CN105147844B - 一种具有抗胃癌作用的组合物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种具有抗胃癌作用的组合物及其应用，该组合物由5‑氟尿嘧啶和中药组合物组成，中药组合物由熟大黄，水蛭，炒蛴螬，桃仁，黄芩，白芍，土鳖虫，虻虫，煅干漆，炒苦杏仁，地黄和甘草组成。本发明立足祖国医药学方剂配伍理论，在大量实验研究基础上，筛选出组份配比科学合理的中药组合物，本发明提供的组合物可促进胃癌细胞凋亡，抑制AGS的DNA合成阶段，并可能通过影响caspase3发挥杀伤细胞作用，诱导细胞产生iNOS而促进细胞损伤，中药组合物与5‑FU组合后具有很好的协同增效的作用，抗胃癌活性更强，不良反应更低，两者组合后，具有比单用5‑氟尿嘧啶更高的药物安全性。

Description

一种具有抗胃癌作用的组合物及其应用

技术领域

本发明涉及一种药物，具体设计一种具有抗胃癌作用的组合物及其该组合物在制备抗胃癌药物中的应用。

背景技术

5-氟尿嘧啶为合成的抗代谢药，并在临床上是目前应用最广的抗嘧啶类药物，对消化道癌及其它实体瘤有良好疗效，在肿瘤内科治疗中占有重要地位。5-氟尿嘧啶经过酶转化为5-氟脱氧尿嘧啶核苷酸而具有抗肿瘤活性。5-FU通过抑制胸腺嘧啶核苷酸合成酶而抑制DNA的合成。此酶的作用可能把甲酰四氢叶酸的一碳单位转移给脱氧尿嘧啶核苷-磷酸合成胸腺嘧啶核苷一酸。5-FU对RNA的合成也有一定抑制作用。临床对多种肿瘤，如消化道肿瘤、乳腺癌、卵巢癌、绒毛膜上皮癌、子宫颈癌、肝癌、膀胱癌、皮肤癌均有较好的疗效。

但是5-氟尿嘧啶在临床使用过程中具有一定的副作用，如骨髓抑制，白细胞减少、血小板下降，另外还有食欲不振、恶心、呕吐、口腔炎、胃炎、腹痛及腹泻等胃肠道反应。这些副作用在一定程度上限制了其临床应用。

因此，很有必要在现有技术的基础之上研究开发出一种组份配比科学合理，抗肿瘤效果更好，并且不良反应更低的抗肿瘤组合物。

发明内容

发明目的：本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种抗肿瘤活性更强，并且不良反应更低的抗肿瘤组合物。

技术方案：为了实现以上目的，本发明采取的技术方案为：

一种具有抗胃癌作用的组合物，它由下列重量份数的原料制成：

5-氟尿嘧啶0.1～1份，中药组合物提取物1～500份；

所述的中药组合物由熟大黄300～600g，水蛭60～120g，炒蛴螬45～90g，桃仁120～240g，黄芩60～120g，白芍120～240g，土鳖虫30～60g，虻虫45～90g，煅干漆30～60g，炒苦杏仁120～240g，地黄300～600g，甘草90～180g制成。

作为优选方案，以上所述的具有抗胃癌作用的组合物，它由下列重量份数的原料制成：5-氟尿嘧啶1份，中药组合物提取物15～500份；

所述的中药组合物由熟大黄300～600g，水蛭60～120g，炒蛴螬45～90g，桃仁～90120g，黄芩60～120g，白芍120～240g，土鳖虫30～60g，虻虫45～90g，煅干漆30～60g，炒苦杏仁120～240g，地黄300～600g，甘草90～180g制成。

以上所述的具有抗胃癌作用的组合物，所述的中药组合物提取物为中药组合物的水提取物、醇提取物或水提醇沉物。

其中中药组合物的水提取物为将中药组合物原料熟大黄300g，水蛭(制)60g，蛴螬(炒)45g，桃仁120g，黄芩60g，白芍120g，土鳖虫(炒)30g，虻虫(去翅足，炒)45g，干漆(煅)30g，炒苦杏仁120g，地黄300g，甘草90g，粉碎成细粉，过筛，混匀，每100g粉末用炼蜜80～100g制成小蜜丸或大蜜丸，使用时用超纯水充分溶解，4℃过夜，过滤除菌，4℃保存待用。

其中中药组合物的醇提取物为中药组合物的细粉加入8～20倍体积量的乙醇，采用回流，超声，浸渍或渗滤提取1～3次，每次1～3小时，浓缩得到提取物。

其中中药组合物的水提醇沉物，可以是中药组合物水提后，用浓度为30～95％乙醇沉淀后得到的精制物；作为其它优选方案，本发明所述的中药组合物提取物也可以为水提醇沉后，上大孔吸附树脂柱，用水、低浓度到高浓度的乙醇依次洗脱，取浓度为30至85％浓度乙醇的洗脱物，得到去除杂质的中药组合物精制提取物。

作为优选方案，以上所述的具有抗胃癌作用的组合物，将5-氟尿嘧啶和中药组合物的提取物和药学上可接受的载体，如稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、润滑剂等制备成注射液、粉针剂、胶囊剂、片剂、颗粒剂或丸剂的药物。

本发明提供的具有抗肿瘤活性的组合物制成片剂时，把组合物和载体乳糖或玉米淀粉，需要时加入润滑剂硬脂酸镁，混合均匀，然后压片制成片剂。

本发明提供的组合物制成胶囊剂时把组合物和载体乳糖或玉米淀粉混合均匀，整粒，然后装胶囊制成胶囊剂。

本发明提供的组合物制成颗粒剂时，把组合物和稀释剂乳糖或玉米淀粉混合均匀，整粒，干燥，制成颗粒剂。

本发明提供的组合物制成注射液时，取组合物加入增溶剂，搅拌均匀，80℃加热30分钟，过滤，调节PH值，用垂熔玻璃漏斗或其它滤器过滤至澄明，灌装，在100至115℃灭菌30分钟制成注射液。

本发明所述的具有抗胃癌作用的组合物在制备抗胃癌药物中的应用。

有益效果：本发明提供的5-氟尿嘧啶和中药组合物提取物的组合物和现有技术相比具有以下优点：

本发明立足祖国医药学方剂配伍理论，在大量实验研究基础上，筛选出组份配比科学合理的中药组合物，本研究发现中药组合物可促进胃癌(AGS)细胞凋亡，抑制AGS的DNA合成阶段，并可能通过影响caspase3发挥杀伤细胞作用，诱导细胞产生iNOS而促进细胞损伤，与5-FU组合后具有很好的协同作用，抗胃癌活性更强，不良反应更低，两者组合后，具有比单用5-氟尿嘧啶更高的药物安全性，是一种很有应用前景的化学药物和中药复方的组合物，对临床用药具有重要的指导作用。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐明本发明，应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等价形式的修改均落于本申请所附权利要求所限定的范围。

实施例1

一种具有抗胃癌作用的组合物，它由下列重量份数的原料制成：

5-氟尿嘧啶0.0195份，中药组合物水提取物10份。

中药组合物水提取物的制备方法为：取熟大黄300g，水蛭(制)60g，蛴螬(炒)45g，桃仁120g，黄芩60g，白芍120g，土鳖虫(炒)30g，虻虫(去翅足，炒)45g，干漆(煅)30g，炒苦杏仁120g，地黄300g，甘草90g，粉碎成细粉，过筛，混匀，每100g粉末用炼蜜80～100g制成小蜜丸或大蜜丸，使用时用超纯水充分溶解，4℃过夜，过滤除菌，4℃保存待用。

实施例2

一种具有抗胃癌作用的组合物，它由下列重量份数的原料制成：

5-氟尿嘧啶0.0195份，中药组合物水提取物5份。

中药组合物水提取物的制备方法为：取熟大黄300g，水蛭(制)60g，蛴螬(炒)45g，桃仁120g，黄芩60g，白芍120g，土鳖虫(炒)30g，虻虫(去翅足，炒)45g，干漆(煅)30g，炒苦杏仁120g，地黄300g，甘草90g，粉碎成细粉，过筛，混匀，每100g粉末用炼蜜80～100g制成小蜜丸或大蜜丸，使用时用超纯水充分溶解，4℃过夜，过滤除菌，4℃保存待用。

实施例3

5-氟尿嘧啶0.0195份，中药组合物水提取物2.5份。

中药组合物水提取物的制备方法为：取熟大黄300g，水蛭(制)60g，蛴螬(炒)45g，桃仁120g，黄芩60g，白芍120g，土鳖虫(炒)30g，虻虫(去翅足，炒)45g，干漆(煅)30g，炒苦杏仁120g，地黄300g，甘草90g，粉碎成细粉，过筛，混匀，每100g粉末用炼蜜80～100g制成小蜜丸或大蜜丸，使用时用超纯水充分溶解，4℃过夜，过滤除菌，4℃保存待用。

实施例4

一种具有抗胃癌作用的组合物，它由下列重量份数的原料制成：

5-氟尿嘧啶0.0195份，中药组合物水提取物1.25份。

中药组合物水提取物的制备方法为：取熟大黄300g，水蛭(制)60g，蛴螬(炒)45g，桃仁120g，黄芩60g，白芍120g，土鳖虫(炒)30g，虻虫(去翅足，炒)45g，干漆(煅)30g，炒苦杏仁120g，地黄300g，甘草90g，粉碎成细粉，过筛，混匀，每100g粉末用炼蜜80～100g制成小蜜丸或大蜜丸，使用时用超纯水充分溶解，4℃过夜，过滤除菌，4℃保存待用。

实施例5

一种具有抗胃癌作用的组合物，它由下列重量份数的原料制成：

5-氟尿嘧啶0.0195份，中药组合物水提取物0.625份。

中药组合物醇提取物的制备方法为：取熟大黄300g，水蛭(制)60g，蛴螬(炒)45g，桃仁120g，黄芩60g，白芍120g，土鳖虫(炒)30g，虻虫(去翅足，炒)45g，干漆(煅)30g，炒苦杏仁120g，地黄300g，甘草90g，粉碎加乙醇回流提取1～3次，每次1～2小时，合并提取液，浓缩得乙醇提取物。

实施例6中药组合物抗胃癌活性实验

1.实验方法

1.1 细胞培养及传代

将胃癌(AGS)细胞按1×10⁶个接种至25cm²培养瓶，使用含10％胎牛血清F12K培养基，于5％二氧化碳细胞培养箱37℃培养48～72h。待细胞长至80％满时，用0.25％胰酶消化传代进行试验。

1.2 CCK8检测细胞抑制率

将AGS细胞按0.8×10⁵个/孔接种至96孔板，37℃培养24h，弃去培养基，加入不同种类的药物，每浓度4复孔。实验设空白对照组，5-FU阳性对照组，中药组合物水提液组(DHZ组)，中药组合物水提液与5-FU混合药物组(HH组)。空白对照组：使用无血清培养基；5-FU阳性对照组药物浓度0.0195mg/mL；中药组合物组药物浓度为10、5、2.5、1.25、0.625、0.3125mg/mL；中药组合物与5-FU混合药物组(其中中药组合物药物浓度10、5、2.5、1.25、0.625、0.3125mg/mL，5-FU浓度0.0195mg/mL)。各组培养24h、48h后加入cck8试剂10μL/孔，37℃反应3h，450nm波长检测各孔吸光度值(A)。

按公式计算细胞抑制率：抑制率＝[(A_{空白对照组}-A_实验孔)/A_{空白对照组}-A_本底)]×100％。

1.3 流式细胞术检测细胞周期

AGS细胞按1×10⁶个细胞/孔接种于6孔板，培养24h后，弃去培养基，加入不同种类的药物，每浓度3复孔。空白对照组，5-FU阳性对照组同1.2；中药组合物水提液组药物浓度为5、2.5、1.25mg/mL，混合药物组中药组合物水提液药物浓度5、2.5、1.25mg/mL，5-FU浓度0.0195mg/mL。作用24h后，胰酶消化收集细胞制备成细胞悬液，1000r/min离心5min，弃上清，PBS洗2次，加入70％冷乙醇1mL 4℃固定过夜，按碧云天细胞周期与细胞凋亡检测试剂盒操作，1000r/min离心5min，弃上清，用4℃预冷PBS洗2次，加入PI染色30min。400目过筛，流式细胞仪检测细胞周期。

1.4 Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术检测细胞凋亡

AGS细胞按1.3方法接种及加药作用24h，每浓度3复孔。胰酶消化收集细胞，1000r/min离心5min，弃上清，按Annexin V-FITC/PI双染试剂盒流程操作，PBS和染色缓冲液各洗细胞1次，Annexin V室温染色15min，染色缓冲液洗细胞1次，1000r/min离心5min，弃上清，加200μL染色缓冲液重悬细胞，再加入5μL的PI染液染色30min，流式细胞仪检测细胞凋亡情况。实验重复2次。

1.5 Hoechst染色观察细胞凋亡

AGS细胞按1.3方法接种及加药作用24h，每浓度3复孔。PBS洗涤细胞1次，固定液固定30min，PBS洗2次，加入Hoechst 33258染色液染色5分钟，PBS洗2次，加抗荧光淬灭封片液，荧光显微镜350nm激发波长下观察细胞。

1.6 NO及NOS检测

AGS细胞按1.3方法接种及加药作用24h，每浓度3复孔。取细胞上清液，3000r/min4℃离心5min，吸取上清分别按照一氧化氮(NO)测试盒、一氧化氮合酶(NOS)测定试剂盒检测各组NO及NOS。

1.7 caspase3检测

细胞按1.3方法接种及加药作用24h，每浓度3复孔。胰酶消化收集细胞，1000r/min离心5min，弃上清，PBS洗涤细胞1次，裂解液冰浴裂解细胞15min，16000r/min 4℃离心15min，取上清分别按Bradford法试剂盒说明测定样品蛋白含量，按Caspase 3活性检测试剂盒流程测定各组样品中Caspase 3催化产生的pNA量。计算样品单位重量蛋白中所含的Caspase 3的酶活力单位＝pNA量/蛋白含量。

1.8 统计方法

应用SPSS16.0软件进行统计学分析，实验结果以表示，组间比较采用两样本单因素方差分析(one-wayANOVA)，P<0.05表示结果具有统计学意义。

2.结果

2.1中药组合物水提液对AGS细胞抑制率的作用

药物作用24h后混合药物组(HH组)中药组合物水提液浓度为0.3125～10mg/mL时均能明显抑制AGS细胞生长(P<0.01)，并且其细胞抑制率均高于5-FU组。药物作用48h后，浓度为5、10mg/mL中药组合物水提液明显抑制AGS细胞生长(P<0.01)；混合药物各浓度组均明显抑制AGS细胞生长(P<0.01)，且浓度为0.625～10mg/mL水提液与5-FU混合作用时抑制AGS细胞生长效果明显强于5-FU组(P<0.05)。详细结果见表1。

表1中药组合物水提液对AGS细胞作用(n＝4)

注：与空白对照组比较，^#P<0.05，^##P<0.01；与5-FU阳性药组比较，^*P<0.05；^**P<0.01。

2.2中药组合物水提液对AGS细胞周期影响

分析实验结果发现，5-FU作用于AGS细胞后，其G0/G1期、G2期比例明显增高，S期细胞比例下降(P<0.01)，表明细胞可能因DNA合成受到抑制而被阻滞于G0/G1和G2期。5～1.25mg/mL水提液浓度的DHZ组细胞G0/G1期细胞比例较空白对照组明显增高(P<0.01)，且具有随药物浓度升高而增加的趋势；DHZ组S期细胞比例较对空白照组出现随药物浓度增高而明显下降的趋势(P<0.01)，表明中药组合物水提液可能作用于细胞DNA合成阶段而抑制AGS增殖。5～1.25mg/mL水提液浓度的HH组细胞G0/G1期细胞比例不仅明显高于空白对照组(P<0.01)，亦高过5-FU组(P<0.01)；相应的其S期细胞比例显著低于空白对照组及5-FU组(P<0.01)，表明中药组合物水提液和5-FU可能具有协同作用，抑制细胞增殖活性。详细结果见表2。

表2中药组合物水提液对AGS细胞周期的影响(n＝3)

注：与空白对照组比较，^#P<0.05，^##P<0.01；与5-FU阳性药组比较，^*P<0.05；^**P<0.01。

2.3流式细胞术检测中药组合物水提液对AGS细胞凋亡影响

流式细胞仪检测结果表明，药物作用24h后，1.25～5mg/mL浓度中药组合物水提液可促进AGS细胞发生早期凋亡，但无统计学意义；但中药组合物水提液浓度为1.25～5mg/mL的HH组细胞凋亡率均高于空白对照组，其中水提液浓度为5mg/mL的HH组细胞凋亡率较5-FU组和5mg/mL纯水提液组均显著增高(P<0.01)。流式细胞术结果见表3所示。

表3中药组合物水提液对AGS细胞凋亡影响(n＝3)

注：与空白对照组比较，^#P<0.05，^##P<0.01；与5-FU阳性药组比较，^*P<0.05；^**P<0.01。

2.4中药组合物水提液对AGS细胞的Hoechst染色观察

药物作用24h后，采用Hoechst染色，荧光显微镜放大400倍观察AGS细胞形态。结果表明：空白对照组细胞核为类椭圆形，大小比较均匀；5-FU组、浓度5mg/mL的DHZ组和水提液浓度5mg/mL的HH组可见贴壁细胞数量减少，且较正常细胞组相比出现细胞核体积缩小比例增高。

2.5中药组合物水提液对AGS细胞产生NO及NOS的影响

实验表明，5-FU组、DHZ组和HH组与空白对照组相比可促进细胞释放NO，但均无统计学意义。各实验组作用于AGS细胞24h后所产生的TNOS与空白对照组相比无明显变化，但1.25～5mg/mL的DHZ组及水提液浓度1.25～5mg/mL的HH组iNOS含量却显著增加(P<0.05)，并且均较5-FU组iNOS水平升高(P<0.05)。结果见表4。

表4中药组合物水提液对AGS细胞产生NO和NOS的影响(n＝3)

注：与空白对照组比较，^#P<0.05，^##P<0.01；与5-FU阳性药组比较，^*P<0.05；^**P<0.01。

2.6中药组合物水提液对AGS细胞产生caspase3酶活性的影响

实验显示，药物作用24h，5-FU处理组和1.25～5mg/mLDHZ组可促进AGS细胞产生caspase3酶活性单位，并且随药物浓度增高而下降，HH组对AGS细胞caspase3酶活性单位则无明显影响。

通过以上研究表明，5-氟尿嘧啶与本发明提供的中药组合物科学组合后，可明显抑制AGS细胞生长，可加强抑制AGS细胞增殖的效果，中药组合物与5-FU配伍后具有协同抗肿瘤的功效，临床疗效更好，不良反应更低，安全性更好。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理和构思的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (3)

1.一种具有抗胃癌作用的组合物，其特征在于，它由下列重量份数的原料制成：5-氟尿嘧啶1份，中药组合物的水提取物15～500份；

所述的中药组合物由熟大黄300～600g，水蛭60～120g，炒蛴螬45～90g，桃仁～90120g，黄芩60～120g，白芍120～240g，土鳖虫30～60g，虻虫45～90g，煅干漆30～60g，炒苦杏仁120～240g，地黄300～600g，甘草90～180g制成。

2.根据权利要求1所述的具有抗胃癌作用的组合物，其特征在于，将5-氟尿嘧啶和中药组合物的水提取物和药学上可接受的载体制备成注射液、胶囊剂、片剂、颗粒剂或丸剂的药物。

3.权利要求1所述的具有抗胃癌作用的组合物在制备抗胃癌药物中的应用。