，DMSO-d6)δ：156.53(C-2)，133.51(C-3)，177.45(C-4)，161.37(C-5)，98.99(C-6)，164.62(C-7)，93.79(C-8)，156.70(C-9)，103.87(C-10)，120.94(C-1′)，131.02(C-2′)，115.10(C-3′)，159.85(C-4′)，115.02(C-5′)，131.07(C-6′)，102.23(C-1″)，71.05(C-2″)，73.01(C-3″)，68.03(C-4″)，73.25(C-5″)，65.36(C-6″)，100.16(C-1″′)，70.17(C-2″′)，78.03(C-3″′)，70.92(C-4″′)，70.56(C-5″′)，17.88(C-6″′)，102.36(C-1″″)，70.37(C-2″″)，70.41(C-3″″)，72.05(C-4″″)，68.33(C-5″″)，17.70(C-6″″)。

流份II，黄色粉末，ESI-MS：781.4[M-H]^-，与标准品山柰酚-3-O-α-L-鼠李糖基-(1→3)-(4-O-乙酰基-α-L-鼠李糖基)-(1→6)-β-D-吡喃半乳糖苷的色谱保留时间一致。

流份III，黄色粉末，ESI-MS：823.3[M-H]^-，与标准品山柰酚-3-O-α-L-鼠李糖基-(1→3)-(2，4-二-O-乙酰基-α-L-鼠李糖基)-(1→6)-β-D-吡喃半乳糖苷的色谱保留时间一致。

根据上述结构鉴定结果，流份I鉴定为山柰酚-3-O-α-L-鼠李糖基-(1→3)-α-L-鼠李糖基-(1→6)-β-D-吡喃半乳糖苷，流份II鉴定为山柰酚-3-O-α-L-鼠李糖基-(1→3)-(4-O-乙酰基-α-L-鼠李糖基)-(1→6)-β-D-吡喃半乳糖苷，流份III鉴定为山柰酚-3-O-α-L-鼠李糖基-(1→3)-(2，4-二-O-乙酰基-α-L-鼠李糖基)-(1→6)-β-D-吡喃半乳糖苷。

实施例2

1、药材提取：称取对萼猕猴桃叶600g，用6倍量体积浓度为60％的乙醇回流提取2次，每次2小时，过滤，合并滤液，50℃减压浓缩至无醇味，得浓缩后的提取液。

2、粗提物的制备：取浓缩后的提取液1000ml，加等量水混悬后，加入装有500g经处理过的DM-301型大孔吸附树脂的层析柱上，上样完毕后吸附1小时，用2500ml水洗脱，然后分别用3000ml体积浓度为20％的乙醇和4000ml体积浓度为60％的乙醇洗脱，收集体积浓度为60％的乙醇洗脱溶液，减压浓缩，真空干燥得粗提物粉末27.5g，提取得率为4.58％。

3、粗提物中单体化合物的分离纯化、纯度检测及结构鉴定的方法、步骤同实施例1。

实施例3

1、药材提取：称取对萼猕猴桃叶600g，用6倍量体积浓度为65％的乙醇回流提取2次，每次2小时，过滤，合并滤液，50℃减压浓缩至无醇味，得浓缩提取液。

2、粗提物的制备：取浓缩后的提取液1000ml，加等量水混悬后，加入装有500g经处理过的HPD-300型大孔吸附树脂的层析柱上，上样完毕后吸附1小时，用3000ml水洗脱，然后分别用3000ml体积浓度为20％的乙醇和4500ml体积浓度为50％的乙醇洗脱，收集体积浓度为60％的乙醇洗脱溶液，减压浓缩，真空干燥得粗提物粉末30.2g，提取得率为5.03％。

3、粗提物中单体化合物的分离纯化、纯度检测及结构鉴定的方法、步骤同实施例1。

Claims (3)

1.一种从对萼猕猴桃叶中分离制备高纯度黄酮苷类化合物的方法，其特征是，包括药材提取工序、粗提物制备工序和单体化合物分离纯化工序，

药材提取工序中，将对萼猕猴桃叶用体积浓度为50％～80％的乙醇回流提取2-4次，减压回收乙醇后得提取液；

粗提物制备工序中，提取液过大孔吸附树脂，用水、体积浓度为20％～30％的乙醇及体积浓度为50％～60％的乙醇洗脱，收集体积浓度为50％～60％的乙醇洗脱液，浓缩干燥后得到粗提物；

单体化合物分离纯化工序中，采用高速逆流色谱法对所得粗提物进行分离纯化，包括配制构成固定相、流动相的溶剂体系，使逆流色谱仪柱子中充满固定相，然后使柱子转动，再将流动相泵入柱内，将制备好的粗提物进入进样阀，根据检测图谱接收目标流份，其中，溶剂体系为乙酸乙酯∶正丁醇∶水，当乙酸乙酯∶正丁醇∶水为2∶1∶3时，分离得到山柰酚-3-O-α-L-鼠李糖基-(1→3)-α-L-鼠李糖基-(1→6)-β-D-吡喃半乳糖苷、山柰酚-3-O-α-L-鼠李糖基-(1→3)-(4-O-乙酰基-α-L-鼠李糖基)-(1→6)-β-D-吡喃半乳糖苷；当乙酸乙酯∶正丁醇∶水为4∶1∶5时，分离得到山柰酚-3-O-α-L-鼠李糖基-(1→3)-(4-O-乙酰基-α-L-鼠李糖基)-(1→6)-β-D-吡喃半乳糖苷、山柰酚-3-O-α-L-鼠李糖基-(1→3)-(2，4-二-O-乙酰基-α-L-鼠李糖基)-(1→6)-β-D-吡喃半乳糖苷。

2.根据权利要求1所述的从对萼猕猴桃叶中分离制备高纯度黄酮苷类化合物的方法，其特征在于，药材提取工序中，对萼猕猴桃叶用体积浓度为70％的乙醇回流提取。

3.据权利要求1所述的从对萼猕猴桃叶中分离制备高纯度黄酮苷类化合物的方法，其特征在于，粗提物制备工序中，大孔吸附树脂型号为HPD-300或DM-301型，依次用水、体积浓度为20％、体积浓度为60％乙醇洗脱，收集体积浓度为60％乙醇洗脱液，浓缩干燥后可得到粗提物。

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