CN112143742B - 丹参细胞色素p450基因cyp72a395的基因克隆引物、表达载体、催化功能及应用 - Google Patents

丹参细胞色素p450基因cyp72a395的基因克隆引物、表达载体、催化功能及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了丹参中一条反向调控丹参酮合成的细胞色素P450基因CYP72A395的编码基因序列；本发明所提供的CYP72A395基因具有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，所述基因编码蛋白质具有SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。本发明检测了CYP72A395的转录表达谱，发现其在丹参花和根周皮高丰度表达；构建了CYP72A395‑RNAi载体及CYP72A395‑过表达(CYP72A395‑oe)载体，通过发根农杆菌介导的丹参遗传转化获得转基因毛状根阳性株系；化学检测分析发现，在CYP72A395‑RNAi株系中，丹参酮类化合物含量升高，而在CYP72A395‑oe株系中，丹参酮类化合物含量显著降低。本发明提供的CYP72A395具有负调控丹参酮类化合物生物合成的功能，可能参与丹参酮生物合成途径的竞争途径。本研究为提高丹参中丹参酮产量提供了新思路，并为丹参酮合成生物学研究奠定基础。

Description

丹参细胞色素P450基因CYP72A395的基因克隆引物、表达载 体、催化功能及应用
技术领域
本发明属于植物分子生物学及基因工程领域，具体涉及一种反向调控丹参酮生物合成的CYP72A395的基因克隆和功能研究。
背景技术
丹参(Salvia miltiorrhiza Bunge)，为唇形科鼠尾草属多年生双子叶植物，根和根茎入药。丹参主要有效成分包括脂溶性的丹参酮类成分和水溶性的丹酚酸类成分。目前，已有40余种丹参酮类化合物从丹参中分离出来，其中主要包括二氢丹参酮I、隐丹参酮、丹参酮I和丹参酮IIA等化合物，它们具有抗氧化、扩张血管、抗血栓、抗菌消炎以及抗肿瘤等多种药理作用，在制药、美容以及化妆品等领域得到广泛应用。随着人们生活水平的提高，心脑血管疾病的发病率逐年增长，因此，含有丹参的药品的临床需求量日益增大，通过对丹参酮合成调控机制的研究，对于利用基因工程手段提高丹参中丹参酮的含量具有重要意义。
细胞色素P450(Cytochrome P450，CYP450)在生物界中广泛存在，是一种血红蛋白结合蛋白，具有单加氧酶活性。CYP450是含有亚铁血红素的一类酶，约占植物蛋白编码基因的1％，是参与植物次生代谢活动最多的一类的氧化酶超基因家族，具有复杂的底物选择性和催化活性。CYP450可催化多种类型的反应，主要包括羟基化、脱烷基化、环氧基化、脱硫、脱卤、脱氢作用等。随着分子生物学以及相关技术的不断发展，CYP450在次生代谢途径中的功能正在逐步得以验证。近年来，利用异源表达和RNA干扰等技术相继在人参、黄花蒿和长春花等多种药用植物中鉴定出参与次生代谢途径的CYP450。
在丹参酮生物合成途径中，目前只鉴定了三个参与丹参酮类化合物结构修饰的CYP450基因CYP76AH1、CYP76AH3和CYP76AK1，仍有若干参与丹参酮合成的CYP450基因有待于鉴定。
发明内容
本发明的目的在于提供一种反向调控丹参酮生物合成的细胞色素P450基因CYP72A395的基因及其编码的蛋白质。
本发明提供的CYP72A395基因，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
本发明提供的CYP72A395基因编码的蛋白质，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
本发明设计出了扩增CYP72A395基因特异性片段的引物，其碱基序列如SEQ IDNO.3和SEQ ID NO.4所示。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：基于丹参全基因组及不同丹参器官/组织转录组差异表达分析筛选出可能调控丹参酮合成的CYP450基因CYP72A395的编码基因。
利用实时荧光定量PCR技术检测CYP72A395基因在丹参不同组织、器官中的表达谱。
构建一种含有CYP72A395基因特异性片段的正向和反向序列的植物RNAi双元表达载体
构建一种含有CYP72A395基因全长序列的植物过表达双元表达载体。
本发明通过发根农杆菌侵染丹参叶片，获得CYP72A395-RNAi(RNAi)阳性毛状根及CYP72A395-oe(过表达)阳性毛状根。
本发明利用化学检测方法发现丹参酮类化合物的含量在CYP72A395-RNAi转基因毛状根阳性株系中升高，在CYP72A395-oe转基因毛状根阳性株系中丹参酮类化合物的含量显著降低。本发明提供的CYP72A395具有反向调控丹参酮生物合成的作用，这为提高丹参酮的产量提供了崭新的思路。
附图说明
图1所示CYP72A395基因在丹参不同组织/器官(R：根S：茎L：叶F：花R1：周皮R2：韧皮部R3：木质部)中的表达谱，其在丹参的花和根的周皮部显著高表达。
图2所示为CYP72A395在CYP72A395-RNAi转基因毛状根中表达量降低(A)及在CYP72A395-oe转基因毛状根中表达量上升(B)。
图3所示为丹参转基因毛状根在液体培养基中摇床培养五个月后的形态。
图4所示为UPLC分析CYP72A395-RNAi转基因毛状根(A)及CYP72A395-oe转基因毛状根(B)中二氢丹参酮I(DT-1)、隐丹参酮(CT)、丹参酮I(D-I)和丹参酮IIA(T-IIA)的含量。
具体实施方式
以下结合实例详细说明本发明。实施是为更好的理解本发明，但不限定于本发明。以下实施方法中的实验方法均为常规方法，所涉及的实验试剂均为常规生化试剂。
实施例1丹参CYP72A395基因的克隆
采用RNAprep Pure Plant Kit(TIANGEN，China)试剂盒提取RNA，经PrimeScriptTMII 1st Strand cDNA Synthesis Kit(Takara，Japan)试剂盒合成cDNA；基于丹参基因组数据，根据CYP72A395基因序列的开放阅读框设计基因全长扩增引物，F：5′-ATGGCGGTGGAATACCAAATT-3′，R：5′-CTAGAGCTTGTGCAAGGTAAGG-3′。使用Pyrobest DNAPolymerase(Takara，Japan)聚合酶克隆CYP72A395全长基因，利用1％琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，回收扩增产物的目的片段后连接pEASY-Blunt Zero克隆载体测序。PCR扩增得到CYP72A395基因的核苷酸序列，长度为1551bp，序列如SEQ ID No.1。将核苷酸序列翻译后推导出CYP72A395的氨基酸序列，包含516个氨基酸残基，序列如SEQ ID No.2。
实施例2丹参CYP72A395的组织表达特异性检测
采集2年生丹参99-3株系的不同器官(根、茎、叶、花)及根不同组织(周皮、韧皮部、木质部)的样品后，分别提取RNA，经逆转录获得cDNA，以此cDNA为模板，利用实时荧光定量PCR方法，扩增程序为：95℃30s；40个循环：95℃5s，60℃34s；使用ABI 7500 real-time PCR基因表达定量检测系统，以丹参管家基因Actin作为内参基因，采用2-ΔΔCt方法计算基因的相对表达量。结果如图1所示：发现CYP72A395在丹参花和根的周皮部显著高丰度表达。
实施例3丹参CYP72A395转基因毛状根的获得和基因表达量检测
1)RNAi引物设计及PCR扩增。挑选CYP72A395基因中一段长为145bp的特异性片段作为RNAi目标区域(位于基因的208-352bp)，对目标区域设计引物(CYP72A395-RNAiF/R)，根据Gateway使用原理，在引物的5′端添加attB序列。过表达引物(CYP72A395-oeF/R)在CYP72A395基因的全长引物的5′端添加attB序列。引物序列如下表。
Figure BSA0000185186480000031
Figure BSA0000185186480000041
2)构建CYP72A395-RNAi载体和CYP72A395-过表达载体。BP反应：在PCR反应管中加入25ng attB-PCR回收产物，75ng pDONR221入门载体，1μL BP clonase II enzyme，补充ddH2O至5μL；轻轻混匀后，于25℃孵育1小时以上；再加入0.5μL的蛋白激酶K，混匀后37℃孵育10min；转入DH5α感受态细胞，用含50mg/L Kan(卡那霉素)抗性的LB固体培养基筛选培养，再对克隆利用PCR进行检测。LR反应：在PCR反应管中加入75ng pDONR221-RNAi/oe回收产物，75ng pK7GWIWG2D(II)/pK7WG2D受体载体(pDONR221-RNAi回收产物连接pK7GWIWG2D(II)载体，pDONR221-oe回收产物连接pK7WG2D载体)，1μL LR clonase II enzyme，补充ddH2O至5μL；轻轻混匀后，于25℃温育1小时以上；再加入0.5μL的蛋白激酶K，混匀后37℃孵育10min；转入DH5α感受态细胞，用含50mg/L Spec(壮观霉素)抗性的LB固体培养基筛选培养，经PCR检测后将阳性克隆送测；测序正确的克隆提取重组质粒pK7GWIWG2D(II)/pK7WG2D-CYP72A395，转入发根农杆菌ACCC10060中。
3)农杆菌ACCC10060侵染丹参叶片。用转入pK7GWIWG2D(II)/pK7WG2D载体的发根农杆菌作为对照菌株，同时侵染丹参叶片。选取生长旺盛的丹参组培苗，取其幼嫩叶片，剪成0.5cm2的叶盘，置于MS培养基平板上25℃预培养2-3天；用50mg/L Spec+50mg/L Rif的液体YEB培养基分别培养含重组质粒(pK7GWIWG2D(II)/pK7WG2D-CYP72A395)和空载体(pK7GWIWG2D(II)/pK7WG2D)的发根农杆菌ACCC10060菌株，28℃摇培至OD600达到0.4-0.6；将菌液离心，富集菌体后用等体积的MS液体培养基重悬菌体(MS-plasmid)，将预培养的叶盘置于MS-plasmid中，浸泡10min后用无菌滤纸吸去多余菌液，置于MS平板上，25℃黑暗条件下共培养48-72h；将共培养的叶盘分别用无菌水和含于500mg/L Car(羧苄青霉素)的无菌水中浸泡10min，用滤纸吸去多余水分后置于含500mg/L Car+50mg/L Kan的MS平板上，25℃黑暗条件下筛选培养，每10天更换一次培养基。选择长势良好的毛状根，待其长至2.0-3.0cm后切下，置于含200mg/L Car+15mg/L Kan+0.1mg/L IAA的6，7-V平板上刺激一周后转入不含IAA的平板上，长出较多侧根后，利用荧光显微镜检测GFP的表达情况判断转基因的毛状根是否为阳性株系。将阳性株系移至6，7-V液体培养基中，120rpm，25℃黑暗条件下扩大培养。
4)毛状根液体摇床培养1个月后，提取RNA，利用实时荧光定量PCR方法检测CYP72A395-RNAi(395i-3、395i-4)和CYP72A395-oe(395oe-1、395oe-2、395oe-5)转基因阳性株系中基因表达量，如图2所示。与RNAi对照株系(pki)相比，株系395i-3、395i-4中基因的抑制率分别为0.87、0.25；与过表达对照株系(pkoe)相比，株系395oe-1、395oe-2、395oe-5中基因的过表达倍数分别为3.80、2.84、8.51。
实施例4 UPLC检测转基因毛状根中丹参酮类化合物含量
本发明采用UPLC技术对丹参转基因毛状根进行化学成分检测，步骤如下：
1)样品前处理：毛状根在液体培养基中摇床培养5个月后取出拍照，如图3所示。将毛状根烘干后称重，使用球磨仪打粉，每100mg毛状根用0.5ml甲醇提取，提取物超声处理30min，8,000g离心10min，用0.22μm尼龙过滤器将上清过滤至棕色液相小瓶中，待进样；
2)UPLC条件：采用ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱(2.1×100mm，1.7μm；Waters)；检测波长，255nm；柱温，25℃；流速，0.25mL/min；进样量，2μL，流动相：甲醇(A)-水(B)，梯度洗脱条件为20-60％A(0-5min)，60-70％A(5-20min)，70-80％A(20-25min)，80-100％A(25-26min)，100％A(26-30min)；CYP72A395-RNAi转基因株系及CYP72A395-oe转基因株系中4种丹参酮类化合物的含量测定结果如图4A、4B所示。
本发明首次基于丹参全基因组筛选并克隆CYP72A395基因，验证发现CYP72A395具有反向调控丹参酮生物合成的功能，为提高丹参酮产量和利用合成生物学解决丹参资源紧张问题奠定基础。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出对于技术领域普通人员来说在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些也应视为在本发明的保护范围。
Figure ISA0000185186500000011
Figure ISA0000185186500000021
Figure ISA0000185186500000031
Figure ISA0000185186500000041
Figure ISA0000185186500000051

Claims (4)

1.一种反向调控丹参酮生物合成的细胞色素P450基因CYP72A395的编码基因，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
2.权利要求1所述的反向调控丹参酮生物合成的细胞色素P450基因CYP72A395编码的蛋白质，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
3.一种植物RNAi双元表达载体，其特征在于，所述RNAi双元表达载体含有CYP72A395特异性片段的正向序列和反向序列，通过将CYP72A395特异性片段以正反两个方向插入pK7GWIWG2D(II)载体中构建而成；所述CYP72A395特异性片段的核苷酸序列为SEQ ID No.1的208-352bp所示的核苷酸序列。
4.权利要求3所述的植物RNAi双元表达载体在调控丹参中的丹参酮类化合物的生物合成中的应用。
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