CN113186205B - 丹参CYP76AK5v2的基因克隆引物、表达载体、催化功能及应用 - Google Patents

丹参CYP76AK5v2的基因克隆引物、表达载体、催化功能及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了丹参中一条反向调控丹参酮合成的细胞色素P450基因CYP76AK5v2的编码基因序列；本发明所提供的CYP76AK5v2基因具有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，所述基因编码蛋白质具有SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。本发明检测了CYP76AK5v2在丹参组织中的表达情况，发现其在丹参根和根周皮高丰度表达；构建了CYP76AK5v2‑RNAi载体及CYP76AK5v2‑过表达(CYP76AK5v2‑oe)载体，通过发根农杆菌介导的丹参遗传转化获得转基因毛状根阳性株系；化学检测分析发现，在CYP76AK5v2‑RNAi株系中，丹参酮类化合物含量升高，而在CYP76AK5v2‑oe株系中，丹参酮类化合物含量显著降低。本发明提供的CYP76AK5v2具有反调控丹参酮类化合物生物合成的功能，可能参与丹参酮生物合成途径的竞争途径。本研究有助于解析植物次生代谢途径分子机制，为丹参酮的合成生物学研究奠定基础。

Description

丹参CYP76AK5v2的基因克隆引物、表达载体、催化功能及应用
技术领域
本发明属于植物分子生物学及基因工程领域，具体涉及一种反向调控丹参酮生物合成的CYP76AK5v2基因克隆和功能研究。
背景技术
丹参(Salvia miltiorrhiza Bunge)，为双子叶植物唇形科鼠尾草属多年生直立草本植物，根和根茎入药，是一种传统的具有重要药用价值和经济价值的药用植物。药理学研究表明，丹参具有扩张冠脉、抗氧化、抗动脉粥样硬化、抗心律失常、清除自由基和保护心肌、改善微循环和血液流变、抗肿瘤、抗炎、抗菌等药理作用。丹参的有效成分主要为脂溶性的丹参酮类(包括多种菲醌类物质)和水溶性丹酚酸类(多为多聚酚酸类成分)。目前，已有40余种丹参酮类化合物从丹参中分离出来，其中主要包括二氢丹参酮I、隐丹参酮、丹参酮I和丹参酮IIA等。以丹参为主要成分的“复方丹参滴丸”在治疗心脑血管疾病方面已取得显著疗效。丹参基因组小、染色体数目少、世代周期短、组织培养技术以及遗传转化体系成熟，使得丹参成为理想的药用模式植物。
CYP450是含有亚铁血红素的一类酶，在细胞中主要分布在内质网和线粒体内膜上，作为一种末端加氧酶，参与多种生物化学途径，产生初级和次级代谢物，如苯丙类、生物碱、萜类、脂类等。基因组测序研究揭示了植物基因组中存在大量的CYP450基因，到目前为止，已有多个植物基因组中的CYP450基因家族的基因序列存储在GenBank中。CYP450是植物基因组中最大的基因超家族之一，也是参与植物次生代谢途径最大的氧化酶超家族，具有复杂的底物选择性和催化活性。
近年来，对CYP450的结构、功能特别是对其在次生代谢途径中的功能研究取得较大进展。在丹参中，已经鉴定到三个CYP450参与丹参酮生物合成途径：CYP76AH1能够催化次丹参酮二烯合成铁锈醇(ferruginol)；CYP76AH3催化铁锈醇可以同时合成11-羟基铁锈醇(11-hydorx ferruginol)、柳杉酚(sugiol)和11-羟基柳杉酚(11-hydorxy sugiol)；CYP76AK1可分别羟基化11-羟基铁锈醇和11-羟基柳杉酚的C20位点生成11，20-二羟基铁锈醇(11，20-hydorx ferruginol)及11，20-二羟基柳杉酚(11，20-hydorxy sugiol)。据推测的丹参酮合成途径，仍会有其他CYP450参与丹参酮生物合成过程。
发明内容
本发明的目的在于提供一种反向调控丹参酮生物合成的细胞色素P450基因CYP76AK5v2的基因及其编码的蛋白质。
本发明提供的CYP76AK5v2基因，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
本发明提供的CYP76AK5v2基因编码的蛋白质，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
本发明设计出了扩增CYP76AK5v2基因特异性片段的引物，其碱基序列如SEQ IDNO.3和SEQ ID NO.4所示。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：基于丹参全基因组及不同丹参器官/组织转录组差异表达分析筛选出可能调控丹参酮合成的CYP450基因CYP76AK5v2的编码基因。
利用实时荧光定量PCR技术检测CYP76AK5v2基因在丹参不同组织、器官中的表达谱。
构建一种含有CYP76AK5v2基因特异性片段的正向和反向序列的植物RNAi双元表达载体。
构建一种含有CYP76AK5v2基因全长序列的植物过表达双元表达载体。
本发明通过发根农杆菌侵染丹参叶片，获得CYP76AK5v2-RNAi(RNAi)阳性毛状根及CYP76AK5v2-oe(过表达)阳性毛状根。
本发明利用化学检测方法发现丹参酮类化合物的含量在CYP76AK5v2-RNAi转基因毛状根阳性株系中升高，在CYP76AK5v2-oe转基因毛状根阳性株系中丹参酮类化合物的含量显著降低。本发明提供的CYP76AK5v2具有反向调控丹参酮生物合成的作用，这为提高丹参酮的产量提供了崭新的思路。
附图说明
图1所示CYP76AK5v2基因在丹参不同器官(A)和不同组织(B)中的表达谱，显示其在丹参的根和根的周皮部显著高表达。(R：根；S：茎；L：叶；F：花；R1：周皮；R2：韧皮部；R3：木质部)。
图2所示为CYP76AK5v2在CYP76AK5v2-RNAi转基因毛状根中表达量降低(A)及在CYP76AK5v2-oe转基因毛状根中表达量上升(B)。
图3所示为丹参转基因毛状根在液体培养基中震荡培养五个月后的形态。
图4所示为UPLC分析CYP76AK5v2-RNAi转基因毛状根和对照株系中丹参酮类化合物的含量变化。A.二氢丹参酮I(DT-1)；B.隐丹参酮(CT)；C.丹参酮I(T-I)；D.丹参酮IIA(T-IIA)。
图5所示为UPLC分析CYP76AK5v2-oe转基因毛状根和对照株系中丹参酮类化合物的含量变化。A.二氢丹参酮I(DT-1)；B.隐丹参酮(CT)；C.丹参酮I(T-I)；D.丹参酮IIA(T-IIA)。
具体实施方式
以下结合实例详细说明本发明。实施是为更好的理解本发明，但不限定于本发明。以下实施方法中的实验方法均为常规方法，所涉及的实验试剂均为常规生化试剂。
实施例1 丹参CYP76AK5v2基因的克隆
采用RNAprep Pure Plant Kit(TIANGEN，China)试剂盒提取RNA，经PrimeScriptTMII lst Strand cDNA Synthesis Kit(Takara，Japan)试剂盒合成cDNA；基于丹参基因组数据，根据CYP76AK5v2基因序列的开放阅读框设计基因全长扩增引物，F：5-ATGCAAGTTTACATTCT TCTCTCG-3′，R：5′-TTAAAGCTTGATAGGAATAGCCCAA-3′。使用PyrobestDNA Polymerase(Takara，Japan)聚合酶克隆CYP76AK5v2全长基因，利用1％琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，回收扩增产物的目的片段后连接pEASY-Blunt Zero克隆载体并测序。PCR扩增得到CYP76AK5v2基因的核苷酸序列，长度为1503bp，序列如SEQ ID No.1。将核苷酸序列翻译后推导出CYP76AK5v2的氨基酸序列，包含500个氨基酸残基，序列如SEQ ID No.2。
实施例2 丹参CYP76AK5v2的组织表达特异性检测
采集2年生丹参99-3株系的不同器官(根、茎、叶、花)及根不同组织(周皮、韧皮部、木质部)的样品后，分别提取RNA，经逆转录获得cDNA，以此cDNA为模板，利用实时荧光定量PCR方法，扩增程序为：95℃ 30s；40个循环：95℃ 5s，60℃ 34s；使用ABI 7500real-timePCR基因表达定量检测系统，以丹参管家基因Actin(HM231319.1)作为内参基因，采用2-ΔΔCt方法计算基因的相对表达量。结果如图1所示：发现CYP76AK5v2在丹参根和根的周皮部显著高丰度表达。
实施例3 丹参CYP76AK5v2转基因毛状根的获得和基因表达量检测
1)RNAi引物设计及PCR扩增。挑选CYP76AK5v2基因中一段长为167bp的特异性片段作为RNAi目标区域(位于基因的794-960bp)，对目标区域设计引物(CYP76AK5v2-RNAi F/R)，根据Gateway系统使用原理，在引物的5′端添加attB序列。过表达引物(CYP76AK5v2-oeF/R)在CYP76AK5v2基因的全长引物的5′端添加attB序列。引物序列如下表。
Figure BSA0000200136710000041
2)构建CYP76AK5v2-RNAi载体和CYP76AK5v2-过表达载体。BP反应：在PCR反应管中加入25ng attB-PCR回收产物，75ng pDONR221入门载体，1μL BP clonase II enzyme，补充ddH2O至5μL；轻轻混匀后，于25℃孵育1小时以上；再加入0.5μL的蛋白激酶K，混匀后37℃孵育10min；转入DH5α感受态细胞，用含50mg/L卡那霉素(Kan)抗性的LB固体培养基筛选培养，再对经抗性筛选获得的单克隆进行PCR检测。LR反应：在PCR反应管中加入75ng pDONR221-RNAi/oe回收产物，75ng pK7GWIWG2D(II)/pK7WG2D受体载体(pDONR221-RNAi回收产物连接pK7GWIWG2D(II)载体，pDONR221-oe回收产物连接pK7WG2D载体)，1μL LR clonase IIenzyme，补充ddH2O至5μL；轻轻混匀后，于25℃温育1小时以上；再加入0.5μL的蛋白激酶K，混匀后37℃孵育10min；转入DH5α感受态细胞，用含50mg/L壮观霉素(Spec)抗性的LB固体培养基筛选培养，经PCR检测后将阳性克隆送公司测序；测序正确的克隆提取重组质粒pK7GWIWG2D(II)/pK7WG2D-CYP76AK5v2，转入发根农杆菌ACCC10060中。
3)农杆菌ACCC10060侵染丹参叶片。用转入pK7GWIWG2D(II)/pK7WG2D空载体的发根农杆菌作为对照菌株，同时侵染丹参叶片。选取生长旺盛的丹参组培无菌苗，取其幼嫩叶片，剪成0.5cm2的叶盘，置于MS培养基平板上25℃预培养2-3天；用50mg/L Spec+50mg/LRif的液体YEB培养基分别培养含重组质粒(pK7GWIWG2D(II)-/pK7WG2D-CYP76AK5v2)和空载体(pK7GWIWG2D(II)/pK7WG2D)的发根农杆菌ACCC10060菌株，28℃震荡培至OD600达到0.4-0.6；将菌液离心，富集菌体后用等体积的MS液体培养基重悬菌体(MS-plasmid)，将预培养的叶盘置于MS-plasmid中，浸泡10min后用无菌滤纸吸去多余菌液，置于MS平板上，25℃黑暗条件下共培养48-72h；将共培养的叶盘分别用无菌水和含于500mg/L羧苄青霉素(Car)的无菌水中浸泡10min，用滤纸吸去多余水分后置于含500mg/L Car+50mg/L Kan的MS平板上，25℃黑暗条件下筛选培养，每10天更换一次培养基。选择长势良好的毛状根，待其长至2.0-3.0cm后切下并转置于含200mg/L Car+15mg/L Kan+0.1mg/L IAA的6，7-V平板上刺激一周后转入不含IAA的平板上，长出较多侧根后，利用荧光显微镜检测GFP的表达情况判断转基因的毛状根是否为阳性株系。将阳性株系移至6，7-V液体培养基中，120rpm，25℃黑暗条件下扩大培养。
4)毛状根在液体培养基中置于摇床培养1个月后，取适量毛状根提取RNA，利用实时荧光定量PCR方法检测CYP76AK5v2-RNAi(AK5i-2、AK5i-7、AK5i-10)和CYP76AK5v2-oe(AK5oe-1、AK5oe-4、AK5oe-5)转基因阳性株系中基因表达量，如图2所示。与RNAi对照株系(pki)(基因相对表达量定为“1”)相比，株系AK5i-2、AK5i-7、AK5i-10中基因的相对表达量分别为对照株系中基因表达量的0.12、0.55、0.24；与过表达对照株系(pkoe)(基因相对表达量定为“1”)相比，株系AK5oe-1、AK5oe-4、AK5oe-5中基因的相对表达量分别为对照株系中基因表达量的9.98、215.84、53.13倍。
实施例4 UPLC检测转基因毛状根中丹参酮类化合物含量
本发明采用UPLC技术对丹参转基因毛状根进行化学成分检测，步骤如下：
1)样品前处理：毛状根在液体培养基中经摇床震荡培养5个月后取出拍照，如图3所示。将毛状根烘干后称重，使用球磨仪打粉，每100mg毛状根用0.5ml甲醇提取，提取物超声处理30min，8,000g离心10min，用0.22μm尼龙过滤器将上清过滤至棕色液相小瓶中，待进样。
2)UPLC条件：采用ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱(2.1×100mm，1.7μm；Waters)；检测波长：255nm；柱温：25℃；流速：0.25mL/min；进样量：2μL。流动相：甲醇(A)-水(B)，梯度洗脱条件为：20-60％A(0-5min)，60-70％A(5-20min)，70-80％A(20-25min)，80-100％A(25-26min)，100％A(26-30min)；CYP76AK5v2-RNAi转基因株系及CYP76AK5v2-oe转基因株系中4种丹参酮类化合物的含量测定结果分别如图4、图5所示。
本发明首次基于丹参全基因组筛选并克隆了CYP76AK5v2基因，验证发现CYP76AK5v2具有反向调控丹参酮生物合成的功能，为提高丹参酮产量和进行丹参分子辅助育种等研究奠定基础。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出对于技术领域普通人员来说在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些也应视为在本发明的保护范围。
Figure ISA0000200136730000011
Figure ISA0000200136730000021
Figure ISA0000200136730000031
Figure ISA0000200136730000041
Figure ISA0000200136730000051
Figure ISA0000200136730000061

Claims (2)

1.一种植物RNAi双元表达载体在提高丹参酮类化合物含量中的应用，其特征在于，所述RNAi双元表达载体含有CYP76AK5v2特异性片段的正向和反向序列以及特异性片段的引物序列；所述特异性片段为SEQ ID No.1所示的794-960bp；所述引物序列如SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示；所述丹参酮类化合物为二氢丹参酮I、隐丹参酮、丹参酮I和丹参酮IIA。
2.细胞色素P450基因CYP76AK5v2在植物基因工程中的应用，其特征在于，CYP76AK5v2在细菌、真菌和高等植物中通过基因工程手段调控丹参酮类化合物的生物合成；所述CYP76AK5v2的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；所述植物为丹参。
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丹参酮合成相关的候选基因CYP76AK5克隆及生物信息学分析;浦香东等;《中国现代中药》;20170816(第08期);摘要、第1107-1108页第2节和第1109页右栏第3-4段 *

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