CN101879170B - 丙二酰黄芪皂苷ⅰ及其苷元的抗肿瘤的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及天然药物领域，具体涉及四环三萜类化合物丙二酰黄芪皂苷Ⅰ(Malonylastragaloside Ⅰ)及其苷元环黄芪醇(Cycloastragenol)抗肿瘤的用途。其可以用于制备治疗抗肿瘤药物，特别是用于制备治疗肠癌、白血病、肺癌或肝癌的药物的用途。

Description

丙二酰黄芪皂苷Ⅰ及其苷元的抗肿瘤的用途
技术领域
本发明涉及天然药物领域，具体涉及四环三萜类化合物丙二酰黄芪皂苷Ⅰ(Malonylastragaloside Ⅰ)及其苷元环黄芪醇(Cycloastragenol)抗肿瘤的用途。
背景技术
黄芪为豆科植物蒙古黄芪Astragalus membranaceus(Fisch.)Bge.var.mongholicus(Bge.)Hsiao或膜荚黄芪A.membranaceus(Fisch.)Bge.的干燥根。黄芪作为一味传统的扶正中药，具有补气升阳、益卫固表、托毒生肌、利水消肿等功效，一直以来被用来增强机体免疫。黄芪化学成分主要有皂苷类、黄酮类、多糖类等，近年来对其药理作用的研究取得了较大进展，特别是在免疫调节、保护心脏、降血糖、保肝等方面。黄芪属皂苷部分主要包含黄芪皂苷Ⅰ、黄芪皂苷Ⅱ、黄芪甲苷、异黄芪皂苷Ⅱ和异黄芪皂苷Ⅰ等(Qi L.W.，Yu Q.T.，et al.J.Chromatogr.A，2006，1134，162-169.)，研究结果表明：当黄芪总皂苷在100mg/L时对K562细胞具有抑制作用，体内移植瘤实验表明其可提高机体免疫力，抑制肿瘤增殖作用(刘明华，任美萍，等。中药药理与临床，2009，25(2)：68-70.)。Ionkova I等报道了黄芪皂苷Ⅰ、黄芪皂苷Ⅱ、黄芪皂苷Ⅲ的抗MDA-MB-231、HT-29、HL-60、HL-60/Dox和SKW-3的IC50分别＞200mg/ml，400mg/ml，190mg/ml，75mg/ml和73mg/ml(Ionkova I，Momekov G，Proksch P.Fitoterapia.2010Jul；81(5)：447-51.)。综上文献表明，目前已确定结构的黄芪皂苷类具有一定的抗肿瘤活性，但作用剂量很高，不利于新药开发。
我们在前期研究中通过化学分离，发现了一种新型四环三萜类化合物(Chu Chu，Hai-XiaCai，Mei-Ting Ren，et al.J Sep Sci.2010，33，570-581.)，并且其在新鲜黄芪药材中含量较高，比黄芪甲苷高约10倍以上。
该化合物为一粉红色粉末，经高分辨质谱(m/z 977.4667[M+Na]+及m/z 953.4767[M-H]-)和核磁共振确证分子式为C48H74O19，其及苷元的结构式如下所示：
Figure BSA00000187658600021
其中，当基团R1是葡萄糖，R2是2，3-di-O-乙酰-4-O-丙酰-β-D-木糖时，命名为丙二酰黄芪皂苷Ⅰ(英文名：MalonylastragalosideⅠ)；当R1、R2均为H时，即其苷元，命名为环黄芪醇(英文名：Cycloastragenol)。
发明内容
本发明公开了结构式I化合物的医药用途，即其可以用于制备治疗抗肿瘤药物的用途，所述肿瘤优选肠癌、白血病、肺癌或肝癌。
本发明的MalonylastragalosideⅠ可采用文献方法制备。也可以采用如下方法制备：
(1)将150g蒙古黄芪根粉碎成粗粉；
(2)用含1％甲酸的甲醇溶液超声提取两次(频率为40kHz)，第一次加入500ml溶剂超声提取1h后，过滤；第二次再加入900ml溶剂提取1h后，滤过，合并两次滤液，40℃减压回收溶剂；
(3)残渣用两倍量水稀释混匀，3000g下室温离心10min，收集上清液；
(4)上清液以反相硅胶-中压液相色谱进行分离，流动相为甲醇-1％甲酸水，梯度洗脱：40％MeOH(600ml)，60％MeOH(600ml)，70％MeOH(600ml)，80％MeOH(600ml)，90％MeOH(600ml)，每120ml一个馏分，流速为10ml/min；
(5)将60％-90％MeOH极性段的各馏分在40℃减压回收甲醇。此时80％MeOH馏分出现浑浊，将混悬液离心(14000g，4℃)10min，分离沉淀，室温下氮气吹干，得到粉红色粉末。
本发明所使用的试剂和设备均为市售或者常用的，具有普适性。
本发明公开了Malonylastragaloside Ⅰ及其苷元Cycloastragenol的应用，即将该化合物及其苷元用于制备抗肿瘤药物。研究表明，本发明的Malonylastragaloside Ⅰ及其苷元Cycloastragenol对肿瘤细胞的抑制随着化合物的浓度和时间的增加而增加。
发明人在对Malonylastragaloside Ⅰ及其苷元Cycloastragenol药理活性的研究中发现，在众多的抑制肿瘤试验中，Malonylastragaloside Ⅰ及其苷元对结肠癌、白血病、肺癌和肝癌的疗效最好，对这几种癌症的治疗效果明显好于对其它癌症的治疗效果。发明人分别对人肝癌细胞SMMC-7721、人乳腺癌MCF-7、人宫颈癌HeLa、人胰腺癌Aspc-1、人急性白血病细胞HL-60、人鼻咽癌CNE2、前列腺癌PC-3、人肺癌A549、人结肠癌HT-29等肿瘤细胞进行体外MTT筛选，发现其对人肝癌细胞SMMC-7721、人乳腺癌MCF-7、人宫颈癌HeLa、人胰腺癌Aspc-1、人急性白血病HL-60、人结肠癌HT-29、人肺癌A549的抗增殖活性强并呈良好的时效与量效关系，其中对人肝癌细胞SMMC-7721、人肺癌A549、人结肠癌细胞HT-29和人急性白血病HL-60细胞的抑制效果好，同时将其作用正常肝细胞L-O2，未发现细胞毒性反应。
以下结合实施例对Malonylastragaloside Ⅰ及其苷元Cycloastragenol的药理活性做进一步阐述。
附图说明
图1为不同浓度MalonylastragalosideⅠ作用HL-60肿瘤细胞和L-O2正常肝细胞24小时后的抑制曲线图
图2为不同浓度Malonylastragaloside Ⅰ作用HT-29肿瘤细胞和L-O2正常肝细胞24小时后的抑制曲线图
图3为不同浓度Malonylastragaloside Ⅰ作用A549肿瘤细胞和L-O2正常肝细胞24小时后的抑制曲线图
图4为不同浓度Malonylastragaloside Ⅰ作用SMMC-7721肿瘤细胞和L-O2正常肝细胞24小时后的抑制曲线图
图5为不同浓度Malonylastragaloside Ⅰ作用HL-60肿瘤细胞和L-O2正常肝细胞72小时后的抑制曲线图
图6为不同浓度Malonylastragaloside Ⅰ作用HT-29肿瘤细胞和L-O2正常肝细胞72小时后的抑制曲线图
图7为不同浓度Malonylastragaloside Ⅰ作用A549肿瘤细胞和L-O2正常肝细胞72小时后的抑制曲线图
图8为不同浓度Malonylastragaloside Ⅰ作用SMMC-7721肿瘤细胞和L-O2正常肝细胞72小时后的抑制曲线图
图9为不同浓度Cycloastragenol作用HL-60肿瘤细胞和L-O2正常肝细胞24小时后的抑制曲线图
图10为不同浓度Cycloastragenol作用HT-29肿瘤细胞和L-O2正常肝细胞24小时后的抑制曲线图
图11为不同浓度Cycloastragenol作用A549肿瘤细胞和L-O2正常肝细胞24小时后的抑制曲线图
图12为不同浓度Cycloastragenol作用SMMC-7721肿瘤细胞和L-O2正常肝细胞24小时后的抑制曲线图
图13为不同浓度Cycloastragenol作用HL-60肿瘤细胞和L-O2正常肝细胞72小时后的抑制曲线图
图14为不同浓度Cycloastragenol作用HT-29肿瘤细胞和L-O2正常肝细胞72小时后的抑制曲线图
图15为不同浓度Cycloastragenol作用A549肿瘤细胞和L-O2正常肝细胞72小时后的抑制曲线图
图16为不同浓度Cycloastragenol作用SMMC-7721肿瘤细胞和L-O2正常肝细胞72小时后的抑制曲线图
具体实施方式
本实施例中的Malonylastragaloside Ⅰ及其苷元Cycloastragenol由发明人制备，其纯度经高效液相检测均大于95％(面积归一化)。
实施例1
Malonylastragaloside Ⅰ及其苷元Cycloastragenol的体外抗肿瘤作用
取对数生长期的细胞，根据细胞的大小接种4～10×103个于96孔板上，待生长24小时后，离心弃上清，然后按以下分组给药：肿瘤细胞设不加药溶剂对照组和加药组(浓度分别为1～100μM或1～30μM)，每组设5或6个复孔，培养24或72小时，弃上清，加入100μl含0.5mg/ml的MTT(四氮唑盐)无血清培养液培养4小时，加入100μl DMSO(二甲亚砜)，放置于微型振荡仪上振荡10min，再置于酶标仪上570nm处检测OD值。正常人细胞系L-O2做毒性评价，每次实验均重复3次。结果见表1和图1～图16。
表1  Malonylastragaloside Ⅰ、Cycloastragenol和5-FU作用不同细胞株的IC50结果
Figure BSA00000187658600051
从表1可看出Malonylastragaloside Ⅰ对HL-60、MCF-7、Aspc-1、HT-29、HeLa、A549和SMMC-7721细胞株的24小时作用IC50＜22μM，72小时作用后IC50＜15μM，其中Malonylastragaloside Ⅰ对作用HT-29、A549、HL-60和SMMC-7721细胞24小时后的IC50＜15μM，72小时后的IC50＜8μM，表明其可以抑制肿瘤细胞HT-29、A549、HL-60和SMMC-7721的增殖活性。同时，从表1可获得苷元Cycloastragenol对HL-60、MCF-7、Aspc-1、HT-29、HeLa、A549和SMMC-7721细胞株的24小时作用IC50＜15μM，72小时作用后IC50＜10μM，其中Cycloastragenol对作用HT-29、A549、HL-60和SMMC-7721细胞24小时后的IC50＜10μM左右，72小时后的IC50＜5μM，说明对HT-29、A549、HL-60和SMMC-7721细胞的抑制活性好。同时，我们将其跟阳性药物5-FU比较，Malonylastragaloside Ⅰ和Cycloastragenol均具有良好的抗肿瘤药效。
图1，2，3，4分别为在不同浓度Malonylastragaloside Ⅰ(1，5，10，15，20，25，30，50，100μM)下对HL-60、HT-29、A549和SMMC-7721肿瘤细胞与正常细胞L-O2作用24小时后的生长抑制情况，结果提示，随着化合物的浓度增加，与相应不加化合物的溶剂对照组比较，HT-29、HL-60、A549和SMMC-7721细胞增殖活性分别下降，提示该化合物呈浓度依赖性抑制肿瘤细胞细胞增殖；而不抑制正常肝细胞系L-O2细胞的增殖。
图5，6，7，8分别为在不同浓度Malonylastragaloside Ⅰ(1，5，10，15，20，25，30，50，100μM)下对HL-60、HT-29、A549和SMMC-7721肿瘤细胞与正常细胞L-O2作用72小时后的生长抑制情况，可得出72小时后，相应浓度作用肿瘤细胞株的抑制率增加并不抑制正常肝细胞L-O2的生长。综合图1～8的实验结果，说明化合物Malonylastragaloside Ⅰ对抑制肿瘤细胞生长具有良好的时效和量效关系，同时对正常细胞具有低毒的特性。
图9，10，11，12分别为在不同浓度Cycloastragenol(1，5，10，15，20，25，30μM)下对HL-60、HT-29、A549和SMMC-7721肿瘤细胞与正常细胞L-O2作用24小时后的生长抑制情况，结果提示，随着化合物的浓度增加，与相应不加化合物的对照组比较，HT-29、HeLa、HL-60、A549和SMMC-7721细胞增殖活性分别下降，提示该化合物苷元Cycloastragenol呈浓度依赖性抑制肿瘤细胞细胞增殖；而不抑制正常肝细胞系L-O2细胞的增殖。
图13，14，15，16分别为在不同浓度Cycloastragenol(1，5，10，15，20，25，30μM)下对HL-60、HT-29、A549和SMMC-7721肿瘤细胞与正常细胞L-O2作用72小时后的生长抑制情况，可得出72小时后，相应浓度作用肿瘤细胞株的抑制率增加并不抑制正常肝细胞L-O2的生长。综合图9～16实验结果，说明Malonylastragaloside Ⅰ苷元Cycloastragenol抑制肿瘤细胞增殖具有良好的时效和量效关系，同时对正常细胞具有低毒的特性。

Claims (1)

1.结构式I的化合物用于制备治疗肿瘤疾病的药物的用途：
Figure FSB00000613913700011
其中R1、R2同时代表H；
或者R1代表glc并且R2代表2，3-di-O-乙酰-4-O-丙酰-β-D-木糖，其中肿瘤疾病是白血病、结肠癌、肺癌或肝癌。
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