CN101220066B

CN101220066B - 山楂叶中单体化合物的分离纯化方法

Info

Publication number: CN101220066B
Application number: CN2008100326782A
Authority: CN
Inventors: 范国荣; 周婷婷; 闻俊; 许红蕾; 吴玉田
Original assignee: Second Military Medical University SMMU
Current assignee: Second Military Medical University SMMU
Priority date: 2008-01-16
Filing date: 2008-01-16
Publication date: 2012-05-02
Anticipated expiration: 2028-01-16
Also published as: CN101220066A

Abstract

本发明涉及医药技术领域，具体涉及从山楂叶中分离纯化单体化合物4

-O-鼠李糖芦丁、牡荆素-2″-O-鼠李糖苷和4″-O-葡萄糖牡荆素的方法。国内外多采用柱色谱法和重结晶等分离纯化山楂叶中的有效单体。本发明的方法包括用水或乙醇水溶液浸泡或回流制备山楂叶粗提物，采用大孔吸附树脂先分别以水和低浓度乙醇洗脱去除水溶性杂质，再用较低浓度乙醇洗脱，洗脱液减压浓缩得山楂叶大孔吸附树脂提取物，再采用高速逆流色谱和制备液相色谱相结合的方法对该提取物进行分离纯化，即得纯度高于99％的4-O-鼠李糖芦丁、牡荆素-2″-O-鼠李糖苷和4″-O-葡萄糖牡荆素。本发明制备方法操作简便、分离效率高、产品纯度好，适于工业化生产。

Description

山楂叶中单体化合物的分离纯化方法

技术领域

本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种从山楂叶中分离纯化高纯度的单体化合物4

-O-鼠李糖芦丁、牡荆素-2″-O-鼠李糖苷和4″-O-葡萄糖牡荆素的方法。

背景技术

山楂为蔷薇科(Rosaceae)山楂属(Crataegus.L)植物，分布于北温带，在我国东北、华北和广东、广西、福建等地都有种植，其叶最早在东晋时代就有入药的记载。药理及临床实验表明：山楂叶中黄酮类化合物对心血管系统具有降压、降血脂、增加冠脉流量、改善血液流变等功效，对心肌缺血、心律失常等心血管疾病均有较好疗效。其中4

-O-鼠李糖芦丁(4

-O-rhamnosylrutin)、牡荆素-2″-O-鼠李糖苷(2″-O-rhamnosylvitexin)和″-O-葡萄糖牡荆素(4″-O-glucosylvitexin)是山楂叶中的主要活性成分(Rayyan S，et al.Phytochem.Anal.2005，16：334；Dong YJ，et al.J Shenyang Pharm Univ.1996，13(1)：31；BeckMA，et al.Phytochemistry.1999，50：329.)，它们的结构式如下：

4

-O-鼠李糖芦丁

牡荆素-2″-O-鼠李糖苷

4″-O-葡萄糖牡荆素

目前，国内外多采用柱色谱法和重结晶等传统方法分离纯化山楂叶中的有效单体，这类方法或需使用有毒有机溶剂，如硅胶柱层析使用氯仿、甲醇，会造成环境污染；或成本高且操作繁琐，如聚酰胺填料，耗时费力(Zhang PC，et al.Phytochemistry.2001，57：1249；Svedstron U，et al.Phytochemistry.2002，60：821)，而且所用固定相对样品有不可逆性吸附作用。另外，由于山楂叶中各主要成分极性极为相近，通常无法在较短时间内使目标化合物得到有效的分离导致所得产品纯度不高，需借助多次重复制备进行纯化而造成目标化合物损失较多。

高速逆流色谱(High-speed counter-current chromatography HSCCC)是一种较新的液液分配色谱技术，它不用任何固体支撑体或载体而克服了传统分离方法对样品的不可逆性吸附作用，因而样品回收率高，同时还具有应用范围广、仪器操作简单、分离量大等优点。此外，高速逆流色谱技术由于其分离机理不同于传统的高效液相色谱技术，常作为HPLC的一种强有力的补充技术广泛应用于天然产物的分离及纯化。但目前国内外还未见有将高速逆流色谱应用于山楂叶中单体化合物的分离纯化。

发明内容

本发明的目的是提供一种制备工艺简单快速、回收率高、纯度高且适于工业化生产的，从山楂叶中分离纯化单体化合物4-O-鼠李糖芦丁、牡荆素-2″-O-鼠李糖苷和4″-O-葡萄糖牡荆素的方法。

山楂叶中主要活性成分为中等极性黄酮类成分，其中大多结构十分相近，传统的制备液相色谱技术无法在较短的时间内使各极性相近的黄酮类化合物获得有效的分离。本发明采用高速逆流色谱技术与传统的制备液相技术相结合，利用两者的不同分离机理将目标化合物4

-O-鼠李糖芦丁、牡荆素-2″-O-鼠李糖苷和4″-O-葡萄糖牡荆素与其他极性相近的干扰成分分离，从而获得高纯度的目标化合物。

本发明提供一种从山楂叶中分离纯化单体化合物4

-O-鼠李糖芦丁、牡荆素-2″-O-鼠李糖苷和4″-O-葡萄糖牡荆素的方法，包括如下步骤：

1.制备山楂叶粗提物：

按常规将干燥山楂叶粗粉以水或乙醇水溶液浸泡或回流提取1～3次，过滤，将滤液减压浓缩至无醇味，得山楂叶粗提液；

2.纯化：

(1)用大孔吸附树脂纯化：将上述制得的山楂叶粗提液加适量水混悬后，过大孔吸附树脂柱，先分别用水和5％～15％浓度的乙醇溶液充分洗脱，弃去洗脱液，再用20％～30％浓度的乙醇溶液洗脱，收集洗脱液，减压浓缩干燥，即得提取物，经高效液相色谱(HPLC)检测，含有90％以上4-O-鼠李糖芦丁、牡荆素-2″-O-鼠李糖苷和4″-O-葡萄糖牡荆素，得率为3％～5％；

(2)用高速逆流色谱和制备液相色谱将4

-O-鼠李糖芦丁、牡荆素-2″-O-鼠李糖苷和4″-O-葡萄糖牡荆素分离纯化：构成高速逆流色谱固定相、流动相的溶剂体系为正丁醇∶水＝1∶1、乙酸乙酯∶正丁醇∶水＝2∶1∶4或乙酸乙酯∶正丁醇∶水＝2∶1∶3，在分液漏斗中充分振摇后静止分层，上相为固定相，下相为流动相；先使逆流色谱仪柱子中充满固定相，然后使主机转动，再泵入流动相，取步骤(1)中所得的提取物溶于少量下相，由进样阀进样，根据检测器谱图接收流分“I”、“II”；采用高效液相色谱法对所得流分进行纯度检测(峰面积归一化法)，测得流份“II”为单一色谱峰，纯度高于99％，流份“I”中含两个主要色谱峰，两峰总纯度高于95％；再应用制备液相色谱对流份“I”分离纯化，得流份“III”、“VI”，按上述高效液相色谱法检测，两个化合物纯度均高于99％；挥干溶剂后对流分“II”、“III”、“VI”进行MS、¹HNMR和¹³CNMR分析，根据所得数据进行结构确认，流分“II”为牡荆素-2″-O-鼠李糖苷，流分“III”为4-O-鼠李糖芦丁，流分“VI”为4″-O-葡萄糖牡荆素。

上述方法中制备山楂叶粗提液时，用60％乙醇回流提取。

上述方法中用大孔吸附树脂纯化时，先分别用水和10％浓度的乙醇溶液充分洗脱，弃去洗脱液，再用20％～30％浓度的乙醇溶液洗脱，收集洗脱液，减压浓缩干燥，即得提取物。

上述方法中用大孔吸附树脂纯化时，先分别用水和5％～15％浓度的乙醇溶液充分洗脱，弃去洗脱液，再用20％浓度的乙醇溶液洗脱，收集洗脱液，减压浓缩干燥，即得提取物。

上述方法中所述的大孔吸附树脂为1300或D101或AB-8型大孔吸附树脂。

本发明采用大孔吸附树脂对样品进行前处理，只使用水和低浓度乙醇洗脱，成本低廉，不污染环境；在对目标组分分离纯化过程中，针对山楂叶中黄酮类成分结构、极性均十分相近的情况，利用高速逆流色谱技术与高效液相色谱技术互补的分离机理将目标化合物与干扰组分分离，从而从山楂叶中制备得到高纯度的4

-O-鼠李糖芦丁、牡荆素-2″-O-鼠李糖苷和4″-O-葡萄糖牡荆素，方法简单快速且回收率高，克服了传统制备方法操作繁琐、分离周期长等缺点，并具有分离效率高、产品纯度好、简便、适于工业化生产等优点。

附图说明

图1为经大孔吸附树脂纯化的提取物的高效液相色谱图

图2为经大孔吸附树脂纯化的提取物的高速逆流色谱(HSCCC)的色谱图

图3为本发明4

-O-鼠李糖芦丁和4″-O-葡萄糖牡荆素的制备液相色谱的色谱图

图4为HSCCC分离流分“I”(高速逆流分离所得含4

-O-鼠李糖芦丁和4″-O-葡萄糖牡荆素的流份)高效液相色谱图

图5为HSCCC分离流份“II”(牡荆素-2″-O-鼠李糖苷)高效液相色谱图

图6为制备液相色谱流分“III”(4

-O-鼠李糖芦丁)高效液相色谱图

图7为制备液相色谱流分“VI”(4″-O-葡萄糖牡荆素)高效液相色谱图

具体实施方式

下面结合附图及实施例对本发明进行详细描述。

实施例1：

1.制备山楂叶粗提液：

取干燥山楂叶药材粗粉500g，用8倍量60％乙醇回流提取2次，每次2小时，过滤，合并滤液，60℃减压浓缩至无醇味，得山楂叶粗提液。

2.纯化：

(1)用大孔吸附树脂纯化：取上述山楂叶粗提液，加水混悬后总体积为600ml。加入到装有500g经预处理过的1300大孔吸附树脂层析柱上，上样完毕后吸附2小时。分别用1500ml水及10％乙醇洗脱(弃去)。再用2000ml 20％乙醇洗脱，乙醇洗脱流份减压浓缩后，真空干燥(60℃)，得提取物粉末20.25g，得率为4.1％，经HPLC检测，其中4-O-鼠李糖芦丁、牡荆素-2″-O-鼠李糖苷和4″-O-葡萄糖牡荆素总含量为90.3％。

(2)应用高速逆流色谱(深圳同田生化有限公司)和制备液相色谱将4

-O-鼠李糖芦丁、牡荆素-2″-O-鼠李糖苷和4″-O-葡萄糖牡荆素分离纯化：构成高速逆流色谱固定相、流动相的溶剂体系为正丁醇∶水＝1∶1。在分液漏斗中充分振摇后静止分层，上相为固定相，下相为流动相。先使逆流色谱仪柱子中充满固定相，然后使主机转动，再泵入流动相，逆流色谱柱体积为300ml，固定相保留率35％，流速2.0ml/min，转速830rpm，检测波长254nm，取步骤(1)所得提取物粉末200mg溶解于15ml下相中，由进样阀进样，根据检测器谱图接收流分“I”、“II”，见图1。对该部分进行HPLC分析表明“II”为单一色谱峰，峰纯度为99.3％，流份“I”含两个主要色谱峰，总纯度约为96.8％。再应用制备液相色谱分离纯化流份“I”。HPLC制备条件为色谱柱YMC ODS-C₁₈(250mm×10mmi.d.；5μm)；流动相为乙腈∶0.5％醋酸水溶液＝15∶85；流速3.0ml/min；柱温25℃；检测波长254nm。根据检测器谱图接收目标成份，得流分“III”、“VI”，分别对两个流分进行高效液相分析表明均为单一色谱峰，峰纯度分别为99.8％和99.9％。制备液相色谱图见图2。HPLC分析条件为色谱柱YMCODS-C₁₈(250mm×4.6mm i.d.；5μm)；流动相为乙腈∶0.5％醋酸水溶液＝20∶80；流速0.6ml/min；柱温25℃；检测波长254nm。在此条件下所得各高效液相色谱图见图3、图4、图5、图6，其中峰II为牡荆素-2″-O-鼠李糖苷，峰III为4

-O-鼠李糖芦丁，峰VI为4″-O-葡萄糖牡荆素。将分离得到的“II”、“III”、“VI”流分挥干，得流分“II”黄色粉末107.8mg，得率为2.2％；流分“III”黄色粉末15.9mg，得率为0.3％；流分“VI”黄色粉末31.7mg，得率为0.6％。对流分“II”、“III”、“VI”在Varian INOVA-500型核磁共振仪和Varian MAT-212型质谱仪上，进行¹HNMR、¹³CNMR和MS分析，经结构解析并与文献数据比对，确定流分II为牡荆素-2″-O-鼠李糖苷，流分III为4

-O-鼠李糖芦丁，流分VI为4″-O-葡萄糖牡荆素。

具体数据为：流分“II”UVλmax(nm MeOH)：340，271。ESI-MS：579[M+H]⁺，417，399(M-glu)。¹³CNMR(500MHz，CD₃OD)δ：166.05(C-2)，103.42(C-3)，183.76(C-4)，162.51(C-5)，99.79(C-6)，164.01(C-7)，105.43(C-8)，157.54(C-9)，105.85(C-10)，123.38(C-1′)，129.88(C-2′)，116.76(C-3′)，162.49(C-4′)，116.89(C-5′)，129.94(C-6′)，73.52(C-1″)，77.99(C-2″)，81.47(C-3″)，72.12(C-4″)，82.67(C-5″)，62.66(C-6″)，102.28(C-1

)，72.41(C-2

)，71.81(C-3

)，73.25(C-4

)，69.82(C-5

)，17.93(C-6)。流分“III”UVλmax(nm MeOH)：349，256。ESI-MS：757[M+H]⁺，779[M+Na]⁺。¹³CNMR(500MHz，CD₃OD)δ：158.3(C-2)，134.2(C-3)，179.1(C-4)，162.8(C-5)，99.7(C-6)，165.6(C-7)，94.8(C-8)，158.8(C-9)，105.7(C-10)，123.4(C-1′)，117.3(C-2′)，146.1(C-3′)，149.2(C-4′)，117.2(C-5′)，123.4(C-6′)，102.5(C-1″)，73.9(C-2″)，78.8(C-3″)，71.6(C-4″)，77.2(C-5″)，68.3(C-6″)，102.1(C-1

)，72.3(C-2

)，72.1(C-3

)，80.2(C-4

)，69.7(C-5)，17.7(C-6

)，100.4(C-1″″)，71.8(C-1″″)，72.3(C-1

)，73.8(C-1″″)，69.8(C-1″″)，17.4(C-1″″)。流分“VI”UVλmax(nm MeOH)：338，266。ESI-MS：595[M+H]⁺，617[M+Na]⁺。¹³CNMR(500MHz，DMSO-d₆)δ：163.8(C-2)，105.2(C-3)，182.2(C-4)，156.1(C-5)，98.1(C-6)，159.8(C-7)，103.6(C-8)，162.4(C-9)，103.8(C-10)，121.7(C-1′)，128.6(C-2′)，115.8(C-3′)，160.7(C-4′)，116.0(C-5′)，128.8(C-6′)，81.9(C-1″)，70.1(C-2″)，71.6(C-3″)，80.9(C-4″)，78.5(C-5″)，61.4(C-6″)，102.5(C-1

)，74.3(C-2)，76.1(C-3

)，69.4(C-4

)，76.5(C-5

)，60.4(C-6

)。

Claims

1.一种从山楂叶中分离纯化单体化合物4′″-O-鼠李糖芦丁、牡荆素-2″-O-鼠李糖苷和4″-O-葡萄糖牡荆素的方法，其特征在于该方法包括如下步骤：

A.制备山楂叶粗提物：

B.纯化：

(a)用大孔吸附树脂纯化：将上述制得的山楂叶粗提液加适量水混悬后，过大孔吸附树脂柱，先分别用水和5％～15％浓度的乙醇溶液充分洗脱，弃去洗脱液，再用20％～30％浓度的乙醇溶液洗脱，收集洗脱液，减压浓缩干燥，即得提取物，经高效液相色谱检测，含有90％以上4′″-O-鼠李糖芦丁、牡荆素-2″-O-鼠李糖苷和4″-O-葡萄糖牡荆素，得率为3％～5％；

(b)用高速逆流色谱和制备液相色谱将4′″-O-鼠李糖芦丁、牡荆素-2″-O-鼠李糖苷和4″-O-葡萄糖牡荆素分离纯化：构成高速逆流色谱固定相、流动相的溶剂体系为正丁醇∶水＝1∶1、乙酸乙酯∶正丁醇∶水＝2∶1∶4或乙酸乙酯∶正丁醇∶水＝2∶1∶3，在分液漏斗中充分振摇后静止分层，上相为固定相，下相为流动相；先使逆流色谱仪柱子中充满固定相，然后使主机转动，再泵入流动相，取步骤(a)中所得的提取物溶于少量下相，由进样阀进样，根据检测器谱图接收流分“I”、“II”；采用高效液相色谱法对所得流分进行纯度检测，测得流份“II”为单一色谱峰，纯度高于99％，流份“I”中含两个主要色谱峰，两峰总纯度高于95％；再应用制备液相色谱对流份“I”分离纯化，HPLC制备条件为色谱柱YMC ODS-C₁₈(250mm×10mm i.d.；5μm)；流动相为乙腈∶0.5％醋酸水溶液＝15∶85；流速3.0ml/min；柱温25℃；检测波长254nm，得流份“III”、“VI”，按上述高效液相色谱法检测，两个化合物纯度均高于99％；挥干溶剂后对流分“II”、“III”、“VI”进行MS、¹HNMR和¹³CNMR分析，根据所得数据进行结构确认，流分“II”为牡荆素-2″-O-鼠李糖苷，流分“III”为4′″-O-鼠李糖芦丁，流分“VI”为4″-O-葡萄糖牡荆素。

2.根据权利要求1所述的一种从山楂叶中分离纯化单体化合物4′″-O-鼠李糖芦丁、牡荆素-2″-O-鼠李糖苷和4″-O-葡萄糖牡荆素的方法，其特征在于制备山楂叶粗提液时，用60％乙醇回流提取。

3.根据权利要求1所述的一种从山楂叶中分离纯化单体化合物4′″-O-鼠李糖芦丁、牡荆素-2″-O-鼠李糖苷和4″-O-葡萄糖牡荆素的方法，其特征在于用大孔吸附树脂纯化时，先分别用水和10％浓度的乙醇溶液充分洗脱，弃去洗脱液，再用20％～30％浓度的乙醇溶液洗脱，收集洗脱液，减压浓缩干燥，即得提取物。

4.根据权利要求1所述的一种从山楂叶中分离纯化单体化合物4′″-O-鼠李糖芦丁、牡荆素-2″-O-鼠李糖苷和4″-O-葡萄糖牡荆素的方法，其特征在于用大孔吸附树脂纯化时，先分别用水和5％～15％浓度的乙醇溶液充分洗脱，弃去洗脱液，再用20％浓度的乙醇溶液洗脱，收集洗脱液，减压浓缩干燥，即得提取物。

5.根据权利要求1所述的一种从山楂叶中分离纯化单体化合物4′″-O-鼠李糖芦丁、牡荆素-2″-O-鼠李糖苷和4″-O-葡萄糖牡荆素的方法，其特征在于所述的大孔吸附树脂为1300、D101或AB-8型大孔吸附树脂。