CN106138440A

CN106138440A - 一种含有玛咖和红景天的组合物及制备方法与用途

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Publication number: CN106138440A
Application number: CN201610787967.8A
Authority: CN
Inventors: 张丽
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2016-08-30
Filing date: 2016-08-30
Publication date: 2016-11-23
Anticipated expiration: 2036-08-30
Also published as: CN106138440B

Abstract

本发明提供了一种缓解体力疲劳、增强免疫力的组合物及其制备方法与用途。本发明所述组合物主要成分原料由玛咖、红景天、西洋参、巴戟天和枸杞子组成。本发明的组合物具有良好的缓解体力疲劳、增强免疫力作用，没有任何毒副作用。

Description

一种含有玛咖和红景天的组合物及制备方法与用途

技术领域

本发明涉及一种含有玛咖和红景天的组合物及制备方法与用途。具体涉及一种包括玛咖、红景天、西洋参、巴戟天和枸杞子的组合物及制备方法与在缓解体力疲劳、增强免疫力中的用途。

技术背景

疲劳是机体的生理过程，不能将其机能保持在一特定水平或各器官不能维持其预定的运动强度。是一个涉及许多生理生化因素的综合性的生理过程，是人体脑力或体力活动到一定阶段时必然出现的一种正常而危险的生理现象，它既标志着机体原有工作能力的暂时下降，又可能是机体发展到伤病状态的一个先兆。

疲劳使工作效力降低、对事物的反映迟钝、学习效力下降，长时间的疲劳会产生过劳导致健康受损，除一部分器官和系统过度紧张各种病损外，也会出现循环、呼吸、消化等功能减退。

免疫是指机体接触“抗原性异物”或“异己成分”的一种特异性生理反应。免疫力是人体自身的防御机制，是人体识别和消灭外来侵入的任何异物(病毒、细菌等)；处理衰老、损伤、死亡、变性的自身细胞以及识别和处理体内突变细胞和病毒感染细胞的能力。免疫系统对维持机体正常生理功能具有重要意义。免疫力下降，对免疫机制产生不良影响。

免疫力低下的身体易于被感染或患癌症，极易招致细菌、病毒、真菌等感染，因此免疫力低下最直接的表现就是容易生病。

因此，提供一种缓解体力疲劳、增强免疫力的保健品非常有必要，目前市场上也有一些类似的保健品，但见效缓慢，效果不十分明显。

发明内容

本发明提供了一种含有玛咖和红景天的组合物。

在一个具体的实施方案中，本发明提供了一种缓解体力疲劳、增强免疫力的组合物，其有效成分主要由下列重量份的原料组成：

玛咖10～80份、红景天2～30份、西洋参2～40份、巴戟天5～50份、枸杞子5～60份

在一个更优选的实施方案中，所述组合物的有效成分主要由下列重量份的原料组成：

玛咖20～60份、红景天5～15份、西洋参5～25份、巴戟天10～30份、枸杞子10～50份

玛咖40份、红景天10份、西洋参15份、巴戟天20份、枸杞子30份

本发明还提供了上述缓解体力疲劳、增强免疫力的组合物制备方法，包含以下步骤：

称取上述重量份玛咖、枸杞子、巴戟天、西洋参、红景天饮片，玛咖先粉碎成粉，玛咖粉用干净布袋分袋包裹，置浸提灌底，再将其余原料饮片均匀铺于浸提罐中，加6-20倍量白酒(50％)于浸提罐中，密闭，浸提7-28天。浸提时每隔12-48小时，循环1次酒液。浸提结束放出酒液，药渣压榨，酒液200目筛滤过，得浸提酒液。

浸提酒液加入适量的纯化水、白酒(50％)，循环搅拌1-2小时，使充分混合均匀，勾兑至酒精度为36％(v/v)，并调至配方量，得勾兑酒液。

将勾兑酒液置0-10℃冷藏24小时，冷藏后用板框过滤器(滤材为滤纸)过滤，得组合物。

本发明还公开了上述组合物用于在制备具有缓解体力疲劳、增强免疫力保健品的用途。

一个具体的实施方案中，所述保健品为酒剂。

本发明的原理和优点如下：

玛咖(Lepidium meyenii Walp)为十字花科(Cruciferae)独行菜属(Lepidium)一年生或两年生草本植物，生长于海拔3500m-4500m自然环境恶劣的南美高原安第斯山区。玛咖在秘鲁广泛栽培已有数千年历史，具有丰富的营养成分，是当地居民的主要食物来源之一，作为民间药物广泛使用，有“秘鲁人参”之称。玛咖含有18种人体所必需的氨基酸、20种脂肪酸，其饱和与不饱和脂肪酸比率为0.76。玛咖中主要的生物活性物质是玛咖酰胺、玛咖稀、β-谷甾醇、黄酮、皂苷、生物碱等。实验表明：玛咖不仅缓解体力疲劳、增强免疫力的作用，还有调节内分泌抗氧化作用。玛咖还被宣称可用于风湿症、呼吸疾病、抑郁症、贫血症等的治疗。

红景天为景天科(Crassulaceae)红景天属(RhodiolaL.)多年生草本或亚灌木植物，是珍稀药用植物之一，被誉为“高原人参”。选用的是高山红景天(RhodiolaSachalinensis.A.Bor)或大花红景天(Rhodiola crenulata H Ohba)，主要成分包含红景天苷(Salidroside)、酪醇(P-Tyrosol)、红景天芬(Rosavin)、红景天任(Rosarin)、红景天素(Rosin)、多糖、人体必需的18种氨基酸、微量元素及丰富的维生素A、维生素D、维生素E等。研究表明其具有缓解体力疲劳，免疫调节，抗氧化衰老，抗缺氧，抗辐射，抗肿瘤，清除自由基，增强记忆，改善睡眠，调节血糖，保护肾功能等多种药理作用。

西洋参(Panax quiquefolium L.英文名：American Ginseng)，又名美国参、花旗参、洋参、广东参，系五加科人参属多年生草本植物，原产北美的原始森林，主产北美洲加拿大，药用部分为干燥的根。主要含有人参皂苷Rg1、Rb1等17种皂苷，又含有挥发油，有机酸，甾醇，氨基酸，蛋白质，多糖等，但主要成分是皂苷、多糖类和黄酮类。西洋参具有滋补强壮，养血生津，宁神益智的功能。临床用于镇静镇惊、安神促智、抗心律失常、抗休克、保护心肌、防血管硬塞、降血、降血脂、增强机体免疫功能、抗应激、抗肿瘤、保肝，缓解体力疲劳等。

巴戟天为茜草科多年生攀援木质藤本植物巴戟天(Morinda officinalis How.又名巴戟、鸡眼藤、黑藤钻、糠藤、三角藤)的干燥根，是我国著名的四大南药之一，具有补肾阳，强筋骨，祛风湿的功效。其主要化学成分有蒽醌类化合物、糖类、氨基酸等。现代实验研究表明：巴戟天具有提高免疫力作用，抗骨质疏松作用，抗氧化作用等。

枸杞子为茄科植物宁夏枸杞Lycium barbarum L.的干燥成熟果实。枸杞子主要含枸杞多糖、甜菜碱、胡萝卜素等。枸杞子甘平质润，为滋补、强壮之佳品，延年益寿之良药。现代医学通过大量药理实验和临床实验证明，枸杞的确具有促进调节免疫功能、保肝功能，抗衰老功能及缓解体力疲劳等药理作用。

本发明采用玛咖、红景天、枸杞子、西洋参、巴戟天的组合物，疗效显著；组合物中西洋参不能由人参替代，人参性温、热，大补元气，提气助火；西洋参性阴、凉，补气养阴、滋阴降火、润肺，西洋参在组合物中起到阴阳平衡的作用，换成人参营养失调，会产生毒副作用。

相对于现有技术，本发明具有以下优点：

1、本发明通过合理配伍，将以上所述有效成分按照一定比例科学配伍，使其能够充分发挥生物活性，特别是将其用酒剂的形式使用，非常有利于吸收。

2、本发明所属组合物的制备方法，采用常温浸提的方法，确保温度不发生较大变化，不破坏有效成分，最大限度保留有效成分，使产品效果更好。

3、本发明提供的玛咖、红景天、西洋参、巴戟天、枸杞子组合物，经动物实验表明，能够有效的缓解体力疲劳、增强免疫力。

4、本发明提供的组合物经小鼠急性经口毒性试验、遗传毒性试验(小鼠骨髓细胞微核试验和小鼠精子畸形试验)以及长期毒性实验(30天喂养试验)，结果表明无毒性反应和其它异常。

具体实施方式

实施例1

组分：玛咖80份、红景天30份、西洋参40份、巴戟天50份、枸杞子60份

制备方法：

1、原辅料的要求

枸杞子、巴戟天、西洋参、红景天饮片符合《中华人民共和国药典》(2010版)一部的相应标准要求；玛咖使用事先粉碎好的玛咖粉；白酒(50％)符合GB2757的标准要求；纯化水符合《中华人民共和国药典》(2010版)二部的纯化水规定要求。

2、投料、浸提

饮片原料先净选，取配方量玛咖粉、枸杞子、巴戟天、西洋参、红景天饮片，玛咖粉用干净布袋分袋包裹，置浸提灌底，再将其余原料饮片均匀铺于浸提罐中，加20倍量白酒(50％)于浸提罐中，密闭，浸提28天。浸提时每隔24小时，循环1次酒液。浸提结束放出酒液，药渣压榨，酒液200目筛滤过，得浸提酒液。

3、勾兑

浸提酒液加入适量的纯化水、白酒(50％)，循环搅拌2小时，使充分混合均匀，勾兑至酒精度为36％(v/v)，并调至配方量，得勾兑酒液。

4、冷藏、过滤

将勾兑酒液置0-4℃冷藏48小时，冷藏后用板框过滤器(滤材为滤纸)过滤，得组合物。

5、灌装

将上述组合物酒液进行灌装，规格为500ml/瓶，压盖。灌装的瓶装酒再进行灯检，剔除装量不足，密封不严，破损，有其他异物的不合格品，酒液中不允许有肉眼可见的外来杂质。

6、外包装，成品检验、入库：

灌装后的瓶装酒进行外包装，按规定随机抽取每批产品，按照质量标准所述方法及要求进行检验，检验合格成品入库。

实施例2

组分：玛咖60份、红景天15份、西洋参25份、巴戟天30份、枸杞子50份

制备方法：

1、原辅料的要求

2、投料、浸提

饮片原料先净选，取配方量玛咖粉、枸杞子、巴戟天、西洋参、红景天饮片，玛咖粉用干净布袋分袋包裹，置浸提灌底，再将其余原料饮片均匀铺于浸提罐中，加15倍量白酒(50％)于浸提罐中，密闭，浸提21天。浸提时每隔24小时，循环1次酒液。浸提结束放出酒液，药渣压榨，酒液200目筛滤过，得浸提酒液。

3、勾兑

4、冷藏、过滤

5、灌装

6、外包装，成品检验、入库：

实施例3

组分：玛咖40份、红景天10份、西洋参15份、巴戟天20份、枸杞子30份

制备方法：

1、原辅料的要求

2、投料、浸提

饮片原料先净选，取配方量玛咖粉、枸杞子、巴戟天、西洋参、红景天饮片，玛咖粉用干净布袋分袋包裹，置浸提灌底，再将其余原料饮片均匀铺于浸提罐中，加10倍量白酒(50％)于浸提罐中，密闭，浸提14天。浸提时每隔24小时，循环1次酒液。浸提结束放出酒液，药渣压榨，酒液200目筛滤过，得浸提酒液。

3、勾兑

4、冷藏、过滤

将勾兑酒液置0-4℃冷藏24小时，冷藏后用板框过滤器(滤材为滤纸)过滤，得组合物。

5、灌装

6、外包装，成品检验、入库：

实施例4

本实施例是用实施例3制得组合物进行缓解体力疲劳药效学实验。同时按照实施例3制得缺失西洋参的样品作为缺失对照组1，按照实施例3制得缺失巴戟天的样品作为缺失对照组2，按照实施例3制得缺失西洋参、巴戟天的样品作为缺失对照组3，做对比实验。

1材料与方法

1.1实验动物

SPF级昆明种雄性小鼠，18-22g。由湖北省实验动物研究中心提供，实验动物生产许可证号为SCXK(鄂)2008-0005，实验动物使用许可证号为SYXK(鄂)2012-0065。动物饲养室温度为20～25℃，湿度为40～70％。

1.2样品来源及处理

样品为红棕色液体，由北京希科奥科技有限公司提供，成品的人群推荐日摄入量为100ml/60kg BW，换算成试验样品(15倍浓缩液)的人群推荐日摄入量为6.67ml/60kg BW(0.111ml/kg BW)。

样品配制：确量取受试物的15倍浓缩液11.1、22.2、33.3ml加酒基(15°v/v)分别定容到200ml，作低、中、高剂量组灌胃用。另取200ml蒸馏水作阴性对照组，取200ml酒基(15°v/v)作酒对照组。试验前配制，临用前摇匀，未用完的样品放入4℃冰箱保存。

1.3剂量分组

按送检的样品计算的人群日推荐用量为6.67ml/60kg BW(0.111ml/kg BW)，作为剂量设计依据，设计1.11、2.22、3.33ml/kg BW(分别相当人群推荐量的10、20、30倍)作为三个剂量组，同时设阴性对照组(蒸馏水)和酒基对照组(酒基(15°v/v))，缺失对照组1、缺失对照组2、缺失对照组3，缺失对照组均用高剂量。共设4个实验组，每组120只，每个剂量组15只小鼠。灌胃容量为20ml/kg BW，30天后开始测试。实验一组负重游泳实验，实验二组血乳酸实验，实验三组血清尿素氮实验，实验四组肝糖原含量实验。

1.4实验方法

1.4.1负重游泳试验

方法：小鼠连续灌胃30天，末次给受试物后30min，小鼠尾根部负重5％体重，置游泳箱中游泳观察小鼠自游泳至死亡时间。室温：24-26℃，水温：25±1℃。

1.4.2血乳酸含量的测定

方法：小鼠连续灌胃30天，末次给受试物后30min，放入30℃的水中游泳10min，游泳前、游泳后即刻、游泳休息后20min分别三次取血(内眦取血)测定血乳酸值。所用试剂盒由南京建成生物工程研究所提供，试剂盒批号：20130709。室温：24-26℃。

1.4.3血清尿素氮含量的测定

方法：小鼠连续灌胃30天，末次给受试物后30min，放入30℃的水中游泳90min，出水后，休息60min，眼球取血测定血清尿素氮含量。尿素氮测定采用日立7020型全自动生化分析仪测定，所用试剂盒由上海丰汇医学科技有限公司提供，试剂盒批号：130645。室温：24-26℃。

1.4.4肝糖原含量的测定

方法：小鼠连续灌胃30天，末次给受试物后30min，取肝脏测定肝糖原含量。所用试剂盒由南京建成生物工程研究所提供，试剂盒批号：20130708。室温：24-26℃。

2.实验结果

结果显示：1)各剂量组能显著性延长小鼠负重游泳时间；2)中高剂量组能显著性减少小鼠游泳后、休息后血乳酸值；3)各剂量组能显著性降低小鼠血清尿素氮值；4)各剂量组对小鼠肝糖原含量均无显著性影响。4)缺失对照组1，2，3与阴性对照组、酒基对照组无显著性差异。

综合各项试验结果判定，该组合物具有缓解体力疲劳功能

2.1对小鼠负重游泳时间、对小鼠血清尿素氮、肝糖原含量的影响

各剂量组能延长小鼠负重游泳时间，与阴性对照组、酒基对照组比较有显著性差异(与阴性对照组、酒基对照组比较，*P＜0.05)，缺失对照组1，2，3与阴性对照组、酒基对照组无显著性差异，阴性对照组、酒基对照组之间无差异。各剂量组能显著性降低血清尿素氮值，与阴性对照组、酒基对照组比较有显著性差异(*P＜0.05)，缺失对照组1，2，3与阴性对照组、酒基对照组无显著性差异，阴性对照组、酒基对照组之间无差。各剂量组对小鼠肝糖原含量无显著性改变(p＞0.05)，缺失对照组1，2，3与阴性对照组、酒基对照组无显著性差异，阴性对照组、酒基对照组之间无差异。

对小鼠负重游泳时间、对小鼠血清尿素氮、肝糖原含量的影响(均数±标准差)

2.2各剂量组对小鼠小鼠游泳前、后、休息血乳酸值的影响

各剂量组对小鼠游泳前血乳酸值的影响无显著性改变(p＞0.05)，缺失对照组1，2，3与阴性对照组、酒基对照组无显著性差异，阴性对照组、酒基对照组之间无差异。与阴性对照组、酒基对照组比较，中高剂量组能显著性降低小鼠游泳后血乳酸值(*P＜0.05)，缺失对照组1，2，3有一定的作用，但与阴性对照组、酒基对照组无显著性差异，阴性对照组、酒基对照组之间无差异。与阴性对照组、酒基对照组比较，各剂量组能显著性降低小鼠休息后的血乳酸值(*P＜0.05)，缺失对照组1，2，3有一定的作用，但与阴性对照组、酒基对照组无显著性差异，阴性对照组、酒基对照组之间无差异。

小鼠游泳前、后、休息血乳酸值的影响(均数±标准差)

结果显示：1)各剂量组能显著性延长小鼠负重游泳时间；2)中、高剂量组能显著性减少游泳后血乳酸值，各剂量组能显著性减少小鼠游泳后、休息后血乳酸值；3)各剂量组能显著性降低小鼠血清尿素氮值；4)各剂量组对小鼠肝糖原含量均无显著性影响。

按照功能作用评价程序规定，综合以上各项试验结果判定，组合物具有缓解体力疲劳功能。缺失西洋参、巴戟天中的一味或西洋参、巴戟天同时缺失的情况下，有一定的作用，但与阴性对照组、酒基对照组无显著性差异。

实施例5

本实施例是用实施例3制得组合物进行增强免疫力药效学实验。同时按照实施例3制得缺失西洋参的样品作为缺失对照组1，按照实施例3制得缺失巴戟天的样品作为缺失对照组2，按照实施例3制得缺失西洋参、巴戟天的样品作为缺失对照组3，做对比实验。

1材料与方法

1.1实验动物及环境

同实施例4中的1.1实验动物及环境

1.2样品来源及处理

同实施例4中的1.2样品来源及处理

1.3剂量分组

样品为红棕色液体，由北京希科奥科技有限公司提供，成品的人群推荐日摄入量为100ml/60kg BW，换算成试验样品(15倍浓缩液)的人群推荐日摄入量为6.67ml/60kg BW(0.111ml/kg BW)，作为剂量设计依据，设计1.11、2.22、3.33ml/kg BW(分别相当人群推荐量的10、20、30倍)作为三个剂量组，同时设阴性对照组(蒸馏水)和酒基对照组(酒基(15°v/v))，缺失对照组1、缺失对照组2、缺失对照组3，缺失对照组均用高剂量。共设5个实验组，每组120只。共分五个实验组，每实验组包括阴性对照组、酒基对照组、低、中、高剂量组，各剂量组实验动物数为15只。免疫实验一组进行迟发型变态反应实验；免疫实验二组进行ConA诱导的小鼠淋巴细胞转化实验和NK细胞活性测定；免疫实验三组进行小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验；免疫实验四组进行血清溶血素的测定和抗体生成细胞检测；免疫实验五组进行淋巴器官/体重比值测定和碳廓清实验。小鼠连续灌胃30天后开始试验。各实验组灌胃容量为20ml/kg BW容量经口灌胃给予。

1.4试验方法

1.4.1ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化试验

方法：无菌取脾，置于盛有适量无菌Hank’s液平皿中，用镊子轻轻将脾磨碎，制成单个细胞悬液。经200目筛网过滤，用Hank’s液洗2次，每次离心10min(1000r/min)。然后将细胞悬浮于1mL的完全培养液中，用台酚兰染色计数活细胞数(应在95％以上)，调整细胞浓度为3×10⁶个/mL。将每一份脾细胞悬液分两孔加入24孔培养板中，每孔1mL，一孔加75μLConA液(相当于7.5μg/mL)，另一孔作为对照，置5％CO₂，37℃CO₂孵箱中培养72h。培养结束前4h，每孔轻轻吸去上清液0.7mL，加入0.7mL不含小牛血清的RPMI1640培养液，同时加入MTT(5mg/mL)50μL/孔，继续培养4h。培养结束后，每孔加入1mL酸性异丙醇，吹打混匀，使紫色结晶完全溶解。然后分装到96孔培养板中，每个孔作3个平行孔(100μL/孔)，用酶标仪以570nm波长测定光密度值。

1.4.2二硝基氟苯(DNFB)诱导迟发型变态反应(DTH)

方法：耳肿胀法。用1％DNFB(以1∶1的丙酮麻油溶液配制)致敏小鼠后，第5天再用DNFB攻击右耳，24h后处死动物剪下左右耳壳用打孔器取下直径8mm的耳片，称重，以左右耳的重量之差来表示DTH的程度。

1.4.3抗体生成细胞检测

取脱纤维的羊血，用生理盐水洗涤3次，每次离心(2000r/min)10min，每只鼠经腹腔注射2％(v/v)SRBC 0.2mL。将SRBC免疫4～5天后的小鼠颈椎脱臼处死，取出脾脏，放在盛装有Hank’s液的小平皿内，轻轻磨碎脾脏，制成细胞悬液，经200目筛网过滤，离心(1000/min)10min，用Hank’s液洗2遍，最后将细胞悬浮在5mLRPMI1640培养液中，计数细胞，并将细胞浓度调整为5×106个/mL。

空斑的测定：将表层培养基(1g琼脂糖加双蒸水至100mL)加热溶解后，放入45～50℃水浴保温，与等量pH7.2～7.4、2倍浓度的Hank’s液混合，分装小试管，每管0.5mL，再向管内加50μL10％SRBC(v/v，用SA缓冲液配制)，20μL脾细胞悬液(5×10⁶个/mL)，迅速混匀，倾倒于己刷琼脂糖薄层的玻片上，做平行片，待琼脂凝固后，将玻片水平扣放在片架上，放入二氧化碳培养箱中孵育1.5h，然后用SA缓冲液稀释的补体(1∶8)加入玻片架凹槽内，继续温育1.5h后，计数溶血空斑数。

1.4.4血清溶血素的测定

方法：血凝法。取羊血，用生理盐水洗涤3次，每次离心(2000r/min)10min。将压积SRBC用生理盐水配成2％(v/v)的细胞悬液，每只鼠腹腔注射0.2mL进行免疫。4～5天后，摘除眼球取血于离心管内，放置约1h，将凝固血与管壁剥离，使血清充分析出，2000r/min离心10min，收集血清。

凝集反应：用生理盐水将血清倍比稀释，将不同稀释度的血清分别置于微量血凝实验板内，每孔100μL，再加入100μL 0.5％(v/v)SRBC悬液，混匀，放入湿润的平盘内并加盖，于37℃温箱孵育3h，观察血球凝集程度。根据血清凝聚程度的级别计算出抗体积数。

1.4.5小鼠碳廓清试验

方法：按体重从小鼠尾静脉注入稀释的印度墨汁(10mL/kg)，待墨汁注入，立即计时注入墨汁后2、10min，分别从内眦静脉丛取血20μL，并立即将其加到2mL0.1％Na₂CO₃溶液中。各吸0.1mL于96孔酶标板中，用酶标仪在600nm波长处测光密度值(OD)，以Na₂CO₃溶液作阴性对照。

将小鼠处死.取肝脏和脾脏，用滤纸吸干脏器表面血污，分别称重。

以吞噬指数表示小鼠碳廓清的能力。按下式计算吞噬指数a。受试样品组的吞噬指数显著高于对照组，可判定该项实验结果阳性。

1.4.6腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞试验

方法：半体内法。制备20％的鸡红细胞悬液；每只鼠腹腔注射1mL该悬液，30min后处死动物，将其仰位固定于鼠板上，开腹，经腹腔注入生理盐水2mL，转动鼠板1min，然后，吸出腹腔洗液1mL，平均分滴于2片载玻片上，37℃温育30min；育毕用生理盐水漂洗，晾干，以1∶1的丙酮甲醇溶液固定，4％Giemsa-磷酸缓冲液染色3min，再用蒸馏水漂洗晾干。油镜下计数100个巨噬细胞，按下式计算吞噬率和吞噬指数：

1.4.7NK细胞活性测定

方法：乳酸脱氢酶(LDH)测定法。

靶细胞的传代(YAC-1细胞)：

实验前24h将靶细胞进行传代培养。用前以Hank’s液洗3次，用RPMI1640完全培养液调整细胞浓度为4×10⁵个/mL。

脾细胞悬液的制备(效应细胞)：

无菌取脾，置于盛有适量无菌Hank’s液的小平皿中，用镊子轻轻将脾磨碎，制成单细胞悬液。经200目筛网过滤，用Hank’s液洗2次，每次离心10min(1000r/min)。弃上清将细胞浆弹起，加入0.5mL灭菌水20秒，裂解红细胞后再加入0.5mL2倍Hank’s液及8mLHanks液，1000r/min，10min离心，用1mL含10％小牛血清的RPMI1640完全培养液重悬，用1％冰醋酸稀释后计数(活细胞数应在95％以上)，用台酚兰染色计数活细胞数(应在95％以上)，最后用RPM11640完全培养液调整细胞浓度为2×10⁷个/mL。

NK细胞活性检测：

取靶细胞和效应细胞各100μL(效靶比50∶1)，加入U型96孔培养板中：靶细胞自然释放孔加靶细胞和培养液各100μL，靶细胞最大释放孔加靶细胞和1％NP40各100μL；上述各项均设三个平行孔，于37℃、5％CO₂培养箱中培养4h，然后将96孔培养板以1500r/min离心5min，每孔吸取上清100μL置平底96孔培养板中，同时加入LDH基质液100μL，根据室温不同反应3～10min，每孔加入1mol/L的HCL 30μL，在酶标仪490nm处测定光密度值(OD)。按下式计算NK细胞活性，受试样品组的NK细胞活性显著高于对照组的NK细胞活性，即可判定该项实验结果阳性。

2实验结果

2.1对小鼠淋巴器官/体重比值的影响：

各剂量组均不能显著性增强动物淋巴器官/体重比值，与阴性对照组、酒基对照组比较，P＞0.05。缺失对照组1，2，3与阴性对照组、酒基对照组无显著性差异，阴性对照组、酒基对照组之间无差异。

对小鼠淋巴器官/体重比值的影响

2.2对小鼠脾淋巴细胞转化的影响，对小鼠迟发型变态反应的影响：

中、高剂量组能极显著性增强小鼠Con A诱导的脾淋巴细胞增殖能力，与阴性对照组、酒基对照组比较**P＜0.01，缺失对照组1，2，3均有一定作用，但与阴性对照组、酒基对照组无显著性差异，阴性对照组、酒基对照组之间无差异。中、高剂量组能极显著性增强小鼠对DNFB诱发的DTH反应，与阴性对照组、酒基对照组比较**p＜0.01，缺失对照组1，2，3均有一定作用，但与阴性对照组、酒基对照组无显著性差异，阴性对照组、酒基对照组之间无差异。

对细胞免疫功能的影响

2.3对小鼠抗体生成细胞检测的影响：

中剂量组能显著性提高小鼠抗体生成细胞数量，与阴性对照组、酒基对照组比较，P＜0.05；高剂量组能极显著性提高小鼠抗体生成细胞数量，与阴性对照组、酒基对照组比较，P＜0.01；缺失对照组1，2，3有一定的作用，但与阴性对照组、酒基对照组无显著性差异，阴性对照组、酒基对照组之间无差异。

对抗体生成细胞功能的影响

2.3对小鼠血清溶血素滴度水平的影响：

中剂量组能显著性升高小鼠血清溶血素含量，与阴性对照组、酒基对照组比较*P＜0.05，高剂量组能极显著性升高小鼠血清溶血素含量，与阴性对照组、酒基对照组比较**P＜0.01，缺失对照组1，2，3有一定的作用，但与阴性对照组、酒基对照组无显著性差异，阴性对照组、酒基对照组之间无差异。

对小鼠溶血素滴度水平的影响

2.4对小鼠碳廓清功能的影响：

中、高剂量组能显著性提高小鼠碳廓清吞噬指数，与阴性对照组、酒基对照组比较*P＜0.05，缺失对照组1，2，3有一定的作用，但与阴性对照组、酒基对照组无显著性差异，阴性对照组、酒基对照组之间无差异。

对小鼠碳廓清功能的影响

2.5对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬红细胞的影响：

中剂量组能极显著性提高小鼠吞噬百分率，与阴性对照组比较，**p＜0.01，高剂量组能显著性提高小鼠吞噬百分率，与阴性对照组比较，*p＜0.05，缺失对照组1，2，3有一定的作用，但与阴性对照组、酒基对照组无显著性差异，阴性对照组、酒基对照组之间无差异；中、高剂量组能显著性提高小鼠吞噬指数，与阴性对照组、酒基对照组比较，*p＜0.05。缺失对照组1，2，3有一定的作用，但与阴性对照组、酒基对照组无显著性差异，阴性对照组、酒基对照组之间无差异。

对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响

2.6对小鼠NK细胞活性的影响：

中高剂量组均能显著性增强小鼠NK细胞活性，与阴性对照组、酒基对照组比较，*p＜0.05，低剂量组不能显著增强小鼠NK细胞活性，与阴性对照组、酒基对照组比较，P＞0.05。缺失对照组1，2，3有一定的作用，但与阴性对照组、酒基对照组无显著性差异。阴性对照组、酒基对照组之间无差异。

对小鼠NK细胞活性的影响

按照增强免疫力功能作用评价程序规定，该受试物具有增强免疫力功能作用。缺失对照组1，2，3在高剂量有一定的作用，但与阴性对照组、酒基对照组无显著性差异。实施例4、5同时也说明这五种有效成分的组合物是非常合理性的组合，具有一定创造性。

实施例6

本实施例是用实施例3的工艺和组分制得缺失玛咖、红景天、枸杞子其中某一味药材的组合物进行缓解体力疲劳药效学实验。考察缺失其中一味药材时的缓解体力疲劳疗效。

本实施例的试验方法按照实施例4的实验方法采用高剂量进行。

实验结果如下：

1、对小鼠负重游泳时间、对小鼠血清尿素氮、肝糖原含量的影响(均数±标准差)

2、各剂量组对小鼠小鼠游泳前、后、休息血乳酸值的影响

小鼠游泳前、后、休息血乳酸值的影响(均数±标准差)

结果显示：缺失玛咖、红景天、枸杞子任意一味药材，有一定的作用，但与阴性对照组、酒基对照组比较，在延长小鼠负重游泳时间、减少小鼠游泳后、休息后血乳酸值、降低小鼠血清尿素氮值等关键点上均无显著性差异。缺失玛咖、红景天、枸杞子任意一味药材，阴性对照组、酒基对照组比较，对小鼠肝糖原含量均无显著性影响。

按照功能作用评价程序规定，综合以上各项试验结果判定，缺失玛咖、红景天、枸杞子任意一味药材组合物有一定的作用，但是不能评价有缓解体力疲劳功能。

实施例7

本实施例是用实施例3的工艺和组分制得缺失玛咖、红景天、枸杞子其中某一味药材的组合物进行缓解体力疲劳药效学实验。考察缺失其中一味药材时的增强免疫力疗效。

本实施例的试验方法按照实施例5的实验方法采用高剂量进行。

实验结果于下：

1、对小鼠淋巴器官/体重比值的影响：

对小鼠淋巴器官/体重比值的影响

2、对小鼠脾淋巴细胞转化的影响，对小鼠迟发型变态反应的影响：

对细胞免疫功能的影响

3、对小鼠抗体生成细胞检测的影响：

对抗体生成细胞功能的影响

4、对小鼠血清溶血素滴度水平的影响：

对小鼠溶血素滴度水平的影响

5、对小鼠碳廓清功能的影响：

对小鼠碳廓清功能的影响

6、对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬红细胞的影响：

对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响

7、对小鼠NK细胞活性的影响：

对小鼠NK细胞活性的影响

结果显示：缺失玛咖、红景天、枸杞子任意一味药材，有一定的作用，但与阴性对照组、酒基对照组比较在对小鼠脾淋巴细胞转化的影响、对小鼠迟发型变态反应的影响、对小鼠抗体生成细胞检测的影响、对小鼠血清溶血素滴度水平的影响、对小鼠碳廓清功能的影响、对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬红细胞的影响、对小鼠NK细胞活性的影响，均没有显著性差异，缺失玛咖、红景天、枸杞子中任何一味药材在对小鼠淋巴器官/体重比值的影响实验中表明没有影响。按照功能作用评价程序规定，综合以上各项试验结果判定，缺失玛咖、红景天、枸杞子任意一味药材组合物有一定的增强免疫力作用，但与阴性对照组、酒基对照组比较有显著性差异，应该评价为没有增强免疫力的功能。

实施例8

本实施例是用实施例3制得组合物进行安全性毒理学实验。

1材料和方法

1.1样品及处理样品由北京希科奥科技有限公司提供。人群推荐日摄入量为100ml成品酒/人/天，即1.67ml成品酒/kg BW或0.111ml(15倍浓缩液)/kg BW(按照成人60kg体重均值计算)。本试验所使用的样品为15倍浓缩液(酒精度已调整至15°)，另外，酒基为15°。以下试验均采用15倍浓缩液样品。

1.2动物品种及来源：同实施例4中的1.2样品来源及处理

1.3小鼠急性经口毒性试验

1.3.1剂量设置：受试样品小鼠灌胃剂量为20.0ml/kg BW，相当于成人推荐日摄入量0.111ml(15倍浓缩液)/kg BW的180.18倍。

1.3.2样品配制：将厂家提供的15倍浓缩液直接灌胃。

1.3.3试验方法：最大耐受量法。选用SPF级昆明种小鼠，体重为18～22g，雌雄各10只，灌胃前16小时动物禁食不禁水，称重后经口一次灌胃给予灌胃容量为20ml/kg BW。灌胃当天连续观察，以后每天观察2次直至第14天，并记录动物中毒症状及死亡数，试验结束时未死亡动物称重。

1.4遗传毒性试验

1.4.1小鼠骨髓细胞微核试验

1.4.1.1试验动物：选用体重为25～30g的昆明种小鼠，雌雄各25只，随机分成5组，每组雌雄各5只。

1.4.1.2试剂与仪器：环磷酰胺，批号11042421，由江苏恒瑞医药股份有限公司提供；奥林巴斯显微镜(日本产)。

1.4.1.3剂量分组：(1)阴性对照组给予(15°v/v)酒基；(2)阳性对照组经口灌胃给予环磷酰胺40mg/kgBW；(3)受试样品低、中、高三个剂量组，2.78、5.55、11.10ml(15倍浓缩液)/kgBW。

1.4.1.4样品配制：准确量取15倍浓缩液22.2、11.1、5.6ml，分别放入小烧杯中，加适量酒基(15°v/v)充分搅拌均匀，最后定容至40ml，浓度分别为0.56、0.28、0.14ml(30浓缩液)/ml。准确确称取环磷酰胺0.12g，定容至60ml，使成澄清溶液，浓度为0.002g/ml。

1.4.1.5试验方法：采用30小时试验法，即分两次灌胃给予受试物，间隔24小时，受试样品各组每次小鼠灌胃容量均为20ml/kg BW。于第二次给予受试物后6小时处死动物，取股骨做骨髓涂片，自然干燥后用甲醇固定，Giemsa染色。每只动物油镜下观察1000个嗜多染红细胞，记录出现微核的嗜多染红细胞数，其微核发生率以含微核的PCE千分率计；计数200个嗜多染红细胞数(PCE)，同时计数成熟红细胞数(NCE)，并计算PCE占红细胞总数(PCE+NCE)百分比。

1.4.1.6数据统计处理方法：SPSS软件建立数据库，采用卡方检验对微核率按动物性别分别统计。

1.4.2小鼠精子畸形试验

1.4.2.1试验动物：选用体重为25～35g的昆明种雄性小鼠，25只，随机分成5组，每组5只。

1.4.2.2试剂与仪器：同1.4.1.2。

1.4.2.3剂量分组：同1.4.1.3。

1.4.2.4样品配制：同1.4.1.4。

1.4.2.5试验方法：各试验组小鼠均连续5天给予相应的受试物，小鼠灌胃容量均为20ml/kg BW，继续喂养30天后(即在首次给受试物后的第35天)处死动物。取两侧附睾置于0.5ml生理盐水中，用眼科剪将附睾纵向剪1-2刀，用四层擦镜纸过滤后涂片，空气干燥后，甲醇固定，再用1％伊红染色。每只动物高倍镜下观察1000个精子，记录畸形精子数，计算畸形精子发生率(以千分率计)，并进行统计处理。

1.4.2.6数据统计处理方法：SPSS软件建立数据库，每个剂量组分别与相应的阴性对照组比较，用卡方检验方法评价精子畸形阳性率。

1.530天喂养试验

1.5.1剂量及分组；选100只体重60～80g Wistar大鼠，雌雄各半，随机分成阴性对照组、酒基对照组、低、中、高三个剂量组，即2.78、5.55、11.10ml(15倍浓缩液)/kg BW，受试样品低、中、高剂量组分别相当于成人推荐日摄入量的25、50、100倍。阴性对照组和酒基对照组分别给予等容量的蒸馏水和酒基。每组雌雄各10只大鼠，饲养方法为单笼喂养。

1.5.2样品配制及给予：准确量取15倍浓缩液18.5、37.6、74.0ml，分别放入烧杯中，加适量酒基(15°)充分搅拌均匀，最后定容至100ml，浓度分别为0.185、0.370、0.740ml(15倍浓缩液)/ml。大鼠灌胃容量为15ml/kg BW。

1.5.3观察指标：包括

①一般临床症状：一般表现，行为，中毒症状和死亡情况。

②体重、进食量和食物利用率。

③血液学检查：试验结束时测定血红蛋白(HB)、红细胞计数(RBC)、白细胞(WBC)计数及分类、淋巴细胞(LY％)、单核细胞(MO％)、粒细胞(GR％)，均用日本光电MEK-6318K型自动血球计数仪测定。

④血液生化检查：试验结束时测定血清谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、血清尿素氮(BUN)、总胆固醇(TCH)、甘油三酯(TG)、肌酐(Cr)、血糖(GLu)、血清白蛋白(Alb)、总蛋白(TP)等指标。检测仪器为：日立7020型全自动生化分析仪。检测试剂为：上海丰汇医学科技有限公司生产的试剂盒。

⑤脏器重量和脏/体比值(为禁食后的体重，即剖杀重)。

⑥病理组织学检查：大体解剖：对30天喂养试验的SPF级Wistar大鼠各剂量组禁食16h，3％戊巴比妥钠溶液(80mg/kgBW)麻醉，腹主动脉采血。而后立即放血处死动物，解剖，肉眼观察每只动物心、肝、脾、肺、肾、胃肠等胸腹腔内器官有无颜色改变、渗出液、水肿、增生、萎缩等病变，做好记录。用眼科镊和眼科剪分离肝、脾、肾、胃肠、睾丸(雄性)等脏器，清除干净各脏器周围结缔组织和脂肪组织，用电子天平(精确度为0.01g)逐一称重(胃肠除外)，再用10％福尔马林溶液立即固定。

病理切片检查：大体解剖肉眼未见异常，故选取阴性对照组和高剂量组作病理切片。

选取阴性对照组和高剂量组各20只动物(雌雄各半)部分脏器(肝、脾脏、肾、胃肠、卵巢和睾丸)，取材后，常规脱水、透明、浸蜡、制片及HE染色，在光学显微镜下由低倍至高倍观察各组织的形态学变化，并详细记录描述所观察到的形态学变化。

病理结果评价标准：与阴性对照组比较，以镜下形态学变化进行描述判断。

病理组织学观察：依各脏器形态学结构各异，但主要是以细胞的变性作为观察指标，并根据病理改变程度“-”、“+”、“++”、“+++”量化，本试验所获数据采用非参数统计法(Nonparametric statistic)进行病理改变的评价。

细胞变性：包括浊肿、空泡样变、水样变性和脂肪变性、炎性细胞浸润，(其中肾小球尚需观察大小不一、近端曲细小管主要观察细胞的混浊肿胀、远端曲细小管主要观察水样变和脂肪变性，胃肠组织以观察粘膜、粘膜下、肌层、浆膜层等部位)共分3级。

+散在的单个细胞浊肿、脂滴及胞浆状物和灶状炎性细胞浸润。

(包括肾小球大小不一，胃肠粘膜上皮变性)-----------------------------1分

++灶状细胞浊肿，脂滴或形成透明状空泡。

(3-5个细胞形成灶状和肾小球大小不一超过3-5个)-----------------------2分

+++数个细胞相融成片状空泡和边缘光滑的脂滴，肾小球囊内可见明显炎性细胞浸润或肾小球大小不一明显，胃肠粘膜各层可见多个炎性细胞浸润灶等病理改变。3分

细胞坏死：散在个别细胞占整个视野的1/4，2分；坏死细胞占整个视野的1/2，4分；坏死细胞占整个视野的3/4，6分；坏死细胞弥漫存在占整个视野，8分。

2实验结果

2.1小鼠急性经口毒性试验

对小鼠急性毒性试验结果(均数±标准差)

结论：在两周观察期内动物未见明显中毒症状，亦无动物死亡，MTD值大于20.0ml(15倍浓缩液)/kg BW，按急性毒性分级标准评价，该受试样品属无毒级。

2.2.1小鼠骨髓细胞微核试验

对小鼠骨髓细胞微核试验结果

^**：与阴性对照组比较，P＜0.01；PCE：嗜多染红细胞，NCE：成熟红细胞。

结论：与阴性对照组比较，阳性对照组雌雄小鼠微核率有极显著性差异(P＜0.01)，而受试样品各剂量组雌雄小鼠微核率差异均无显著性(P＞0.05)，且均在实验室测定值正常范围内，表明该受试样品骨髓细胞微核试验结果为阴性。受试物各组未成熟红细胞占红细胞总数的比例[PCE/(PCE+NCE)总数]均不少于阴性对照组的20％。

2.2.2小鼠精子畸形试验

对小鼠精子畸形试验结果

▲其他畸形：包括尾折叠、双头、双尾等；**：与阴性对照组比较，P＜0.01。

结论：与阴性对照组比较，阳性对照组小鼠精子畸形发生率有显著性差异(P＜0.01)；而受试样品各剂量组差异均无显著性(P＞0.05)，且在实验室测定值正常范围内，表明该受

试样品精子畸形试验结果为阴性。

2.3 30天喂养试验

30天喂养试验结果表明：将受试样品按2.78、5.55、11.10ml(15倍浓缩液)/kg BW剂量(分别相当于成人推荐日摄入量的25、50、100倍)对SPF级Wistar大鼠连续给予30天，动物未见中毒症状和死亡。受试样品各剂量组大鼠体重、进食量、食物利用率、血液学、血液生化、脏器重量、脏/体比值以及病理组织学等指标与阴性对照组和酒基对照组比较，差异均无显著性，结果为未发现该受试样品有毒性作用。

实施例9

本实施例是用实施例3制得组合物，该组合物用人参替代西洋参，进行小鼠急性经口毒性试验。试验方法同实施例8的1.3小鼠急性经口毒性试验。

实验结果

小鼠急性经口毒性试验

对小鼠急性毒性试验结果(均数±标准差)

结论：在两周观察期内动物可将明显中毒症状，3只动物死亡，7只有明显中毒症状，MTD值大于20.0ml(15倍浓缩液)/kg BW，按急性毒性分级标准评价，该受试样品属有毒级。结果表明本发明的组合物西洋参不能被人参取代。

Claims

1.一种缓解体力疲劳、增强免疫力的组合物，其有效成分主要由下列重量份的原料比组成：

玛咖10～80份、红景天2～30份、西洋参2～40份、巴戟天5～50份、枸杞子5～60份。

2.权利要求1所述的缓解体力疲劳、增强免疫力的组合物，其有效成分主要由下列重量份的原料比组成：

玛咖20～60份、红景天5～15份、西洋参5～25份、巴戟天10～30份、枸杞子10～50份。

3.权利要求1-2所述的缓解体力疲劳、增强免疫力的组合物，其有效成分主要由下列重量份的原料比组成：

玛咖40份、红景天10份、西洋参15份、巴戟天20份、枸杞子30份。

4.权利要求1-3任一项所述的抗疲劳、增强免疫力的组合物，其中所述组合物为酒剂。

5.权利要求1-3任一项所述的缓解体力疲劳、增强免疫力的组合物的制备方法，所述方法以下步骤：

所述重量份的玛咖、红景天、西洋参、巴戟天、枸杞子，其中玛咖，则先粉碎成粉，所得玛咖粉用干净布袋分袋包裹，置浸提灌底，再将其余原料均匀铺于浸提罐中，加6-20倍量白酒(50％-85％)于浸提罐中，密闭，浸提7-28天；浸提时每隔12-48小时，循环1次酒液。浸提结束放出酒液，药渣压榨，酒液200目筛滤过，得浸提酒液；浸提酒液加入适量的纯化水、白酒(50％-85％)，循环搅拌，使充分混合均匀，勾兑至酒精度为36％，并调至配方量，得勾兑酒液；将勾兑酒液置0-10℃冷藏，冷藏后过滤，得所述的组合物。

6.权利要求1-3任一项所述的组合物在制备缓解体力疲劳、增强免疫力的保健品中应用。

7.根据权利要求6所述应用，其特征在于，所述保健品为酒剂。