CN103961385A - 一种药物组合物及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种药物组合物，其包括人参提取物和抗肿瘤药物成分5-氟尿嘧啶，优选的，人参提取物和5-氟尿嘧啶质量比为1∶1。所述人参提取物包括人参皂苷Rb1、人参皂苷Re、人参皂苷Rd、人参皂苷Rb3、人参皂苷Rg3、人参皂苷Rh2、和人参皂苷Rg1。本发明药物组合物的用途在于增强抗肿瘤成分的疗效，并减少抗肿瘤成分治疗造成的副作用。本发明药物组合物特别针对治疗胃癌疾病。

Description

一种药物组合物及其用途

【技术领域】

本发明涉及医药技术领域，尤其涉及一种抗肿瘤药物的组合物及其医药用途。

【背景技术】

根据WHO(世界卫生组织)统计显示，目前在残害人类生命各种疾病中，癌症已经成为死亡率第一重大疾病。仅在2008年，全球约有1270万癌症新增病例以及760万癌症死亡病例，其中约70％的死亡病例发生在低等收入和中等收入国家。另据国际权威调查机构统计，到2020年癌症死亡人数将翻一番，达到1000万人以上。目前，癌症的治疗手段主要包括手术、放疗和化疗等。其中，化疗能够明显延长病人的生命，适合于几乎所有的肿瘤治疗，在癌症的综合治疗中占有越来越重要的地位。但众所周知：在肿瘤治疗中，患者普遍具有明显的恶心、呕吐、身体衰弱以及体重明显下降等副作用，给患者带来强烈的不适感和明显的不良预后。因此，在肿瘤治疗过程中，探索既可以增强药物疗效又能够减低副作用的辅助性治疗方案变得极为重要。

人参是一种药食同源营养品，在中医药中有很长的应用历史，未见显著的副作用，对多种疾病上都具有防治效果，例如动脉硬化、高脂血、血栓、高血压、免疫功能降低、肝功能降低等。在国际上，人参作为一种膳食营养补充品，深受人们的欢迎。但具有一定质量控制的人参提取物配方与抗肿瘤药物的协同作用还未见报道。

【发明内容】

本发明所解决的技术问题是提供一种具有增强抗肿瘤药物效果，并减少抗肿瘤药物副作用的药物组合物。

根据上述需解决的技术问题，设计了一种药物组合物，其包括人参提取物和抗肿瘤药物成分5-氟尿嘧啶(以下文中简称5-FU)，人参提取物和5-氟尿嘧啶质量比为30％～200％。

作为本发明进一步改进，人参提取物和5-氟尿嘧啶质量比为100％，即1∶1。

作为本发明进一步改进，所述人参提取物包括人参皂苷Rb1、人参皂苷Re、人参皂苷Rd、人参皂苷Rb3、人参皂苷Rg3、人参皂苷Rh2、和人参皂苷Rg1。

作为本发明进一步改进，所述人参提取物中：人参皂苷Rb1的质量百分比为20％～40％、人参皂苷Re的质量百分比为30％～50％、人参皂苷Rd的质量百分比为10％～30％、人参皂苷Rb3的质量百分比为5％～20％、人参皂苷Rg3的质量百分比为1％～10％、人参皂苷Rh2的质量百分比为3％～20％、和人参皂苷Rg1的质量百分比为8％～25％。

本发明药物组合物的用途在于增强抗肿瘤成分的疗效，并减少抗肿瘤成分治疗造成的副作用。本发明药物组合物特别针对治疗胃癌疾病。

本发明将人参提取物配方，与抗肿瘤药物5-FU配合使用，有助于大鼠体重的增加从而抵抗抗肿瘤药物的副作用，减慢5-FU在大鼠体内的代谢进而增加抗肿瘤药物5-FU的作用时间，同时人参提取物与5-FU联合应用有明显的抑制人癌细胞生长的协同作用(增强作用)。这些结果预示着在肿瘤化疗过程中，同时服用该人参提取物的特定配方，有助于肿瘤病人的治疗和康复。

【附图说明】

图1为大鼠体重变化图(n＝6)；

图2.5-FU在大鼠体内的血药浓度-时间曲线图；

【具体实施方式】

下面结合附图和实施方式对本发明作进一步说明。

本发明提供了一种抗肿瘤的药物组合物，包括人参提取物和抗肿瘤药物成分5-FU，人参提取物和5-氟尿嘧啶质量比为30％～200％。优选的，在本实施方式中，人参提取物和抗肿瘤药物成分5-FU质量比为1∶1。

所述人参提取物包括人参皂苷Rb1、人参皂苷Re、人参皂苷Rd、人参皂苷Rb3、人参皂苷Rg3、人参皂苷Rh2、和人参皂苷Rg1。其中，人参皂苷Rb1的质量百分比为20％～40％、人参皂苷Re的质量百分比为30％～50％、人参皂苷Rd的质量百分比为10％～30％、人参皂苷Rb3的质量百分比为5％～20％、人参皂苷Rg3的质量百分比为1％～10％、人参皂苷Rh2的质量百分比为3％～20％、和人参皂苷Rg1的质量百分比为8％～25％。优选地，在本实施方式中，人参皂苷Rb1的质量百分比25％、人参皂苷Re的质量百分比为35％、人参皂苷Rd的质量百分比为10％、人参皂苷Rb3的质量百分比为5％、人参皂苷Rg3的质量百分比为5％、人参皂苷Rh2的质量百分比为5％、和人参皂苷Rg1的质量百分比为15％。

本发明人参提取物各成分的制作方法：

一、人参皂苷Rb1提取纯化方法：

1、粗提液制备：

称取200g人参药材，粉碎成粗粉，过60目筛，应用80％乙醇水浴加热回流提取3次，每次500ml，时间2h。提取液减压浓缩至50ml，即为人参粗提液。

2、D₁₀₁大孔吸附树脂柱分离：

人参粗提液用20倍量水溶液加到已处理好的D₁₀₁大孔吸附树脂柱(50×4cm，树脂为200g)。先用水洗柱，再用2％NaOH溶液、2％HCl溶液依次洗柱，再用水洗至流出液呈中性，最后采用90％乙醇淋洗，收集流出液。回收溶剂，60℃减压干燥，得干燥疏松黄白色粉末，即为人参总皂苷。

3、纯化：

用40ml70％乙醇溶解人参总皂苷，后加入400ml丙酮搅拌，有大量沉淀析出，放置，过滤，沉淀干燥，得到棕黄色干燥疏松粉末。粉末再用40ml水溶解，加400ml丙酮搅拌，析出大量沉淀，静置，过滤，沉淀再用40ml水溶解，重复上述步骤。60℃减压干燥，得黄白色干燥疏松粉末，即为人参皂苷Rb1。经HPLC检测，人参皂苷Rb1的纯度(质量分数)为95％。

二、人参皂苷Re提取纯化方法：

1、粗提液制备：

称取200g人参药材，粉碎成粗粉，过60目筛，应用80％乙醇水浴加热回流提取3次，每次500ml，时间2h。提取液减压浓缩至50ml，即为人参粗提液。

2、D₁₀₁大孔吸附树脂柱分离：

人参粗提液用20倍量水溶液加到已处理好的D₁₀₁大孔吸附树脂柱(50×4cm，树脂为200g)。先用水洗柱，再用2％NaOH溶液、2％HCl溶液依次洗柱，再用水洗至流出液呈中性，最后采用90％乙醇淋洗，收集流出液。回收溶剂，60℃减压干燥，得干燥疏松黄白色粉末，即为人参总皂苷。

3、纯化：

用40ml70％乙醇溶解人参总皂苷，后加入400ml丙酮搅拌，有大量沉淀析出，放置，过滤，母液回收溶剂至干，得棕黄色疏松粉末。粉末再用40ml95％乙醇溶解，加300ml丙酮搅拌，析出沉淀，静置，过滤，母液回收至干，再用丙酮同法处理二次，过滤，回收溶液至干，60℃减压干燥，得黄白色干燥疏松粉末，即为人参皂苷Re。经HPLC检测，人参皂苷Re的纯度(质量分数)为92％。

三、人参皂苷Rd提取纯化方法：

1、粗提液制备：

取200g人参药材，粉碎成粗粉，过60目筛，加90％乙醇500ml，冷浸过夜，滤过。药渣再加入500ml90％乙醇，水浴加热回流提取2次，每次2h。冷至室温，滤过，合并3次滤液，60℃水浴减压干燥，残渣用适量甲醇溶解。

2、AB-8型大孔吸附树脂柱分离：

用AB-8型大孔吸附树脂500g装填层析柱。25％乙醇平衡柱后，上样液，再依次用25％、40％、80％和95％乙醇梯度洗脱，流速10ml/min，以每份500ml收集，共收集80份。洗脱液用硅胶H薄层色谱分析，展开剂为“正丁醇-乙酸乙酯-水”/4∶1∶5(上层)，10％硫酸乙醇溶液显色。合并色谱斑点相同组分，减压回收溶剂。经TLC检测，得到含有Rd组分的洗脱液。

3、硅胶柱梯度洗脱：

用500g硅胶H装填层析柱，以“氯仿-甲醇”(84∶16)平衡柱子。将经大孔吸附树脂分离含有Rd组分的浓缩液上样，依次用“氯仿-甲醇-水”为83∶16∶1、76∶22∶2、68∶28∶4、65∶30∶5、61∶33∶6、54∶38∶8的溶剂洗脱，流速10ml/min，每份收集500ml，共42份。洗脱液用硅胶H薄层色谱分析，展开剂同上。采用薄层色谱检查，得到含有Rd组分的洗脱液，经HPLC测定，纯度达92％。

四、人参皂苷Rb3提取纯化方法：

1、粗提液的制备：

取干燥的人参药材500g，加500ml水煮2h，冷却，过滤，药渣再用水煮2次，合并滤液。滤液经D₄₀₂₀多孔树脂分离，用水洗脱至无色，续用50％乙醇溶液淋洗，回收乙醇得浸膏，再用95％乙醇搅拌，静置2h，过滤，回收乙醇得总皂苷。

2、纯化：

加入500ml水溶解总皂苷，然后用乙酸乙酯萃取3次，每次100ml，将水层继续用饱和正丁醇萃取，静置过夜。浓缩上层水饱合正丁醇溶液，滴加丙酮，有沉淀析出，将剩余的滤液浓缩，再次滴加丙酮，析出晶体，反复两次。真空抽滤，即为人参皂苷Rb3。

五、人参皂苷Rg3提取纯化方法：

1、人参总皂苷的制备：

取200g人参药材，粉碎成粗粉，过60目筛。加入1000ml的70％乙醇，回流2h，充分震荡后过滤，再加入1000ml的70％乙醇，如此重复共计5次，合并5次滤液，减压蒸干得人参总皂苷。

2、人参二醇组分的分离：

称取20g人参总皂苷溶于1000ml水，将此溶液通过AB-8型大孔树脂。首先用1000ml水洗树脂，流速为10ml/min；再用500ml的30％乙醇溶液洗；后以1000ml的pH＝10的碱性70％乙醇溶液洗脱。将洗脱液用旋转蒸发器真空浓缩至干，放入电热干燥箱中60℃干燥，得人参二醇组分粗皂苷。

3、微波法纯化人参皂苷Rg3：

称取2g人参二醇组分粗皂苷，溶于100ml水中，加入盐酸至浓度为0.5mol/L，加水稀释到200ml。放入微波反应器内，选用225w，v＝2500MHz，开始反应。反应结束后，冷却至室温，倒去上清液，加甲醇100ml，10000r离心20min。过滤除去沉淀，得人参皂苷Rg3。

六、人参皂苷Rh2提取纯化方法：

1、人参总皂苷的制备：

取200g干燥人参药材，加入1000ml的95％乙醇水浴加热回流2h，过滤，药渣再用1000ml的95％乙醇水浴加热回流2次，合并滤液，回收乙醇得浸膏，再用3倍量无水乙醇搅拌，静置2h，过滤，减压蒸干得人参总皂苷。

2、人参皂苷Rh2组分的分离：

取人参总皂苷20g，加入200ml水溶解，采用乙醚萃取3次，每次50ml，将萃取液合并，回收溶液得含人参皂苷Rh2组分。

3、薄层色谱纯化：

采用CHCl₃∶MeOH∶H₂O(2∶2∶4下层)溶剂系统，经硅胶柱反复层析；薄层色谱检查，分离得到白色化合物，应用甲醇-水体系重结晶，得到无色针状结晶，即为人参皂苷Rh2。

七、人参皂苷Rg1提取纯化方法：

1、人参浸膏的制备：

取200g干燥人参药材，以70％乙醇为提取溶剂，用量1000ml，80℃回流提取3次，每次2h。合并滤液，回收乙醇得浸膏。

2、人参皂苷Rg1的分离：

采用D-101大孔树脂对人参乙醇提取物干膏进行初步分离，上样量为20g，上样流速为0.5ml/min，其中，70％乙醇为洗脱剂，洗脱剂用量为1000ml，洗脱流速为1.0ml/min，通过TLC定性检测收集人参皂苷Rg1纯度较高的解析液，合并，蒸干，得到含人参皂苷Rg1的粗品。

3、人参皂苷Rg1的纯化：

采用薄层色谱法对人参皂苷Rg1粗品进行精制，其中，以2mm的硅胶HF254-石膏作为固定相，上样量为5g，以CH₂Cl₂∶MeOH＝7∶1作为洗脱剂，洗脱剂流速为10ml/min。利用TLC定性鉴别方法，收集纯度较高的洗脱液进行合并，再通过二次分离，重结晶，得到纯度为92％的人参皂苷Rg1单体。

本发明通过以下的实验来验证上述药物组合物的效果。

1、人参提取物对5-FU药代动力学影响的实验：

1.1实验方法

健康SD大鼠，雄性，120-140g，清洁级，由北京维通丽华实验动物公司提供，许可证号：SCXK(京)2007-0001。将12只大鼠平均分成两组：

(1)对照组：6只大鼠，每只灌喂生理盐水1.5ml/次，每天两次，连续10天；

(2)实验组：6只大鼠，每只灌喂人参提取物溶液1.5ml/次，每天两次，连续10天，相当于每天灌喂人参生药0.162g(0.81g/kg)。

10天后，禁食12h，给药5-FU生理盐水溶液48mg/kg，按10mg/ml腹腔注射1ml，于给药前和给药后0，1，3，5，10，20，30，60，90，120，240min眼眶取血500μl于肝素化的Eppendorf管(离心管)中，-20℃冰箱保存。

血浆样品预处理方法：将血浆样品离心5min(7000r/min)，取血清200μl置于Eppendorf管中，加入1mg/ml内标液200μl，甲醇600μl，涡旋。摇匀后加入1ml乙酸乙酯-异丙醇(9∶1，v/v)，涡旋1min，再离心5min(3000r/min)。将上清液转入玻璃离心管中。以同样方法再萃取两次，混合上清液，40℃氮气吹干。残渣加入200μl乙腈-甲醇(75∶25，v/v)复溶，涡旋，离心5min(3000r/min)，取上清液于自动进样器中待分析。

5-FU色谱检测方法：色谱柱为Atlantis.dcC18，粒径3μm(30mm×2.1mm)，流动相为醋酸胺(A)与乙腈(B)，梯度洗脱，0-4min∶20％A+80％B；4.1-10min∶100％A+0％B，流速2.0ml/min，进样量10μl。

1.2实验结果

大鼠体重变化：连续10天口服灌喂人参提取物后，大鼠体重明显高于对照组大鼠体重。经过10天的预处理，人参提取物组大鼠体重为183±8克，而对照组(连续10天灌喂等体积的生理盐水)大鼠体重为157±7克，具有显著性差异。说明该人参提取物的特定配方有助于大鼠增加体重。结果详见图1：

5-FU药代动力学结果：通过测量5-FU的血药浓度，绘制血药浓度随时间变化的曲线。通过药代动力学计算软件3p87，计算5-FU的药代动力学参数。从表1中可以看出，相比于对照组5-FU药代动力学参数，服用人参提取物组的消除半衰期(t_1/2(ke))显著性的增长(对照组：79.17±36.25min；人参提取物组：125.72±8.43min)，具有显著性差异，表明服用人参提取物有助于减缓5-FU在体内的代谢，增强5-FU的作用时间。结果详见图2、表1：

表1.5-FU血浆药代动力学参数

注：各种参数实验组与对照组相比，^#p＜0.05，^##p＜0.01。AUC，药时曲线下面积；T_max，达峰时间；C_max，药物峰浓度；CL，清除率；V/F，表观容积；t_1/2(k_e)，代谢半衰期；t_1/2(k_a)，吸收半衰期。

2.人参提取物和5-FU的药物组合物对人胃癌细胞的协同抑制作用：

2.1实验方法

人胃癌细胞系BGC823细胞培养：细胞生长于体积分数为10％的胎牛血清的DMEM/F12培养基中，于37℃，5％CO₂培养箱中培养。3-4天以约1∶3比例传代一次。细胞经胰酶分散传代和收获，取对数生长期细胞进行实验。

人胃癌细胞系BGC823细胞生长抑制实验：采用ATP方法进行实验。取对数生长期的BGC823细胞，0.25％胰酶消化，用含10％胎牛血清的DMEM/F12培养基将细胞配制成细胞悬液，计数。调节细胞浓度至2×10⁴/ml，接种于384孔板中，每孔50μl。置于37℃，5％CO₂培养箱中培养24h。实验分为以下3组：

(1)5-FU组：加入10μl不同浓度5-FU于培养基中，使其终浓度为0.1，0.3，1，3，10，30，100μg/ml；

(2)人参提取物组：加入10μl不同浓度人参提取物于培养基中，使其终浓度为0.1，0.3，1，3，10，30，100μg/ml；

(3)5-FU和人参提取物联合组：以质量浓度1∶1配比5-FU和人参提取物混合液，加入不同浓度该混合液，使终浓度为0.1，0.3，1，3，10，30，100μg/ml。

每个浓度设5个复孔，同时设空白对照(10μl DMEM/F12培养基)。继续培养48h后，加入10μl ATP检测试剂，静置10min，采用多功能酶标仪在595nm波长下检测其发光值，并计算细胞的存活率。计算公式：细胞存活率＝(加药组细胞所测细胞发光值-空白组细胞所测发光值)/(对照组细胞所测发光值-空白组细胞所测发光值)×100％。实验重复三次。

2.2实验结果

人参提取物和5-FU的药物组合物对人胃癌细胞BGC823的生长抑制作用结果见下表：

表2.不同浓度5-FU、人参提取物及5-FU联合人参提取物对BGC823细胞的细胞存活率(％)

注：5-FU联合人参提取物联合组与5-FU组相比，^#p＜0.05，^##p＜0.01。

实验可见，虽然人参提取物单独使用对人胃癌细胞BGC823没有直接抑制生长，单独使用5-FU组的BGC823细胞存活率明显降低，且具有剂量依赖特点；但是，5-FU与人参提取物组合联合使用，其药物组合物按照1∶1比例组合，在3-100μg/ml浓度范围内，人胃癌细胞的存活率比单用5-FU的要更低，并且具有显著性的差异。说明该人参提取物与5-FU联合应用，能够显著增强抗肿瘤药物抑制人胃癌细胞BGC823的生长的作用。于此同时，该人参提取物并不增强抗肿瘤药物5-FU的副作用，由下列实验加以证实：

3.人参提取物和5-FU的组合物对正常胃上皮细胞毒性实验：

3.1实验方法

人胃粘膜上皮细胞系GES-1细胞培养：细胞生长于体积分数为10％的胎牛血清的DMEM/F12培养基中，于37℃，5％CO₂培养箱中培养。3-4天以约1∶3比例传代一次。细胞经胰酶分散传代和收获，取对数生长期细胞进行实验。

人胃粘膜上皮细胞系GES-1细胞毒性实验：采用ATP方法进行实验。取对数生长期的BGC823细胞，0.25％胰酶消化，用含10％胎牛血清的DMEM/F12培养基将细胞配制成细胞悬液，计数。调节细胞浓度至2×10⁴/ml，接种于384孔板中，每孔50μl。置于37℃，5％CO₂培养箱中培养24h。实验分为以下3组：

(1)5-FU组：加入10μl不同浓度5-FU于培养基中，使其终浓度为0.1，0.3，1，3，10，30，100μg/ml；

(2)人参提取物组：加入10μl不同浓度人参提取物于培养基中，使其终浓度为0.1，0.3，1，3，10，30，100μg/ml；

(3)5-FU和人参提取物联合组：以质量浓度1∶1配比5-FU和人参提取物混合液，加入不同浓度该混合液，使终浓度为0.1，0.3，1，3，10，30，100μg/ml。

每个浓度设5个复孔，同时设空白对照(10μl DMEM/F12培养基)。继续培养48h后，加入10μl ATP检测试剂，静置10min，采用多功能酶标仪在595nm波长下检测其发光值，并计算细胞的存活率。计算公式：细胞存活率＝(加药组细胞所测细胞发光值-空白组细胞所测发光值)/(对照组细胞所测发光值-空白组细胞所测发光值)×100％。实验重复三次。

3.2实验结果

人参提取物和5-FU的药物组合物对人胃粘膜上皮细胞GES-1的毒性结果见下表：

表3.不同浓度5-FU、人参提取物及5-FU联合人参提取物作用于GES-1细胞的细胞存活率(％)

注：5-FU联合人参提取物组与5-FU组相比，^#p＜0.05，^##p＜0.01。

从表3可见，人参提取物对人胃粘膜上皮细胞GES-1没有直接抑制生长，5-FU组的GES-1细胞存活率降低，具有剂量依赖特点，这部分体现了抗肿瘤药物5-FU的毒副作用，因此对GES-1的细胞毒性较大；但人参提取物与5-FU联合应用后，没有增加对人胃粘膜上皮细胞的毒、副作用。

综上所述，通过实验研究，我们得到以下结论：1、人参提取物的特定配方，有助于增加大鼠的体重；2、该人参提取物可以延长抗肿瘤药物5-FU在大鼠体内代谢的消除半衰期，有利于维持血浆中抗肿瘤药物5-FU的浓度，增强药物的治疗效果；3、人参提取物与5-FU联合应用，能够协同抑制人胃癌细胞BGC823的生长，显著增强抗肿瘤的疗效，但不会增强5-FU对正常胃粘膜上皮细胞GES-1的毒、副作用。

以上所述的仅是本发明的实施方式，在此应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出改进，但这些均属于本发明的保护范围。

Claims (6)

1.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括人参提取物和抗肿瘤药物成分5-氟尿嘧啶，人参提取物和5-氟尿嘧啶质量比为30％～200％。

2.根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，人参提取物和5-氟尿嘧啶质量比为100％。

3.根据权利要求2所述的药物组合物，其特征在于，所述人参提取物包括人参皂苷Rb1、人参皂苷Re、人参皂苷Rd、人参皂苷Rb3、人参皂苷Rg3、人参皂苷Rh2、和人参皂苷Rg1。

4.根据权利要求3所述的药物组合物，其特征在于，所述人参提取物中：

人参皂苷Rb1的质量百分比为20％～40％、人参皂苷Re的质量百分比为30％～50％、人参皂苷Rd的质量百分比为10％～30％、人参皂苷Rb3的质量百分比为5％～20％、人参皂苷Rg3的质量百分比为1％～10％、人参皂苷Rh2的质量百分比为3％～20％、和人参皂苷Rg1的质量百分比为8％～25％。

5.一种药物组合物的用途在于增强抗肿瘤成分的疗效，并减少抗肿瘤成分治疗造成的副作用。

6.根据权利要求5所述的药物组合物的用途，其特征在于：治疗胃癌疾病。