CN104068398B - 一种具有增强免疫力功能的保健品及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种具有增强免疫力功能的保健品及其制备方法,该保健品是以蛹虫草为活性成分的蛹虫草口服液、蛹虫草片、蛹虫草胶囊或蛹虫草膏。本发明以蛹虫草为活性成分,并搭配合适的组份,从而得到具有显著的增强免疫力功能的蛹虫草口服液、蛹虫草片、蛹虫草胶囊或蛹虫草膏,且制备方法简单,成本低廉,适合用于日常的保健服用。
Description
技术领域
本发明涉及保健品技术领域,尤其涉及一种具有增强免疫力功能的保健品。
背景技术
蛹虫草,又名北冬虫夏草、北虫草等,是由子座(即草部分)与菌核(即虫的尸体部分)两部分组成的复合体,世界性分布天然资源数量很少。冬季幼虫蛰居土里,菌类寄生其中,吸取营养,幼虫体内充满菌丝而死;到了夏季,自幼虫尸体之上生出幼苗,形似草,夏至前后采集而得。中医认为,虫草入肺肾二经,既能补肺阴,又能补肾阳,主治肾虚、阳痿遗精、腰膝酸痛、病后虚弱、久咳虚弱、劳咳痰血和自汗盗汗等,是唯一的一种能同时平衡、调节阴阳的中药。
蛹虫草的化学成份:N6-[β-(乙酰胺甲酰)氧乙基]腺苷、虫草环肽A、核苷、麦角甾醇过氧化物。
现代科学论证蛹虫草不仅具有特殊的营养价值,而且有明显的药用价值。
北冬虫夏草中含有大量的虫草素,虫草素的特殊医疗保健功能已经引起国内外专家的高度重视,已有不少以虫草素为主的保健品、保健食品、化妆品、药品投放市场。据报道,在美国已将虫草素作为抗癌抗病毒新药进入临床试用。在中国也已将由虫草素合成的治疗白血病的新药进入期临床试用。北冬虫夏草的保健功能成分不仅有虫草素,还有虫草多糖是国际医学公认的人体免疫增强剂,中医认为其起扶正固本作用,对老年性慢性支气管炎、肺原性心脏病有显著疗效,能提高肝脏解毒能力,起护肝作用,提高身体抗病毒和抗辐射能力。虫草酸即D-甘露醇是治疗心脑血管疾病的基本药物,具有清除自由基、扩张血管、降低血压的作用。
人工培养的北冬虫夏草的纯子实体,作为食品用于人体,经研究是完全安全的,可广泛用于保健食品、保健膳食和其它滋补类食品。同时人工培育的北冬虫夏草子实体,色泽鲜艳、气味纯正、实用性强、商品价值高,适合多种不同的人群使用。北冬虫草子实体还可与一些中药配伍,对一些疾病有治疗作用。人工培育北冬虫夏草的过程中产生的培养基残基还可以酿制酱油的原料中添加5%~10%的培养基残基,所酿制的酱油口味纯正,营养丰富,具有浓郁的虫草香味。
发明内容
本发明的目的是提供一种以蛹虫草为主要活性成分的具有增强免疫力功能的保健品,具体是指以蛹虫草为主要活性成分的蛹虫草口服液、蛹虫草片、蛹虫草胶囊或蛹虫草膏。
本发明的另一个目的是提供上述蛹虫草口服液、蛹虫草片、蛹虫草胶囊或蛹虫草膏的制备方法。
本发明的上述目的是通过如下方案予以实现的:
一种具有增强免疫力功能的保健品,该保健品是以蛹虫草为主要活性成分的蛹虫草口服液、蛹虫草片、蛹虫草胶囊或蛹虫草膏。
上述蛹虫草口服液的配方,按总体积为1000ml计,具体如下所示:
蛹虫草 80g;
三氯蔗糖 0.2g;
余量为纯化水。
本发明人根据上述蛹虫草口服液的配方特点,针对性地设计了该口服液的制备方法,从而保证了其中活性成分——蛹虫草最大限度地释放活性物质,起到最好的保健效果,该制备方法包括如下步骤:
步骤1
将蛹虫草粉碎后,加入12倍量水,煮沸提取2次,每次2小时,2次提取液合并后用200目滤布过滤;
步骤2
将上述滤液进行减压浓缩,得浓缩液;所述减压浓缩的条件为:温度60℃,真空度0.08Mpa,至相对密度1.05~1.10;
步骤3
将上述浓缩液中加入三氯蔗糖和纯化水进行调配、定容至1000ml,然后板框过滤,取过滤液;所述板框过滤采用纤维素滤纸,滤纸规格为600×600mm;
步骤4
将上述过滤液采用本领域技术人员的常规操作进行灌封后,将灌封后的半成品进行灭菌处理,115℃灭菌30min,则制备得到所需蛹虫草口服液。
本发明还提供一种蛹虫草口服液,按总体积为1000ml计,该蛹虫草口服液的配方具体如下所示:
上述蛹虫草口服液的配方的优选方案如下所示(按总体积为1000ml计):
上述配方中的各原料均采用市售产品,即可实现本发明。
本发明人根据上述蛹虫草口服液的配方特点,针对性地设计了该口服液的制备方法,从而保证了其中活性成分——蛹虫草最大限度地释放活性物质,起到最好的保健效果,该制备方法包括如下步骤:
步骤1
将黄芪、枸杞子、灵芝、桑椹、茯苓、人参、大枣和蛹虫草分别用水洗净后,混合放入提取罐中,加入混合物8倍量的水,加热煮沸提取2小时后放出提取液,总共提取两次,并合并两次提取液后,将提取液用200目滤布过滤,收集滤液;
步骤2
将上述滤液进行浓缩处理,得浓缩液,备用;所述浓缩处理条件为控制真空度为0.04~0.06MPa,温度为60~80℃,将滤液浓缩至相对密度为1.10左右(60℃测);
步骤3
采用50%食用酒精(所述百分比为乙醇的体积百分比)对上述浓缩液进行醇沉处理,收集醇沉液,并将醇沉液中的酒精回收后,向醇沉液中加入纯化水(所述醇沉液也纯化水的体积比为1:3),水沉24h后,取上清液,将三氯蔗糖溶解于该上清液中,并加入纯化水定容至1000ml;将定溶液过滤后收集澄清滤液,115℃高压灭菌30min,则制备得到所需蛹虫草口服液。
本发明提供一种蛹虫草片,其配方是由如下重量份数的各组份组成:
上述蛹虫草片的优化配方是由如下重量份数的各组份组成:
上述配方中的各原料均采用市售产品,即可实现本发明。
本发明人根据上述蛹虫草片的配方特点,针对性地设计了该蛹虫草片的制备方法,从而保证了其中活性成分——蛹虫草最大限度地释放活性物质,起到最好的保健效果,该制备方法包括如下步骤:
步骤1
将蛹虫草清洗后,置于灭菌柜中,115℃灭菌30min;然后转入烘箱中,55~60℃干燥至水分<5.0%,粉碎,过80目筛,得到蛹虫草粉;
将薄膜包衣预混剂加纯化水配制成10%包衣液(所述百分比为质量百分比);
步骤2
将蛹虫草粉、山梨醇、麦芽糊精分别过80目筛后,投入混合机中,混合25min,然后加入45%乙醇(所述百分比为乙醇的体积百分比),边加边搅拌,制成软硬适中的软材;将该软材经14目筛网制粒,颗粒置于烘箱中,温度55~65℃,干燥至水分<3.0%;
步骤3
将干燥后的颗粒投入摇摆式颗粒机料斗中,过14目筛整粒;然后转入混合机中,加入硬脂酸镁,混合20min;混合后的颗粒用旋转式压片机压片,得到素片;
步骤4
将步骤3制备的素片加入高效包衣机内,设置转速为1~2r/min,预热至片床温度在40~45℃,提高转速至6~8r/min,喷入步骤1制备的10%包衣液进行包衣,则制备得到本发明所需蛹虫草片。
上述步骤2中,45%乙醇为加工助剂,在制备过程中会逐渐挥发掉,不会进入蛹虫草片的成分中。
上述蛹虫草片所用的薄膜包衣预混剂采用市售的薄膜包衣预混剂即可实现本发明,但本发明人为了进一步提高蛹虫草片的服用效果以及活性成分地释放效果,针对该蛹虫草片配方的优化方案专门设计了相应的薄膜包衣预混剂,该薄膜包衣预混剂的配方,按重量百分比计,是由如下组份组成:
上述配方中的各原料均采用市售产品,即可实现本发明。
本发明提供一种蛹虫草胶囊,该蛹虫草胶囊的内容物配方,是由如下重量份数的各组份组成:
蛹虫草 320份;
糊精 30份。
上述内容物可搭配药学上可接受的胶囊皮,通过本领域技术人员进行胶囊制备的常规方法,制备蛹虫草胶囊,均可实现本发明。
本发明提供一种蛹虫草膏,该蛹虫草膏的配方按总体积为1000ml计,具体如下所示:
上述蛹虫草膏的优化配方如下所示(按总体积为1000ml计):
上述配方中的各原料均采用市售产品,即可实现本发明。
本发明人根据上述蛹虫草膏的配方特点,针对性地设计了该蛹虫草膏的制备方法,从而保证了其中活性成分——蛹虫草最大限度地释放活性物质,起到最好的保健效果,该制备方法包括如下步骤:
步骤1
将黄芪、枸杞子、灵芝、桑椹、茯苓、人参、大枣、蛹虫草,用水分别洗净后混合置于提取罐中,加入8倍量的水,加热煮沸提取2小时放出提取液,渣再加8倍量水加热煮沸提取2小时放出提取液,渣弃去,合并二次提取液,并用200目滤布过滤,得滤液,备用;
步骤2
将滤液置于浓缩罐中,浓缩条件为真空度0.04~0.06MPa,温度为60~80℃,将滤液浓缩至相对密度为1.10左右(60℃测),得浓缩液,备用;
步骤3
将麦芽糖浆、白砂糖和水加热溶解成糖浆,将糖浆与浓缩液混合边加热边搅拌,并补充水至总体积为1000ml,得到膏液,将该膏液灌装后,移至高压灭菌锅中于115℃高压灭菌30min,制备得到所需蛹虫草膏。
本发明的蛹虫草口服液、蛹虫草片、蛹虫草胶囊或蛹虫草膏经性能测试,均具有显著的增强免疫力功能。
与现有技术相比,本发明具有如下有益效果:
1.本发明以蛹虫草为活性成分,通过考虑在充分发挥蛹虫草保健作用的基础上,搭配合适的组份,并对各组份的用量进行优化,从而得到具有很好增强免疫力功能的蛹虫草口服液、蛹虫草片、蛹虫草胶囊或蛹虫草膏;
2.本发明人针对各配方组份的不同,搭配合适的制备方法,从而能够保证配方中活性成分的充分释放,发挥很好的保健功能;
3.本发明制备方法简单,成本低廉,经检测产品的保健功能好,具有显著的增强免疫力功能的作用。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步地描述,但具体实施例并不对本发明做任何限定。
实施例1 蛹虫草口服液
本实施的蛹虫草口服液,其配方如下所示:
蛹虫草 80g;
三氯蔗糖 0.2g;
纯化水 加至1000ml。
本实施例蛹虫草口服液的制备方法,具体包括如下步骤:
(1)原料的准备:
将检验合格的蛹虫草从仓库领出,经粉碎机粉碎成粗粉,根据配方比例称取,放在提取车间备用;
(2)提取:
将蛹虫草投入提取罐中,加入12倍量水,煮沸提取2次,每次2小时;
(3)过滤:
提取液用200目滤布过滤;
(4)浓缩:
滤液进行减压浓缩,温度60℃,真空度0.08Mpa,至相对密度1.05~1.10;
(5)调配、定容:
浓缩液加入三氯蔗糖和纯化水进行调配、定容,然后板框过滤(纤维素滤纸:φ600×600mm);
(6)灌封:
玻璃瓶先用饮用水冲洗1遍,再用纯化水刷洗2遍,把水排空,150℃烘干;
瓶盖先用饮用水冲洗1遍,再用纯化水精洗2遍,80~85℃烘干;
口服液灌装要求全自动灌装封口,10ml/支或120ml/瓶,注意封口完好情况;
(7)灭菌:
将灌封后的半成品装入灭菌柜中,通入蒸汽,115℃灭菌30min;
(8)灯检:
在灯检台下,观看有无杂质、异物,有无漏液,液体是否澄明等,如有异常,必须挑出;
(9)包装:
每盒10支口服液(配吸管)或1瓶/盒;装箱,封口。
(10)检验:
检验微生物(菌落总数、大肠菌群、霉菌、酵母)、装量、可溶性固形物、PH值,检验合格方可入库。
本实施例的蛹虫草口服液,其标志性成分及含量为:每100ml含:腺苷3.0mg;其食用方法及食用量为每日1次,每次20ml;其规格为10ml/支。
实施例2 蛹虫草口服液
本实施例的蛹虫草口服液,其配方如下所示:
本实施例蛹虫草口服液的制备方法,具体包括如下步骤:
(1)检验:
检验黄芪、枸杞子、灵芝、桑椹、茯苓、人参、大枣、蛹虫草等药材是否合格;
(2)水提取:
取规定量的黄芪、枸杞子、灵芝、桑椹、茯苓、人参、大枣、蛹虫草,用水将其洗净后置于提取罐中,加入8倍量的水,加热煮沸提取2小时放出提取液,渣再加8倍量水加热煮沸提取2小时放出提取液,渣弃去,合并二次提取液,并用200目滤布过滤,得滤液,备用;
(3)减压浓缩
将滤液置于浓缩罐中,控制真空度为0.04~0.06MPa,温度为60~80℃,将滤液浓缩至相对密度为1.10左右(60℃测),得浓缩液,备用;
(4)醇沉:
取两倍浸膏量的50%食用酒精慢慢加入提取液中并加以搅拌,密封放置12小时后移取上清液,渣再加入倍量50%食用酒精,密封放置16小时后移取上清液,合并两次清液,得醇沉液;将醇沉液置于酒精回收塔中进行酒精回收;
(5)水沉:
将经过酒精回收后的膏液加入3倍量纯化水,水沉24h,取上清液;
(6)调配、定容:
称取规定量的三氯蔗糖溶解于水沉上清液中并加入适量纯化水定容至规定量;将定容好的液体用板框过滤器过滤,得澄清滤液;
(7)装瓶:
将玻璃瓶和盖子清净烘干。将过滤好的液体按照20ml的装量进行灌装;
(8)灭菌:
将灌装好的液体移至高压灭菌锅中于115℃高压灭菌30min,得半成品;
(9)包装:
对经灯检合格的半成品按照7支/盒进行包装,得最终的成品。
本实施例的蛹虫草口服液,其标志性成分及含量为:每100ml含:总皂苷60mg;粗多糖180mg;其食用方法及食用量为每日1次,每次1支;其规格为20ml/支。
实施例3 蛹虫草口服液
本实施例的蛹虫草口服液,其配方如下所示:
本实施例蛹虫草口服液的制备方法,同实施例2。
实施例4 蛹虫草口服液
本实施例的蛹虫草口服液,其配方如下所示:
本实施例蛹虫草口服液的制备方法,同实施例2。
实施例5 蛹虫草片
本实施例的一种蛹虫草片,其配方如下所示:
上述配方中,薄膜包衣预混剂的配方如下所示:
所述百分比为该成分占薄膜包衣预混剂配方总质量的质量百分比。
本实施例的蛹虫草片,其制备方法包括如下步骤:
(1)蛹虫草粉的制备
蛹虫草经清洗后,置于灭菌柜中,115℃灭菌30min;然后转入烘箱中,55~60℃干燥至水分<5.0%,粉碎,过80目筛,得到蛹虫草粉;
(2)物料准备:将蛹虫草粉、山梨糖醇、麦芽糊精、硬脂酸镁、薄膜包衣预混剂按照进入洁净区的程序,在缓冲间脱外包,内包装表面消毒后,立即转入洁净区;
(3)称量、备用:
将蛹虫草粉、山梨糖醇、麦芽糊精过80目筛后,按照计划生产量及配方比例,称取蛹虫草粉、山梨糖醇、麦芽糊精、硬脂酸镁、薄膜包衣预混剂,备用;
(4)混合、制软材:
将蛹虫草粉、山梨糖醇、麦芽糊精投入混合机中,混合25min,然后加入45%乙醇,边加边搅拌,制成软硬适中的软材;
(5)制粒、干燥:
用摇摆式制粒机装14目筛网制粒,颗粒置于烘箱中,温度55~65℃,干燥至水分<3.0%;
(6)整粒,总混:
将干燥后的颗粒投入摇摆式颗粒机料斗中,过14目筛整粒;然后转入混合机中,加入硬脂酸镁,混合20min;
(7)压片:
混合后的颗粒用旋转式压片机压片,0.78g/片;
(8)包衣:
薄膜包衣预混剂加纯化水配制成10%包衣液,将素片加入高效包衣机内,设置转速为1~2r/min,预热至片床温度在40~45℃,提高转速至6~8r/min,喷入包衣液进行包衣至规定要求;
(9)分装:
内包材选用符合YBB00122002质量标准的高密度聚乙烯瓶,每瓶装60片;
外包材选用符合GB6543质量标准的瓦楞纸箱,装箱,封装。
本实施例的蛹虫草片,其标志性成分及含量为:每100ml含:腺苷30mg;其食用方法及食用量为口服,每日2次,每次2片;其规格为800mg/片。
实施例6 蛹虫草片
本实施例的一种蛹虫草片,其配方如下所示:
该蛹虫草片的薄膜包衣预混剂配方,及制备方法,均同实施例5。
实施例7 蛹虫草片
本实施例的一种蛹虫草片,其配方如下所示:
该蛹虫草片的薄膜包衣预混剂配方,及制备方法,均同实施例5。
实施例8 蛹虫草胶囊
本实施例的一种蛹虫草胶囊,其内容物配方如下所示:
蛹虫草 320g;
糊精 30g。
本实施例蛹虫草胶囊的制备方法如下所示:
(1)将检验合格的蛹虫草、麦芽糊精按照进入洁净区的程序,在缓冲间脱外包,表面消毒后进入洁净车间;
(2)先将蛹虫草快速清洗,沥干,置于热压灭菌柜中115℃灭菌30min,取出,转入烘箱中,55~65℃干燥至水分<5%,然后粉碎,过80目筛,备用;
(3)将蛹虫草粉和麦芽糊精投入混合机中混合25min,加入45%乙醇制软材,用摇摆式制粒机装14目筛制粒;
(4)干燥、整粒:
颗粒经60℃干燥至水分<3%,摇摆式颗粒剂装14目筛整粒;
(5)填充、抛光:
将颗粒装入胶囊填充机料斗,按每粒胶囊装350mg填充,填充好的胶囊经胶囊抛光机抛光,挑去破损及空囊,装入洁净容器中,密封;
(6)包装:
内包装材料选用符合YBB00122002质量标准的口服固体药用高密度聚乙烯瓶,每瓶装60粒;外包装材料选用符合GB6543质量标准的空白瓦楞纸箱,打包。
本实施例的蛹虫草胶囊,其标志性成分及含量为:每100ml含:腺苷140mg;其食用方法及食用量为口服,每日2次,每次2粒;其规格为350mg/粒。
实施例9 蛹虫草膏
本实施例的一种蛹虫草膏,其配方如下所示:
本实施例蛹虫草膏的制备方法,具体包括如下步骤:
(1)检验:
检验黄芪、枸杞子、灵芝、桑椹、茯苓、人参、大枣、蛹虫草等药材是否合格;
(2)水提取:
取规定量的黄芪、枸杞子、灵芝、桑椹、茯苓、人参、大枣、蛹虫草,用水将其洗净后置于提取罐中,加入8倍量的水,加热煮沸提取2小时放出提取液,渣再加8倍量水加热煮沸提取2小时放出提取液,渣弃去,合并二次提取液,并用200目滤布过滤,得滤液,备用;
(3)减压浓缩:
将滤液置于浓缩罐中,控制真空度为0.04~0.06MPa,温度为60~80℃,将滤液浓缩至相对密度为1.10左右(60℃测),得浓缩液,备用;
(4)炼膏:
将浓缩液已移至10万级洁净区进行炼膏。于隔层锅中加入麦芽糖浆、白砂糖和水加热溶解成糖浆再与浓缩液混合并边加热边搅拌,最终制成相对密度为1.35左右(60℃测)的膏液;
(5)装瓶:
将玻璃瓶和盖子清净烘干。将制好的膏液按照140ml的装量进行灌装;
(6)灭菌:
将灌装好的膏液移至高压灭菌锅中于115℃高压灭菌30min,得半成品;
(7)包装:
对经灯检合格的半成品进行包装,得最终的成品。
本实施例的蛹虫草膏,其标志性成分及含量为:每100g含:总皂苷80mg;粗多糖1.0g;其食用方法及食用量为口服,每日1次,每次20ml;其规格为140ml/瓶。
实施例10 蛹虫草膏
本实施例的一种蛹虫草膏,其配方如下所示:
本实施例蛹虫草膏的制备方法,同实施例9。
实施例11 蛹虫草膏
本实施例的一种蛹虫草膏,其配方如下所示:
本实施例蛹虫草膏的制备方法,同实施例9。
实施例12 动物功能实验
对实施例1~4制备的蛹虫草口服液、实施例5~7制备的蛹虫草片、实施例8制备的蛹虫草胶囊,以及实施例9~11制备的蛹虫草膏进行动物功能实验,实验结果显示,实施例1~4制备的蛹虫草口服液、实施例5~7制备的蛹虫草片、实施例8制备的蛹虫草胶囊,以及实施例9~11制备的蛹虫草膏均具有显著的增强免疫力的功能。
下面具体以实施例5制备的蛹虫草片为例,详细描述动物功能试验的步骤和结果。
(一)样品来源
采用实施例5制备的蛹虫草片,该蛹虫草片的标志性成分及含量为:每100ml含:腺苷30mg;其食用方法及食用量为口服,每日2次,每次2片;其规格为800mg/片。
人群推荐日摄入量为3.20/6.0kg BW(即0.053g/kg BW)。
样品配制:准确量取受试物的内容物5.3g、10.7g、16.0g,分别用蒸馏水定容至200ml,供低、中、高剂量组小鼠灌胃用。
(二)实验动物
SPF级昆明种雌性小鼠,18-22g,200只。
(三)剂量分组
按人群推荐日摄入量为0.053g/kg BW,扩大10、20、30倍设置低、中、高三个剂量组,即0.53g/kg BW、1.07g/kg BW、1.60g/kg BW,共分五个实验组,每个实验组包括阴性对照组(是指去掉原料只用辅料喂养小白鼠的一组,用于做功能实验效果进行对比的;原料就是蛹虫草,其余都是辅料)、低剂量组、中剂量组和高剂量组,每个剂量组实验动物为10只。
五个实验组具体如下所示:
(1)免疫试验一组:进行迟发型变态反应实验;
(2)免疫试验二组:进行ConA诱导的小鼠淋巴细胞转化实验和NK细胞活性测定;
(3)免疫试验三组:进行小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验;
(4)免疫试验四组:进行血清溶血素的测定和抗体生成细胞检测;
(5)免疫试验五组:进行淋巴器官/体重比值测定和碳廓清实验。
小鼠连续灌胃30天后开始实验。
各实验组小鼠均按0.20ml/10g BW容量经口灌胃给予。
(四)实验方法
1、ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化实验
方法:无菌取脾,置于盛有适量无菌Hank`s液平皿中,用镊子轻轻将脾磨碎,制成单个细胞悬液;经200目筛网过滤,用Hank`s液洗2次,每次李欣10min(1000r/min),然后将细胞悬浮于1ml的完全培养液中,用台酚蓝染色计数活细胞数(应在95%以上),调整细胞浓度为3×106个/ml,将每一份脾细胞悬液分两孔加入24孔培养板中,每孔1ml,一孔加75ulConA液(相当于7.5μg/ml),另一孔作为对照,置5%CO2,38℃CO2孵箱中培养72h;培养结束前4h,每孔轻轻吸去上清液0.7ml,加入0.7ml不含小牛血清的RPMI1640培养液,同时加入MTT(5mg/ml)50ul/孔,继续培养4h;培养结束后,每孔加入1ml酸性异丙醇,吹打混匀,使紫色结晶完全溶解;然后分装到96孔培养板中,每个孔作3个平行孔(100ul/孔),用酶标仪以570nm波长测定光密度值。
2、二硝基氟苯(DNFB)诱导迟发型变态反应(DTH)
方法:耳肿胀法。用1%DNFB(以1:1的丙酮麻油溶液配制)致敏小鼠后,第五天再用DNFB攻击右耳,24h后处死动物剪下左右耳壳用打孔器取下直径8mm的耳片,称重,以左右耳的重量之差来表示DTH的程度。
3、血清溶血素的测定
方法:血凝法。取羊血,用生理盐水洗涤3次,每次离心(2000r/min)10min,将压积SRBC用生理盐水配成2%(v/v)的细胞悬液,每只鼠腹腔注射0.2ml进行免疫;4~5天后,摘除眼球取血于离心管内,放置约1h,将凝固血与管壁剥离,使血清充分析出,2000r/min离心10min,收集血清。
凝集反应:用生理盐水将血清倍比稀释,将不同稀释度的血清分别置于微量血凝实验板内,每孔100ul,再加入100ul0.5%(v/v)SRBC悬液,混匀,放入湿润的平盘内并加盖,于37℃温箱孵育3h,观察血球凝集程度,根据血清凝聚程度的级别计算出抗体积数。
4、腹腔巨噬细胞吞噬鸡血红细胞实验
方法:半体内法。制备20%的鸡红细胞悬液;每只鼠腹腔注射1ml该悬液,30min后处死动物,将其仰位固定于鼠板上,开腹,经腹腔注入生理盐水2ml,转动鼠板1min,然后吸出腹腔洗液1ml,平均分滴于2片载玻片上,37℃温育30min;育毕用生理盐水漂洗,晾干,以1:1的丙酮甲醇溶液固定,4%Giemsa-磷酸缓冲液染色3min,再用蒸馏水漂洗晾干,油镜下计100个巨噬细胞,按下式计算吞噬率和吞噬指数:
5、小鼠碳廓清实验
方法:按体重从小鼠尾静脉注入稀释的印度墨汁(10ml/kg),待墨汁注入,立即计时注入墨汁后2、10min,分别从内静脉丛取血20ul,并立即将其加到2ml0.1%Na2CO4溶液中,各吸0.1ml于96孔酶标板中,用酶标仪在600nm波长处测光密度值(OD),以Na2CO4溶液作阴性对照。
将小鼠处死,取肝脏和脾脏,用滤纸吸干脏器表面血污,分别称重。
以吞噬指数表示小鼠碳廓清的能力,按下式计算吞噬指数a,受试样品的吞噬指数显著高于对照组,可判定该项实验结果阳性。
6、抗体生成细胞检测
取脱纤维的羊血,用生理盐水洗涤3次,每次离心(2000r/min)10min,每只鼠经腹腔注射2%(v/v)SRBC0.2ml,将SRBC免疫4~5天后的小鼠颈椎脱臼处死,取出脾脏,放在盛装有Hank`s液的小平皿中,轻轻磨碎脾脏,制成细胞悬液,经200目筛网过滤,离心(1000/min)10min,用Hank`s液洗2遍,最后将细胞悬浮在5mlRPMI1640培养液中,计数细胞,并将细胞浓度调整为5×106个/ml。
空斑的测定:将表层培养基(1g琼脂糖加双蒸水至100ml)加热溶解后,放入45~50℃水浴保温,与等量PH7.2~7.4,2倍浓度的Hank`s液混合,分装小试管,每管0.5ml,再向管内加50ul10%SRBC(v/v,用SA缓冲液配制),20ul脾细胞悬液(5×106个/ml),迅速混匀,倾倒于已刷琼脂糖薄层的玻片上,做平行片,待琼脂凝固后,将玻片水平扣放在片架上,放入二氧化碳培养箱中孵育1.5h,然后用SA缓冲液稀释的补体(1:8)加入玻片架凹槽内,继续温育1.5h后,计数溶血空斑数。
7、NK细胞活性测定
方法:乳酸脱氢酶(LDH)测定法。
靶细胞的YAC-1细胞传代,以及效应细胞(脾细胞)悬液的制备均采用本领域技术人员的常规操作。
NK细胞活性检测:
取靶细胞和效应细胞各100ul(效靶比50:1),加入U型96孔培养板中,靶细胞自然释放孔加靶细胞和培养液各100ul,靶细胞最大释放孔加靶细胞和1%NP40各100ul;上述各项均设三个平行孔,于37℃、5%CO2培养箱中培养4h,然后将96孔培养板以1500r/min离心5min,每孔吸取上清100ul置平底96孔培养板中,同时加入LDH基质液100ul,根据室温不同反应3~10min,每孔加入1mol/L的HCL30ul,在酶标仪490nm处测定光密度值(OD)。
按下式计算NK细胞活性,受试样品组的NK细胞活性显著高于对照组的NK细胞活性,则可判定该项试验结果阳性。
(五)试验结果
1、实施例5制备的蛹虫草片对小鼠体重的影响:
如表1、表2、表3、表4和表5所示,蛹虫草片对小鼠体重无明显影响,各剂量组与阴性对照组比较P>0.05。
表1 实验一组试验前后小鼠体重变化()
各组与阴性对照组比较P>0.05。
表2 实验二组试验前后小鼠体重变化()
各组与阴性对照组比较P>0.05。
表3 实验三组试验前后小鼠体重变化()
各组与阴性对照组比较P>0.05。
表4 实验四组试验前后小鼠体重变化()
各组与阴性对照组比较P>0.05。
表5 实验五组试验前后小鼠体重变化()
各组与阴性对照组比较P>0.05。
2、实施例5制备的蛹虫草片对动物淋巴器官/体重比值的影响,如表6所示,蛹虫草片对小鼠胸腺/体重比值和脾脏/体重比值无明显影响,各剂量组与阴性对照组比较均为P>0.05。
表6 实施例5的蛹虫草片对小鼠淋巴器官/体重比值的影响()
各组与阴性对照组比较P>0.05。
3、实施例5的蛹虫草片脾淋巴细胞转化试验结果:
蛹虫草片中剂量组能显著性增强ConA诱导的脾淋巴细胞增殖能力,与阴性对照组比较P<0.05,见表7。
表7 实施例5的蛹虫草片对细胞免疫功能的影响()
4、实施例5的蛹虫草片对小鼠迟发型变态反应的影响:
实施例5的蛹虫草片中剂量组能显著性增强小鼠对DNFB诱发的DTH反应,与阴性对照组比较P<0.01,见表7。
5、实施例5的蛹虫草片对小鼠血清溶血素滴度水平的影响:
蛹虫草片中剂量组能显著性升高血清溶血素含量,与阴性对照组比较P<0.05,见表8。
表8 实施例5的蛹虫草片对小鼠溶血素滴度水平的影响()
6、实施例5的蛹虫草片腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验结果:
蛹虫草片中剂量组能明显提高吞噬率、吞噬指数,与阴性对照组比较,P<0.01、P<0.05,见表9。
表9 实施例5的蛹虫草片对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响()
7、实施例5的蛹虫草片碳廓清试验结果:
蛹虫草片中剂量组能显著提高小鼠碳廓清吞噬指数,与阴性对照组比较P<0.05,见表10。
表10 实施例5的蛹虫草片对小鼠碳廓清功能的影响()
8、实施例5的蛹虫草片抗体生成细胞检测试验结果:
蛹虫草片各剂量组均无明显提高抗体生成细胞数量,与阴性对照组比较,P>0.05,见表11。
表11 实施例5的蛹虫草片对抗体生成细胞功能的影响()
9、实施例5的蛹虫草片NK细胞活性试验结果:
蛹虫草片各剂量组均不能明显增强小鼠NK细胞活性,与阴性对照组比较,P>0.05,见表12。
表12 实施例5的蛹虫草片对小鼠NK细胞活性的影响()
综上所述,按照增强免疫力功能作用评价程序规定,该受试物(也就是实施例5的蛹虫草片)具有增强免疫力功能作用。
实施例 13毒理试验
以实施例5制备的蛹虫草片为例,进行毒理试验,其试验方法采用本领域技术人员的常规操作,蛹虫草片毒理试验样品的人群推荐量为0.053g/kg BW,其试验结果如下所示:
(1)对两种性别的SPF级昆明种小鼠急性经口毒性试验,两次累计灌胃剂量达20g/kg BW(相当于成人推荐日摄入量0.053g/kg BW的377倍),在14天的观察期内动物未见明显中毒症状和死亡,该产品MTD值大于20g/kg BW,依据急性毒性分级评价标准规定,该受试样品属无毒级;
(2)二项致突变试验(小鼠骨髓细胞微核试验和精子畸形试验)结果均为阴性;
(3)30天喂养试验结果表明:将受试样品按1.33、2.65、5.30g/kg BW剂量(分别相当于成人推荐日摄入量0.053g/kg BW的25、50、100倍)对SPF级Wsitar大鼠连续给予30天,动物未见明显的中毒症状和死亡,受试样品各剂量组大鼠体重、进食量、食物利用率、血液学、血液生化、脏器重量、脏/体比值以及病理组织学等指标与阴性对照组比较,差异均无显著性,结果为:未发现该受试样品有明显的毒性作用。
实施例14 临床试验
对实施例2制备的蛹虫草口服液进行临床试验,从而验证其是否具有增强免疫力的治疗效果,具体如下所示:
对20例易患感冒的人群进行调查,未服用本产品前,20例患者年累计犯感冒疾病约280次以上.
让这20例患者按照每日1次,每次1支(20ml)的方法,服用实施例2的蛹虫草口服液一年。
一年后,对这20例易患感冒的人群再次进行调查,结果发现,其全年累计犯感冒疾病20次,且普遍反映,服用蛹虫草口服液前,每次犯感冒最少要7天,多则半个月才能治愈,服用蛹虫草口服液后,犯感冒不超过3天治疗就可痊愈。
Claims (4)
1.一种具有增强免疫力功能的蛹虫草口服液制备方法,其特征在于该制备方法所采用的蛹虫草口服液配方,按总体积为1000ml计,具体如下所示:
黄 芪 145~155 g;
枸杞子 145~155g;
灵 芝 95~105g;
桑 椹 95~105g;
茯 苓 95~105g;
人 参 45~55g;
大 枣 45~55g;
蛹虫草 30g;
三氯蔗糖 0.2g;
余量为纯化水;
该制备方法具体包括如下步骤:
(1)检验:
检验药材黄芪、枸杞子、灵芝、桑椹、茯苓、人参、大枣和蛹虫草是否合格;
(2)水提取:
取黄芪、枸杞子、灵芝、桑椹、茯苓、人参、大枣和蛹虫草,用水将其洗净后置于提取罐中,加入8倍量的水,加热煮沸提取2小时放出提取液,渣再加8倍量水加热煮沸提取2小时放出提取液,渣弃去,合并二次提取液,并用200目滤布过滤,得滤液,备用;
(3)减压浓缩
将滤液置于浓缩罐中,控制真空度为0.04~0.06MPa,温度为60~80℃,将滤液浓缩至相对密度为1.10,60℃测,得浓缩液,备用;
(4)醇沉:
取两倍浓缩液量的50%食用酒精慢慢加入浓缩液中并加以搅拌,密封放置12小时后移取上清液,渣再加入倍量50%食用酒精,密封放置16小时后移取上清液,合并两次清液,得醇沉液;将醇沉液置于酒精回收塔中进行酒精回收;
(5)水沉:
将经过酒精回收后的膏液加入3倍量纯化水,水沉24h,取上清液;
(6)调配、定容:
称取三氯蔗糖溶解于水沉上清液中并加入纯化水定容至1000ml;将定容好的液体用板框过滤器过滤,得澄清滤液;
(7)装瓶:
将玻璃瓶和盖子清净烘干;
将过滤好的液体按照20 ml的装量进行灌装;
(8)灭菌:
将灌装好的液体移至高压灭菌锅中于115℃高压灭菌30min,得半成品;
(9)包装:
对经灯检合格的半成品按照7支/盒进行包装,得最终的成品。
2.根据权利要求1所述一种具有增强免疫力功能的蛹虫草口服液制备方法,其特征在于所述蛹虫草口服液的配方,按总体积为1000ml计,具体如下所示:
黄 芪 150 g;
枸杞子 150 g;
灵 芝 100g
桑 椹 100g
茯 苓 100g
人 参 50g
大 枣 50g
蛹虫草 30g
三氯蔗糖 0.2g
余量为纯化水。
3.一种具有增强免疫力功能的蛹虫草膏的制备方法,其特征在于该制备方法所采用的蛹虫草膏的配方按总体积为1000ml计,具体如下所示:
黄 芪 145~150g;
枸杞子 145~150g;
灵 芝 95~100g;
桑 椹 95~100g;
茯 苓 95~100g;
人 参 45~50g;
大 枣 45~50g;
蛹虫草 30g;
白砂糖 200g;
麦芽糖浆 500ml;
余量为纯化水;
该制备方法具体包括如下步骤:
(1)检验:
检验黄芪、枸杞子、灵芝、桑椹、茯苓、人参、大枣、蛹虫草是否合格;
(2)水提取:
取黄芪、枸杞子、灵芝、桑椹、茯苓、人参、大枣、蛹虫草,用水将其洗净后置于提取罐中,加入8倍量的水,加热煮沸提取2小时放出提取液,渣再加8倍量水加热煮沸提取2小时放出提取液,渣弃去,合并二次提取液,并用200目滤布过滤,得滤液,备用;
(3)减压浓缩:
将滤液置于浓缩罐中,控制真空度为0.04~0.06MPa,温度为60~80℃,将滤液浓缩至相对密度为1.10,60℃测,得浓缩液,备用;
(4)炼膏:
将浓缩液移至10万级洁净区进行炼膏,于隔层锅中加入麦芽糖浆、白砂糖和水加热溶解成糖浆再与浓缩液混合并边加热边搅拌,最终制成相对密度为1.35的膏液,60℃测;
(5)装瓶:
将玻璃瓶和盖子清净烘干;
将制好的膏液按照140 ml的装量进行灌装;
(6)灭菌:
将灌装好的膏液移至高压灭菌锅中于115℃高压灭菌30min,得半成品;
(7)包装:
对经灯检合格的半成品进行包装,得最终的成品。
4.根据权利要求3所述一种具有增强免疫力功能的蛹虫草膏的制备方法,其特征在于所述蛹虫草膏的配方按总体积为1000ml计,具体如下所示:
黄 芪 150g
枸杞子 150g
灵 芝 100g
桑 椹 100g
茯 苓 100g
人 参 50g
大 枣 50g
蛹虫草 30g
白砂糖 200g
麦芽糖浆 500ml
余量为纯化水。
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