CN1415304A - 一种以20(S)－人参皂甙Rh2为有效成分的抗癌辅助药物及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种以20(S)－人参皂甙Rh2为有效成分的抗癌辅助药物及应用，该药物具有增强抗癌药物疗效、降低抗癌药物毒性、预防和治疗放化疗引起的白细胞降低以及增强机体免疫功能的作用，可用于癌症的辅助治疗。
Description
技术领域：
本发明涉及一种用于增强抗癌药物疗效，降低抗癌药物毒性、预防和治疗放化疗引起的白细胞降低及增强机体免疫功能的抗癌辅助药物，属于癌症治疗的医药领域。
背景技术：
癌症是危害人类健康的三大疾病之一，其发病率及死亡率在某些国家已上升到第1位。因此研制开发抗癌药物是广大医药工作者面临床的重大课题之一。至今开发成功的很多抗癌药物，虽然治疗效果越来越好，但是因为药物本身的毒副作用太强，导致临床应用受到限制。因此，目前抗癌药物研究，一方面继续开发杀死癌细胞的治疗药物外，开发以增强抗癌药物的疗效，降低其毒副作用为主要功效的抗癌辅助药物也越来越受到重视。
我国是中药大国，中医中药理论源远流长，在利用中医中药治疗癌症，尤其是中西药结合治疗癌症方面具有丰富的经验。在中西药结合治疗癌症的过程中，中药所起的作用主要是增加抗癌药物的疗效，降低其毒性，增强患者的机体免疫功能，能使患者继续接受放化疗，帮助患者战胜癌症。
人参是一种名贵的滋补药物，具有大补元气，复脉固脱，补脾益肺，生津、安神功能。在临床上用于提高癌症患者的机体免疫功能，预防和治疗因放化疗引起的白细胞降低等方面。
人们对人参的化学成分及生理活性的研究始于20世纪60年代，主要集中在日本、韩国及中国，从那时起人们相继从人参中分离出了20余种四环三萜皂甙类成分，其中包括含量较高的人参皂甙Ra1、Ra2、Ra3、Rb1、Rb2、Rb3、Rc、Rd、Rc、Rg1、Rg2和含量非常低的Rg3、Rh2、Rh1等。另外还包括人参皂甙的酸水解、碱水解、酶水解及生物代谢产物，如人参皂甙Rck、人参皂甙Y、原人参二醇、原人参三醇、人参二醇、人参三醇等。
与此同时，人们对人参及其主要化学成分-人参皂甙的生理活性进行了很多的研究，证明了人参的有效成分是人参皂甙，并发表了大量的关于人参皂甙的单体或它们的混合物的生理活性研究报告。
人参皂甙Rh2，最早由日本学者北川勋从红参中分得，其含量只有十万分之几，而人参皂甙Rh2又分为20(S)-人参皂甙Rh2和20(S)-人参皂甙Rh2两个对映异构体。
20(S)-人参皂甙Rh2 20(R)-人参皂甙Rh2
本发明涉及的是20(S)-人参皂甙Rh2。
关于人参皂甙Rh2的活性方面的研究相对较少，而且主要集中在抗癌活性方面。日本专利昭58-57399公开了以20(S)-人参皂甙Rh2为有效成分的抗癌药物专利，认为20(S)-人参皂甙Rh2具有较强抑制肿瘤生长活性。太田等人[Journal of PharmaceuticalScience 80(12)：1141_1143，1991]发表了人参皂甙Rh2抑制黑色素瘤的活性研究报告，中国专利CN1225366A公开了20(S)-人参皂甙Rh2的制备方法及做为抗癌药物的应用。
由于20(S)-人参皂甙Rh2在人参或人参属其它植物中的含量非常低，所以只能靠其它人参皂甙的水解或合成的方式获得20(S)-人参皂甙Rh2。
20(S)-人参皂甙Rh2的制备方法，陈英杰等人[沈阳药学院学报，5(2)：149，1988]报道了从人参中分离纯化人参皂甙Rh2的方法，宋长春等人[中国药学杂志，27(1)：6，1992]报道了利用西洋参茎叶总皂甙通过碱水解制备Rh2的方法。另外韩国专利91-16456公开了20(R)-人参皂甙Rh2的制备方法及化合物专利。
我们认为人参及人参皂甙具有一定的抗癌活性，但其杀伤癌细胞的作用比不上化学合成药，比如环磷酰胺、5-氟气尿嘧定、顺铂等，但是它对抗癌药物的增效减毒作用、提高癌症患者的机体免疫力等方面具有明确的显著效果。因此，我们根据文献报道，有选择地进行了人参皂甙的抑瘤活性尤其是抗癌增效减毒方面的研究工作。
结果发现，20(S)-人参皂甙Rh2具有一定的抑制恶性肿瘤活性，但其活性确实不如化学合成药，而20(S)-人参皂甙Rh2在抗癌药物的增效减毒、增强机体免疫功能等方面确实具有非常明显的效果。经过反复多次的实验研究，终于完成了本发明。
发明内容：
首先，我们研究成功了利用高沸点有机溶剂作反应介质，在常压下经过高温碱水解，从人参二醇组皂甙(人参皂甙Rb1、Rb2、Rc、Rd等)制备20(S)-人参皂甙Rh2的方法，并申请了中国专利(CN1293198A)。此方法可利用人参、西洋参、三七等人参属植物中大量存在的人参皂甙Rb1、Rb2、Rb3、Rc、Rd等制备20(S)-人参皂甙Rh2，此方法产量大、产率高、操作简便、适于工业化生产。
上述方法制备的20(S)-人参皂甙Rh2，经药效学、毒理学研究发现，具有非常显著的增强抗癌药物疗效，降低抗癌药物毒性、预防和治疗抗癌药物引起的白细胞降低、增强机体免疫功能的作用，而且毒副作用小，是一个非常理想的抗癌辅助药物。
20(S)-人参皂甙Rh2药效学研究结果如下：20(S)-人参皂甙Rh2与功能主治有关的主要药效学试验
摘要 通过小鼠体内移植性肿瘤模型，对20(S)-人参皂甙Rh2抗肿瘤作用，对化疗药物环磷酰胺(CTX)的增效、减毒作用进行研究。结果表明，20(S)-人参皂甙Rh2具有良好的抗癌活性，50、100、200mg/kg剂量组对肝癌H22的平均抑瘤率分别为27.63％、37.16％、47.23％；对Lewis肺癌的平均抑瘤率分别为25.0％、42.4％、49.9％；对黑色素瘤B16的平均抑瘤率分别为28.6％、37.1％、46.8％。而且20(S)-人参皂甙Rh2对CTX具有较明显的增效、减毒作用。通过对NK、SI、IL-2等免疫学指标的测定，表明20(S)-人参皂甙Rh2可能通过增强免疫功能达到抗肿瘤功效的。
试验目的 观察荷瘤动物应用20(S)-人参皂甙Rh2后肿瘤生长情况，对该药进行抗肿瘤药效学、增效、减毒及增强免疫作用研究。
试验材料
1.药物20(S)-人参皂甙Rh2原料粉 海南亚洲制药有限公司提供，批号000816；羧甲基纤维素钠上海化学试剂公司提供，批号990606；环磷酰胺上海华联制药有限公司提供，批号000205。
2.动物 昆明种小鼠，5～8周龄，体重18～22g，雌雄兼用，每批实验采用同一性别。实验前在实验室常规饲养三天，由长春高新医学实验动中心提供。合格证号：10-5113；C57BL/6纯系小鼠，5～8周龄，体重18～22g，雌雄兼用，每批实验采用同一性别。实验前在实验室常规饲养一周，中国医学科学院实验动物繁育场提供，合格证号：SCXK11-00-0006。
3.细胞株 小鼠肝癌H22、小鼠黑色素瘤B16、小鼠Lewis肺癌，由吉林省肿瘤研究所提供，经本实验室传代保存。
试验方法
1.药物配制 将20(S)-人参皂甙Rh2原料粉在研钵内以1％羧甲基纤维素钠配成不同浓度的混悬液。环磷酰胺以无菌生理盐水稀释，配成0.1％溶液，现用现配。
2.动物分组及给药方案 将小鼠按体重随机分为下列各组：(1)抑瘤试验溶剂对照组： 给予1％羧甲基纤维素钠阳性药对照组： 给予环磷酰胺20mg/kg药物小剂量组： 给予20(S)-人参皂甙Rh2 50mg/kg药物中剂量组： 给予20(S)-人参皂甙Rh2 100mg/kg药物大剂量组： 给予20(S)-人参皂甙Rh2 200mg/kg(2)增效试验
溶剂对照组： 给1％羧甲基纤维素钠
阳性药小剂量对照组： 给环磷酰胺5mg/kg
阳性药小+药物小剂量组： 给环磷酰胺5mg/kg+20(S)-人参皂甙Rh2
50mg/kg
阳性药小+药物大剂量组： 给环磷酰胺5mg/kg+20(S)-人参皂甙Rh2
200mg/kg
阳性药大剂量对照组： 给环磷酰胺10mg/kg
阳性药大+药物小剂量组： 给环磷酰胺10+20(S)-人参皂甙Rh2 50mg/kg
阳性药大+药物大剂量组： 给环磷酰胺10+20(S)-人参皂甙Rh2 200mg/kg(3)减毒试验
溶剂对照组： 给1％羧甲基纤维素钠
阳性药小剂量对照组： 给环磷酰胺10mg/kg
阳性药小+药物小剂量组： 给环磷酰胺10+20(S)-人参皂甙Rh2 50mg/kg
阳性药小+药物大剂量组： 给环磷酰胺10+20(S)-人参皂甙Rh2 200mg/kg
阳性药大剂量对照组： 给环磷酰胺20 mg/kg
阳性药大+药物小剂量组： 给环磷酰胺20+20(S)-人参皂甙Rh2 50mg/kg
阳性药大+药物大剂量组： 给环磷酰胺20+20(S)-人参皂甙Rh2 200mg/kg
各组药物均灌胃(i.g)给药，容量为0.2ml/10g，连续给药10天。
3. 20(S)-人参皂甙Rh2的体内抑瘤试验
按抗肿瘤药物实验方法学方法接种肿瘤，取腹腔内传代7天的肝癌H22小鼠，在无菌条件下抽取瘤细胞，并以生理盐水洗涤3次，调整瘤细胞浓度为1×107/ml，接种于昆明种小鼠左腹股沟皮下，每只小鼠接种0.2ml。取传代Lewis肺癌和黑色素瘤B16肿瘤生长良好的小鼠，在无菌条件下剥离瘤组织块，在玻璃研磨器内研磨成肿瘤匀浆，按瘤重(g)∶生理盐水(ml)＝1∶2的比例制备瘤液，接种于C57BL/6小鼠左腹股沟皮下，每只小鼠接种0.2ml。接种次日起给药，连续给药10天，于停药后24小时颈椎脱臼处死荷瘤小鼠，剥离肿瘤组织，称重。结果以肿瘤生长抑瘤率表示：
抑瘤率＝(1-实验组平均瘤重/对照平均瘤组)×100％
取符合实验标准要求(对照组平均瘤重＞1g，且瘤重＜400mg的动物数不超过总数的20％)的三批试验结果进行统计学分析。
4. 20(S)-人参皂甙Rh2的增效试验 用小鼠肝癌H22及Lewis肺癌建立小鼠体内移植性肿瘤模型，方法及给药同前。末次给药后24小时颈椎脱臼处死荷瘤小鼠，取瘤并称重，比较单纯应用环磷酰胺5mg及10mg治疗同与20(S)-人参皂甙Rh2 50mg及200mg分别合用治疗各组之间抑瘤率差异，观察20(S)-人参皂甙Rh2增效作用。
5. 20(S)-人参皂甙Rh2的减毒试验 用小鼠肝癌H22及Lewis肺癌建立小鼠体内移植性肿瘤模型，方法及给药同前。比较单纯应用环磷酰胺10mg及20mg治疗同与20(S)-人参皂甙Rh2 50mg及200mg分别合用治疗各组之间各组动物体重差异，计算脏器指数，按常规方法计数外周血白细胞数，观察20(S)-人参皂甙Rh2的减毒作用。
6. 20(S)-人参皂甙Rh2对荷瘤小鼠免疫功能的影响
6.1药物对小鼠脾淋巴细胞转化功能的影响
第三批肝癌H22抑瘤试验中，末次给药后24小时在观察抑瘤率同时，无菌条件下取出荷瘤小鼠脾脏，分组研磨，用IMDM培养液调脾细胞浓度到1×107个/ml。取96孔平底培养板，每只鼠设：
(1)对照孔，3复孔，每孔加100μl IMDM培养液
(2)ConA刺激孔，3复孔，每孔加100μl ConA(10μg/ml)
然后每孔加100μl脾细胞悬液。在37℃、5％CO2培养箱中培养72小时，终止培养前4小时加入MTT溶液(5mg/ml)10μl/孔。终止培养后，小心吸弃孔内上清液，每孔加入100μl DMSO，振荡10min，使结晶物充分溶解。用酶标仪在570nm波长处测定吸光度(OD值)，计算刺激指数。
刺激指数＝ConA刺激孔OD值/对照孔OD值
6.2药物对荷瘤小鼠NK细胞毒百分率影响的测定
取上述脾细胞悬液，制备常规培养YAC-1细胞悬液，调浓度至1×106个/ml。取96孔圆底培养板，每只鼠设：
(1)效应细胞∶靶细胞(10∶1)孔，加50μl脾细胞悬液，100μl YAC-1细胞悬液，50μl IMDM培养液；效应细胞对照孔，加50μl脾细胞悬液，150μl IMDM培养液。
(2)效应细胞∶靶细胞(20∶1)孔，加100μl脾细胞悬液，100μl YAC-1细胞悬液；效应细胞对照孔，加入100μl脾细胞悬液，100μl IMDM培养液。
(3)靶细胞对照孔，加入100μl YAC-1细胞悬液，100μl IMDM培养液。
上述各组均设三复孔，将培养板于37℃、5％CO2及100％湿度的培养箱中孵育24小时后，各孔加入MTT溶液(5mg/ml)10μl，同样条件下继续孵育4小时终止培养。然后小心吸弃孔内上清液，每孔加入100μl DMSO，振荡10min。用酶标仪在490nm波长处测定OD值，计算NK细胞毒百分率。
6.3药物对荷瘤小鼠IL-2活性的影响
采用依赖细胞株法检测Ppd对荷瘤小鼠IL-2活性的影响。
(1)小鼠脾细胞IL-2诱生 制备脾细胞悬液，方法同上，冲洗一次后调细胞浓度为0.5×107/ml。加入终浓度为5～10μg/ml的ConA，3000rpm离心10min收获细胞培养上清(其中含IL-2)。
(2)IL-2活性测定 将IL-2标准品用培养液倍比稀释，以3复孔加入96孔板，每孔100μl。将待测样品1∶2稀释，亦按3复孔加入到96孔板内。将生长状态良好的CTL2细胞离心洗涤两遍，用含10％小牛血清的IMDM培养液配成5×105/ml浓度的细胞悬液。向每孔中加入100μl细胞悬液，置5％CO237℃培养箱中孵育22小时后，各孔加入MTT溶液(5mg/ml)10μl，同样条件下继续孵育4小时终止培养，小心吸弃孔内上清液，每孔加入100μl DMSO，振荡10min。用酶标仪在570nm波长处测定OD值。用log2稀释度(X)和各稀释度对应的OD值(Y)作直线回归，分析计算待测样品的IL-2浓度。
统计方法 所有结果均采用Excel进行T检验显著性差异检测，结果以均值±标准差(x±s)表示。
试验结果
1 20(S)-人参皂甙Rh2的抑瘤作用
1.1 20(S)-人参皂甙Rh2对小鼠肝癌H22的生长抑制作用
结果表明，20(S)-人参皂甙Rh2对肝癌H22具有明显的生长抑制作用，且存在剂量效应关系，实验组三个剂量的平均抑瘤率分别为27.63％、37.16％、47.23％，见表1。
1.2 20(S)-人参皂甙Rh2对小鼠Lewis肺癌的生长抑制作用
结果表明，20(S)-人参皂甙Rh2对Lewis肺癌具有明显的生长抑制作用，且存在剂量效应关系，实验组三个剂量的平均抑瘤率分别为25.0％、42.4％、49.9％，见表2。
1.3 20(S)-人参皂甙Rh2对小鼠黑色素瘤B16的生长抑制作用
结果表明，20(S)-人参皂甙Rh2对黑色素瘤B16具有明显的生长抑制作用，且存在剂量效应关系，实验组三个剂量的平均抑瘤率分别为28.6％、37.1％、46.8％，见表3。
表1 20(S)-人参皂甙Rh2对小鼠肝癌H22的生长抑制作用(n＝10 x±s)组别 剂量 瘤重(g) 抑瘤率％ P值溶剂对照 20ml/kg 1.64±0.36 -环磷酰胺 20mg/kg 0.48±0.28 71.0＜0.001小剂量组 50mg/kg 1.27±0.35 22.6＜0.05中剂量组 100mg/kg 1.08±0.41 34.1＜0.01大剂量组 200mg/kg 0.92±0.28 43.9＜0.001溶剂对照 20ml/kg 1.37±0.46 -环磷酰胺 20mg/kg 0.47±0.11 65.3＜0.001小剂量组 50mg/kg 0.86±0.31 37.2＜0.01中剂量组 100mg/kg 0.78±0.21 43.1＜0.001大剂量组 200mg/kg 0.67±0.18 51.1＜0.001溶剂对照 20ml/kg 1.69±0.57 -环磷酰胺 20mg/kg 0.27±0.10 84.1＜0.001小剂量组 50mg/kg 1.30±0.22 23.1＜0.05中剂量组 100mg/kg 1.11±0.29 34.3＜0.01大剂量组 200mg/kg 0.90±0.19 46.7＜0.001表2 20(S)-人参皂甙Rh2对小鼠Lewis肺癌的生长抑制作用(n＝10 x±s)组别 剂量 瘤重(g) 抑瘤率％ P值溶剂对照 20ml/kg 1.62±0.45 -环磷酰胺 20mg/kg 0.47±0.28 71.0 ＜0.001小剂量组 50mg/kg 1.17±0.35 27.8 ＜0.05中剂量组 100mg/kg 0.84±0.25 48.1 ＜0.01大剂量组 200mg/kg 0.79±0.43 51.2 ＜0.01溶剂对照 20ml/kg 1.06±0.24 -环磷酰胺 20mg/kg 0.27±0.06 74.3 ＜0.001小剂量组 50mg/kg 0.81±0.22 23.6 ＜0.05中剂量组 100mg/kg 0.61±0.18 42.5 ＜0.01大剂量组 200mg/kg 0.50±0.14 52.8 ＜0.001溶剂对照 20ml/kg 1.53±0.29 -环磷酰胺 20mg/kg 0.37±0.20 75.7 ＜0.001小剂量组 50mg/kg 1.17±0.41 23.5 ＜0.05中剂量组 100mg/kg 0.97±0.63 36.6 ＜0.05大剂量组 200mg/kg 0.83±0.41 45.8 ＜0.001表3 20(S)-人参皂甙Rh2对小鼠黑色素瘤B16的生长抑制作用(n＝10 x±s)组别 剂量 瘤重(g) 抑瘤率％ P值溶剂对照 20ml/kg 1.56±0.53 -环磷酰胺 20mg/kg 0.24±0.09 84.9 ＜0.001小剂量组 50mg/kg 1.03±0.41 34.0 ＜0.05中剂量组 100mg/kg 0.98±0.34 37.2 ＜0.01大剂量组 200mg/kg 0.80±0.28 48.7 ＜0.01溶剂对照 20ml/kg 1.60±0.49 -环磷酰胺 20mg/kg 0.23±0.10 85.5 ＜0.001小剂量组 50mg/kg 1.13±0.36 29.4 ＜0.05中剂量组 100mg/kg 0.94±0.31 41.3 ＜0.01大剂量组 200mg/kg 0.81±0.37 49.4 ＜0.01溶剂对照 20ml/kg 1.25±0.22 -环磷酰胺 20mg/kg 0.26±0.05 79.5 ＜0.001小剂量组 50mg/kg 0.97±0.26 22.4 ＜0.05中剂量组 100mg/kg 0.84±0.34 32.8 ＜0.01大剂量组 200mg/kg 0.72±0.19 42.4 ＜0.001
2 20(S)-人参皂甙Rh2的增效作用
2.1 20(S)-人参皂甙Rh2对环磷酰胺治疗小鼠肝癌H22的增效作用
结果表明，环磷酰胺5mg/kg剂量组平均抑瘤率为20.19％，而加用20(S)-人参皂甙Rh2 50mg/kg及200mg/kg实验组平均抑瘤率分别为26.69％及48.42％，提高抑瘤率6.50～28.23％。环磷酰胺10mg/kg剂量组平均抑瘤率为32.45％，而加用20(S)-人参皂甙Rh250mg/kg及200mg/kg实验组平均抑瘤率分别为46.38％及65.02％，提高抑瘤率13.93～32.57％，结果见表4。
2.2 20(S)-人参皂甙Rh2对环磷酰胺治疗小鼠Lewis肺癌的增效作用
结果表明，环磷酰胺5mg/kg剂量组平均抑瘤率为19.40％，而加用20(S)-人参皂甙Rh2 50mg/kg及200mg/kg组平均抑瘤率分别为24.90％及46.21％，提高抑瘤率5.50～26.81％。环磷酰胺10mg/kg剂量组平均抑瘤率为37.25％，而加用20(S)-人参皂甙Rh2 50mg/kg及200mg/kg组平均抑瘤率分别为53.13％及59.98％，提高抑瘤率15.88～22.73％，结果见表5。
以上结果提示，环磷酰胺5mg剂量组为治疗肝癌H22及Lewis肺癌的无效剂量，环磷酰胺10mg剂量组为治疗肝癌H22及Lewis肺癌的有效剂量，20(S)-人参皂甙Rh2分别与其联合应用可以提高抑瘤率，增强治疗效果。而且20(S)-人参皂甙Rh2与环磷酰胺联合用药优于环磷酰胺单纯用药，增效作用明显(与相应剂量的环磷酰胺组比较P＜0.05～P＜0.001)。表4 20(S)-人参皂甙Rh2对环磷酰胺抑制小鼠肝癌H22生长的增效作用组别 剂量 瘤重(g) 抑瘤率％溶剂对照组 20ml/kg 1.99±0.55 -环磷酰胺 5mg/kg 1.53±0.47 23.31环磷酰胺+20(S)-人参皂甙Rh2 5+50mg/kg 1.48±0.3925.63*环磷酰胺+20(S)-人参皂甙Rh2 5+200mg/kg 0.93±0.2853.26** ##环磷酰胺 10mg/kg 1.14±0.3830.65*环磷酰胺+20(S)-人参皂甙Rh2 10+50mg/kg 0.98±0.2950.75**环磷酰胺+20(S)-人参皂甙Rh2 10+200mg/kg 0.67±0.2166.33*** ##溶剂对照组 20ml/kg 1.23±0.40 -环磷酰胺 5mg/kg 0.89±0.26 27.64环磷酰胺+20(S)-人参皂甙Rh2 5+50mg/kg 0.79±0.2135.77*环磷酰胺+20(S)-人参皂甙Rh2 5+200mg/kg 0.58±0.2552.85** #环磷酰胺 10mg/kg 0.78±0.21 36.59*环磷酰胺+20(S)-人参皂甙Rh2 10+50mg/kg 0.64±0.1347.97**环磷酰胺+20(S)-人参皂甙Rh2 10+200mg/kg 0.41±0.1966.67*** ##溶剂对照组 20ml/kg 1.66±0.66 -环磷酰胺 5mg/kg 1.50±0.469.61环磷酰胺+20(S)-人参皂甙Rh2 5+50mg/kg 1.35±0.4118.67环磷酰胺+20(S)-人参皂甙Rh2 5+200mg/kg 1.01±0.3639.16* #环磷酰胺 10mg/kg 1.16±0.3730.10*环磷酰胺+20(S)-人参皂甙Rh2 10+50mg/kg 0.99±0.2740.36**环磷酰胺+20(S)-人参皂甙Rh2 10+200mg/kg 0.63±0.2062.05***###注：与溶剂对照比较*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001
与相应剂量环磷酰胺比较#P＜0.05，##P＜0.01，###P＜0.001(下同)表5 20(S)-人参皂甙Rh2对环磷酰胺抑制小鼠Lewis肺癌生长的增效作用组别 剂量 瘤重(g) 抑瘤率％溶剂对照组 20ml/kg 1.10±0.37 -环磷酰胺 5mg/kg 0.88±0.29 20.00环磷酰胺+20(S)-人参皂甙Rh2 5+50mg/kg 0.86±0.2421.82*环磷酰胺+20(S)-人参皂甙Rh2 5+200mg/kg 0.59±0.1246.36** #环磷酰胺 10mg/kg 0.69±0.2037.27*环磷酰胺+20(S)-人参皂甙Rh2 10+50mg/kg 0.61±0.2744.54**环磷酰胺+20(S)-人参皂甙Rh2 10+200mg/kg 0.52±0.1452.72** #溶剂对照组 20ml/kg 1.31±0.36 -环磷酰胺 5mg/kg 1.04±0.27 20.61环磷酰胺+20(S)-人参皂甙Rh2 5+50mg/kg 0.98±0.2525.19环磷酰胺+20(S)-人参皂甙Rh2 5+200mg/kg 0.65±0.1150.38** ##环磷酰胺 10mg/kg 0.83±0.2736.64*环磷酰胺+20(S)-人参皂甙Rh2 10+50mg/kg 0.54±0.1958.78** #环磷酰胺+20(S)-人参皂甙Rh2 10+200mg/kg 0.44±0.1466.42*** ##溶剂对照组 20ml/kg 1.48±0.31 -环磷酰胺 5mg/kg 1.22±0.2417.58环磷酰胺+20(S)-人参皂甙Rh2 5+50mg/kg 1.07±0.2227.70*环磷酰胺+20(S)-人参皂甙Rh2 5+200mg/kg 0.86±0.2841.89** #环磷酰胺 10mg/kg 0.92±0.1337.84*环磷酰胺+20(S)-人参皂甙Rh2 10+50mg/kg 0.65±0.1756.08** #环磷酰胺+20(S)-人参皂甙Rh2 10+200mg/kg 0.58±0.1660.81** ##
3 20(S)-人参皂甙Rh2的减毒作用
在肝癌H22及Lewis肺癌肿瘤模型中，环磷酰胺10mg及20mg剂量组在抑瘤作用的同时可见体重、免疫器官及白细胞均明显下降(P＜0.01或0.001)，有些小鼠在停药前就已经死亡。20(S)-人参皂甙Rh2与环磷酰胺合用可对此起保护作用，对抗环磷酰胺所致的体重、白细胞下降及免疫器官萎缩，提高小鼠胸腺及脾脏重量，降低荷瘤小鼠死亡率，减轻环磷酰胺的毒性，见表6-1、2、3及表7-1、2、3。
表6-120(S)-人参皂甙Rh2对环磷酰胺抑制小鼠肝癌H22生长的减毒作用组别 体重(g) 胸腺指数 脾指数 WBC(×10 9/L)溶剂对照组20ml/kg 22.05±1.64 0.152±0.043 0.705±0.156 8.26±2.86环磷酰胺10mg/kg 19.84±1.57*** 0.086±0.021*** 0.478±0.094** 4.76±2.47***环磷酰胺20mg/kg 18.70±1.63*** 0.048±0.042*** 0.410±0.120** 4.24±2.89***环磷酰胺+20(S)-人参皂甙Rh210+50mg/kg 21.90±1.43## 0.127±0.057## 0.631±0.124# 7.53±2.76##环磷酰胺+20(S)-人参皂甙Rh210+200mg/kg 21.68±1.12## 0.151±0.036### 0.729±0.140##7.36±3.16##环磷酰胺+20(S)-人参皂甙Rh220±50mm/kg 21.43±1.37### 0.1118±0.051## 0.621±0.065##7.55±3.47##环磷酰胺+20(S)-人参皂甙Rh220+200mg/kg 21.14±1.67## 0.133±0.064### 0.692±0.179##7.78±3.52##
表6-2 20(S)-人参皂甙Rh2对环磷酰胺抑制小鼠肝癌H22生长的减毒作用组别 体重(g) 胸腺指数 脾指数 WBC(×10 9/L)溶剂对照组20ml/kg 25.43±2.31 0.283±0.052 0.849±0.138 10.67±2.55环磷酰胺10mg/kg 23.39±1.88* 0.132±0.024*** 0.443±0.112*** 6.76±1.01***环磷酰胺20mg/kg 20.76±1.92*** 0.096±0.029*** 0.389±0.087*** 5.28±2.37***环磷酰胺+20(S)-人参皂甙Rh210+50mg/kg 24.73±1.56 0.232±0.035## 0.746±0.185## 11.56±2.46##环磷酰胺+20(S)-人参皂甙Rh210+200mg/kg 25.5±2.23# 0.178±0.038# 0.718±0.147### 10.35±2.78##环磷酰胺+20(S)-人参皂甙Rh220+50mg/kg 24.57±2.76## 0.221±0.042## 0.733±0.145### 9.57±1.43##环磷酰胺+20(S)-人参皂甙Rh220+200mg/kg 25.68±3.16### 0.285±0.433### 0.768±0.164### 11.07±3.65##
表6-3 20(S)-人参皂甙Rh2对环磷酰胺抑制小鼠肝癌H22生长的减毒作用组别 体重(g) 胸腺指数 脾指数 WBC(×10 9/L)溶剂对照组20ml/kg 24.08±2.05 0.188±0.035 0.718±0.137 10.26±2.34环磷酰胺10mg/kg 21.83±1.76* 0.091±0.022*** 0.426±0.058*** 5.81±2.51***环磷酰胺20mg/kg 19.97±2.64*** 0.045±0.014*** 0.401±0.125*** 4.21±1.80***环磷酰胺+20(S)-人参皂甙Rh210+50mg/kg 23.12±2.87 0.162±0.083## 0.723±0.164## 9.39±1.43##环磷酰胺+20(S)-人参皂甙Rh210+200mg/kg 23.70±2.54# 0.174±0.024### 0.649±0.186## 9.60±2.45##环磷酰胺+20(S)-人参皂甙Rh220+50mg/kg 24.16±3.01### 0.167±0.059## 0.612±0.185## 9.78±2.02##环磷酰胺+20(S)-人参皂甙Rh220+200mg/kg 24.04±2.68### 0.182±0.025### 0.610±0.147### 10.12±2.89##表7-120(S)-人参皂甙Rh2对环磷酰胺抑制小鼠Lewis肺癌生长的减毒作用组别 体重(g) 胸腺指数 脾指数 WBC(×10 9/L)溶剂对照组20ml/kg 26.75±1.64 0.173±0.046 0.552±0.168 8.68±2.11环磷酰胺10mg/kg 23.83±1.57*** 0.089±0.020*** 0.371±0.120* 4.52±1.44***环磷酰胺20mg/kg 20.71±1.68*** 0.075±0.042*** 0.286±0.116** 4.01±0.85***环磷酰胺+20(S)-人参皂甙Rh210+50mg/kg 25.62±2.17# 0.187±0.074## 0.594±0.065# 7.52±2.65##环磷酰胺+20(S)-人参皂甙Rh210+200mg/kg 26.23±2.32## 0.202±0.072### 0.525±0.168# 8.67±2.54##环磷酰胺+20(S)-人参皂甙Rh220+50mg/kg 25.36±2.36## 0.166±0.032### 0.528±0.143## 7.85±1.12##环磷酰胺+20(S)-人参皂甙Rh220+200mg/kg 26.01±2.87### 0.176±0.045### 0.549±0.187## 8.76±2.39##表7-220(S)-人参皂甙Rh2对环磷酰胺抑制小鼠Lewis肺癌生长的减毒作用组别 体重(g) 胸腺指数 脾指数 WBC(×10 9/L)溶剂对照组20ml/kg 24.47±2.38 0.223±0.052 0.481±0.138 9.65±2.57环磷酰胺10mg/kg 21.30±1.69** 0.118±0.021*** 0.285±0.087*** 4.76±1.04***环磷酰胺20mg/kg 19.77±2.96*** 0.097±0.015*** 0.246±0.112*** 4.23±1.18***环磷酰胺+20(S)-人参皂甙Rh210+50mg/kg 24.35±1.76## 0.214±0.073## 0.431±0.130## 8.51±1.43##环磷酰胺+20(S)-人参皂甙Rh210+200mg/kg 24.38±2.21## 0.219±0.060## 0.405±0.152## 9.12±1.45##环磷酰胺+20(S)-人参皂甙Rh220+50mg/kg 24.42±2.32### 0.208±0.038## 0.432±0.056###8.65±1.21##环磷酰胺+20(S)-人参皂甙Rh220+200mg/kg 24.61±3.23### 0.221±0.058### 0.423±0.074### 9.73±2.71###表7-320(S)-人参皂甙Rh2对环磷酰胺抑制小鼠Lewis肺癌生长的减毒作用组别 体重(g) 胸腺指数 脾指数 WBC(×10 9/L)溶剂对照组20ml/kg 23.38±2.11 0.290±0.057 0.495±0.132 10.26±2.34环磷酰胺10mg/kg 20.52±1.83** 0.091±0.015*** 0.322±0.114*** 5.81±2.51***环磷酰胺20mg/kg 18.17±1.60*** 0.045±0.011*** 0.250±0.129*** 4.21±1.80***环磷酰胺+20(S)-人参皂甙Rh210+50mg/kg 22.63±2.20# 0.213±0.065## 0.410±0.161## 9.23±1.67##环磷酰胺+20(S)-人参皂甙Rh210+200mg/kg 23.31±2.25## 0.236±0.087## 0.414±0.165## 9.56±2.18##环磷酰胺+20(S)-人参皂甙Rh220+50mg/kg 22.56±2.14## 0.201±0.045## 0.429±0.187## 9.80±2.54##环磷酰胺+20(S)-人参皂甙Rh220+200mg/kg 23.13±2.02### 0.275±0.056### 0.415±0.178### 984±2.86##4 20(S)-人参皂甙Rh2对小鼠免疫功能的影响4.1 20(S)-人参皂甙Rh2对小鼠脾淋巴细胞转化功能的影响20(S)-人参皂甙Rh2中剂量及大剂量灌胃给药10天后，ConA诱导的小鼠淋巴细胞增殖反应明显增高(P＜0.05及0.01)，且存在量效关系。见表8。
4.2 20(S)-人参皂甙Rh2对NK细胞活性的影响
20(S)-人参皂甙Rh2中剂量及大剂量灌胃给药10天后，可明显提高小鼠NK细胞活性(P＜0.05及0.01)，且存在量效关系。见表8。
4.3 20(S)-人参皂甙Rh2对荷瘤小鼠IL-2活性的影响
20(S)-人参皂甙Rh2中剂量及大剂量灌胃给药10天后，CTLL2诱导荷瘤小鼠产生的IL-2的量明显增加(P＜0.05及0.01)，且存在量效关系，见表8。
表8 20(S)-人参皂甙Rh2对肝癌H22荷瘤小鼠免疫功能的影响组别 剂量 SI NK(％) IL-2溶剂对照 20ml/kg 1.022±0.253 19.23±2.10 2.169±0.360环磷酰胺 20mg/kg 1.198±0.331 17.45±3.14 2.474±0.441小剂量组 50mg/kg 1.082±0.106 20.43±2.55 2.152±0.232中剂量组 100mg/kg 1.287±0.146* 21.58±2.24* 3.126±0.854*大剂量组 200mg/kg 1.302±0.187* 23.35±3.25** 4.987±1.569**
注：与溶剂对照组比较*P＜0.05 **P＜0.01
本发明的药物组合物，其有效成分是20(S)-人参皂甙Rh2，可以口服给药，也可以注射给药，还可以采用其它给途径，可制成各种相应的口服制剂、注射制剂或其它制剂。例如，利用20(S)-人参皂甙Rh2和各种药用辅料，可以制成片剂、胶囊剂、颗粒剂、口服液等，也可以用注射用溶媒和(或)助溶剂制成注射液或注射用粉针剂。
另外，本发明的药物组合物，还可以制成以20(S)-人参皂甙Rh2为主要有效成分，同时含有其它一种或多种天然的或合成的抗癌药物组成的复方制剂供临床应用。例如，可以用20(S)-人参皂甙Rh2和环磷酰胺、5-氟尿嘧啶，阿霉素、顺铂等组成复方制剂，制成疗效增强、毒性降低的药物组合物。
本发明的药物组合物，其临床用量以20(S)-人参皂甙Rh2计可以是20-1500mg，最好是100-200mg，每日分两次服用。
具体实施方式：20(S)-人参皂甙Rh2的制备实施例：
实施例1：将6g固体氢氧化钠溶于50ml 1，4-丁二醇中，再加入5g二醇组人参皂甙干粉，搅拌下加热至210℃进行水解反应40分钟，反应完成后趁热倾入150ml 25℃的水中稀释、混匀，加入乙酸乙酯萃取3次，每次使用乙酸乙酯70ml，回收乙酸乙酯后于105℃干燥得水解总产物2.0g。以硅胶柱层析(洗脱液：氯仿∶甲醇∶乙酸乙酯∶水＝2∶2∶7∶1)分得20-(S)人参皂甙Rh2粗品410mg，再将此粗品以甲醇-水重结晶得白色晶体345mg，收率6.90％，其纯度经HPLC法测定91.4％。此白色晶体经TLC、MS、13C-NMR、1H-NMR、13C-1HCOSY、1H-1H COSY、比旋光度及熔点测定，并与20-(S)人参皂甙Rh2的文献数据核实，确认此白色晶体为20-(S)人参皂甙Rh2。
实施例2：将6g固体氢氧化钠溶于50ml，丙三醇中，再加入5g二醇组人参皂甙干粉，搅拌下加热至220℃进行水解反应30分钟，反应完成后趁热倾入150ml 25℃的水中稀释、混匀，加入乙酸乙酯萃取3次，每次使用乙酸乙酯70ml，回收乙酸乙酯后于105℃干燥得水解总产物2.3g。以硅胶柱层析(洗脱液：氯仿∶甲醇∶乙酸乙酯∶水＝2∶2∶7∶1)分得20-(S)人参皂甙Rh2粗品432mg，再将此粗品以甲醇-水重结晶得白色晶体368mg，收率7.36％，其纯度经HPLC法测定92.3％。此白色晶体经TLC、MS、13C-NMR、1H-NMR、13C-1HCOSY、1H-1H COSY、比旋光度及熔点测定，并与20-(S)人参皂甙Rh2的文献数据核实，确认此白色晶体为20-(S)人参皂甙Rh2。
实施例3：将6g固体氢氧化钠溶于50ml丙三醇中，再加入5g二醇组人参皂甙干粉，搅拌下加热至210℃进行水解反应30分钟，反应完成后趁热倾入150ml 25℃的水中稀释、混匀，加入乙酸乙酯萃取3次，每次使用乙酸乙酯70ml，回收乙酸乙酯后于105℃干燥得水解总产物2.4g。以硅胶柱层析(洗脱液：氯仿∶甲醇∶乙酸乙酯∶水＝2∶2∶7∶1)分得20-(S)人参皂甙Rh2粗品430mg，ODS柱层析(洗脱液：甲醇∶水＝20∶1)后再以甲醇-水重结晶得白色晶体302mg，收率6.04％，其纯度经HPLC法测定98.5％。此白色晶体经TLC、MS、13C-NMR、1H-NMR、13C-1H COSY、1H-1H COSY、比旋光度及熔点测定，并与20-(S)人参皂甙Rh2的文献数据核实，确认此白色晶体为20-(S)人参皂甙Rh2。
实施例4：将1.2Kg固体氢氧化钠溶于20L丙三醇中，再加入1Kg二醇组人参皂甙干粉，搅拌下加热至220℃进行水解反应30分钟，反应完成后趁热倾入60L 25℃的水中稀释、混匀，加入乙酸乙酯萃取3次，每次使用乙酸乙酯21L，回收乙酸乙酯后于105℃干燥得水解总产物450g。以硅胶柱层析(洗脱液：氯仿∶甲醇∶乙酸乙酯∶水＝2∶2∶7∶1)分得20-(S)人参皂甙Rh2粗品84g，再将此粗品以甲醇-水重结晶得白色晶体71.2g，收率7.12％，其纯度经HPLC法测定92.4％。此白色晶体经TLC、MS、13C-NMR、1H-NMR、13C-1HCOSY、1H-1H COSY、比旋光度及熔点测定，并与20-(S)人参皂甙Rh2的文献数据核实，确认此白色晶体为20-(S)人参皂甙Rh2。20-(S)人参皂甙Rh2制剂的实施例：制剂的实施例1：取10g 20(S)-人参皂甙Rh2加可溶性淀粉适量，混匀，制粒，装入胶囊，制成每粒含20(S)-人参皂甙Rh250mg的胶囊200粒。制剂的实施例2：20ml溶射用蒸馏水，加入吐温-80适量，再加入20mg 20(S)-人参皂甙Rh2，加热溶解，过滤、分装、灭菌，制成每ml含1mg20(S)-人参皂甙Rh2的注射液5支。制剂的实施例3：250ml注射用蒸馏水，加入适量吐温-80，再加入100mg 20(S)-人参皂甙Rh2，加热溶解、过滤、灭菌，制成静脉点滴用20(S)-人参皂甙Rh2注射液。制剂的实施例4：取10g 20(S)-人参皂甙Rh2、加环磷酰胺400mg及可溶性淀粉适量，混匀，制粒，装入胶囊，制成每粒含20(S)-人参皂甙Rh250mg、环磷酰胺2mg的胶囊200粒。
Claims (5)
1.一种以20(S)-人参皂甙Rh2为有效成分，用于增强抗癌药物疗效，降低抗癌药物毒性、预防和治疗放化疗引起的白细胞降低及增强机体免疫功能的药物。
2.根据权利要求1所述的药物是20(S)-人参皂甙Rh2和药学上可接受的载体或辅料组成的药物组合物。
3.根据权利要求1所述的药物，是由20(S)-人参皂甙Rh2和其它抗癌药物以及药学上可接受的载体或辅料组成的药物组合物。
4.根据权利要求3所述的药物组合物，其中抗癌药物选自环磷酰胺、5-氟尿嘧啶、阿霉素、紫杉醇及顺铂中的一种或多种。
5. 20(S)-人参皂甙Rh2在制备具有增强抗癌药物疗效，降低抗癌药物毒性、预防和治疗放化疗引起的白细胞降低及增强机体免疫功能作用的药物组合物中的用途。
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN 02146552 Pending CN1415304A (zh) | 2002-10-22 | 2002-10-22 | 一种以20(S)－人参皂甙Rh2为有效成分的抗癌辅助药物及应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN1415304A (zh) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103961385A (zh) * | 2013-01-29 | 2014-08-06 | 北京国士堂健康科技股份有限公司 | 一种药物组合物及其用途 |
| CN104127457A (zh) * | 2014-07-25 | 2014-11-05 | 天津圣炻焊接辅助材料有限公司 | 一种抗癌组合物及其制备方法 |
-
2002
- 2002-10-22 CN CN 02146552 patent/CN1415304A/zh active Pending
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103961385A (zh) * | 2013-01-29 | 2014-08-06 | 北京国士堂健康科技股份有限公司 | 一种药物组合物及其用途 |
| CN104127457A (zh) * | 2014-07-25 | 2014-11-05 | 天津圣炻焊接辅助材料有限公司 | 一种抗癌组合物及其制备方法 |
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