CN105148124B - 一种具有抗肿瘤作用的组合物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种具有抗肿瘤作用的组合物及其应用，该组合物由5‑氟尿嘧啶和中药组合物组成，其中中药组合物提取物可为中药组合物的水提取物、醇提取物或水提醇沉物等。本发明提供的具有抗肿瘤作用的组合物，在大量实验研究基础上，筛选出中药组合物可明显降低抗肿瘤药物5‑氟尿嘧啶的骨髓抑制，中药组合物与5‑氟尿嘧啶科学配比组合后，5‑氟尿嘧啶在发挥其强抗肿瘤活性的同时，骨髓抑制等副作用明显降低，两者组合后，具有比单用5‑氟尿嘧啶更高的药物安全性，是一种很有应用前景的化学药物和中药复方的组合物，对临床用药具有重要的指导作用。

Description

一种具有抗肿瘤作用的组合物及其应用

技术领域

本发明涉及一种药物，具体设计一种具有抗肿瘤作用的组合物及其该组合物在制备抗肿瘤药物中的应用。

背景技术

5-氟尿嘧啶为合成的抗代谢药，并在临床上是目前应用最广的抗嘧啶类药物，对消化道癌及其它实体瘤有良好疗效，在肿瘤内科治疗中占有重要地位。5-氟尿嘧啶经过酶转化为5-氟脱氧尿嘧啶核苷酸而具有抗肿瘤活性。5-FU通过抑制胸腺嘧啶核苷酸合成酶而抑制DNA的合成。此酶的作用可能把甲酰四氢叶酸的一碳单位转移给脱氧尿嘧啶核苷-磷酸合成胸腺嘧啶核苷一酸。5-FU对RNA的合成也有一定抑制作用。临床对多种肿瘤，如消化道肿瘤、乳腺癌、卵巢癌、绒毛膜上皮癌、子宫颈癌、肝癌、膀胱癌、皮肤癌均有较好的疗效。

但是5-氟尿嘧啶在临床使用过程中具有一定的副作用，其中最明显的毒副作用是骨髓抑制，对骨髓基质细胞具有损失作用，表现为白细胞减少、血小板下降。另外还有食欲不振、恶心、呕吐、口腔炎、胃炎、腹痛及腹泻等胃肠道反应。这些副作用在一定程度上限制了其临床应用。

因此，很有必要在现有技术的基础之上研究开发出一种组份配比科学合理，不仅具有很好的抗肿瘤效果，并且能有效抑制5-氟尿嘧啶导致的骨髓抑制不良反应的抗肿瘤组合物。

发明内容

发明目的：本发明所要解决的技术问题是克服现有技术中5-氟尿嘧啶存在骨髓抑制问题的不足，提供一种抗肿瘤活性强，并且能有效抑制5-氟尿嘧啶导致的骨髓抑制不良反应的抗肿瘤组合物。

技术方案：为了实现以上目的，本发明采取的技术方案为：

一种具有抗肿瘤作用的组合物，它由下列重量份数的原料制成：

5-氟尿嘧啶0.1～1份，中药组合物提取物1～400份。

作为优选方案，以上所述的具有抗肿瘤作用的组合物，它由下列重量份数的原料制成：5-氟尿嘧啶1份，中药组合物提取物12～400份。

作为优选方案，以上所述的具有抗肿瘤作用的组合物，中药组合物提取物和5-氟尿嘧啶组合后发挥降低5-氟尿嘧啶对骨髓基质细胞损伤的用途。

作为优选方案，以上所述的具有抗肿瘤作用的组合物，所述的中药组合物提取物为中药组合物的水提取物、醇提取物或水提醇沉物。

其中中药组合物的水提取物为中药组合物的细粉加入8～20倍体积量的水，超声，煎煮，浸渍或渗滤提取1～3次，每次1～3小时，浓缩得到提取物。

其中中药组合物的醇提取物为中药组合物的细粉加入8～20倍体积量的乙醇，采用回流，超声，浸渍或渗滤提取1～3次，每次1～3小时，浓缩得到提取物。

其中中药组合物的水提醇沉物，可以是中药组合物水提后，用浓度为30～95％乙醇沉淀后得到的精制物；作为其它优选方案，本发明所述的中药组合物提取物也可以为水提醇沉后，上大孔吸附树脂柱，用水、低浓度到高浓度的乙醇依次洗脱，取浓度为30至85％浓度乙醇的洗脱物，得到去除杂质的中药组合物精制提取物。

作为优选方案，以上所述的具有抗肿瘤作用的组合物，将5-氟尿嘧啶和中药组合物的提取物和药学上可接受的载体，如稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、润滑剂等制备成注射液、粉针剂、胶囊剂、片剂、颗粒剂或丸剂的药物。

本发明提供的具有抗肿瘤活性的组合物制成片剂时，把组合物和载体乳糖或玉米淀粉，需要时加入润滑剂硬脂酸镁，混合均匀，然后压片制成片剂。

本发明提供的组合物制成胶囊剂时把组合物和载体乳糖或玉米淀粉混合均匀，整粒，然后装胶囊制成胶囊剂。

本发明提供的组合物制成颗粒剂时，把组合物和稀释剂乳糖或玉米淀粉混合均匀，整粒，干燥，制成颗粒剂。

本发明提供的组合物制成注射液时，取组合物加入增溶剂，搅拌均匀，80℃加热30分钟，过滤，调节PH值，用垂熔玻璃漏斗或其它滤器过滤至澄明，灌装，在100至115℃灭菌30分钟制成注射液。

作为优选方案，以上所述的具有抗肿瘤作用的组合物，所述的中药组合物由党参，炒白术，陈皮，炒枳实，炒山楂和炒麦芽制成。

作为更加优选方案，以上所述的具有抗肿瘤作用的组合物，所述的中药组合物由党参200g，炒白术300g，陈皮200g，炒枳实200g，炒山楂150g和炒麦芽200g制成。

本发明所述的具有抗肿瘤作用的组合物在制备抗肿瘤药物中的应用。

本发明所述的具有抗肿瘤作用的组合物在制备抗肿瘤药物中的应用。作为优选方案，本发明所述的具有抗肿瘤作用的组合物在制备治疗消化道肿瘤、乳腺癌、卵巢癌、绒毛膜上皮癌、子宫颈癌、肝癌、膀胱癌或皮肤癌药物中的应用。

有益效果：本发明提供的5-氟尿嘧啶和中药组合物提取物的组合物和现有技术相比具有以下优点：

本发明立足祖国医药学方剂配伍理论，在大量实验研究基础上，筛选出组份配比科学合理的中药组合物，该中药组合物可明显降低抗肿瘤药物5-氟尿嘧啶的骨髓抑制毒副作用，中药组合物与5-氟尿嘧啶科学配比组合后，5-氟尿嘧啶在发挥其强抗肿瘤活性的同时，骨髓抑制等副作用明显降低，两者组合后，具有比单用5-氟尿嘧啶更高的药物安全性，是一种很有应用前景的化学药物和中药复方的组合物，对临床用药具有重要的指导作用。

附图说明

图1是中药组合物对5-FU损伤OP9的保护作用柱状图。

图2是流式细胞术检测中药组合物对5-FU损伤OP9早期凋亡柱状图。

图3是中药组合物对5-FU损伤OP9细胞INOS影响的柱状图。

图4是中药组合物对5-FU损伤OP9细胞TNOS影响的柱状图。

图5是中药组合物对5-FU损伤OP9细胞NO影响的柱状图。

图6是中药组合物对5-FU损伤OP9细胞的Caspase 3活性影响的柱状图。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐明本发明，应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等价形式的修改均落于本申请所附权利要求所限定的范围。

实施例1

一种具有抗肿瘤作用的组合物，它由下列重量份数的原料制成：

5-氟尿嘧啶1份，中药组合物水提取物400份。

中药组合物水提取物的制备方法为：取党参200g，炒白术300g，陈皮200g，炒枳实200g，炒山楂150g和炒麦芽200g组成的中药组合物，加入药材重量8倍量的水煎煮提取2次，每次2小时，合并提取液，减压浓缩，干燥，得中药组合物水提取物。

实施例2

一种具有抗肿瘤作用的组合物，它由下列重量份数的原料制成：

5-氟尿嘧啶1份，中药组合物水提取物12份。

中药组合物水提取物的制备方法为：取党参200g，炒白术300g，陈皮200g，炒枳实200g，炒山楂150g和炒麦芽200g组成的中药组合物，加入药材重量12倍量的水煎煮提取3次，每次1小时，合并提取液，减压浓缩，干燥，得中药组合物水提取物。

实施例3

一种具有抗肿瘤作用的组合物，它由下列重量份数的原料制成：

5-氟尿嘧啶1份，中药组合物醇提取物12份。

中药组合物醇提取物的制备方法为：取党参200g，炒白术300g，陈皮200g，炒枳实200g，炒山楂150g和炒麦芽200g组成的中药组合物，加8倍量的体积浓度为95％乙醇回流提取2次，每次2小时，合并提取液，减压浓缩，干燥，得中药组合物醇提取物。

实施例4

一种具有抗肿瘤作用的组合物，它由下列重量份数的原料制成：

5-氟尿嘧啶1份，中药组合物水提醇沉提取物50份。

中药组合物水提醇沉提取物的制备方法为：取党参200g，炒白术300g，陈皮200g，炒枳实200g，炒山楂150g和炒麦芽200g组成的中药组合物，加8倍量的水煎煮提取3次，每次2小时，合并提取液，减压浓缩，然后加入95％乙醇，使水提液中乙醇的浓度为50～85％，3000转/分钟，离心，取上清液，浓缩，干燥，得中药组合物水提醇沉提取物。

实施例5

一种具有抗肿瘤作用的组合物，它由下列重量份数的原料制成：

5-氟尿嘧啶1份，中药组合物提取物100份。

中药组合物提取物的制备方法为：取党参200g，炒白术300g，陈皮200g，炒枳实200g，炒山楂150g和炒麦芽200g组成的中药组合物，加8倍量的水煎煮提取3次，每次2小时，合并提取液，减压浓缩，然后加入95％乙醇，使水提液中乙醇的浓度为50～85％，3000转/分钟，离心，取上清液，浓缩，干燥，得中药组合物水提醇沉提取物上大孔吸附树脂柱，用水和20％至90％浓度的乙醇依次洗脱，收集浓度为30至85％浓度乙醇的洗脱物，得到去除杂质的中药组合物精制提取物。

实施例6中药组合物对5-FU损伤骨髓基质细胞(OP9)的保护作用

1.实验方法

1.1CCK8检测中药组合物水提液对5-FU损伤OP9的细胞存活率，细胞以1×10⁵个/孔密度接种于96孔板上，培养24h后，弃培养基，分别加入不同种类的药物，每组6复孔。实验设空白对照组、5-FU模型组、表皮细胞生长因子(EGF)组、中药组合物组。空白对照组加入100ul培养液；5-FU模型组加入终浓度为25μg/mL5-FU；EGF组加入终浓度为20ng/mL的EGF溶液及25μg/mL5-FU，中药组合物组(中药组合物水提取物的制备方法为：取党参200g，炒白术300g，陈皮200g，炒枳实200g，炒山楂150g和炒麦芽200g组成的中药组合物，加入药材重量8倍量的水煎煮提取2次，每次2小时，合并提取液，减压浓缩，干燥，得中药组合物水提取物)加入10mg/mL、5mg/mL、2.5mg/mL、1.25mg/mL、0.625mg/mL、0.3125mg/mL中药组合物水提液及25μg/mL5-FU。

分别于药物作用24h后加入CCK8试剂10μL，37℃反应2h，450nm波长检测各孔吸光度值(A)。按公式计算细胞存活率：存活率＝[(A实验孔-A本底)/A空白对照组-A本底)]×100％。

1.2Hoechst染色检测中药组合物水提液对5-FU损伤OP9的作用

细胞按1×10⁶个细胞/孔接种于6孔板，细胞进行爬片，培养24h后，空白对照组、5-FU模型组、EGF组按1.1方法给药处理，中药组合物组(中药组合物水提取物的制备方法为：取党参200g，炒白术300g，陈皮200g，炒枳实200g，炒山楂150g和炒麦芽200g组成的中药组合物，加入药材重量8倍量的水煎煮提取2次，每次2小时，合并提取液，减压浓缩，干燥，得中药组合物水提取物)加入10mg/mL、2.5mg/mL、0.625mg/mL中药组合物水提液及25μg/mL5-FU(J1～J3组)，每组3复孔。24h后，用PBS清洗，固定液固定，然后用Hoechst33258染色液将细胞染色5分钟，PBS洗去染液，加抗荧光淬灭封片液后，经荧光显微镜放大400倍观察细胞核。

1.3Annexix V-PI双染检测细胞凋亡实验

细胞按1×10⁶个细胞/孔接种于6孔板，按1.2方法培养细胞及给药处理，24h后，胰酶消化收集细胞，用PBS洗2次，按Anexin V-FITC/PI双染试剂盒操作，FCM分析细胞凋亡情况。

1.4FCM检测细胞周期

按1.3方法培养细胞及给药处理，24h后，胰酶消化收集细胞，按细胞周期与细胞凋亡检测试剂盒操作，FCM分析细胞周期变化。

1.5NO和NOS含量检测

按1.3的实验方法将细胞给药处理后24h，取细胞上清液，按一氧化氮(NO)测试盒相关步骤处理，测定各组NO变化情况。同时取细胞上清液，按一氧化氮合酶(NOS)测定试剂盒相关步骤处理，测定各组一氧化氮合酶(NOS)的活性变化情况。实验重复3次。

1.6检测Caspase 3酶活性

按1.3方法培养细胞及给药处理后24h，胰酶消化收集细胞制备成的细胞悬液，冰浴裂解细胞后，4℃高速离心，取上清液一部分按Caspase 3活性检测试剂盒相关步骤处理，测定各组样品中Caspase 3催化产生的pNA产生的吸光度，通过pNA标准曲线可以计算出样品中催化产生的pNA的量。另取一部分上清液样品用Bradford法测定蛋白，通过蛋白标准曲线可以计算出每个样品中所含的蛋白的量。每个样品pNA的量比上样品中所含的蛋白的量即为单位重量蛋白中所含的Caspase 3的酶活力单位。实验重复2次。

2.实验结果

2.1中药组合物水提液对5-FU损伤骨髓基质细胞(OP9)的保护作用

实验表明5-FU组细胞存活率明显低于空白对照组(P<0.001)；中药组合物在10、5、2.5mg/mL剂量下OP9细胞存活率明显较5-FU组高(P<0.001)，表明10～2.5mg/mL中药组合物可有效抑制5-FU对OP9造成的细胞损伤，具有直接保护细胞的作用。具体结果见图1。

2.2Hoechst染色检测中药组合物水提液对5-FU损伤OP9的影响

荧光显微镜下观察发现，模型组与空白对照组相比，模型组细胞数量明显减少，细胞核缩小。干预处理后，中药组合物组(10mg/mL)与模型组相比细胞数量明显增加，细胞核较大，细胞活性缺失较模型组程度减轻。表明中药组合物可以抑制5-FU诱导OP9的细胞凋亡

2.3Annexix V-PI双染检测细胞凋亡实验结果

如图2实验结果显示，5-FU损伤模型组早期凋亡细胞所占比例(11.46％)明显高于空白对照组(3.87％)，差异具有统计学意义(P<0.05)，EGF作用干预后，细胞早期凋亡率分别为334％，与模型组相比明显降低(P<0.05)。中药组合物组(10mg/mL)与模型组相比细胞早期凋亡率(3.44％)明显降低(P<0.05)。表明10mg/mL中药组合物可以通过抑制5-FU造成的细胞凋亡保护OP9细胞。

2.4中药组合物对5-FU损伤OP9细胞周期影响

流式实验结果显示，G0/G1期细胞比例与模型组相比，EGF、中药组合物组均能显著增高(EGF组、J1组P<0.01；J2组P<0.05)。G2/M期细胞比例与模型组相比，EGF、中药组合物组明显增高(P<0.05)。G2/M期细胞比例与模型组相比，EGF、中药组合物组明显减低(EGF组、J1组P<0.001；J2、J3组P<0.01)。表明中药组合物可以减少5-FU造成OP9细胞的DNA合成障碍，促进细胞增殖活性。见表1。

表1各组的细胞周期变化情况(X±S，n＝2)

注：与空白对照组比较，^#P<0.05；^##P<0.01；^###P<0.001；与模型组比较，^*P<0.05；^**P<0.01；^***P<0.001；

2.5中药组合物对5-FU损伤OP9细胞NO、NOS影响

如图3，图4和图5结果显示，5-FU损伤模型组细胞上清液中的NO含量明显高于空白对照组，差异具有统计学意义(P<0.05)，中药组合物作用干预后，NO含量明显降低，与模型组相比差异有统计学意义(P<0.05)。TNOS各组间无明显变化，而中药组合物组iNOS含量明显低于模型组(P<0.01)。表明中药组合物可减轻5-FU引起OP9细胞的损伤，具有一定抑制炎症的作用。

2.6Caspase 3检测结果

如图6结果显示，5-FU损伤模型组细胞Caspase 3含量明显低于空白对照组，差异具有统计学意义(P<0.05)，中药组合物作用后，Caspase 3含量明显升高，与模型组相比差异有统计学意义(P<0.05)。表明中药组合物可以激活Caspase 3途径抑制5-FU引起的细胞损伤。

实施例7中药组合物与5-氟尿嘧啶组合物抗肿瘤的细胞实验

1、实验方法：使用MTT法对5-氟尿嘧啶，中药组合物与5-氟尿嘧啶组合物，进行体外抗癌细胞HepG2实验。将相应的细胞用胰酶进行消化、计数、制成浓度为5×10⁴个/ml的细胞悬液。将96孔板中每孔加入100μl细胞悬液(每孔5×10³个细胞)，然后置于37℃，5％CO₂培养箱中培养24小时；用完全培养基稀释药物至所需的不同剃度浓度，每孔加入100μL相应的含药培养基，同时设立阴性对照组，再将96孔板置于37℃，5％CO₂培养箱中培养72小时。然后每孔加入20μL MTT(5mg/ml)，继续培养4小时，终止培养，弃去培养基，每孔加入150μLDMSO溶解，摇床10分钟轻轻混匀。在λ＝490nm处用酶标仪检测每孔的吸光度即OD值，计算各药物的抑制率。

2、实验结果：Hep G2细胞具有与人类相似的代谢能力，如下表2所示，在同样5-氟尿嘧啶的剂量下组合不同浓度的中药组合物，发现组合物同样具有良好的抗肿瘤活性，因此5-氟尿嘧啶和中药组合物组合后仍能发挥5-氟尿嘧啶的抗肿瘤作用。

表2中药组合物与5-氟尿嘧啶组合物对癌细胞HepG2的抑制作用(，n＝4)

通过以上研究表明5-氟尿嘧啶与中药组合物科学组合后，在发挥良好抗肿瘤作用的同时，能明显降低其骨髓抑制，临床用药更安全，对指导临床用药具有重要的意义。因此本发明提供的组合物，其抗肿瘤作用强，骨髓抑制更低，有望开发成为新安全性更好的抗肿瘤药物制剂。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理和构思的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (3)

1.一种具有抗肿瘤作用的组合物，其特征在于，它由下列重量份数的原料制成：

5-氟尿嘧啶1份，中药组合物提取物12～400份；

所述的中药组合物由党参200g，炒白术300g，陈皮200g，炒枳实200g，炒山楂150g和炒麦芽200g制成；

中药组合物提取物和5-氟尿嘧啶组合后发挥降低5-氟尿嘧啶对骨髓基质细胞损伤的用途。

2.根据权利要求1所述的具有抗肿瘤作用的组合物，其特征在于，所述的中药组合物提取物为中药组合物的水提取物、醇提取物或水提醇沉物。

3.根据权利要求1或2所述的具有抗肿瘤作用的组合物，其特征在于，将5-氟尿嘧啶和中药组合物的提取物和药学上可接受的载体制备成注射液、胶囊剂、片剂、颗粒剂或丸剂的药物。