CN103585400A - 具有增强免疫功能和缓解疲劳作用的组合物及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种具有增强免疫功能和缓解疲劳作用的组合物及其制备方法，所述组合物由以下原料制成：黄芪、人参、乳鸽肉、山药、枸杞子、龙眼肉、大枣和蛤蚧。

Description

具有增强免疫功能和缓解疲劳作用的组合物及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种具有增强免疫功能和缓解疲劳作用的组合物及其制备方法，所述组合物由以下原料制成：黄芪、人参、乳鸽肉、山药、枸杞子、龙眼肉、大枣和蛤蚧。

背景技术

疲劳是机体在一定环境条件下，由于长时间或过于繁重、紧张的劳动（包括脑力和体力）而引起的工作效率暂时降低的一种生理心理现象。免疫力是人体自身的防御机制，是人体识别和消灭外来侵入的任何异物（病毒、细菌等）；处理衰老、损伤、死亡、变性的自身细胞以及识别和处理体内突变细胞和病毒感染细胞的能力。

随着社会的进步，人们的生活、工作节奏不断加快，不断面临着来自社会、家庭的各种压力，经常出现饮食不合理、起居不规律、劳逸失衡、休息不足、过度紧张、压力过大以及不良情绪等身心问题，而自然环境的污染和恶化也威胁着人们的身心健康。这些因素导致身心失调，机体处于亚健康状态，免疫力下降，容易疲劳，甚至未老先衰。根据对2.3万的人流行病学调查，18-40岁的人随着年龄增长，心身轻度失调呈缓慢上升趋势；到了40岁以上，潜临床状态的比例陡然升高；55岁前后进入前临床状态的明显增多；65岁以上的人即使没有明确的病变存在，大多数人也处于生理性衰老状态。这告诉我们，亚健康状态在中年以后变得明朗化，滑向疾病的步伐迅速加快。因此，积极预防、改善和治疗亚健康状态对于疾病的预防非常重要。

亚健康的发病多因七情内伤，加之劳倦、饮食、生活不节等导致体内阴阳平衡失调，升降失常，气血津液、脏腑经络功能紊乱，出现心脾气血两亏、脾虚湿盛、肝郁气滞、气滞血疲、肝肾阴亏等；如不加调整进一步发展，引起脏腑气血功能失调，将会导致气滞、血疲、痰湿、郁久化热进而出现热、毒、疲、虚的一系列病理变化。中医学认为，应主要通过药物协调阴阳，调理脏腑，补气健脾等来治疗亚健康状态。亚健康人群以中年以上人群居多，他们大多数脏腑虚弱，气血亏少阴阳偏颇，故用药当以平和为主，重在调和气血阴阳，健脾和胃益肾。

因此，本领域需要能够有效增强免疫功能和缓解疲劳作用的药品、保健食品，以预防、改善和治疗亚健康状态。

发明内容

根据本发明的一个方面，提供了一种具有增强免疫功能和缓解疲劳作用的组合物，其特征在于所述组合物由以下原料制得：

黄芪、人参、乳鸽肉、山药、枸杞子、龙眼肉、大枣和蛤蚧。

根据本发明的另一个方面，提供了上述本发明的组合物的制备方法，所述方法包括以下步骤：

(a)将黄芪、人参、乳鸽肉、山药、枸杞子、龙眼肉、大枣和蛤蚧混合；

(a)用足量水、醇或醇的水溶液提取(a)中所得混合物；

(b)过滤步骤(b)所得混合物，收集滤液；

(c)任选地再将步骤(b)和(c)重复进行1-3次，优选2次，并且合并收集的滤液；

(d)任选地将合并的滤液浓缩和/或干燥；和

(e)任选地加入药学或食品可接受的添加剂。

本发明的组合物具有增强免疫功能和缓解疲劳的作用，可以用于预防、改善和/或治疗免疫力下降，亚健康状态，疲劳综合征，消化系统疾病如厌食、消化不良、腹胀嗳气、便秘或腹泻、慢性胃炎、萎缩性胃炎、胃肠功能紊乱等，呼吸系统疾病如流行性感冒、病毒性感冒以及易感体质、久咳、哮喘、慢性气管炎及支气管炎等，月经不调、贫血、神经衰弱、腰膝酸软、头晕耳鸣、视力下降、尿频、夜尿、阳痿早泄、性欲减退、记忆力下降等症状或疾病。

具体实施方式

在一个实施方案中，本发明的组合物由以下原料制得：

20-80重量份、优选30-60重量份、更优选40重量份的黄芪；10-40重量份、优选15-30重量份、更优选20重量份的人参；15-60重量份、优选22.5-45重量份、更优选30重量份的乳鸽肉；10-40重量份、优选15-30重量份、更优选20重量份的山药；13-52重量份、优选19.5-39重量份、更优选26重量份的枸杞子；3-12重量份、优选4.5-9重量份、更优选6重量份的龙眼肉；8-32重量份、优选12-24重量份的大枣、更优选16重量份的大枣；和3-12重量份、优选4.5-9重量份、更优选6重量份的蛤蚧。

在一个优选的实施方案中，所述组合物由以下原料制得：

20-80重量份的黄芪、10-40重量份的人参、15-60重量份的乳鸽肉、10-40重量份的山药、13-52重量份的枸杞子、3-12重量份的龙眼肉、8-32重量份的大枣和3-12重量份的蛤蚧。

在进一步优选的实施方案中，所述组合物由以下原料制得：

30-60重量份的黄芪、15-30重量份的人参、22.5-45重量份的乳鸽肉、15-30重量份的山药、19.5-39重量份的枸杞子、4.5-9重量份的龙眼肉、12-24重量份的大枣和4.5-9重量份的蛤蚧。

在一个更优选的实施方案中，所述组合物由以下原料制得：

40重量份的黄芪、20重量份的人参、30重量份的乳鸽肉、20重量份的山药、26重量份的枸杞子、6重量份的龙眼肉、16重量份的大枣和6重量份的蛤蚧。

本文使用的术语“黄芪”指豆科植物蒙古黄芪Astragalusmembranaceus(Fisch.)Bge.var.mongholicus(Bge.)Hsiao或膜荚黄芪Artragalus membranaceus(Fisch.)Bge.的干燥根，可以是生黄芪、炒黄芪和炙黄芪。

本文使用的术语“人参”指五加科植物人参Panax ginseng C.A.Mey.的干燥根和根茎，可以是各种种类的参，如园参、山参、生晒参、生晒山参、白糖参、红参；还可以选用人参叶替代所述人参。所述人参叶为五加科植物人参Panax ginseng C.A.Mey.的干燥叶。

本文使用的术语“乳鸽肉”是指将体重为0.30-0.40kg的家鸽(鸽形目(Columbiformes)鸠鸽科(Columbidae)鸽属(Columba))除去毛和内脏的鸽肉用烤箱于约120-140℃如约130℃，烘烤2-4小时如约3.5小时得到的干肉。使用前可于4℃或更低温度下储存，储存期限为约2年。

本文使用的术语“山药”指薯蓣科植物薯蓣Dioscorea oppositaThunb.的干燥根茎。

本文使用的术语“枸杞子”指茄科植物宁夏枸杞Lycium barbarumL.的干燥成熟果实。

本文使用的术语“龙眼肉”指无患子科植物龙眼Dimocarpuslongan Lour.的假种皮。

本文使用的术语“大枣”指鼠李科植物枣Ziziphus jujuba Mill.的干燥成熟果实。

本文使用的术语“蛤蚧”指壁虎科动物蛤蚧Gekko gecko Linnaeus的干燥体。

在一个实施方案中，本发明的组合物可以通过本领域中的常规方法和技术来制备，例如通过用水、醇（如甲醇或乙醇或其组合，优选乙醇）或醇的水溶液提取所述原料制得。优选地，所述组合物通过用乙醇水溶液提取所述原料制得，所述提取优选通过浸渍法或渗漉法进行。所述乙醇水溶液的乙醇浓度为20%-99%（v/v），优选为20%-75%（v/v），更优选为20%-55%（v/v）。在一个实施方案中，所述乙醇水溶液可以为适合的食用或饮用酒，包括酿造酒和蒸馏酒。

本文使用的术语“酿造酒”是指以谷物、水果等为原料经发酵而制得的含有乙醇的酒精饮料。酿造酒不经过进一步的蒸馏。所述酿造酒包括米酒（又称“醪糟”或“黄酒”等）、葡萄酒、果汁酒等。

本文所用的术语“蒸馏酒”是指通过蒸馏由谷物、水果或植物等发酵得到的乙醇而制得的含有乙醇的酒精饮料，包括白酒、清酒、白兰地、伏特加、威士忌、朗姆酒、龙舌兰酒、金酒等。其中，由谷物为原料制备的蒸馏酒称作“谷类酒”，如白酒、清酒、威士忌等。

在一个实施方案中，所述乙醇水溶液为酿造酒，例如米酒。在另一个实施方案中，所述乙醇水溶液为蒸馏酒，优选谷类酒，例如白酒。

上文提及各种酒是可以商购得到的，或者可以通过酿酒技术领域的常规方法和技术来制备得到。

本发明的组合物可以多种形式存在。

在一个实施方案中，所述组合物可以为溶液、悬浮液、流浸膏、浸膏或干燥固体如粉末、颗粒的形式。所述组合物为含有乙醇的溶液的形式，其中乙醇浓度为20%-75%（v/v），优选为20%-55%（v/v），更优选为20%-45%（v/v）。

任选地，所述组合物还包含药学或食品可接受的添加剂。所述添加剂可选自适合的赋形剂、填充剂、防腐剂、抗氧化剂、粘合剂、载体（如水、糖浆、酒基等）、着色剂、澄清剂、芳香剂、湿润剂、增塑剂、助悬剂、甜味剂、抗粘附剂、粘合剂、稀释剂、崩解剂、助流剂、润滑剂、增稠剂、张力剂等。

本发明的组合物可以是药物制剂的形式。

在一个实施方案中，本发明的组合物是口服药物制剂的形式，并且可以按照本领域的常规方法制备。

在进一步的实施方案中，所述口服药物制剂可以为液体制剂、混悬剂、浸膏剂、流浸膏剂或固体制剂的形式，例如酒剂、酊剂、合剂、糖浆剂、丸剂、散剂、片剂、胶囊、颗粒剂或滴丸。优选地，所述口服药物制剂为酒剂、酊剂、合剂或糖浆剂的形式，更优选为酒剂的形式。优选地，所述酒剂的乙醇浓度为20%-75%（v/v），优选为20%-55%（v/v），更优选为20%-45%（v/v），例如20%、32%、35%、38%、39%、40%、42%、45%、50%或52%（v/v）。以本发明组合物的原料（生药）的总重量计，所述酒剂包含约0.08-0.33、优选约0.12-0.25g、更优选约0.16g生药/ml酒剂。所述酒剂的日服用量可以为例如30ml或更少至150ml或更多/日，如50-120ml或75ml/日，可分1或2次服用，并且可每日、每隔一日、每隔二日或以其他时间间隔服用，视服用者的性别、年龄、体重、生活方式或一般健康情况等条件而定。

也可以将本发明的组合物配制成食品的形式，特别是酒精饮料的形式。优选地，所述酒精饮料的乙醇浓度为20%-75%（v/v），优选为20%-55%（v/v），更优选为20%-45%（v/v）。以本发明组合物的原料（生药）的总重量计，所述酒精饮料包含约0.08-0.33、优选约0.12-0.25g、更优选约0.16g生药/ml酒精饮料。所述酒精饮料的日服用量可以为例如30ml或更少至150ml或更多/日，如50-120ml或75ml/日，可分1或2次服用，并且可每日、每隔一日、每隔二日或以其他时间间隔服用，视服用者的性别、年龄、体重、生活方式或一般健康情况等条件而定。

可使用本领域技术人员所熟知的方法和食品可接受的添加剂将本发明的组合物配制成食品特别是酒精饮料的形式。

本申请还提供上述本发明的组合物的制备方法。所述方法可包括将上述本发明组合物的原料分开地提取，然后合并所得提取物的步骤；或者所述方法可包括将所述原料混合在一起提取的步骤。

在一个实施方案中，本发明的组合物通过包括以下步骤的方法制备：

(a)将黄芪、人参、乳鸽肉、山药、枸杞子、龙眼肉、大枣和蛤蚧混合；

(b)用足量水、醇或醇的水溶液提取(a)中所得混合物；

(c)过滤步骤(b)所得混合物，收集滤液；

任选地再将步骤(b)和(c)重复进行1-3次，优选2次，并且合并收集的滤液；

任选地将合并的滤液浓缩和/或干燥；和

任选地加入药学或食品可接受的添加剂。

在上述方法中，所述醇可以为甲醇、乙醇或其组合，优选乙醇，所述醇的水溶液可以为甲醇水溶液、乙醇水溶液或其组合，优选乙醇水溶液。

在一个实施方案中，在上述方法的步骤(b)中，使用乙醇水溶液进行所述提取，优选通过浸渍法或渗漉法，更优选通过浸渍法进行所述提取。

在一个特别的实施方案中，在上述方法的步骤(b)中，使用乙醇水溶液通过浸渍法进行所述提取，其中所述乙醇水溶液的乙醇浓度为20%-99%（v/v），优选为20%-75%（v/v），更优选为20%-55%（v/v）。优选地，所述乙醇水溶液为食用或饮用酒，包括酿造酒如米酒和蒸馏酒如谷类酒。优选地，在所述特别的实施方案中，在上述方法的步骤(b)中，于约18-32℃如约20-25℃，在密闭容器中进行所述浸渍6-24天，优选10-20天，更优选15天。从经济学的角度考虑，为了充分提取所述原料，所述方法可包括上述步骤(d)。进一步地，例如为了制备浓缩的浸膏或流浸膏、或者固体形式的组合物，或者利用如此获得组合物进一步配制成药物制剂或食品的形式，所述方法还可包括上述步骤(e)和/或(f)。或者，进一步地，例如为了制备溶液形式的组合物，上述方法还可包括以下步骤：(g)于约18-32℃如约20-25℃，在密闭容器中将步骤(c)或(d)中所得滤液陈化10-20天，优选12-18天，更优选15天，过滤并收集滤液，从而避免长期保存时析出沉淀。更优选地，上述方法还包括以下步骤：(h)将步骤(g)中所得滤液的乙醇浓度调整到20%-75%（v/v），优选20%-55%（v/v），更优选20%-45%（v/v）。由所述步骤(g)和/或(h)所得的液体组合物可以作为、或用于制备本发明的溶液形式、口服液体药物制剂形式或酒精饮料形式的组合物。其中，乙醇浓度的调整是本领域技术人员所熟知的，例如可以通过浓缩滤液和/或加入乙醇或更高浓度的乙醇水溶液来提高乙醇浓度，或者通过加入水或更低浓度的乙醇水溶液来降低乙醇浓度。

在一个具体的实施方案中，本发明的组合物通过包括以下步骤的方法制备：

(a)将200-800g黄芪、100-400g人参、150-600g乳鸽肉、100-400g山药、130-520g枸杞子、30-120g龙眼肉、80-320g大枣和30-120g蛤蚧混合；

(b)于约18-32℃（如约20-25℃），用1750-7000ml乙醇浓度为20%-55%(v/v)、优选20%的乙醇水溶液（优选米酒或白酒）在密闭容器中浸渍(a)中所得混合物10-20天，优选15天；

(c)过滤步骤(b)所得混合物，收集滤液；

(d)再重复进行步骤(b)和(c)1-3次，优选2次，并且合并收集的滤液；

(e)于约18-32℃（如约20-25℃），在密闭容器中将滤液陈化10-20天，优选12-18天，更优选15天，过滤并收集滤液；

(f)将所得滤液的乙醇浓度调整到20%-55%（v/v），优选20%-45%（v/v）；和

(g)任选地加入药学或食品可接受的添加剂。

在另一个具体的实施方案中，本发明的组合物通过包括以下步骤的方法制备：

(a)将400g黄芪、200g人参、300g乳鸽肉、200g山药、260g枸杞子、60g龙眼肉、160g大枣和60g蛤蚧混合；

(b)于约18-32℃（如约20-25℃），用3500ml乙醇浓度为20%(v/v)的乙醇水溶液（优选米酒或白酒）在密闭容器中浸渍(a)中所得混合物15天；

(c)过滤步骤(b)所得混合物，收集滤液。

(d)再重复进行步骤(b)和(c)2次，并且合并收集的滤液。

(e)于约18-32℃（如约20-25℃），在密闭容器中将滤液陈化15天，过滤并收集滤液。

(f)将所得滤液的乙醇浓度调整到20%(v/v)；和

(g)任选地加入药学或食品可接受的添加剂。

所述任选加入的药学或食品可接受的添加剂可选自适合的防腐剂、抗氧化剂、着色剂、澄清剂、芳香剂、助悬剂、甜味剂、张力剂等。

实验证明：（1）本发明的组合物能促进ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞增殖、转化能力，促进小鼠的迟发型变态反应，促进小鼠的抗体生成细胞增殖，提高小鼠的血清溶血素水平，促进小鼠的单核-巨噬细胞的吞噬功能，而对小鼠的体重增长、胸腺／体重比值、脾脏／体重比值及NK细胞活性无明显影响，表明本发明的组合物具有增强免疫功能的作用；（2）本发明的组合物能延长小鼠的负重游泳时间，减少疲劳小鼠的血清尿素产生，增加小鼠的肝糖原的储备量，减少小鼠运动后的血乳酸曲线下面积，而对小鼠的体重增长无明显影响，表明本发明的组合物具有缓解疲劳的作用。

因此，本发明的组合物、制剂、食品和酒精饮料可用于预防、改善和/或治疗免疫力下降，亚健康状态，疲劳综合征，消化系统疾病如厌食、消化不良、腹胀嗳气、便秘或腹泻、慢性胃炎、萎缩性胃炎、胃肠功能紊乱等，呼吸系统疾病如流行性感冒、病毒性感冒以及易感体质、久咳、哮喘、慢性气管炎及支气管炎等，月经不调、贫血、神经衰弱、腰膝酸软、头晕耳鸣、视力下降、尿频、夜尿、阳痿早泄、性欲减退、记忆力下降等症状或疾病。

下面通过实施例更详细地例示本发明，但下述实施例并不对本发明构成任何限制，本发明的范围仅由所附权利要求定义。

实施例

实施例1－本发明的溶液形式的组合物的制备

取黄芪400g、人参200g、乳鸽肉300g、山药200g、枸杞子260g、龙眼肉60g、大枣160g和蛤蚧60g，置于容器中，用20%(v/v)的白酒3500ml于室温、密闭条件下浸泡15天，过滤并收集滤液。再重复以上浸泡和过滤操作2次，并且合并收集的滤液，于室温下在密闭容器中陈化15天，并调整酒精度到20%，搅匀，过滤，得到约10000ml本发明的组合物。

实施例2－本发明的溶液形式的组合物的制备

取黄芪200g、人参100g、乳鸽肉150g、山药100g、枸杞子130g、龙眼肉30g、大枣80g和蛤蚧30g，置于容器中，用52%(v/v)的白酒1200ml于室温、密闭条件下浸泡10天，过滤并收集滤液。再重复以上浸泡和过滤操作3次，并且合并收集的滤液，得到约4600ml滤液，即为本发明的组合物。

实施例3－本发明的溶液形式的组合物的制备

除用约75%(v/v)的白酒、每次用5000ml浸渍并最后通过加入饮用水将酒精度调整到50%以外，以与实施例1相同的方法，用黄芪700g、人参150g、乳鸽肉500g、山药100g、枸杞子400g、龙眼肉30g、大枣100g和蛤蚧80g制得酒精度为50%的约20000ml本发明的组合物。

实施例4－本发明的流浸膏形式的组合物的制备

取黄芪200g、人参400g、乳鸽肉150g、山药150g、枸杞子130g、龙眼肉30g、大枣80g和蛤蚧40g，将乳鸽肉切碎，将其余药材粉碎成粗粉，置于容器中。用70%乙醇水溶液作溶剂，浸渍24小时后，以每分钟1-3ml的速度缓缓渗漉，收集初漉液900ml，另器保存。继续渗漉并收集续漉液，至渗漉液色淡为止，浓缩至稠膏状，加入初漉液，混匀，用60%乙醇水溶液稀释至1000ml，静置至澄清，滤过，即得本发明的组合物。

实施例5－本发明的浸膏形式的组合物的制备

取黄芪300g、人参100g、乳鸽肉300g、山药400g、枸杞子400g、龙眼肉120g、大枣300g和蛤蚧100g，将乳鸽肉切碎，将其余药材粉碎成粗粉，置于容器中。用75%乙醇水溶液回流提取2次（10000ml，然后8000ml)，每次1.5小时，合并提取液。滤过，减压浓缩滤液并回收乙醇至稠膏状，即得本发明的组合物。

实施例6-8－本发明的固体形式的组合物的制备

采用与实施例1-3相同的方法，在收集浸渍液之后，减压浓缩并回收乙醇，至浸膏状，干燥，研细并过四号筛，即得粉末形式的本发明的组合物。

实施例9-11－本发明的固体形式的组合物的制备

分别取如实施例1-3所述的原料，置于容器中，加足量水煎煮三次，每次煎煮时间为约2小时。合并三次煎煮所得煎液，滤过，并将滤液真空浓缩成浸膏，干燥，研细并过四号筛，即得粉末形式的本发明的组合物。

实施例12－包含本发明组合物的酒精饮料的制备

将实施例1制备的本发明组合物，分装为75ml/杯的形式，检验合格后即得本发明的酒精饮料。

实施例13－包含本发明组合物的酒精饮料的制备

将实施例2制备的本发明组合物于室温下在密闭容器中陈化18天，加入饮用水约716ml并搅匀，将酒精度调整到约45%，过滤，得到约5315ml滤液。将滤液分装为75ml/杯的形式，检验合格后即得本发明的酒精饮料。

实施例14－包含本发明组合物的酒精饮料的制备

将实施例3制备的本发明组合物分装为75ml/杯的形式，检验合格后即得本发明的酒精饮料。

实验例

实验例1－本发明的酒精饮料增强免疫功能的作用

1.材料和方法

1.1.供试品：实施例12的酒精饮料，规格为75mL/杯，产品批号：20100501。成人口服推荐用量为l.25mL/kg体重/天。以送检的20倍浓缩液样品（不含乙醇，以下称“浓缩液样品”，置4℃冰箱保存）和50%乙醇浓度的酒基进行试验。

1.2.实验动物：SPF级健康昆明种雄性小鼠，体重为18～22克，广东省医学实验动物中心提供。共设6组：第I组进行ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化实验：第II组进行迟发型变态反应实验；第III组进行脏/体比值测定、血清溶血素测定和抗体生成细胞数测定；第IV～VI组分别进行碳廓清实验、腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验和NK细胞活性测定。实验室温度：22～25℃，相对湿度：55～70%。

1.3.剂量与给药方式：根据上述成人口服推荐用量，设低、中、高剂量组，分别为6.3、12.5、25.0mL/kg体重（分别相当于人推荐用量的5、10、20倍），并设一个阴性对照组和一个酒基（溶剂）对照组，每组10只动物。用纯水将乙醇浓度为50%的酒基稀释成15%的乙醇浓度。量取12.5mL浓缩液样品，加乙醇浓度为50%的酒基60mL，再加纯水至200mL，混匀，配成6.25%的溶液作为高剂量组溶液（乙醇终浓度为15%）；再用乙醇浓度为15%的酒基溶液将该溶液依次对倍稀释（取100mL，加乙醇浓度为15%的酒基溶液至200mL），分别配成3.125%、1.563%的溶液作为中、低剂量组溶液。按0.2mL/10g体重的体积分别给相应剂量组动物灌胃，阴性对照组给予等体积的纯水，酒基对照组给予等体积的乙醇浓度为15%的酒基，每天灌胃一次，连续灌胃30天。

1.4.实验方法：

1.4.1.脏器/体重比值测定：称重后处死小鼠，取出胸腺和脾脏，在电子分析天平上称重，计算脏/体比值。

1.4.2.ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化实验（MTT法）：

无菌取脾，置于盛有适量无菌Hank’s液的小平皿中，制成细胞悬液，经200目筛网过滤。

用Hank’s液洗涤三次，离心10min(1000r/min）。然后将细胞悬浮于1mL完全培养液中，计数活细胞数，用RPMI 1640培养液调整细胞浓度为3×10⁶个/mL。再将细胞悬液加入24孔培养板的2个孔中，每孔1mL，在其中一孔加75μL ConA液（相当于7.5μg/mL），另一孔作为对照，置5%CO₂、37℃二氧化碳孵箱中培养72h。培养结束前4h，从每孔轻轻吸去上清液0.7mL，加入0.7mL不含小牛血清的RPMI 1640培养液，同时加入MTT（5mg/mL）50μL/孔，继续培养4h。培养结束后，每孔加入1mL酸性异丙醇，吹打混匀，使紫色结晶完全溶解。然后，将每个孔中的溶液平行三份地添加到96孔培养板中，以570nm波长在酶标仪中测定光密度值。

淋巴细胞的增殖能力用加ConA孔的光密度值减去不加ConA孔的光密度值表示。

1.4.3.二硝基氟苯诱导的小鼠DTH实验（耳肿胀法）：

实验结束前5天用硫化钡将小鼠腹部皮肤脱毛约3cm×3cm范围，用50μL DNFB溶液均匀涂抹致敏，5天后将10μL DNFB均匀涂抹于小鼠右耳两面进行攻击，24小时后颈椎脱臼处死小鼠，剪下左右耳壳，用打孔器取下8mm直径的耳片、称重，以左右耳重量之差值表示DTH的程度。

1.4.4.抗体生成细胞检测（Jeren改良玻片法）

取脱纤维的羊血，用生理盐水洗涤3次，每次离心10min（2000r/min），用生理盐水将压积SRBC配成2%（v/v）的细胞悬液，每只小鼠腹腔注射0.2mL。将免疫后5天的小鼠处死，取脾脏置盛有Hank’s液的平皿内，轻轻磨碎脾脏，制成细胞悬液，经200目筛网过滤，离心10min（2000r/min），用Hank’s液洗涤2遍，最后将细胞悬浮在8mL Hank’s液中。将表层培养基（1g琼脂糖加双蒸水至100mL）加热溶解后，置于45～50℃水浴保温，与等量的2倍浓度的Hank’s液（pH 7.2～7.4）混合，分装入小试管，每管0.5mL，再向管内加入50μL 10%SRBC（v/v，用SA缓冲液配制）、25μL脾细胞悬液，迅速混匀后倾倒于已涂覆琼脂糖薄层的玻片上，做平行片。待琼脂凝固后，将玻片平扣放在玻片架上，放入二氧化碳培养箱中孵育l.5h，将用SA缓冲液稀释的补体（1:8）加入玻片架凹槽内，继续孵育l.5h，计数溶血空斑数。用空斑数/10⁶脾细胞表示抗体生成细胞数。

1.4.5.血清溶血素的测定（血凝法）

取脱纤维的羊血，用生理盐水洗涤3次，每次离心10min（2000r/min），用生理盐水将压积SRBC配成2%（v/v）的细胞悬液，每只小鼠腹腔注射0.2mL。免疫5天后，摘除小鼠的眼球，取血于离心管内，放置约1h，2000r/min离心10min，分离、收集血清。用生理盐水将血清倍比稀释，将不同稀释度的血清分别置于微量血凝板内，每孔100μL，再加入100μL 0.5%（v/v）的SRBC悬液，混匀，装入湿润的平盘内并加盖，于37℃温箱孵育3h，观察血球凝集程度。按下式计算抗体积数：

抗体积数＝（S₁+2S₂+3S₃……n S_n）

式中l、2、3……n为对倍稀释的指数，S为凝集程度的级别。

1.4.6.小鼠碳廓清实验

经尾静脉给小鼠注射用生理盐水稀释4倍的印度墨汁，每10g体重注射0.1mL。墨汁注入后立即计时，于注入墨汁后第2、10min，分别从内眦静脉丛取血20μL，加入到2mL 0.1%Na₂CO₃溶液中，摇匀。以Na₂CO₃溶液作空白对照，以600nm波长测光密度值（OD）。将小鼠处死，取肝、脾脏，称重。按下式计算吞噬指数a。

a=K^1/3×体重/（肝重＋脾重），式中K=（lg OD₁-lg OD₂）/（t₂-t₁）

1.4.7.小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验（半体内法）

向小鼠腹腔注射鸡红细胞悬液（20%（v/v），用生理盐水配制），每只小鼠1mL，间隔30min，颈椎脱臼处死小鼠，正中剪开腹腔皮肤，向腹腔注入2mL生理盐水，转动鼠板1min，吸出腹腔洗液1mL，平均滴于2片载玻片上，放入垫有湿纱布的搪瓷盒内，置37℃孵箱温育30min。孵毕，取出玻片于生理盐水中漂洗后晾干，用甲醇:丙酮（1:1）溶液固定，用4%（v/v）Giemsa-磷酸缓冲液染色，再用纯水漂洗、晾干。于油镜下每片计数100个巨噬细胞，按下式计算吞噬率和吞噬指数。

吞噬率（%）＝吞噬鸡红细胞的巨噬细胞数/计数的巨噬细胞数×100

吞噬指数＝被吞噬的鸡红细胞总数/计数的巨噬细胞数×100

1.4.8.NK细胞活性测定（LDH测定法）

将小鼠颈椎脱臼处死，无菌取脾，制成脾细胞悬液，用Hank’s液洗2次，每次离心10min（1000r/min）。弃上清将细胞浆弹起，加入0.5mL灭菌纯水，放置20秒，裂解红细胞后再加入0.5mL 2倍Hank’s液及8mL Hank’s液，1000r/min离心10min，用1mL含10%小牛血清的RPMI l640完全培养液重悬，用1%冰醋酸稀释后计数（活细胞数应在95%以上），用台酚兰染色计数活细胞数，最后用RPMI1640完全培养液调整细胞浓度至2×10⁷个/mL，此为效应细胞。取传代后24h生长良好的YAC-1细胞，用RPMI 1640完全培养液调整细胞浓度至4×10⁵个/mL，此为靶细胞。取靶细胞和效应细胞各100μL（效应细胞:靶细胞的比为50:l），加入U型96孔培养板中；靶细胞自然释放孔加靶细胞和培养液各100μL，靶细胞最大释放孔加靶细胞和1%NP40各100μL。上述各项各设3个平行孔，置于37℃、5%CO₂培养箱中培养4h。然后将96孔培养板以1500r/min离心5min，每孔吸取上清100μL置平底96孔培养板中，同时加入LDH基质液100μL，反应8分钟，每孔加入1mol/L的HCl 30μL，在酶标仪中于490nm处测定光密度（OD）值。按下式计算NK细胞活性。

NK细胞活性（%）=（反应孔OD-自然释放孔OD）/（最大释放孔OD-自然释放孔OD）×100%

1.5.结果判定：如果在细胞免疫功能、体液免疫功能、单核-巨噬细胞功能和NK细胞活性四方面中任两个方面的结果为阳性，则可判定该供试品具有增强免疫功能的作用。

2.结果

2.1.对小鼠体重的影响

与酒基对照组、阴性对照组比较，实验初、实验中期、实验末期各剂量组的小鼠体重及实验期间小鼠体重增长值均无显著性差异（P>0.05），表明该供试品对小鼠的体重增长无明显影响。

2.2.对小鼠免疫器官/体重比值的影响

表1.免疫器官/体重比值

*注：表中P值l为与酒基对照组比较的P值，P值2为与阴性对照组比较的P值。下同。

从表1可见，供试品各剂量组小鼠的胸腺/体重及脾脏/体重比值与酒基对照组比较，均无显著性差异（P>0.05），与阴性对照组比较也无显著性差异（P>0.05），表明该受试品对小鼠的免疫器官重量无明显影响。

2.3.对小鼠的细胞免疫的影响

2.3.1.对ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化能力的影响

表2.小鼠淋巴细胞转化实验结果

从表2可见，供试品各剂量组小鼠的淋巴细胞增殖能力高于酒基对照组和阴性对照组，且高剂量组与酒基对照组及阴性对照组的差异具有显著性（P<0.05），表明该供试品具有促进小鼠的淋巴细胞增殖、转化能力的作用。

2.3.2.对小鼠迟发型变态反应（DTH）的影响

表3.小鼠迟发型变态反应（DTH）实验结果

从表3可见，供试品各剂量组小鼠的左右耳片重量差值高于酒基对照组和阴性对照，且高、中剂量组与酒基对照组的差异具有显著性（分别为P<0.01和P<0.05），高剂量组与阴性对照组的差异具有显著性（P<0.05），表明该供试品具有促进小鼠的迟发型变态反应的作用。

2.4.对小鼠的体液免疫的影响

2.4.1.对小鼠的抗体生成细胞数的影响

表4.抗体生成细胞检测实验结果

从表4可见，供试品各剂量组小鼠的抗体生成细胞数均高于酒基对照组和阴性对照组，且高、中剂量组与酒基对照组及阴性对照组的差异具有非常显著性（P<0.01），表明该供试品具有促进小鼠的抗体生成细胞增殖的作用。

2.4.2.对小鼠血清溶血素的影响

表5.小鼠溶血素测定结果

从表5可见，供试品各剂量组小鼠的抗体积数高于酒基对照组和阴性对照组，且高、中剂量组与酒基对照及阴性对照组的差异具有显著性（P<0.05或P<0.01），表明该供试品具有提高小鼠的血清溶血素水平的作用。

2.5.对小鼠的单核-巨噬细胞吞噬功能的影响

2.5.1.对小鼠的单核-巨噬细胞碳廓清的影响

表6.小鼠单核-巨噬细胞碳廓清实验结果

从表6可见，供试品各剂量组小鼠的吞噬指数均高于酒基对照组和阴性对照组，且高剂量组与酒基对照及阴性对照组的差异具有显著性（P<0.05），表明该供试品具有促进小鼠的单核-巨噬细胞碳廓清功能的作用。

2.5.2.对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞的能力的影响

表7.小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验结果

从表7可见，供试品各剂量组小鼠的腹腔巨噬细胞对鸡红细胞的吞噬率及吞噬指数高于酒基对照组和阴性对照组，且高、中剂量组的吞噬率与酒基对照组及阴性对照组的差异具有显著性（P<0.05或P<0.01），高、中剂量组的吞噬指数与酒基对照组的差异具有显著性（P<0.05），高剂量组的吞噬指数与阴性对照组的差异具有显著性（P<0.05），表明该供试品具有促进小鼠的腹腔巨噬细胞的吞噬功能的作用。

2.6.对小鼠的NK细胞活性的影响

表8.小鼠NK细胞活性测定结果

从表8可见，供试品各剂量组小鼠的NK细胞活性高于酒基对照组和阴性对照组，但各剂量组与酒基对照组及阴性对照组的差异均无显著性（P>0.05），表明该供试品对小鼠的NK细胞活性无明显影响。

3.结论

以上实验表明，将供试品连续灌胃30天给予小鼠，能促进ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞增殖、转化能力，促进小鼠的迟发型变态反应，促进小鼠的抗体生成细胞增殖，提高小鼠的血清溶血素水平，促进小鼠的单核-巨噬细胞的吞噬功能，对小鼠的体重增长、胸腺/体重比值、脾脏/体重比值及NK细胞活性无明显影响，表明该供试品具有增强免疫力的功能。

实验例2－本发明的酒精饮料的缓解体力疲劳功能

1.材料和方法

1.1.供试品：同实验例1，系实施例12的酒精饮料。

1.2.实验动物：SPF级健康成年昆明种雄性小鼠，体重为18～22克，广东省医学实验动物中心提供。实验动物室温度：22～25℃，相对湿度：55～70%。

1.3.剂量与给药方式：同实验例1。

1.4.实验方法：依据卫生部《保健食品检验与评价技术规范》（2003年版）中缓解体力疲劳功能检验方法。实验设5个组，包括3个实验组、1个酒基对照组和1个阴性对照组，每组10只小鼠。采用灌胃法，每天以0.2mL/10g体重的体积给小鼠灌胃不同剂量的供试品，阴性对照组给予等体积的纯水，酒基对照组给予等体积的乙醇浓度为15%的酒基溶液。每天灌胃一次，连续灌胃30天。实验结束进行各项抗疲劳指标的测定。

1.4.1.负重游泳试验：末次给予小鼠供试品30min后，置于游泳箱中游泳，水深约30cm，水温25℃±0.5℃，尾根部负荷5%体重的铅皮。记录小鼠自游泳开始至死亡的时间，作为小鼠负重游泳时间。若实验组游泳时间明显长于阴性对照组游泳时间，且差异有显著性（P<0.05），可判定该供试品有延长小鼠负重游泳时间的作用。

1.4.2.血清尿素测定：末次给予小鼠供试品30min后，在温度为30℃的水中不负重游泳90min。运动后休息60min后立即拔除眼球采血0.5mL，离心取血清，用全自动生化分析仪测定血清尿素值。若实验组血清尿素含量明显低于阴性对照组，且差异有显著性（P<0.05），可判定该供试品有减少疲劳小鼠尿素产生的作用。

1.4.3.肝糖原测定：末次给予小鼠供试品30min后，立即处死，取肝脏经生理盐水漂洗后用滤纸吸干，精确称取肝脏100mg，加入三氯乙酸（TCA），匀浆、离心，取上清液测定肝糖原含量（蒽酮法）。若实验组肝糖原含量明显高于阴性对照组，且差异有显著性（P<0.05），可判定该供试品有促进小鼠肝糖原储备的作用。

1.4.4.血乳酸测定：末次给予小鼠供试品30min后，分别在游泳前、游泳（运动）后0min、游泳（运动）后休息20min采血20μL进行乳酸测定。血乳酸曲线下面积用下式计算：

血乳酸曲线下面积＝5×（游泳前血乳酸值＋3×游泳后0min的血乳酸值＋2×游泳后休息20min的血乳酸值）

若实验组血乳酸变化值明显低于阴性对照组，且差异有显著性（P<0.05），可判定该供试品有减小小鼠运动后血乳酸曲线下面积的作用。

1.5.结果判定：以上实验中，若负重游泳实验结果阳性，且血乳酸、血清尿素、肝糖原三项生化指标中任二项指标阳性，可判定该供试品具有缓解体力疲劳功能的作用。

2.实验结果

2.1.对小鼠体重的影响

与酒基对照组、阴性对照组比较，实验初、实验中期、实验末期各剂量组的小鼠体重及实验期间小鼠体重增长值均无显著性差异（P>0.05），表明该供试品对小鼠的体重增长无明显影响。

2.2.对小鼠负重游泳时间的影响

表9.小鼠的负重游泳时间

*注：表中P值1为与酒基对照组比较的P值，P值2为与阴性对照组比较的P值。下同

从表9可见，供试品各剂量组小鼠的负重（5%）游泳时间均比阴性对照组和酒基对照组的延长，且高剂量组与酒基对照组的差异具有显著性（P<0.05），高、中剂量组与阴性对照组的差异具有显著性（分别P<0.01和P<0.05），表明该供试品具有延长小鼠的负重游泳时间的作用。

2.3.对小鼠运动后血清尿素水平的影响

表10.小鼠运动后的血清尿素测定结果

从表10可见，供试品各剂量组小鼠的血清尿素含量均低于阴性对照组和酒基对照组，且高、中剂量组与酒基对照组及阴性对照组的差异具有显著性（P<0.01或P<0.05），表明该供试品能减少或抑制疲劳小鼠血清尿素的产生。

2.4.对小鼠肝糖原含量的影响

表11.小鼠肝糖原含量测定结果

从表11可见，供试品各剂量组小鼠的肝糖原含量均高于阴性对照组和酒基对照组，且高、中剂量组与酒基对照组的差异具有显著性（分别P<0.01和P<0.05），高剂量组与阴性对照组的差异具有显著性（P<0.05），表明该供试品具有促进小鼠的肝糖原储备的作用。

2.5.对小鼠运动后血乳酸值的影响

表12.小鼠运动后的血乳酸（mg/L）曲线下面积

从表12可见，供试品各剂量组在3个时间点的血乳酸曲线下面积均小于阴性对照组和酒基对照组，且高剂量组与酒基对照组的差异具有显著性（P<0.05），高、中剂量组与阴性对照组的差异具有显著性（分别P<0.01和P<0.05），表明该供试品能减少小鼠运动后的血乳酸曲线下面积。

3.结论

以上实验表明，将供试品连续灌胃30天给予小鼠，能延长小鼠的负重游泳时间，减少疲劳小鼠的血清尿素产生，增加小鼠的肝糖原的储备量，减少小鼠运动后的血乳酸曲线下面积，但对小鼠的体重增长无明显影响，表明该供试品具有缓解体力疲劳的功能。

以上实验例1和2的结果表明，本发明的组合物、制剂、食品或酒精饮料具有增强免疫功能和缓解疲劳的作用。

另外，已完成的实施例12的酒精饮料的毒理试验表明：1、灌胃给予小鼠最大剂量（20000mg/kg体重）的酒精饮料的浓缩液后，未见动物有中毒症状，无动物死亡，尸检未见异常，表明该酒精饮料的急性经口毒性属无毒级；2、遗传毒性试验（Ames试验、小鼠骨髓细胞微核试验、小鼠精子畸形试验）结果均为阴性；3、以125.0、62.5、31.3mL/kg体重的剂量连续给大鼠灌胃30天，实验期间动物的生长发育良好，各剂量组的动物体重、增重量、进食量、食物利用率、血常规指标、血生化指标、脏器重量及脏器/体重比值与对照组比较，均无显著性差异，大体解剖观察和组织病理学检查未见与该酒精饮料有关的异常改变，表明在受试剂量范围该酒精饮料未对大鼠的以上各项观察指标产生毒副作用。以上毒理试验结果表明本发明的组合物可安全地用于临床。

Claims (18)

1.一种组合物，其特征在于所述组合物由以下原料制得：

黄芪、人参、乳鸽肉、山药、枸杞子、龙眼肉、大枣和蛤蚧。

2.如权利要求1所述的组合物，其特征在于所述组合物由以下原料制得：

20-80重量份、优选30-60重量份、更优选40重量份的黄芪；10-40重量份、优选15-30重量份、更优选20重量份的人参；15-60重量份、优选22.5-45重量份、更优选30重量份的乳鸽肉；10-40重量份、优选15-30重量份、更优选20重量份的山药；13-52重量份、优选19.5-39重量份、更优选26重量份的枸杞子；3-12重量份、优选4.5-9重量份、更优选6重量份的龙眼肉；8-32重量份、优选12-24重量份的大枣、更优选16重量份的大枣；和3-12重量份、优选4.5-9重量份、更优选6重量份的蛤蚧。

3.如权利要求1或2所述的组合物，其特征在于所述组合物通过用乙醇水溶液提取所述原料制得，所述提取优选通过浸渍法或渗漉法进行。

4.如权利要求3所述的组合物，其特征在于所述乙醇水溶液的乙醇浓度为20%-99%（v/v），优选为20%-75%（v/v），更优选为20%-55%（v/v）。

5.如权利要求3或4所述的组合物，其特征在于所述乙醇水溶液为食用或饮用酒，包括酿造酒如米酒和蒸馏酒如谷类酒。

6.如权利要求3或4所述的组合物，其特征在于所述组合物为溶液、悬浮液、流浸膏、浸膏或干燥固体的形式，优选为含有乙醇的溶液的形式。

7.如权利要求6所述的组合物，其特征在于，所述组合物为含有乙醇的溶液的形式，其中乙醇浓度为20%-75%（v/v），优选为20%-55%（v/v），更优选为20%-45%（v/v）。

8.如权利要求1-7中任一项所述的组合物，其中所述组合物还包含药学或食品可接受的添加剂。

9.如权利要求8所述的组合物，其为口服药物制剂如液体制剂、混悬剂、浸膏剂、流浸膏剂或固体制剂的形式，特别是酒剂、酊剂、合剂或糖浆剂的形式。

10.如权利要求9所述的组合物，其为酒剂的形式。

11.如权利要求8所述的组合物，其为食品，特别是酒精饮料的形式。

12.权利要求1的组合物的制备方法，所述方法包括以下步骤：

(a)将黄芪、人参、乳鸽肉、山药、枸杞子、龙眼肉、大枣和蛤蚧混合；

(b)用足量水、醇或醇的水溶液提取(a)中所得混合物；

(c)过滤步骤(b)所得混合物，收集滤液；

(d)任选地再将步骤(b)和(c)重复进行1-3次，优选2次，并且合并收集的滤液；

(e)任选地将合并的滤液浓缩和/或干燥；和

(f)任选地加入药学或食品可接受的添加剂。

13.如权利要求12所述的方法，其中所述醇的水溶液为乙醇水溶液如食用或饮用酒，包括酿造酒如米酒和蒸馏酒如谷类酒。

14.如权利要求13所述的方法，其中在步骤(b)中，通过浸渍法或渗漉法进行所述提取，优选通过浸渍法进行所述提取。

15.如权利要求14所述的方法，其中所述乙醇水溶液的乙醇浓度为20%-99%（v/v），优选为20%-75%（v/v），更优选为20%-55%（v/v）。

16.如权利要求14或15所述的方法，其中在步骤(b)中，于约18-32℃如约20-25℃，在密闭容器中进行所述浸渍6-24天，优选10-20天，更优选15天。

17.如权利要求16所述的方法，其特征在于所述方法还包括以下步骤：

(g)于约18-32℃如约20-25℃，在密闭容器中将步骤(c)或(d)中所得滤液陈化10-20天，优选12-18天，更优选15天，过滤并收集滤液。

18.如权利要求17所述的方法，其特征在于所述方法还包括以下步骤：

(h)将步骤(g)中所得滤液的乙醇浓度调整到20%-75%（v/v），优选20%-55%（v/v），更优选20%-45%（v/v）。