CN106820134A - 一种基于芝芪菌质的免疫增强剂的制备方法和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于灵芝菌‑黄芪药渣双向性固体发酵复合物的免疫增强剂的制备方法和用途,属于医药技术领域。即将黄芪药渣配制成发酵基质,取灵芝菌种接种于该发酵基质中,于25℃恒温发酵室培养,待菌丝体长满瓶时记为0天,25天后终止发酵,收集整瓶发酵产物,冷冻干燥,得芝芪菌质。用现有的中药制备技术和工艺方法制成任何固体剂型的免疫增强剂,包括颗粒剂、片剂、胶囊剂等,而芝芪菌质40%乙醇洗脱液水溶性极好,除制成固体剂型外,还可制成口服液等液体剂型。本发明旨在通过双向固体发酵技术合理开发利用黄芪药渣,变废为宝,将芝芪菌质制成增强人体机体免疫力的功能性食品及药品,应用前景良好。
Description
技术领域
本发明属于医药技术领域,具体涉及一种基于芝芪菌质的免疫增强剂的制备方法和用途。
背景技术
双向性固体发酵技术是将药用真菌发酵菌种(例如灵芝、槐耳、姬松茸等)和发酵基质(具一定活性成分的中药材或药渣)构成发酵组合,双方如相适应则在一定条件下进行固体发酵。芝芪菌质是将灵芝菌种接种于黄芪药渣中进行固体发酵得到的灵芝菌丝体与黄芪药渣的发酵复合体。一方面培养基中黄芪药渣的化学成分为灵芝真菌的生长提供营养,另一方面灵芝真菌的酶又可改变黄芪药渣的组织和成分,故具有双向性。
中药药材加工为中成药后剩留大量尚含有各种残余成分的药渣,但它大多被废弃。双向固体发酵技术是目前开发药渣最有希望的途径,可被用来开发药渣,以产生各种有用的药性菌质(药渣与真菌菌丝发酵复合体),它作为一种新资源可继续研发成新药或保健品、功能性食品等。黄芪精口服液是国家保护中药品种,收载于部颁标准中药成方制剂第十六册WS3-B-3101-98,目前国内有多个厂家生产该产品,每年有大量黄芪药渣作为废弃物待处理。黄芪药渣已被证实是有效的药性基质,可通过双向性固体发酵技术进行再开发利用。
目前,利用灵芝菌-黄芪药渣双向性固体发酵复合物制备免疫增强剂的报道尚未见报道,其中中国专利200810156224.6公开了一种6-O-β-D-葡萄糖基-3,6,16,25-四羟基环菠萝蜜烷的制备方法,该方法也采用了灵芝菌和黄芪药渣的双向性固体发酵技术,但与本专利的发酵方法不一样,与本专利的发酵产物的处理方法也不一样,与本专利的发明目的也不一样。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于芝芪菌质的免疫增强剂的制备方法和用途。该方法可有效利用黄芪药渣,减少环境污染,合理利用废弃资源。
发明内容:
一:一种基于芝芪菌质的免疫增强剂,制备方法包括下述步骤:
(1)芝芪菌质的制备:
(a)将20-40%乙醇提取后的黄芪药渣,烘干,粉碎,过筛,混匀,调节含水量至55%-65%,装于发酵瓶中,物料体积占发酵瓶容器体积的1/3-1/2,121℃高压灭菌120min,得黄芪药渣发酵基质备用,
(b)取灵芝菌种接种于黄芪药渣发酵基质中,于恒温发酵室培养,待菌丝体长满瓶时记为0天,15-35天后终止发酵,
(c)收集整瓶发酵产物,干燥,得芝芪菌质;
(2)芝芪菌质水提液的制备:
芝芪菌质和水按质量比1:10-1:12混合,加热回流提取,提取液过滤,滤液为芝芪菌质水提液;
(3)免疫增强剂的制备:
使用芝芪菌质水提液制成功能性食品及药品常规剂型中的一种。
所述基于芝芪菌质的免疫增强剂,制备方法(1)中,
方法(a)所述的黄芪药渣干燥温度为50-60℃;
方法(b)所述的恒温发酵室温度为25℃,25~30天后终止发酵;
方法(c)所述的干燥方式为冷冻干燥。
所述基于芝芪菌质的免疫增强剂,制备方法(2)中,
加热回流提取时间为1-2小时,提取次数为2-3次;
所述基于芝芪菌质的免疫增强剂,制备方法(3)中,芝芪菌质水提液制成片剂、胶囊剂、颗粒剂、口服液中的一种。
二:一种基于芝芪菌质的免疫增强剂,制备方法包括下述步骤:
(1)芝芪菌质的制备:
(a)将20-40%乙醇提取后的黄芪药渣,烘干,粉碎,过筛,混匀,调节含水量至55%-65%,装于发酵瓶中,物料体积占发酵瓶容器体积的1/3-1/2,121℃高压灭菌120min,得黄芪药渣发酵基质备用,
(b)取灵芝菌种接种于黄芪药渣发酵基质中,于恒温发酵室培养,待菌丝体长满瓶时记为0天,15-35天后终止发酵,
(c)收集整瓶发酵产物,干燥,得芝芪菌质;
(2)芝芪菌质水浸液的制备:
芝芪菌质和水按适宜比例混合,在适宜状态下研磨,过滤,滤液为芝芪菌质水浸液;
(3)免疫增强剂的制备:
芝芪菌质水浸液制成功能性食品及药品常规剂型中的一种。
所述基于芝芪菌质的免疫增强剂,制备方法(1)中,
方法(a)所述的黄芪药渣干燥温度为50-60℃;
方法(b)所述的恒温发酵室温度为25℃,25~30天后终止发酵;
方法(c)所述的干燥方式为冷冻干燥。
所述基于芝芪菌质的免疫增强剂,制备方法(2)中,
适宜状态为冰敷状态或4℃状态。
所述基于芝芪菌质的免疫增强剂,制备方法(3)中,芝芪菌质水浸液制成口服液。
三:一种基于芝芪菌质的免疫增强剂,制备方法包括下述步骤:
(1)芝芪菌质的制备:
(a)将20-40%乙醇提取后的黄芪药渣,烘干,粉碎,过筛,混匀,调节含水量至55%-65%,装于发酵瓶中,物料体积占发酵瓶容器体积的1/3-1/2,121℃高压灭菌120min,得黄芪药渣发酵基质备用,
(b)取灵芝菌种接种于黄芪药渣发酵基质中,于恒温发酵室培养,待菌丝体长满瓶时记为0天,15-35天后终止发酵,
(c)收集整瓶发酵产物,干燥,得芝芪菌质;
(2)芝芪菌质活性部位的制备:
(a)芝芪菌质和水按质量比1:10-1:12混合,加热回流提取,提取液过滤,滤液为芝芪菌质水提液;
(b)(a)项下的芝芪菌质水提液经大孔树脂分离处理后,采用洗脱液得到不同洗脱系列的免疫活性部位;
(3)免疫增强剂的制备:
芝芪菌质水提液各免疫活性部位制成功能性食品及药品常规剂型中的一种。
所述基于芝芪菌质的免疫增强剂,制备方法(1)中,
方法(a)所述的黄芪药渣干燥温度为50-60℃;
方法(b)所述的恒温发酵室温度为25℃,25~30天后终止发酵;
方法(c)所述的干燥方式为冷冻干燥。
所述基于芝芪菌质的免疫增强剂,制备方法(2)中,
方法(a)中的加热回流提取时间为1-2小时,提取次数为2-3次;方法(b)中洗脱液为水或40%乙醇或95%乙醇。
所述基于芝芪菌质的免疫增强剂3,制备方法(2)(b)中,洗脱液为40%乙醇。
所述基于芝芪菌质的免疫增强剂,制备方法(3)中,芝芪菌质水提液大孔树脂分离后的各免疫活性部位,制成片剂、胶囊剂、颗粒剂、口服液中的一种。
四:所述基于芝芪菌质的免疫增强剂在制备增强人体机体免疫力的功能性食品及药品中的应用。
本发明灵芝菌种从中国普通微生物菌种保藏管理中心China GeneralMicrobiological Culture Collection Center,CGMCC购得。
本发明的有益效果是:以实现资源利用最大化为目的,将黄芪药渣作为二次中药资源利用,不仅变废为宝,减少环境污染,而且得到的芝芪菌质提取物及各分离部位具有免疫增强活性,可作为功能性食品及药品,使黄芪药渣再次在人类医药保健方面发挥作用,实现了较高的生态学效益和社会效益。
具体实施方式
以下通过实施例形式,对本发明的上述内容再作进一步的详细说明,但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例,凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
实施例1:芝芪菌质的制备:
将30%乙醇提取后的黄芪药渣1000g,置于60℃电热鼓风干燥箱烘干,用粉碎机粉碎,过10目筛,混匀,加水,调节含水量至55%,装于发酵瓶中,物料体积占发酵瓶容器体积的1/2,121℃高压灭菌120min,得黄芪药渣发酵基质备用。取固体培养基干重量10-15%的灵芝菌种接种于黄芪药渣发酵基质中,于25℃恒温发酵室培养,待菌丝体长满瓶时记为0天,25天后终止发酵。收集整瓶发酵产物,冷冻干燥,得芝芪菌质。
实施例2:芝芪菌质水提液的制备:
芝芪菌质和水按质量比(1:10-1:12)混合,加热回流提取2次,每次1.5h,提取液过滤,滤液合并为芝芪菌质水提液。
实施例3:芝芪菌质水浸液的制备:
取实施例1方法制备的芝芪菌质和水按适宜比例混合,在冰敷状态下研磨,过滤,滤液为芝芪菌质水浸液。
实施例4:芝芪菌质采用大孔树脂水洗脱液提取活性部位:
取实施例2方法制备的芝芪菌质水提液,使其流经大孔树脂,用水洗脱液(4倍大孔树脂体积量)洗脱,得到水洗脱液活性部位。
实施例5:芝芪菌质采用大孔树脂40%乙醇洗脱液提取活性部位:
取实施例2方法制备的芝芪菌质水提液,使其流经大孔树脂,用40%乙醇洗脱液(5倍大孔树脂体积量)洗脱,得到40%乙醇洗脱液活性部位。
实施例6:芝芪菌质采用大孔树脂95%乙醇洗脱液提取活性部位:
取实施例2方法制备的芝芪菌质水提液,使其流经大孔树脂,用95%乙醇洗脱液(4倍大孔树脂体积量)洗脱,得到95%乙醇洗脱液活性部位。
实施例7:免疫增强剂的制备:
取实施例2制备的芝芪菌质水提液,减压浓缩至稠状,倒出,冷冻干燥,粉碎,过200目筛,混匀,装入空胶囊壳中,即得。
实施例8:免疫增强剂的制备:
取实施例3制备的芝芪菌质水浸液,过滤,滤液备用;另取蔗糖500g制成糖浆,与滤液合并,加入防腐剂适调整总量,静置,滤过,灌装,即得。
实施例9:免疫增强剂的制备:
取实施例4制备的芝芪菌质水洗脱液,减压浓缩至稠状,倒出,冷冻干燥,粉碎,过200目筛,混匀,装入空胶囊壳中,即得。
实施例10:免疫增强剂的制备:
取实施例5制备的芝芪菌质40%乙醇洗脱液,减压浓缩至稠状,倒出,冷冻干燥,粉碎,过200目筛,混匀,装入空胶囊壳中,即得。
实施例11:免疫增强剂的制备:
取实施例6制备的芝芪菌质95%乙醇洗脱液,减压浓缩至稠状,倒出,冷冻干燥,粉碎,过200目筛,混匀,装入空胶囊壳中,即得。
实施例12:免疫增强剂的制备:
取实施例5制备的芝芪菌质40%乙醇洗脱液,减压浓缩至干,加水溶解,溶液备用;取蔗糖500g制成糖浆,与溶液合并,加入防腐剂适调整总量,静置,滤过,灌装,即得。
实施例13:实验名称:非特异性免疫功能实验----小鼠碳粒廓清实验
实验药品:取上述实施例7、8、9、10、11制备的免疫增强剂,除实施例8直接使用外,其余制剂剥去空胶囊壳,将干燥细分直接加水溶解,得相应给药组。
实验过程:
分组方法----取昆明雄性小鼠96只(18-22g),随机分成8组,每组12只:正常组、模型(环磷酰胺)组、阳性(匹多莫德,0.32g/kg)组、给药组5组(实施例7、8、9、10、11制备的免疫增强剂)。除正常组外,其它各组均采用环磷酰胺复制免疫缺陷小鼠模型。
造模方法----实验第1-3d腹腔注射环磷酰胺(80mg/kg),1次/d,连续3d。第6d再以相同剂量强化一次。
给药方法----第1天开始灌胃给药,0.1mL/10g/d给药,400mg/kg,1次/d,连续给药7d,第6d晚禁食12h后,第7d上午最后1次给药,进行检测。
检测方法----每只鼠尾静脉注射5倍稀释的印度墨汁0.05mL/10g体重,分别于第2、12min用毛细采血管在小鼠眼眶后静脉丛取血20μL溶于2mL 0.1%Na2CO3溶液中,摇匀。以0.1%Na2CO3溶液作空白,于600nm处测定吸光度。
检测指标----取小鼠肝、脾脏,称重。计算廓清指数K、校正廓清指数α。
K=(log OD1-log OD2)/(t2-t1)
实验结果:
表1实验各组的碳粒廓清实验结果(n=10)
注:※p<0.05;※※p<0.01
实验结论:上述实验结果提示,实施例7、8、10药品可显著提高免疫缺陷小鼠的非特异免疫吞噬功能,表明其均有免疫增强作用。
实施例14:实验名称:非特异性免疫功能实验----鸡红细胞吞噬功能实验
实验药品:同实施例13。
实验过程:
分组、给药、造模方法----同实施例13。
检测方法----最后一次给药后1h,每只小鼠腹腔注射1%鸡红细胞悬液1mL。间隔30min颈椎脱臼处死,将其仰位固定于鼠板上,正中剪开腹壁皮肤,经腹腔注入生理盐水1mL,转动鼠板1min。然后吸出腹腔液0.5mL,平均分滴于2片玻片上,用生理盐水漂洗,自然干燥,以甲醇溶液固定,加入瑞氏染液染色1min,滴加pH 6.5的PBS与染液混匀,静置5min,纯净水冲去染料,干燥后镜下观察计数,计算吞噬率和吞噬指数。
检测指标----吞噬百分率(%)=吞噬鸡红细胞的巨噬细胞数/计数的巨噬细胞数×100%;吞噬指数=被吞噬的鸡红细胞总数/计数的巨噬细胞数×100%。
实验结果:
表2实验各组的鸡红细胞吞噬功能实验结果(n=10)
注:※p<0.05;※※p<0.01
实验结论:上述实验结果提示,实施例7、8、10药品可显著提高免疫缺陷小鼠的非特异免疫吞噬功能,表明其具有免疫增强作用。
实施例15:实验名称:特异性免疫功能实验----小鼠血清溶血素实验
实验药品:同实施例13。
实验过程:
分组、给药、造模方法----同实施例13。
检测方法----给药7d后,每鼠腹腔注射20%绵羊红细胞悬液0.2mL致敏,给药14d后眼眶取血制备血清,用于溶血素的检测。将收集好的血清做系列稀释,确定最佳稀释度。吸取稀释的血清0.5mL放入另一试管中,依次加入20%SRBC、1:10稀释补体、0.9%生理盐水各0.5mL,空白管用生理盐水代替血清,混匀,置37℃温箱温1h,然后置冰浴中5min以终止反应,离心,取上清液于540nm处测定OD值,计算出溶血素含量。
检测指标----溶血素含量=样本血清的OD值×稀释倍数。
实验结果:
表3实验各组小鼠血清溶血素的含量(n=10)
注:※p<0.05;※※p<0.01
实验结论:上述实验结果提示,实施例7、8、10药品可显著提高免疫缺陷小鼠的特异性免疫功能,表明其具有免疫增强作用。
实施例16:实验名称:特异性免疫功能实验----小鼠血清IgM、IgG含量测定
实验药品:同实施例13。
实验过程:
分组、给药、造模方法----同实施例13。
检测方法----采用ELISA法,按照说明书要求测定血清中IgG、IgM含量。
实验结果:
表4实验各组小鼠血清的IgM、IgG含量(n=10)
注:※p<0.05;※※p<0.01
实验结论:上述实验结果提示,实施例7、8、9、10、11药品可显著提高免疫缺陷小鼠的特异性体液免疫功能,表明其具有免疫增强作用。
实施例17:实验名称:特异性免疫功能实验----小鼠脾淋巴细胞增殖
实验药品:同实施例13。
实验过程:
含药血清的制备----实验各组大鼠连续灌胃7d后,颈动脉取血,制备含药血清。
脾细胞原代培养----小鼠用75%乙醇浸泡5min,无菌操作取脾脏,用完全RPMI-1640培养液制备2.0×106/mL的脾细胞悬液,台盼蓝检测细胞活力>95%以上,备用。
实验方法----将100μL脾细胞悬液分别加入96孔培养板中,Con A(终浓度为5μg/mL)及含药血清,总体积200μL。设置只加200μL RPMI-1640培养基为空白对照。每实验组设10个复孔。加液后把培养板置于微量振荡器上振荡2min混匀,于37℃含5%CO2培养箱中温育72h,变色后用MTT法于酶标仪测吸光值A(λ=490nm)。增殖指数SI=给药组A/ConA组A。
实验结果:
表5实验各组对小鼠脾淋巴细胞增殖的影响
注:※p<0.05;※※p<0.01
实验结论:上述实验结果提示,实施例7、8、10药品可显著提高免疫缺陷小鼠的特异性细胞免疫功能,表明其具有免疫增强作用。
以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以对本发明进行若干改进和修饰,这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。
对所公开的实施例的上述说明,使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的,本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下,在其它实施例中实现。因此,本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例,而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
Claims (10)
1.一种基于芝芪菌质的免疫增强剂,其特征在于,制备方法包括下述步骤:
(1)芝芪菌质的制备:
(a)将20-40%乙醇提取后的黄芪药渣,烘干,粉碎,过筛,混匀,调节含水量至55%-65%,装于发酵瓶中,物料体积占发酵瓶容器体积的1/3-1/2,121℃高压灭菌120min,得黄芪药渣发酵基质备用,
(b)取灵芝菌种接种于黄芪药渣发酵基质中,于恒温发酵室培养,待菌丝体长满瓶时记为0天,15-35天后终止发酵,
(c)收集整瓶发酵产物,干燥,得芝芪菌质;
(2)芝芪菌质水提液的制备:
芝芪菌质和水按质量比1:10-1:12混合,加热回流提取,提取液过滤,滤液为芝芪菌质水提液;
(3)免疫增强剂的制备:
使用芝芪菌质水提液制成功能性食品及药品常规剂型中的一种。
2.一种基于芝芪菌质的免疫增强剂,其特征在于,制备方法包括下述步骤:
(1)芝芪菌质的制备:
(a)将20-40%乙醇提取后的黄芪药渣,烘干,粉碎,过筛,混匀,调节含水量至55%-65%,装于发酵瓶中,物料体积占发酵瓶容器体积的1/3-1/2,121℃高压灭菌120min,得黄芪药渣发酵基质备用,
(b)取灵芝菌种接种于黄芪药渣发酵基质中,于恒温发酵室培养,待菌丝体长满瓶时记为0天,15-35天后终止发酵,
(c)收集整瓶发酵产物,干燥,得芝芪菌质;
(2)芝芪菌质水浸液的制备:
芝芪菌质和水按适宜比例混合,在适宜状态下研磨,过滤,滤液为芝芪菌质水浸液;
(3)免疫增强剂的制备:
芝芪菌质水浸液制成功能性食品及药品常规剂型中的一种。
3.一种基于芝芪菌质的免疫增强剂,其特征在于,制备方法包括下述步骤:
(1)芝芪菌质的制备:
(a)将20-40%乙醇提取后的黄芪药渣,烘干,粉碎,过筛,混匀,调节含水量至55%-65%,装于发酵瓶中,物料体积占发酵瓶容器体积的1/3-1/2,121℃高压灭菌120min,得黄芪药渣发酵基质备用,
(b)取灵芝菌种接种于黄芪药渣发酵基质中,于恒温发酵室培养,待菌丝体长满瓶时记为0天,15-35天后终止发酵,
(c)收集整瓶发酵产物,干燥,得芝芪菌质;
(2)芝芪菌质活性部位的制备:
(a)芝芪菌质和水按质量比1:10-1:12混合,加热回流提取,提取液过滤,滤液为芝芪菌质水提液;
(b)(a)项下的芝芪菌质水提液经大孔树脂分离处理后,采用洗脱液得到不同洗脱系列的免疫活性部位;
(3)免疫增强剂的制备:
芝芪菌质水提液各免疫活性部位制成功能性食品及药品常规剂型中的一种。
4.根据权利要求1或2或3所述基于芝芪菌质的免疫增强剂,其特征在于,制备方法(1)中,
方法(a)所述的黄芪药渣干燥温度为50-60℃;
方法(b)所述的恒温发酵室温度为25℃,25~30天后终止发酵;
方法(c)所述的干燥方式为冷冻干燥。
5.根据权利要求1所述基于芝芪菌质的免疫增强剂,其特征在于,制备方法(2)中的加热回流提取时间为1-2小时,提取次数为2-3次。
6.根据权利要求2所述基于芝芪菌质的免疫增强剂,其特征在于,制备方法(2)中的适宜状态为冰敷状态或4℃状态。
7.根据权利要求3所述基于芝芪菌质的免疫增强剂,其特征在于,制备方法(2)(a)中的加热回流提取时间为1-2小时,提取次数为2-3次;制备方法(2)(b)中洗脱液为水或40%乙醇或95%乙醇。
8.根据权利要求7所述基于芝芪菌质的免疫增强剂,其特征在于,制备方法(2)(b)中,洗脱液为40%乙醇。
9.根据权利要求1或2或3所述基于芝芪菌质的免疫增强剂,其特征在于,制备方法(3)中,芝芪菌质水提液、水浸液和大孔树脂分离后的各免疫活性部位制成片剂、胶囊剂、颗粒剂、口服液中的一种。
10.权利要求1或2或3所述基于芝芪菌质的免疫增强剂在制备增强人体机体免疫力的功能性食品及药品中的应用。
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