CN107903176B - 一种甘青青兰药材中三种化学对照品的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种甘青青兰药材中三种化学对照品的制备方法。本发明采用循环高速逆流色谱经4次循环从甘青青兰药材粗提物中直接分离得到了纯度大于80％的绿原酸、胡麻苷和胡麻苷‑6”‑乙酸酯，其中绿原酸和胡麻苷分离因子小于1.15。本发明采用制备液相色谱对上述三种化合物进行纯化，得到了纯度大于98％的绿原酸、胡麻苷和胡麻苷‑6”‑乙酸酯化学对照品。本发明方法简单、高效、重现性好、样品回收率高、易于实现规模化制备，非常适合甘青青兰药材中绿原酸、胡麻苷和胡麻苷‑6”‑乙酸酯化学对照品的制备。
Description
技术领域
本发明涉及一种化学对照品的制备方法，尤其涉及甘青青兰药材中绿原酸、胡麻苷和胡麻苷-6”-乙酸酯化学对照品的制备方法。
背景技术
甘青青兰为唇形科青兰属植物甘青青兰Dracocephalum tanguticum Maxim的干燥全草，分布于甘肃、青海、四川及西藏等地。甘青青兰具有止咳化痰，和胃疏肝，清热利水之功效，用于治疗咳嗽痰多，头晕，胃炎，肝炎，风湿性关节炎，气管炎，溃疡病等。甘青青兰在藏药制剂中应用广泛，200多个藏药制剂中有21种制剂含有甘青青兰。现代药理研究发现甘青青兰提取物具有抗氧化、抗缺氧和抗HBV活性，但药效物质基础尚不明确。研究表明甘青青兰中的黄酮及其苷类和含咖啡酰基的有机酸及其酯类被认为是其生物活性物质。绿原酸、胡麻苷和胡麻苷-6”-乙酸酯为甘青青兰中三种主要生物活性物质。为更好的研究上述三种活性物质的药理活性，需要大量高纯度的化学对照品。
长期以来，传统的药材中化学对照品的制备方法多采用硅胶层析，存在样品组分损失、玷污、变性、失活、拖尾，分离困难，收率低等问题。高速逆流色谱(HSCCC)是由美国国立卫生研究院(NIH)的Yoichiro Ito博士于上世纪80年代发明的一种基于液-液分配机理的新型色谱分离纯化技术，无需固体作固定相，不存在固体对样品组分的吸附、玷污、变性、失活、拖尾等现象，样品回收率高，在天然产物有效成分的分离、纯化、制备方面显示出强大的优势，非常适合于化学对照品的制备。本发明建立了基于循环高速逆流色谱和制备液相色谱的甘青青兰药材中绿原酸、胡麻苷和胡麻苷-6”-乙酸酯化学对照品的制备方法。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种简单高效，重现性好，适合规模化制备的甘青青兰药材中绿原酸、胡麻苷和胡麻苷-6”-乙酸酯化学对照品的制备方法。
为解决上述问题，本发明所述的一种甘青青兰药材中三种化学对照品的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)样品制备：将甘青青兰药材干燥全草粉碎，以1Kg：5L～30L的比例用体积浓度为30～95％的乙醇在提取温度为60～90℃、提取次数1～4次、每次1～4h的条件下进行热回流提取，合并提取液；所述提取液经管式离心后，减压浓缩到无醇味，得到提取物浓缩液；将提取物浓缩液经冷冻干燥，得到粗提物粉末；
(2)分离：将上述甘青青兰粗提物粉末直接用循环高速逆流色谱分离，得到3种纯度高于80％的组分；
(3)纯化：将上述3种纯度高于80％的组分经制备液相色谱纯化，得到3种纯度高于98％的单体化合物；
(4)结构鉴定：将所述单体化合物通过1H-NMR和13C-NMR进行结构鉴定为绿原酸、胡麻苷和胡麻苷-6”-乙酸酯。
进一步地，所述样品制备冷冻干燥过程中提取物浓缩液的预冻温度为-20～-50℃，隔板加热温度为-5～20℃。
进一步地，所述分离过程中采用的溶剂系统为正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(1～5:3～10:1～5:3～10,v/v)，主机转速为500～1000rpm，分离温度为20～40℃，流动相流速为1.5～3.0mL/min，循环洗脱次数为2～8次。
进一步地，所述纯化步骤中采用等度洗脱模式，流动相为30％～60％的甲醇溶液，流速为10～30mL/min。
本发明与现有技术相比具有以下优点：
1、本发明直接从粗提物中分离制备化学对照品，无需复杂的前处理过程，简单高效。
2、本发明采用循环高速逆流色谱成功分离了分离因子小于1.15的绿原酸和胡麻苷化学对照品。
3、本发明分离纯化过程样品回收率高、重复性好，易于实现规模化制备，非常适合甘青青兰药材中绿原酸、胡麻苷和胡麻苷-6”-乙酸酯化学对照品的制备。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明。
图1为本发明绿原酸(1)、胡麻苷(2)和胡麻苷6-“-乙酸酯(3)的循环高速逆流色谱分离图。
图2为本发明绿原酸(1)的制备液相纯化图。
图3为本发明胡麻苷(2)的制备液相纯化图。
图4为本发明胡麻苷6-“-乙酸酯(3)的制备液相纯化图。
图5为本发明绿原酸(1)的纯度检测图。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
实施例1
一种甘青青兰药材中三种化学对照品的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)样品制备：将甘青青兰药材干燥全草粉碎，以1Kg：5L的比例用体积浓度为30％的乙醇在提取温度为60℃下热回流提取，提取1次、提取1h，合并提取液；所述提取液经管式离心后，减压浓缩到无醇味，得到提取物浓缩液；将提取物浓缩液在-20℃条件下预冻，在隔板加热温度为-5℃条件下冷冻干燥，得到粗提物粉末；
(2)分离：将上述甘青青兰粗提物粉末直接用循环高速逆流色谱分离，溶剂系统为正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(1:3:1:3,v/v)，主机转速为500rpm，分离温度为20℃，流动相流速为1.5mL/min，循环洗脱次数为2次，得到3种纯度高于80％的组分；
(3)纯化：将上述3种纯度高于80％的组分经制备液相色谱纯化，采用等度洗脱模式，流动相为30％的甲醇溶液，流速为10mL/min，得到3种纯度高于98％的单体化合物；
(4)结构鉴定：将所述单体化合物通过1H-NMR和13C-NMR进行结构鉴定为绿原酸、胡麻苷和胡麻苷-6”-乙酸酯。
实施例2
一种甘青青兰药材中三种化学对照品的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)样品制备：将甘青青兰药材干燥全草粉碎，以1Kg：30L的比例用体积浓度为95％的乙醇在提取温度为90℃下热回流提取，提取4次、每次4h，合并提取液；所述提取液经管式离心后，减压浓缩到无醇味，得到提取物浓缩液；将提取物浓缩液在-50℃条件下预冻，在隔板加热温度为20℃条件下冷冻干燥，得到粗提物粉末；
(2)分离：将上述甘青青兰粗提物粉末直接用循环高速逆流色谱分离，溶剂系统为正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(5:10:5:10,v/v)，主机转速为1000rpm，分离温度为40℃，流动相流速为3.0mL/min，循环洗脱次数为8次，得到3种纯度高于80％的组分；
(3)纯化：将上述3种纯度高于80％的组分经制备液相色谱纯化，采用等度洗脱模式，流动相为60％的甲醇溶液，流速为30mL/min，得到3种纯度高于98％的单体化合物；
(4)结构鉴定：将所述单体化合物通过1H-NMR和13C-NMR进行结构鉴定为绿原酸、胡麻苷和胡麻苷-6”-乙酸酯。
实施例3
一种甘青青兰药材中三种化学对照品的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)样品制备：将甘青青兰药材干燥全草粉碎，以1Kg：20L的比例用体积浓度为70％的乙醇在提取温度为70℃的条件下热回流提取、提取3次、每次2h，合并提取液；所述提取液经管式离心后，减压浓缩到无醇味，得到提取物浓缩液；将提取物浓缩液在-30℃条件下预冻，在隔板加热温度为10℃条件下冷冻干燥，得到粗提物粉末；
(2)分离：将上述甘青青兰粗提物粉末直接用循环高速逆流色谱分离，溶剂系统为正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(2:7:2:7,v/v)，主机转速为800rpm，分离温度为30℃，流动相流速为2.0mL/min，循环洗脱次数为6次，得到3种纯度高于80％的组分；
(3)纯化：将上述3种纯度高于80％的组分经制备液相色谱纯化，采用等度洗脱模式，流动相为50％的甲醇溶液，流速为20mL/min，得到3种纯度高于98％的单体化合物；
(4)结构鉴定：将所述单体化合物通过1H-NMR和13C-NMR进行结构鉴定为绿原酸、胡麻苷和胡麻苷-6”-乙酸酯。
实施例4
一种甘青青兰药材中三种化学对照品的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)样品制备：将甘青青兰药材干燥全草粉碎，以1Kg：15L的比例用体积浓度为60％的乙醇在提取温度为80℃的条件下热回流提取、提取2次、每次3h，合并提取液；所述提取液经管式离心后，减压浓缩到无醇味，得到提取物浓缩液；将提取物浓缩液在-40℃条件下预冻，在隔板加热温度为5℃条件下冷冻干燥，得到粗提物粉末；
(2)分离：将上述甘青青兰粗提物粉末直接用循环高速逆流色谱分离，溶剂系统为正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(3:8:3:8,v/v)，主机转速为900rpm，分离温度为25℃，流动相流速为2.5mL/min，循环洗脱次数为4次，得到3种纯度高于80％的组分；
(3)纯化：将上述3种纯度高于80％的组分经制备液相色谱纯化，采用等度洗脱模式，流动相为45％的甲醇溶液，流速为18mL/min，得到3种纯度高于98％的单体化合物；
(4)结构鉴定：将所述单体化合物通过1H-NMR和13C-NMR进行结构鉴定为绿原酸、胡麻苷和胡麻苷-6”-乙酸酯。
实施例5
一种甘青青兰药材中三种化学对照品的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)样品制备：将甘青青兰药材干燥全草粉碎，以1Kg：25L的比例用体积浓度为75％的乙醇在提取温度为75℃的条件下热回流提取、提取3次、每次3h，合并提取液；所述提取液经管式离心后，减压浓缩到无醇味，得到提取物浓缩液；将提取物浓缩液在-35℃条件下预冻，在隔板加热温度为15℃条件下冷冻干燥，得到粗提物粉末；
(2)分离：将上述甘青青兰粗提物粉末直接用循环高速逆流色谱分离，溶剂系统为正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(4:7:2:9,v/v)，主机转速为850rpm，分离温度为32℃，流动相流速为1.8mL/min，循环洗脱次数为5次，得到3种纯度高于80％的组分；
(3)纯化：将上述3种纯度高于80％的组分经制备液相色谱纯化，采用等度洗脱模式，流动相为55％的甲醇溶液，流速为25mL/min，得到3种纯度高于98％的单体化合物；
(4)结构鉴定：将所述单体化合物通过1H-NMR和13C-NMR进行结构鉴定为绿原酸、胡麻苷和胡麻苷-6”-乙酸酯。
在上述说明书阐述本发明时，同时提供了实施例的目的是举例说明本发明的实际操作过程和本发明的意义。在进入本发明权利要求和其等同物范围内时，本发明的实际应用包括所有一般变化、配合，或改进。
Claims (2)
1.一种甘青青兰药材中三种化学对照品的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
（1）样品制备：将甘青青兰药材干燥全草粉碎，以1Kg：5L～30L的比例用体积浓度为30～95%的乙醇在提取温度为60～90℃、提取次数l～4次、每次l～4h的条件下进行热回流提取，合并提取液；所述提取液经管式离心后，减压浓缩到无醇味，得到提取物浓缩液；将提取物浓缩液经冷冻干燥，得到粗提物粉末；
（2）分离：将上述甘青青兰粗提物粉末直接用循环高速逆流色谱分离，得到3种纯度高于80%的组分，采用的溶剂系统为正乙烷-乙酸乙酯-甲醇-水1~5：3~10：1~5：3~10，v/v，主机转速为500~1000 rpm，分离温度为20~40℃，流动相流速为1.5~3.0mL/min，循环洗脱次数为2~8次；
（3）纯化：将上述3种纯度高于80%的组分经制备液相色谱纯化，得到3种纯度高于98%的单体化合物，采用等度洗脱模式，流动相为30%~60%的甲醇溶液，流速为10~30mL/min；
（4）结构鉴定：将所述单体化合物通过1H-NMR和13C-NMR进行结构鉴定为绿原酸、胡麻苷和胡麻苷-6”-乙酸酯。
2.根据权利要求1所述的一种甘青青兰药材中三种化学对照品的制备方法，其特征在于包括以下步骤：所述样品制备冷冻干燥过程中提取物浓缩液的预冻温度为-20～-50℃，隔板加热温度为-5～20℃。
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