CN106550945B

CN106550945B - 人参皂苷混合物及其在作为双向端粒调节剂中的应用

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Publication number: CN106550945B
Application number: CN201610949388.9A
Authority: CN
Inventors: 黄璐琦; 袁媛; 纪瑞锋; 刘娟; 张迎春; 陈同
Original assignee: Institute of Materia Medica of CAMS
Current assignee: Institute of Materia Medica of CAMS
Priority date: 2016-10-26
Filing date: 2016-10-26
Publication date: 2019-03-22
Anticipated expiration: 2036-10-26
Also published as: CN106550945A

Abstract

本发明公开了一种人参皂苷混合物及其在作为双向端粒调节剂中的应用。本发明提供了一种人参皂苷混合物B，由人参皂苷Rb1、人参皂苷Rd和人参皂苷Rb3组成，所述人参皂苷Rb1、人参皂苷Rd和人参皂苷Rb3的质量配比为1‑3∶2‑3∶1‑2。本发明还提供了一种人参皂苷混合物A，由人参皂苷Rg1、人参皂苷Re和人参皂苷Rh2组成，所述人参皂苷Rg1、人参皂苷Re和人参皂苷Rh2质量配比为2‑3∶1‑3∶1‑3。人参皂苷作混合物A作为端粒延长剂，人参皂苷混合物B作为端粒缩短剂，两者共同使用可以有效维持植物端粒长度及研究植物寿命调控。本发明对于新型端粒调节剂的开发及植物寿命调控的研究有重要意义。

Description

人参皂苷混合物及其在作为双向端粒调节剂中的应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种人参皂苷混合物及其在作为双向端粒调节剂中的应用。

背景技术

在植物生长发育过程中，组织器官分化程度越高，端粒长度越短，同时端粒中DNA序列的长度也是植物衰老与寿命的分子标记，所以端粒长度的维持对于植物长寿具有很大意义。端粒DNA序列是非结构基因，不具有编码蛋白质的功能。端粒位于真核生物线性染色体末端，类似一个“帽子”样的特殊结构，对保持染色体的完整性、稳定性和控制细胞分裂周期具有重要意义。

端粒主要由端粒DNA和端粒相关蛋白组成，端粒DNA是由简单的DNA高度重复序列组成，端粒酶可用于给端粒DNA加尾，DNA分子每次分裂复制，端粒就会缩短一点，因此端粒长度反映细胞复制史及复制潜能。前人有对银杏、狐尾松、油松等木本植物端粒长度与树龄关系的报道研究，但有关植物端粒长度维持方面的研究很少，尤其中药有效成分是否对端粒长度维持具有作用鲜有报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种人参皂苷混合物及其在作为双向端粒调节剂中的应用。

本发明提供一种人参皂苷混合物B，由人参皂苷Rb1、人参皂苷Rd和人参皂苷Rb3组成，所述人参皂苷Rb1、人参皂苷Rd和人参皂苷Rb3的质量配比为1-3∶2-3∶1-2。

所述人参皂苷Rb1、人参皂苷Rd和人参皂苷Rb3的质量配比具体可为1∶2∶2。

所述人参皂苷Rb1、人参皂苷Rd和人参皂苷Rb3的质量配比具体可为3∶3∶1。

所述人参皂苷混合物B的用途为如下(a1)-(a6)中的任一种：

(a1)调节端粒长度；

(a2)缩短端粒长度；

(a3)制备端粒调节剂；

(a4)制备端粒缩短剂；

(a5)调控植物寿命；

(a6)缩短植物寿命。

本发明还保护所述人参皂苷混合物B的应用，为如下(a1)-(a6)中的任一种：

(a1)调节端粒长度；

(a2)缩短端粒长度；

(a3)制备端粒调节剂；

(a4)制备端粒缩短剂；

(a5)调控植物寿命；

(a6)缩短植物寿命。

本发明还保护一种产品，其活性成分为人参皂苷混合物B，所述产品的用途为缩短端粒长度。

本发明还保护一种人参皂苷混合物A，由人参皂苷Rg1、人参皂苷Re和人参皂苷Rh2组成，所述人参皂苷Rg1、人参皂苷Re和人参皂苷Rh2质量配比为2-3∶1-3∶1-3。

所述人参皂苷Rg1、人参皂苷Re和人参皂苷Rh2质量配比具体可为3∶3∶1。

所述人参皂苷Rg1、人参皂苷Re和人参皂苷Rh2质量配比具体可为2∶1∶3。

所述人参皂苷混合物A的用途为如下(b1)-(b6)中的任一种：

(b1)调节端粒长度；

(b2)延长端粒长度；

(b3)制备端粒调节剂；

(b4)制备端粒延长剂；

(b5)调控植物寿命；

(b6)延长植物寿命。

本发明还保护所述人参皂苷混合物A的应用，为如下(b1)-(b6)中的任一种：

(b1)调节端粒长度；

(b2)延长端粒长度；

(b3)制备端粒调节剂；

(b4)制备端粒延长剂；

(b5)调控植物寿命；

(b6)延长植物寿命。

本发明还保护一种产品，其活性成分为人参皂苷混合物A，所述产品的用途为延长端粒长度。

本发明还保护一种人参皂苷组合物，包括人参皂苷混合物B和人参皂苷混合物A。

所述人参皂苷组合物的用途为如下(c1)-(c4)中的任一种：

(c1)调节端粒长度；

(c2)维持端粒长度；

(c3)调控植物寿命；

(c4)研究植物寿命调控模型的新型诱导子。

本发明还保护所述人参皂苷组合物的应用，为如下(c1)-(c4)中的任一种：

(c1)调节端粒长度；

(c2)维持端粒长度；

(c3)调控植物寿命；

(c4)研究植物寿命调控模型的新型诱导子。

以上任一所述端粒具体可为植物端粒。

本发明还保护一种缩短植物端粒长度的方法，包括如下步骤：使用人参皂苷混合物B处理植物。

所述方法中，所述人参皂苷混合物B的使用浓度为5-200μg/mL。

所述人参皂苷混合物B的使用浓度具体可为5μg/mL。

所述人参皂苷混合物B的使用浓度具体可为50μg/mL。

所述人参皂苷混合物B的使用浓度具体可为200μg/mL。

本发明还保护一种延长植物端粒长度的方法，包括如下步骤：使用人参皂苷混合物A处理植物。

所述人参皂苷混合物A的使用浓度可为5-200μg/mL。

所述人参皂苷混合物A的使用浓度具体可为5μg/mL。

所述人参皂苷混合物A的使用浓度具体可为50μg/mL。

所述人参皂苷混合物A的使用浓度具体可为200μg/mL。

使用时，以上任一所述人参皂苷混合物A或人参皂苷混合物B可采用50％(体积百分比)乙醇水溶液进行溶解。

以上任一所述植物为双子叶植物或单子叶植物。所述双子叶植物可为伞形目植物。所述伞形目植物可为五加科植物。所述五加科植物可为人参族植物。所述人参族植物可为人参属植物。所述人参属植物具体可为人参。

本发明公开了人参皂苷混合物及其在作为双向端粒调节剂中的应用，利用人参皂苷混合物达到调控植物寿命的目的。人参皂苷作混合物A作为端粒延长剂，可以浓度性地延长植物细胞系寿命，降低细胞突变的几率；人参皂苷混合物B作为端粒缩短剂，可以浓度性地缩短植物细胞系寿命；两者共同使用可以有效维持植物端粒长度及研究植物寿命调控模型的新型诱导子。本发明对于新型端粒调节剂的开发及植物寿命调控的研究有重要意义。

附图说明

图1为实施例2中各组人参悬浮细胞相对端粒长度分析结果。

图2为实施例3中各组人参悬浮细胞相对端粒长度分析结果。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。以下实施例中的人参皂苷混合物A、人参皂苷混合物B及人参皂苷单体均采用50％(体积百分比)乙醇水溶液溶解。

人参皂苷Rg1的分子式为C₄₂H₇₂O₁₄，结构式如下：

人参皂苷Re的分子式为C₄₈H₈₂O₁₈，结构式如下：

人参皂苷Rh2的分子式为C₃₆H₆₂O₈，结构式如下：

人参皂苷Rb1的分子式为C₅₄H₉₂0₂₃，结构式如下：

人参皂苷Rd的分子式为C₄₈H₈₂O₁₈，结构式如下：

人参皂苷Rb3的分子式为C₅₃H₉₀O₂₂，结构式如下：

人参皂苷Rg1：上海融禾生物科技有限公司，CAS号：22427-39-0。

人参皂苷Re：上海融禾生物科技有限公司，CAS号：51542-56-4。

人参皂苷Rh2：上海融禾生物科技有限公司，CAS号：78214-33-2。

人参皂苷Rb1：上海融禾生物科技有限公司，CAS号：41753-43-9。

人参皂苷Rd：上海融禾生物科技有限公司，CAS号：52705-93-8。

人参皂苷Rb3：上海融禾生物科技有限公司，CAS号：68406-26-8。

人参：参考文献：张儒，张变玲，谢涛，等.响应面法优化人参不定根中总皂苷的提取工艺[J].天然产物研究与开发，2015(4)：726-731.；公众可以从中国中医科学院中药研究所获得。

实施例1、人参皂苷混合物的制备

一、人参皂苷混合物A的制备

1、将人参皂苷Rg1、人参皂苷Re和人参皂苷Rh2按照3∶3∶1的质量比混合，得到人参皂苷混合物A1。

2、将人参皂苷Rg1、人参皂苷Re和人参皂苷Rh2按照2∶1∶3的质量比混合，得到人参皂苷混合物A2。

二、人参皂苷混合物B的制备

1、将人参皂苷Rb1、人参皂苷Rd、人参皂苷Rb3按照1∶2∶2的质量比混合，得到人参皂苷混合物B1。

2、将人参皂苷Rb1、人参皂苷Rd、人参皂苷Rb3按照3∶3∶1的质量比混合，得到人参皂苷混合物B2。

实施例2、人参皂苷混合物A在延长人参悬浮细胞端粒长度中的应用

一、人参悬浮细胞的培养

1、将人参主根接种于愈伤组织诱导培养基(MS+2.0mg·L^-1NAA+1.0mg·L^-16-BA)中(26±1)℃暗条件下培养30天，继代3次后，选择生长旺盛、质地疏松的愈伤组织。

2、将步骤1得到的愈伤组织接种于液体培养基(MS+0.5mg·L^-1KT+1.0mg·L^-12，4-D)，转速100r·min^-1、(26±1)℃、暗培养15天，获得体系均一稳定、细胞活力良好的人参悬浮细胞。

二、人参皂苷混合物A处理人参悬浮细胞

实验组I：向步骤一继代培养一周的100mL人参悬浮细胞培养液中加入实施例1制备的人参皂苷混合物A1，人参皂苷混合物A1在培养体系中的浓度为5μg/mL。

实验组II：向步骤一继代培养一周的100mL人参悬浮细胞培养液中加入实施例1制备的人参皂苷混合物A1，人参皂苷混合物A1在培养体系中的浓度为50μg/mL。

实验组III：向步骤一继代培养一周的100mL人参悬浮细胞培养液中加入实施例1制备的人参皂苷混合物A1，人参皂苷混合物A1在培养体系中的浓度为200μg/mL。

实验组IV：向步骤一继代培养一周的100mL人参悬浮细胞培养液中加入实施例1制备的人参皂苷混合物A2，人参皂苷混合物A2在培养体系中的浓度为5μg/mL。

实验组V：向步骤一继代培养一周的100mL人参悬浮细胞培养液中加入实施例1制备的人参皂苷混合物A2，人参皂苷混合物A2在培养体系中的浓度为50μg/mL。

实验组VI：向步骤一继代培养一周的100mL人参悬浮细胞培养液中加入实施例1制备的人参皂苷混合物A2，人参皂苷混合物A2在培养体系中的浓度为200μg/mL。

对照组：正常培养步骤一继代培养一周的人参悬浮细胞。

以上各组100mL人身悬浮细胞培养液中的悬浮细胞浓度为6×10⁴-8×10⁴个/mL。

上述各组在100r·min^-1、(26±1)℃、黑暗条件下培养7天，然后用布氏漏斗滤去培养液，并用去离子水洗净，收集细胞，液氮速冻，于-80℃保存。

三、人参悬浮细胞端粒长度的检测

1、取步骤二收集的各组人参悬浮细胞样品，提取DNA。

2、以步骤1得到的DNA为模板，进行qRT-PCR反应；

端粒引物PgTel-FP：5′-GGTTTTGAGGGATGTGGGATGTGGGATGTGGGATGTGGGAT-3′；

端粒引物PgTel-RP：5′-TCCCGACTAATCCCTATTCCCTAATCCCTAATCCCTAATCCCAA-3′；

单拷贝基因引物PgPGK1-FP：5′-CGAGAAACTGGTGGCTGG-3′；

单拷贝基因引物PgPGK1-RP：5′-TCACGCCCTCAGTGGAAG-3′；

qRT-PCR反应体系为(端粒)：2×SYBR Green mix 10μL，PgTe1-FP(10μ mol·L^-1)0.2μL，PgTel-RP(10μ mol·L^-1)0.6μL，ROX 0.4μL，模板DNA(40ng)1μL，DNase-free H₂O7.8μL。

qRT-PCR反应体系为(单拷贝基因)：2×SYBR Green mix 10μL，PgPGK1-FP(10μmol·L^-1)0.2μL，PgPGK1-RP(10μ mol·L^-1)0.6μL，ROX 0.4μL，模板DNA(40ng)1μL，DNase-free H₂O7.8μL。

qRT-PCR反应条件为(端粒)：95℃30s；95℃5s，54℃34s，72℃30s，25个循环；72℃5min。

qRT-PCR反应条件为(单拷贝基因)：95℃30s；95℃5s，58℃34s，40个循环。

根据Ct值计算得到相对表达量。端粒相对长度与相对表达量一致。

结果如图1所示。结果表明，加入人参皂苷混合物A1或人参皂苷混合物A2，可显著性的延长人参悬浮细胞的端粒长度，各浓度组的人参悬浮细胞的端粒相对长度在1.8-4.2之间。

3、分别采用等浓度的人参皂苷Re或人参皂苷Rg1或人参皂苷Rh2替代人参皂苷混合物A1，按照步骤二、三进行实验和检测。结果表明，单独加入等浓度的人参皂苷Re或人参皂苷Rg1或人参皂苷Rh2，人参悬浮细胞的端粒相对长度在各浓度组均低于2，加入人参皂苷混合物A1或人参皂苷混合物A2较单独加入等浓度的人参皂苷Re或人参皂苷Rg1或人参皂苷Rh2，人参悬浮细胞的端粒长度的增加具有明显优势。

实施例3、人参皂苷混合物B在缩短人参悬浮细胞端粒长度中的应用

一、人参皂苷混合物B处理人参悬浮细胞

实验组I：向实施例2步骤一继代培养一周的人参悬浮细胞中加入实施例1制备的人参皂苷混合物B1，人参皂苷混合物B1在培养体系中的浓度为5μg/mL。

实验组II：向实施例2步骤一继代培养一周的人参悬浮细胞中加入实施例1制备的人参皂苷混合物B1，人参皂苷混合物B1在培养体系中的浓度为50μg/mL。

实验组III：向实施例2步骤一继代培养一周的人参悬浮细胞中加入实施例1制备的人参皂苷混合物B1，人参皂苷混合物B1在培养体系中的浓度为200μg/mL。

实验组IV：向实施例2步骤一继代培养一周的人参悬浮细胞中加入实施例1制备的人参皂苷混合物B2，人参皂苷混合物B2在培养体系中的浓度为5μg/mL。

实验组V：向实施例2步骤一继代培养一周的人参悬浮细胞中加入实施例1制备的人参皂苷混合物B2，人参皂苷混合物B2在培养体系中的浓度为50μg/mL的。

实验组VI：向实施例2步骤一继代培养一周的人参悬浮细胞中加入实施例1制备的人参皂苷混合物B2，人参皂苷混合物B2在培养体系中的浓度为200μg/mL的。

对照组：正常培养步骤一继代培养一周的人参悬浮细胞。

将经过各实验组和对照组处理的人参悬浮细胞在100r·min^-1、(26±1)℃、黑暗条件下培养一天后，用布氏漏斗滤去培养液，并用去离子水洗净，收集细胞，液氮速冻，于-80℃保存。

二、人参悬浮细胞端粒长度的检测

1、取步骤二收集的各组人参悬浮细胞样品，提取DNA。

2、按照实施例2步骤三中的方法进行qRT-PCR反应。

结果如图2所示。结果表明，加入人参皂苷混合物B1或人参皂苷混合物B2，可显著性的缩短人参悬浮细胞的端粒长度。

3、分别采用等浓度的人参皂苷Rb1或人参皂苷Rd或人参皂苷Rb3替代人参皂苷混合物B1，按照步骤一、二进行实验和检测。结果表明，加入等浓度的人参皂苷Re或人参皂苷Rb3，人参悬浮细胞的端粒长度与对照相比无显著性差异，加入5μg/mL或200μg/mL的人参皂苷Rb1，人参悬浮细胞的端粒长度与对照相比无显著性差异，加入50g/mL的人参皂苷Rb1，人参悬浮细胞的端粒长度与对照相比显著升高。

Claims

1.一种人参皂苷混合物B，由人参皂苷Rb1、人参皂苷Rd和人参皂苷Rb3组成，所述人参皂苷Rb1、人参皂苷Rd和人参皂苷Rb3的质量配比为1-3:2-3:1-2。

2.权利要求1所述人参皂苷混合物B的应用，为如下（a1）或（a2）：

（a1）缩短端粒长度；

（a2）制备端粒缩短剂。

3.一种可以缩短端粒长度的产品，其活性成分为权利要求1所述的人参皂苷混合物B，所述产品的用途为缩短端粒长度。

4.一种人参皂苷混合物A，由人参皂苷Rg1、人参皂苷Re和人参皂苷Rh2组成，所述人参皂苷Rg1、人参皂苷Re和人参皂苷Rh2质量配比为2-3:1-3:1-3。

5.权利要求4所述人参皂苷混合物A的应用，为如下（b1）或（b2）：

（b1）延长端粒长度；

（b2）制备端粒延长剂。

6.一种可以延长端粒长度的产品，其活性成分为权利要求4所述的人参皂苷混合物A，所述产品的用途为延长端粒长度。

7.一种人参皂苷组合物，包括权利要求1所述的人参皂苷混合物B和权利要求4所述的人参皂苷混合物A。

8.权利要求7所述人参皂苷组合物的应用，为如下（c1）或（c2）：

（c1）调节端粒长度；

（c2）维持端粒长度。

9.一种缩短植物端粒长度的方法，包括如下步骤：使用权利要求1所述的人参皂苷混合物B处理植物；所述植物为人参；所述人参皂苷混合物B的使用浓度为5-200μg/mL。

10.一种延长植物端粒长度的方法，包括如下步骤：使用权利要求4所述的人参皂苷混合物A处理植物；所述植物为人参；所述人参皂苷混合物A的使用浓度为5-200μg/mL。