WO2015021922A1 - 人参皂苷Rd或其肠溶制剂及用途 - Google Patents

人参皂苷Rd或其肠溶制剂及用途 Download PDF

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WO2015021922A1
WO2015021922A1 PCT/CN2014/084287 CN2014084287W WO2015021922A1 WO 2015021922 A1 WO2015021922 A1 WO 2015021922A1 CN 2014084287 W CN2014084287 W CN 2014084287W WO 2015021922 A1 WO2015021922 A1 WO 2015021922A1
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WO
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ginsenoside
enteric
pharmaceutical composition
group
drug
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PCT/CN2014/084287
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English (en)
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范富林
范子悠
余剑桥
黄娟娟
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广东泰禾医药科技有限公司
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Publication date
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    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7028—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages
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    • A61K31/704—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages attached to a carbocyclic compound, e.g. phloridzin attached to a condensed carbocyclic ring system, e.g. sennosides, thiocolchicosides, escin, daunorubicin
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    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents

Definitions

  • the invention belongs to the field of medicine.
  • the present invention relates to ginsenoside Rd or an enteric preparation thereof and its use in the prevention and treatment of colon cancer. Background technique
  • Colorectal cancer refers to a malignant lesion that occurs in the colon or rectal mucosa epithelium under the influence of various carcinogenic factors such as the environment or heredity.
  • CRC Colorectal cancer
  • One of the objects of the present invention is to provide a novel use of ginsenoside Rd in the prevention and treatment of colon tumors.
  • Another object of the present invention is to provide an enteric pharmaceutical composition containing ginsenoside Rd for use in the prevention and treatment of colon tumors.
  • ginsenoside Rd for the preparation of an enteric drug for the prevention and/or treatment of colon tumors.
  • the enteric drug is a dosage form selected from the group consisting of enteric oral preparations, intestinal suppositories, and enema preparations.
  • the enteric oral preparation is selected from the group consisting of enteric capsules, enteric tablets, enteric microcapsules, enteric granules, enteric-coated pellets.
  • the enema preparation comprises: an enema solution.
  • the unit dosage of the ginsenoside Rd or the enteric drug is 1-150 mg/dose; and/or the dosage of the ginsenoside Rd or the enteric drug is 0.1 based on the body weight of the rat. -30 mg/kg; and/or
  • the ginsenoside Rd or enteric drug is administered at a dose of 0.016-2.5 mg/kg, based on the patient's body weight.
  • the unit dose of the ginsenoside Rd or the enteric drug is 25-50 mg/dose. In another preferred embodiment, the ginsenoside Rd or the enteric drug is administered at a dose of 0.1-15 mg/kg or 0.2-30 mg/kg, preferably 5-10 mg/kg or 2.5-5 mg/kg.
  • the ginsenoside Rd or enteric drug is administered in an amount of 0.4-0.8 mg/kgo, based on the patient's unit weight.
  • the enteric drug further has the following characteristics: (1) inhibiting the increase in the number of colon tumors; and/or
  • the inhibition rate of inhibiting the number of colon tumors is ⁇ 40%; preferably ⁇ 50%; more preferably ⁇ 60%.
  • the inhibition rate of inhibition of the number of abnormal crypt foci is ⁇ 11%; preferably ⁇ 30%; more preferably ⁇ 50%.
  • the enteric drug further has the following characteristics:
  • the carcinogen comprises: DMHC dimethyl hydrazine, 1, 2-Dimethylhydrazine dihydrochloride, DMH+DSS (sodium dextran sulfate), azo oxymethane (AOM) or
  • DMHC dimethyl hydrazine 1, 2-Dimethylhydrazine dihydrochloride
  • DMH+DSS sodium dextran sulfate
  • AOM azo oxymethane
  • an enteric pharmaceutical composition for preventing and/or treating a colon tumor is provided, wherein ginsenoside Rd is used as an active ingredient.
  • the enteric pharmaceutical composition is a dosage form selected from the group consisting of enteric oral preparations, intestinal suppositories, and enema preparations.
  • the enteric oral preparation is selected from the group consisting of enteric capsules, enteric tablets, enteric microcapsules, enteric granules, enteric-coated pellets.
  • the enema preparation comprises: an enema solution.
  • the enteric pharmaceutical composition further comprises a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the pharmaceutically acceptable carrier comprises: shellac, polyvinyl acetate phthalate, cellulose enteric material and derivatives thereof, acrylic resin, cocoa butter, semi-synthetic Glycerol fatty acid ester, glycerin gelatin, polyethylene glycol, starch.
  • the ginsenoside Rd or the enteric pharmaceutical composition has a unit dose of from 1 to 150 mg per dose;
  • the ginsenoside Rd or the enteric pharmaceutical composition is administered at a dose of 0.1-30 mg/kg, based on the body weight of the rat;
  • the ginsenoside Rd or enteric pharmaceutical composition is administered at a dose of 0.016-2.5 mg/kg, based on the patient's unit weight.
  • the unit dosage of the ginsenoside Rd or the enteric pharmaceutical composition is 25-50 mg/dose.
  • the ginsenoside Rd or enteric pharmaceutical composition is administered at a dose of 0.1-15 mg/kg or 0.2-30 mg/kg, preferably 5-10 mg/kg, based on the unit weight of the mouse. Kg or 2.5-5 mg/kg.
  • the ginsenoside Rd or the enteric pharmaceutical composition is administered at a dose of 0.4 to 0.8 mg/kg, based on the unit weight of the patient.
  • the ginsenoside Rd is a ginsenoside Rd monomer extracted from Panax notoginseng; the purity of the ginsenoside Rd monomer is ⁇ 95%.
  • the ginsenoside Rd monomer extracted from Panax notoginseng further contains ginsenoside Rb l , ginsenoside Rb2, and ginsenoside Rc.
  • the ginsenoside Rd may also be from the genus Panax ginseng (such as ginseng, west) Ginseng saponin Rd monomer extracted from roots, flowers, leaves, reeds, stems, and fruits of ginseng.
  • the enteric pharmaceutical composition further comprises other therapeutic agents, including 5-fluorouracil, vitamin D and its derivatives, metformin hydrochloride, and aspirin.
  • the ginsenoside Rd is contained in the pharmaceutical composition in an amount of 0.1 to 95% by weight (preferably 1 to 90% by weight), and the other therapeutic agent is contained in an amount of 0.1 to 95% by weight. Ground l-90wt%).
  • the mass ratio of ginsenoside Rd to other therapeutic agents is 1-1000: 1 - 1000; preferably 1-100: 1-100.
  • the enteric pharmaceutical composition contains ginsenoside Rd and 5-fluorouracil; or the enteric pharmaceutical composition contains ginsenoside Rd and aspirin; or the enteric pharmaceutical composition contains ginsenoside Rd And vitamin D and its derivatives and metformin.
  • the enteric pharmaceutical composition comprises ginsenoside Rd and 5-fluorouracil; and the ratio of ginsenoside Rd to 5-fluorouracil is 1-100 ⁇ : 1- ⁇ ; or
  • the enteric pharmaceutical composition comprises ginsenoside Rd and aspirin; and the ratio of ginsenoside Rd to aspirin is 1 - 80 mg / kg : 1-150 mg / kg; or
  • the enteric pharmaceutical composition comprises ginsenoside Rd and vitamin D and derivatives thereof and metformin; and the ratio of ginsenoside Rd and vitamin D and its derivative to metformin is 1-100 mg/kg: 100-400 IU: 50-1000 mg/kg.
  • the enteric pharmaceutical composition contains ginsenoside Rd and 5-fluorouracil; and the ratio of ginsenoside Rd to 5-fluorouracil is 12.5-50 ⁇ : 10-40 ⁇ .
  • the enteric pharmaceutical composition comprises ginsenoside Rd and aspirin; and the ratio of ginsenoside Rd to aspirin is 10-40 mg/kg: 7.5-130 mg/kg or 10-40 mg/kg: 32.5- 130 mg/kg.
  • the enteric pharmaceutical composition comprises ginsenoside Rd and vitamin D and derivatives thereof and metformin; and the ratio of ginsenoside Rd and vitamin D and its derivative to metformin is 5-50 mg/ Kg: 100-400 IU: 120-480 mg/kg; preferably, 10-40 mg/kg : 200-400 IU: 120-360 mg/kg.
  • a pharmaceutical composition comprising ginsenoside Rd and 5-fluorouracil; or the pharmaceutical composition comprising ginsenoside Rd and aspirin; or the pharmaceutical composition
  • the substance contains ginsenoside Rd and vitamin D and its derivatives and metformin.
  • the pharmaceutical composition comprises ginsenoside Rd and 5-fluorouracil; and ginsenoside
  • the ratio of Rd to 5-fluorouracil is 1-100 ⁇ : 1-100 ⁇ ; or
  • the pharmaceutical composition contains ginsenoside Rd and aspirin; and the ratio of ginsenoside Rd to aspirin is 1 - 80 mg / kg : 1-150 mg / kg; or
  • the pharmaceutical composition contains ginsenoside Rd and vitamin D and its derivatives and metformin; and the ratio of ginsenoside Rd and vitamin D and its derivative to metformin is 1-100 mg/kg: 100-400 IU: 50- 1000 mg/kg.
  • the pharmaceutical composition contains ginsenoside Rd and 5-fluorouracil; and the ratio of ginsenoside Rd to 5-fluorouracil is 12.5-50 ⁇ : 10-40 ⁇ .
  • the pharmaceutical composition contains ginsenoside Rd and aspirin; and the ratio of ginsenoside Rd to aspirin is 10-40 mg/kg: 7.5-130 mg/kg or 10-40 mg/kg: 32.5- 130 mg/kg.
  • the pharmaceutical composition comprises ginsenoside Rd and vitamin D and derivatives thereof and metformin; and the ratio of ginsenoside Rd and vitamin D and its derivative to metformin is 5-50 mg/kg: 100-400 IU: 120-480 mg/kg; preferably, 10-40 mg/kg: 200-400 IU: 120-360 mg/kg.
  • kits comprising a container, and a first drug and a second drug in the container, wherein the first drug is the intestine of the second aspect of the invention A soluble pharmaceutical composition; and the second drug is a pharmaceutical composition containing other therapeutic agents as active ingredients, wherein the other therapeutic agents include: 5-fluorouracil, vitamin D and its derivatives, metformin hydrochloride, or aspirin.
  • the first drug and the second drug are independent of each other.
  • a method for preventing and/or treating a colon tumor comprising the steps of: administering a safe and effective amount of ginsenoside Rd to a subject in need of prevention and/or treatment or the second aspect of the invention Enteric pharmaceutical composition.
  • the subject in need of treatment is a mammal or a human having a colon tumor.
  • the safe and effective amount is 0.1-30 mg/kg, preferably 0.1-15 mg/kg or 0.2-30 mg/kg; more preferably, 5, based on the unit weight of the rat. -10 mg/kg or 2.5-5 mg/kg.
  • the safe and effective amount is 0.016-2.5 mg/kg, preferably 0.16-1.6 mg/kg or 0.4-0.8 mg/kg, based on the unit weight of the patient.
  • Figure 1 shows the normal glandular fossa.
  • Figure 5 shows ACF (AC ⁇ 4).
  • Figure 6 shows mucosal ulcers.
  • Figure 7 shows the large intestine mucosa (normal).
  • Figure 8 shows the large intestine mucosa (tumor).
  • Figure 9 shows the ACF morphology of murine colorectal mucosa. Normal glandular fossa (A); ACF: lCrypt (B), 2 Crypt (C), 3 Crypt (D), ⁇ 4 Crypt (E).
  • Figure 10 shows the ACF morphology of murine colorectal mucosa; normal glandular fossa (A); ACF: lCrypt(B), 2Crypt(C),
  • Figure 11 shows the inhibitory effect of Rd on HCT-1 16 colon cancer cells (24 h, 48 h, 72 h, compared with the negative group, P ⁇ 0.05).
  • Figure 12 shows the inhibitory effect of 5-FU on HCT-116 colon cancer cells (24h, 48h, 72h, compared with the negative group, P ⁇ 0.05).
  • Figure 13 shows the inhibitory effect of Rd+5-FU combined with 5-FU on colon cancer cell line HCT-116 at different time points by MTT assay.
  • * is compared with the 5-FU 20 ⁇ group P ⁇ 0.05; # ⁇ CF 20 M+5-FU 20 ⁇ group comparison! > ⁇ 0.05.
  • ginsenoside Rd has an excellent effect of preventing and treating colon tumors, especially a ginsenoside Rd enteric pharmaceutical composition, which can be displayed at a lower application dose. Excellent preventive and/or therapeutic effects, resulting in lower toxic side effects and higher drug safety. On this basis, the inventors completed the present invention.
  • Ginsenoside Rd monomer
  • Ginsenoside Rd monomer is a monomer isolated from the total saponins of Panax notoginseng, which is the active constituent of Panax notoginseng.
  • the ginsenoside Rd monomer accounts for 4.07% of the total saponins, and is one of the four saponins (Rgl, Rbl, Rl, Rd) mainly having a significant pharmacologically active ingredient.
  • the ginsenoside Rd monomer is also widely present in the roots, flowers, leaves, reeds, stems and fruits of the genus Panax species.
  • the extraction method is mainly based on gradient elution.
  • Ginsenoside Rd is a tetracyclic triterpenoid derivative and is a protopanaxadiol saponin. Its Chinese chemical name is 20-(S)-protosan diol-3 [0- ⁇ - ⁇ -glucopyranose (1 ⁇ 2)- ⁇ - ⁇ -glucopyranoside] -20- ⁇ - ⁇ - ⁇ -glucopyranoside (20(S)-Protopanaxadiol-3[OpD-glucopyranosyl(l ⁇ 2)-pD-glucopyranosyl]-20-OpD-glucopyranoside), molecular formula: C 48 H 82 0 18 , relative molecular weight 947.15; Appearance is white to slightly yellow powder, odorless, soluble in methanol, ethanol, propylene glycol and n-butanol, soluble in acetone, chloroform and hot water. The main physical and chemical constants are: melting point 206-209 ° C, UV absorption in
  • the enteric drug or enteric pharmaceutical composition of the present invention e.g., ginsenoside Rd enteric preparation or intestinal suppository, enema preparation, etc.
  • ginsenoside Rd enteric preparation or intestinal suppository, enema preparation, etc. contains the active ingredient ginsenoside Rd in a safe and effective amount.
  • the active ingredient may be a purified or synthetic ginsenoside Rd monomer (compound of formula 1); the active ingredient may also be a Panax notoginseng extract containing ginsenoside Rd monomer (preferably, the extract, ginseng The content of saponin Rd monomer is ⁇ 95%).
  • the extract further contains ginsenoside Rbl, ginsenoside Rb2, ginsenoside Rc and the like.
  • the pharmaceutical composition contains from 1 to 150 mg of the active ingredient per agent, more preferably from 25 to 50 mg of the active ingredient per agent.
  • the "one dose” is a capsule (such as an enteric capsule) or a tablet (such as an enteric tablet), an intestinal suppository, an enteral preparation or an enteric-coated pellet.
  • compositions of the present invention further comprise a pharmaceutically acceptable excipient or carrier.
  • pharmaceutically acceptable carrier means: one or more compatible solid or liquid fillers or gel materials which are suitable for human use and which must be of sufficient purity and of sufficiently low toxicity.
  • compatibil it is meant herein the incorporation of the components of the composition with the active ingredients and their intermixing without significantly reducing the efficacy of the active ingredient.
  • examples of pharmaceutically acceptable carriers are cellulose and its derivatives (such as sodium carboxymethylcellulose, sodium ethylcellulose, cellulose acetate, etc.), gelatin, talc, solid lubricants (eg Stearic acid, magnesium stearate), calcium sulfate, vegetable oils (such as soybean oil, sesame oil, peanut oil, olive oil, etc.), polyols (such as propylene glycol, glycerin, mannitol, sorbitol, etc.), emulsifiers (such as Tween) , wetting agents (such as sodium decyl sulfate), colorants, flavoring agents, stabilizers, antioxidants, preservatives, pyrogen-free water, ethanol, etc.
  • solid lubricants eg Stearic acid, magnesium stearate
  • calcium sulfate such as soybean oil, sesame oil, peanut oil, olive oil, etc.
  • polyols such as propylene glycol, gly
  • the pharmaceutically acceptable carrier of the present invention is preferably enteric, and includes, for example, shellac, polyvinyl acetate phthalate, cellulose enteric materials, and derivatives thereof (such as cellulose acetate phthalate). , 1,2,4-benzenetricarboxylic acid acetate, hydroxypropyl methylcellulose phthalate, hydroxypropyl methylcellulose 1,2,4-benzenetricarboxylate, cellulose acetate succinate, amber Acid ethyl hydroxypropyl methylcellulose, Opadry, etc.), acrylic resin (such as acrylic resin I, II, III, etc.), cocoa butter, semi-synthetic glycerin fatty acid ester, glycerin gelatin, poly Glycol, gelatin, starch, etc.
  • enteric includes, for example, shellac, polyvinyl acetate phthalate, cellulose enteric materials, and derivatives thereof (such as cellulose acetate phthalate).
  • the mode of administration of the active or pharmaceutical composition of the present invention is not particularly limited, and representative administration forms include, but are not limited to, oral, intratumoral, enteral administration (colon or rectum) and the like.
  • Solid dosage forms for oral administration include enteric capsules, tablets, pills, powders, pills, and granules.
  • the active compound is mixed with at least one conventional inert excipient (or carrier), such as sodium citrate or dicalcium phosphate, or mixed with: (a) a filler or compatibilizer, for example, Starch, lactose, sucrose, glucose, mannitol and silicic acid; (b) binders, for example, hydroxymethylcellulose, alginate, gelatin, polyvinylpyrrolidone, sucrose and gum arabic; (c) moisturizing An agent, for example, glycerin; (d) a disintegrant, for example, agar, calcium carbonate, potato starch or tapioca starch, alginic acid, certain complex silicates, and sodium carbonate; (e) a slow solvent such as paraffin; f) absorption accelerators, for example, quaternary amine compounds; (g) wetting agents, such as cetylene glyco
  • the dosage form may also contain a buffer.
  • Solid dosage forms such as tablets, troches, capsules, pills, pills, and granules can be prepared from coatings and shells, such as enteric coatings and other materials known in the art. They may contain opacifying agents and the release of the active compound or compound in such compositions may be released in a portion of the digestive tract in a delayed manner. Examples of embedding components that can be employed are polymeric and waxy materials. If necessary, the active compound may also be in microencapsulated form with one or more of the above-mentioned excipients.
  • the compounds of the invention may be administered alone or in combination with other pharmaceutically acceptable therapeutic agents.
  • Other therapeutic agents include: Vitamin D and its derivatives, metformin hydrochloride, folic acid, and aspirin. treatment method
  • the present invention provides a method of treatment comprising the steps of: administering to a subject in need of treatment a safe and effective amount of ginsenoside Rd or an enteric pharmaceutical composition thereof.
  • the subject in need of treatment is preferably a mammal having a colon tumor (e.g., human, mouse, rabbit, etc.).
  • the safe and effective amount is that the amount of active ingredient is sufficient to significantly improve the condition without causing serious side effects.
  • the active ingredient or pharmaceutical composition is administered at a dose of 0.1-15 mg/kg, preferably 2.5-5 mg/kg, or the active ingredient or the mouse body weight, calculated as the unit weight of the rat.
  • the pharmaceutical composition is administered at a dose of 0.2-30 mg/kg; preferably, 5-10 mg/kg ; or the active ingredient or pharmaceutical composition is administered at a dose of 0.016-2.5 mg/kg , as calculated by the unit weight of the patient; Preferably, it is 0.4-0.8 mg/kg.
  • specific doses should also consider factors such as the route of administration, the health of the patient, etc., which are within the skill of the skilled physician.
  • the advantages of the invention mainly include:
  • Ginsenoside Rd can significantly reduce the symptoms of diarrhea caused by carcinogens, inhibit the inflammation of the large intestine caused by carcinogens, and reduce ACF. Quantity and number of tumors.
  • a ginsenoside Rd enteric pharmaceutical composition for preventing and treating colon tumors is provided.
  • the ginsenoside Rd enteric preparation of the present invention is significantly reduced in dosage (about one quarter of the application amount of the non-enteric preparation), has low toxic side effects, high safety, and is superior in effect. .
  • the invention will be further elucidated below in conjunction with specific implementations. It is to be understood that the examples are only intended to illustrate the invention and not to limit the scope of the invention.
  • Ginsenoside Rd (produced by Guangdong Taihe Pharmaceutical Technology Co., Ltd., batch number 20100808, purity 95.9%), dissolved in hot water to make a solution; methanol, Merck, chromatographically pure; acetonitrile, Merck, chromatographically pure; sodium chloride injection , Guangdong Litai Pharmaceutical Co., Ltd.;
  • mice were intragastrically administered with ginsenoside Rd solution 80 mg/kg.
  • the duodenum, jejunum, ileum and colon were weighed, and the contents were washed out with physiological saline.
  • calculate the quality of the intestinal contents by adding 1:3 or 1:6 (W/V, g/ml) times to the physiological saline to prepare a homogenate, and take 200 ⁇ of the frozen solution for use.
  • blood samples were collected at 1, 2, 4, 5, 6, 7, 8, 9 and 10 h after gavage, centrifuged (3000 rpm) for 10 min, and plasma was separated for 200 ⁇ and stored for use.
  • the filter was filtered through a 0.45 ⁇ filter, and the drug concentration was determined by HPLC.
  • the drug content in the small intestine was 25.0% of the administered amount.
  • the drug content in the jejunum was transferred to the ileum, and the drug content in the jejunum was 5.5% of the drug administered.
  • the dose of the ileum was 24.3% of the administered amount.
  • oral administration of ginsenoside Rd is basically not absorbed by the intestine, and its bioavailability is low. It can not be used for the treatment of systemic diseases; but most of it can be used after entering the small intestine.
  • the prototype enters the colon and can be used for the treatment of colonic diseases such as colitis, colon cancer, and colon polyps.
  • Ginsenoside Rd produced by Guangdong Taihe Pharmaceutical Technology Co., Ltd., batch number 20100808, purity 95.9%.
  • Preparation of artificial gastric juice Take 0.164ml of dilute hydrochloric acid, add about 8ml of water and 0.1g of pepsin. Stir well and add water to make it to 10ml.
  • Ginsenoside Rd is easily hydrolyzed by gastric acid, and ginsenoside Rd has a large molecular weight, poor permeability in intestinal mucosa, and low bioavailability for oral administration. Saponins have many factors affecting oral absorption, and oral preparations are more effective. difference. Therefore, it is necessary to find a new preparation with high bioavailability, low irritability and good patient compliance. To this end, the inventors conducted Example 3. Example 3 Content of ginsenoside Rd in the intestine after injection into the duodenum of mice
  • Ginsenoside Rd (produced by Guangdong Taihe Pharmaceutical Technology Co., Ltd., batch number 20100808, purity 95.9%), dissolved in hot water to make a solution; methanol, Merck, chromatographically pure; acetonitrile, Merck, chromatographically pure; sodium chloride injection , Guangdong Litai Pharmaceutical Co., Ltd.;
  • mice 40 healthy KM mice, male, weighing 18 ⁇ 24g, were randomly divided into 8 groups according to body weight, 5 rats at each time point. After ether anesthesia, the mice were injected with ginsenoside Rd solution 80mg/kg through the duodenum. , after 0, 4, 5, 6, 7, 8, 9 and l lh after injection, weighed the small intestine and colon, weighed out the contents with physiological saline, and then weighed, calculate the quality of intestinal contents according to 1 :6 (W/V, g/ml) was added to NS to prepare a homogenate, which was aspirated and stored at 200 ⁇ for use.
  • blood was collected from the iliac veins at 0, 4, 5, 6, 7, 8, 9 and l lh after injection, centrifuged (3000 rpm) for 10 min, and the plasma was separated by 200 ⁇ and stored for use.
  • the drug content in the small intestine is 99.25 ⁇ 4.27% of the dose. After 6 hours, the drug content in the small intestine was 90.67 ⁇ 24.84% of the administered dose, and no drug was detected in the colon. After 7 h, the drug content in the colon was 3.80 ⁇ 2.95% of the administered dose. After lh, the drug content in the colon reached the maximum, which was 81.25 ⁇ 9.74% of the drug dosage. See Table 2.
  • the maximum drug content (about 20%) was determined in the colon 6h after gavage administration of ginsenoside Rd in mice, and the drug content in the small intestine was determined to be 80.40 ⁇ 28.88% in mice after duodenal injection of ginsenoside Rd. After 14 hours, the ginsenoside Rd prodrug can still be detected in the small intestine.
  • ginsenoside Rd Prototypes and their metabolites were not detected in the blood at each time point.
  • the drug is not absorbed after oral administration of ginsenoside Rd.
  • the stability of ginsenoside Rd is susceptible to pH, is unstable to acid (degradable under normal human gastric pH), and is stable in alkaline environments (such as the intestine).
  • the nature suggests that the drug can be developed into an enteric preparation, thereby providing a novel preparation of ginsenoside Rd with high bioavailability, low irritability and good patient compliance.
  • ginsenoside Rd Ordinary oral preparations of ginsenoside Rd are used for the treatment of intestinal diseases because they are destroyed by gastric juice in the stomach, and enteric preparations, enemas and suppositories are preferred dosage forms for Rd administration.
  • enteric preparations, enemas and suppositories are preferred dosage forms for Rd administration.
  • Example 4 Prevention and treatment of colon cancer by ginsenoside Rd and its enteric preparation
  • Colorectal cancer is one of the common malignant tumors.
  • the incidence rate in China has shown a rapid upward trend, and the pre-expansion is poor, making chemoprevention an important way to prevent cancer from colorectal cancer.
  • Bird proposed the concept of abnormal crypt foci (ACF)
  • ACF has been considered to be the earliest and smallest precancerous lesion of colorectal cancer, and its number is significantly positively correlated with the incidence of tumor.
  • DMH is an animal-specific intestinal tumor inducer, especially a colon tumor.
  • the DMH-induced colorectal cancer model has the advantages of saving time, cost and animal, and is widely used in the research of colorectal cancer development mechanism and prevention and treatment drugs.
  • DMH dimethyl hydrazine
  • mice Male SPF Wistar rats, 96, weighing 80 ⁇ 120g (purchased from Experimental Animal Center of Southern Medical University). The rats were cultured in plastic cages at room temperature of 22 °C ⁇ 2 °C for 12 hours of daily light. They were free to consume the words and water.
  • Ginsenoside Rd enteric-coated capsule low dose group (2.5 mg/kg);
  • Ginsenoside Rd enteric capsule medium dose group (5 mg / kg);
  • DMH subcutaneously injected once a week with DMH (30 mg/kg) for 18 weeks, which was induced into a colorectal cancer model.
  • DMH was dissolved in sodium chloride injection, adjusted to pH 6.5 ⁇ 7.0 with 5% NaOH solution, and made into a solution containing 20 mg per 1 ml, filtered through 0.22 ⁇ , and used now.
  • Ginsenoside Rd is heated to make a solution, or made into an enteric capsule, which is administered once a day.
  • Inflammation See diarrhea in the process of word cultivation. After dissection, there is obvious inflammation in the intestinal mucosa and more than one ulcer lesion as the criterion for the occurrence of ulcerative inflammation.
  • the incidence of inflammation of the large intestine mucosa in the group animals was proportional to the number of ulcers in the large intestine mucosa (% ) m ⁇ The number of ulcerated animals (%)
  • ACF At the 18th week of the experiment, ACF was not found in the blank control group (as shown in Figure 1), and ACF appeared in other groups (as shown in Figure 2, Figure 3, Figure 4, Figure 5). Compared with the model control group, the number of ACFs in each drug group with different numbers of glandular fossa decreased, and the total number of ACF decreased significantly.
  • the ginsenoside Rd enteric-coated capsule group increased the inhibitory effect on ACF with increasing dose (P ⁇ 0.01); the low dose was equivalent to normal gavage (10 mg/kg). Compared with normal gavage, the total dose of ginsenoside Rd (10 mg/kg) enteric-coated capsules was significantly reduced (P ⁇ 0.01).
  • the ACF of the model control group gradually developed into a tumor, and the area of the ulcer lesion also increased, and the typical ACF number The amount becomes less and no statistics are made.
  • the results of ACF are shown in Table 6.
  • the ginsenoside Rd was inhibitory to the colorectal tumor in rats, and the inhibition rate increased with the increase of the dose.
  • the same dose of ginsenoside Rd (10 mg/kg) enteric-coated capsules showed a significant increase in tumor inhibition rate ⁇ 0.01) compared with normal gavage. See Table 7.
  • ginsenoside Rd enteric-coated capsule The effect of ginsenoside Rd enteric-coated capsule is significantly better than that of ginsenoside Rd aqueous solution.
  • the low dose of ginsenoside Rd enteric-coated capsule (2.5mg/kg, which is about one-fourth of the aqueous solution dose); has been better than normal ginsenoside Rd aqueous solution (10mg/kg), and with the increase of dose, enteric Capsules inhibit the effects of inflammation and tumors significantly.
  • ginsenoside Rd enteric preparations can significantly improve intestinal diseases caused by carcinogens (such as colorectal cancer), which can significantly reduce the number of ACF and tumors in colorectal cancer models.
  • CD-I mice 4 weeks old, 165, 6 were supplied by Hunan Slack Jingda Experimental Animal Co., Ltd., and the certificate number SCXK (Xiang) 2011-0003. After 7 days of adaptation, they were randomly divided into a drug-administered group and a control group according to their body mass. Animal intake and animal mass were recorded weekly. 3. Experimental methods
  • mice 165 mice, male, 4 weeks old, weighing about 30 g, were randomly divided into normal control group, DMH control group, DSS control group, model control group (DMH+DSS), Rd and other 7 drug-administered groups. , a total of 11 groups, 15 mice per group.
  • Normal control group Mouse i.p. saline (NS), served with normal drinking water.
  • DMH control Mice i.p. 20 mg/kg DMH, normal drinking water.
  • DSS control mouse i.p. NS, add DSS to drinking water.
  • Model control group i.p. DMH at a dose of 20 mg/kg, and DSS in drinking water.
  • Rd group ginsenoside Rd 20 mg/kg, ig ;
  • ASP (aspirin) low dose group ASP 15 mg / kg, ig ;
  • ASP medium dose group ASP 31.2 mg/kg, ig ;
  • ASP high dose group ASP 65 mg / kg, ig ;
  • Rd+ASP low dose group ginsenoside Rd 20 mg/kg, ig+ASP 15 mg/kg, ig ;
  • Rd+ASP medium dose group ginsenoside Rd 20 mg/kg, i.g.+ASP 31.2 mg/kg, i.g.;
  • Rd+ASP high dose group ginsenoside Rd 20 mg/kg, ig+ASP 65 mg/kg, ig; 3.2 Mouse colorectal tumor model replication
  • mice and drug treatment group mice i.p. 20 mg/kg DMH once. After 1 wk, DSS (concentration 20 g/L) was added to the drinking water of the mice, and the mice were given 7 days of continuous drinking.
  • DSS concentration 20 g/L
  • Normal control group Mouse i.p. saline, normal drinking water.
  • DMH control group mice i.p. 20 mg/kg DMH 1 time, served normal drinking water.
  • DSS control group Mouse i.p. NS, added DSS in drinking water, but did not inject DMH.
  • Rd and aspirin were added to make a suspension, administered orally, 0.1 ml/10 g body weight once a day.
  • the above drugs were administered from the second day of injection of DMH until the end of the experiment at the 20th week of the experiment.
  • the normal control group, the DMH control group, the DSS control group and the model control group were intragastrically administered only with the drug during the drug treatment.
  • the body weight was recorded once a week during the experiment, and the dose was calculated based on the body weight.
  • Blood was taken from the eyeball of the mouse. After the blood was taken, it was allowed to stand, stored at 4 ° C, centrifuged at 6000 rpm for 8 minutes, and the supernatant was taken to the appropriate volume and stored in a refrigerator at -80 ° C for use.
  • the colorectal was separated, the contents of the intestine were washed with physiological saline, and the colorectal tumor was visually observed to calculate the number of tumors. Vernier calipers measure the length and width of each visible tumor. The whole colorectal was flattened between two layers of filter paper and fixed in 10% neutral formaldehyde.
  • the number of tumors per mouse is the total number of tumors per mouse
  • V total tumor volume per mouse.
  • the whole large intestine was flattened between two layers of filter paper and fixed in 10% neutral formaldehyde for 24 hours.
  • the fixed colon tissue was stained for 10 s in 0.2% methylene blue solution.
  • observe the Aberrant crypt foci (ACF;) of the large large intestine and count the ACF according to the deformed crypt in the lesion, respectively, 1 , 2 , 3 and more than 4 respectively. 1, 2, 3, and 4 points are scored.
  • the experimental data was expressed as Mean ⁇ SD, and statistical processing was performed using Excels software or chi-square test. A P value of less than 0.05 was defined as a significant difference.
  • the total number of colorectal ACF decreased and the score decreased in the low, medium and high dose groups of the ginsenoside Rd group, ginsenoside Rd and ASP combination, and the difference was significant.
  • mice in the model control group was 14/14.
  • the number of tumor-bearing mice in the ginsenoside Rd group was 8/14, and the number of mice in the Rd+ASP high-dose group was 5/11, which was significantly different.
  • the number of tumors in the ginsenoside Rd group was significantly reduced, and the difference was significant; the number of tumors in the low, medium and high dose groups of ASP decreased, but the difference was not significant;
  • DMH control group 14 0 0
  • Model control group 14 14 2.64 ⁇ 1.50
  • 1,2-Dimethylhydrazine Dihy drochloride purchased from Tokyo Rencheng Industry Co., Ltd., EC NO. 206-183-5, dissolved in 0.9% sodium chloride injection; Sodium glycosides (DSS), relative molecular mass 36 000-50 000, purchased from MP biomedicals, CAT NO. 160110; ginsenoside Rd, supplied by Guangdong Taihe Biopharmaceutical Co., Ltd., batch number: 20120718. Folic acid: purchased from Zhengzhou Anyu Biotechnology Co., Ltd., batch number: 20130132, valid for 2 years.
  • DSS Sodium glycosides
  • ginsenoside Rd supplied by Guangdong Taihe Biopharmaceutical Co., Ltd., batch number: 20120718.
  • Folic acid purchased from Zhengzhou Anyu Biotechnology Co., Ltd., batch number: 20130132, valid for 2 years.
  • CD-I mice 4 weeks old, 195, 6 were supplied by Hunan Slack Jingda Experimental Animal Co., Ltd., and the certificate number SCXK (Xiang) 2011-0003. After 7 days of adaptation, they were randomly divided into a drug-administered group and a control group according to their body weight. Animal intake and animal mass were recorded weekly. 2.
  • mice male, 5 weeks old, weighing 30 g, were randomly divided into normal control group and DMH control group.
  • DSS control group model control group (DMH+DSS), metformin (M;), vitamin D3 (D;), Rd, folic acid monotherapy group, M+D group, M+D+Rd group, M +D+ folate + Rd group, a total of 13 groups, 15 mice per group.
  • DH+DSS model control group
  • M metformin
  • D vitamin D3
  • Rd folic acid monotherapy group
  • M+D group M+D+Rd group
  • M +D+ folate + Rd group a total of 13 groups, 15 mice per group.
  • Normal control group Mouse i.p. saline, normal drinking water.
  • DMH control Mice i.p. 20 mg/kg DMH, normal drinking water.
  • DSS control Mouse i.p. NS, add DSS to drinking water.
  • Model control group i.p. DMH at a dose of 20 mg/kg, and DSS in drinking water.
  • Rd group Rd 20 mg/kg, i.g.
  • Metformin (M) group metformin 240 mg/kg, i.g.
  • M+D group VD3 200 IU/kg + metformin 240 mg/kg, i.g.
  • Rd+M+D group Rd 20 mg/kg+VD3 200 IU/kg+ metformin 240 mg/kg, i.g
  • Folic acid group Folic acid 6 mg/kg.
  • Rd+ folic acid group Rd 20 mg/kg + folic acid 6 mg/kg, i.g.
  • VD3 + metformin + folic acid group folic acid 6 mg / kg + VD3 200 IU / kg + metformin 240 mg / kg, i.g.
  • Rd+ VD3+ metformin + folic acid group Rd 20 mg/kg + folic acid 6 mg/kg + VD 200 IU/kg + dimethylformin 240 mg/kg, i.g.
  • mice and drug treatment group mice i.p. 20 mg/kg DMH once. After 1 wk, DSS (20/L) was added to the drinking water of the mice, and the mice were given 7 consecutive drinks.
  • Normal control group Mouse i.p. saline, normal drinking water.
  • DMH control group mice i.p. 20 mg/kg DMH 1 time, served normal drinking water.
  • DSS control group Mice only added DSS, i.p. NS in drinking water but did not inject DMH.
  • Vitamin D3 is dissolved in soybean oil and administered intragastrically once a day.
  • Metformin, folic acid and water are added to make an aqueous solution, and administered intragastrically once a day.
  • the above drugs were administered from the 2nd day after the injection of DMH until the end of the experiment at the 20th week of the experiment.
  • the normal control group, the DMH control group, the DSS control group and the model control group were intragastrically administered only with the drug during the drug treatment.
  • the body weight was recorded once a week during the experiment, and the dose was calculated based on the body weight.
  • ginsenoside Rd, metformin, VD3, folic acid alone, VD3+ metformin, Rd+VD3+ metformin, Rd+ folic acid group, folic acid+VD3+ metformin group, Rd+folate+VD3+ metformin all made mouse colorectal mucosa ACF The total number decreases, the score decreases, and the difference is significant;
  • the total number of ACF in the colorectal mucosa of the mice with Rd and folic acid alone or ginsenoside Rd plus metformin, Rd plus metformin and vitamin D3 decreased, and the score decreased, the difference was significant; compared with the vitamin D3 group
  • the total number of ACF in the colorectal mucosa of the ginsenoside Rd+folic acid combination group, ginsenoside Rd+metformin, vitamin D3 and folic acid combination group decreased, and the score decreased. The difference was significant.
  • DMH control group 12 0 0
  • DSS control group 12 0 0
  • VD3 group 11 2.45 ⁇ 0.82** 4.52 ⁇ 1.33**
  • the number of colorectal tumors in the ginsenoside Rd group, the folic acid group, the VD3 group and the metformin group was significantly decreased, and the difference was significant;
  • DMH control group 14 0 0
  • Model control group 14 14 2.64 ⁇ 1.56
  • VD3 group 14 10* 0.94 ⁇ 0.75*
  • Ginsenoside Rd supplied by Guangdong Taihe Biopharmaceutical Co., Ltd., batch number: 080312, dissolved in propylene glycol, diluted with water to the desired concentration when used; human colon cancer cell HCT-1 16, Yu Zuoren, Shanghai Oriental Hospital Provided by the research team;
  • DMEM fetal calf serum
  • double antibody double antibody
  • thiazole blue 5 mg/ml
  • isopropanol 37% HC1.
  • Rd dose-effect relationship study Rd O M group, Rd 25 ⁇ ⁇ 1 Rd 50 ⁇ ⁇ 1 Rd 100 ⁇ group, Rd 200 ⁇ ⁇ 1 Rd 400 ⁇ ⁇ 1;
  • HCT-116 Human colon cancer cells HCT-116 was cultured in DMEM medium. The log phase cells were collected, counted, and the cell suspension concentration was adjusted. 150 ⁇ was added to each well, and the cells were plated to a density of 5000 cells/well. A total of 4 96-well plates were laid.
  • the dose-effect relationship and time-effect relationship of 5 concentrations of 5-FU at 5 different time points on HCT-1 16 cell proliferation inhibition were observed in the experiment (see Table 13 and Figure 12).
  • the results showed that at 10, 20, 30, 40, 50 ⁇ 5-FU inhibition, with its concentration increase and duration of action, cell survival rate decreased gradually, showing a significant concentration and time dependence.
  • the IC50 values at 24 h, 48 h, and 72 h were 46.9 ⁇ 0.36 ⁇ , 26.8 ⁇ 1.12 ⁇ , and 16.1 ⁇ 0.28 ⁇ , respectively.
  • the tumor inhibition rate of Rd 25 ⁇ +5-FU 20 ⁇ group at 24 h, 48 h, and 72 h was compared with that of 5-FU 20 ⁇ group at each time point, and each time point was Rd 25 ⁇ +
  • the inhibition rate of 5-FU 20 ⁇ group was higher than that of 5-FU 20 ⁇ group (p value was less than 0.05 at 24 h, 48 h, 72 h), indicating that 5-FU combined with Rd was better than single.
  • the tumor inhibition rate of Rd 25 ⁇ +5-FU 20 ⁇ group at 24 h, 48 h, and 72 h was compared with the inhibition rate of CF 20 ⁇ +5-FU 20 ⁇ group at each time point, at 24 h.
  • the inhibition rate of Rd 25 ⁇ +5-FU 20 ⁇ group was not higher than that of CF 20 ⁇ +5-FU 20 ⁇ group (p value was not less than 0.05 at 24 h and 48 h).
  • This application is the first to study its anti-tumor cell proliferation activity against human colon cancer cells and synergistic anti-colon cancer effect with traditional cytotoxic drug 5-FU, and provide new ideas for the development of new colon cancer therapeutic drugs.

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Abstract

一种人参皂苷Rd及其制剂在预防和/或治疗结肠肿瘤的药物中的用途。

Description

人参皂苷 Rd或其肠溶制剂及用途
技术领域
本发明属于医药领域。具体地， 本发明涉及人参皂苷 Rd或其肠溶制剂及其在预防 和治疗结肠癌中的用途。 背景技术
结直肠癌 (Colorectal cancer, CRC)是指结肠或直肠粘膜上皮在环境或遗传等多种 致癌因素作用下发生的恶性病变。 随着社会生活水平的不断提高， 饮食习惯和饮食结 构的改变以及人口老龄化， 结直肠癌的发病率和死亡率均保持上升趋势， 大多数患者 发现时已属于中晚期， 预后不良， 死亡率较高。 结直肠癌的病因尚未明确， 可能与环 境因素、 遗传因素、 大肠腺瘤、 慢性大肠炎症等有关。 近年来的研究认为其发展途径 为"正常粘膜_异常腺窝病灶 _腺瘤 _腺癌"。 结直肠癌的治疗以手术切除癌肿为首 选， 辅之以放射治疗、 化疗药物治疗及中医药治疗等。 然而并没有一种有效治疗结肠 癌的药物。 发明内容
本发明的目的之一提供人参皂苷 Rd在预防和治疗结肠肿瘤中的新用途。
本发明的另一目的在于提供用于预防和治疗结肠肿瘤的含有人参皂苷 Rd的肠溶 性药物组合物。
在本发明的第一方面中， 提供了人参皂苷 Rd 的用途， 用于制备预防和 /或治疗 结肠肿瘤的肠溶性药物。
在另一优选例中， 所述肠溶性药物为选自下组的剂型： 肠溶性口服制剂、肠道栓剂、 灌肠制剂。
在另一优选例中， 所述肠溶性口服制剂选自下组： 肠溶胶囊剂、 肠溶片剂、 肠溶 微囊剂、 肠溶颗粒剂、 肠溶滴丸剂。
在另一优选例中， 所述灌肠制剂包括： 灌肠液。
在另一优选例中， 所述人参皂苷 Rd或肠溶性药物的单位剂量为 l-150mg/剂； 和 /或 按大鼠单位体重计算， 所述人参皂苷 Rd或肠溶性药物的施用剂量为 0.1-30 mg/kg; 禾口 /或
按患者单位体重计算， 所述人参皂苷 Rd 或肠溶性药物的施用剂量为 0.016-2.5mg/kg。
在另一优选例中， 所述人参皂苷 Rd或肠溶性药物的单位剂量为 25-50mg/剂。 在另一优选例中， 按小鼠单位体重计算， 所述人参皂苷 Rd或肠溶性药物的施用剂 量为 0.1-15mg/kg 或 0.2-30mg/kg; 较佳地， 为 5-10mg/kg 或 2.5-5 mg/kg。
在另一优选例中， 按患者单位体重计算， 所述人参皂苷 Rd或肠溶性药物的施用剂 量为 0.4-0.8mg/kgo
在另一优选例中， 所述肠溶性药物还具有以下特性： (1) 抑制结肠肿瘤数的增加； 和 /或
(2) 抑制结肠异常隐窝病灶数的增加。
在另一优选例中， 抑制结肠肿瘤数的抑制率≥40%； 较佳地≥50%； 更佳地≥60%。 在另一优选例中， 抑制异常隐窝病灶数的抑制率≥11 %； 较佳地≥30 %； 更佳地≥50 %。
在另一优选例中， 所述肠溶性药物还具有以下特性：
(a) 减轻致癌物质引起的腹泻症状； 和 /或
(b) 抑制致癌物质引起的大肠炎症。
在另一优选例中， 所述致癌物质包括： DMHC二甲基肼， 1,2-Dimethylhydrazine dihydrochloride) DMH+DSS (葡聚糖硫酸钠）、 氧化偶氮甲垸 (azoxymethane, AOM)或 在本发明第二方面中， 提供了一种用于预防和 /或治疗结肠肿瘤的肠溶性药物组合 物， 以人参皂苷 Rd为活性成分。
在另一优选例中， 所述肠溶性药物组合物为选自下组的剂型： 肠溶性口服制剂、 肠 道栓剂、 灌肠制剂。
在另一优选例中， 所述肠溶性口服制剂选自下组： 肠溶胶囊剂、 肠溶片剂、 肠溶 微囊剂、 肠溶颗粒剂、 肠溶滴丸剂。
在另一优选例中， 所述灌肠制剂包括： 灌肠液。
在另一优选例中， 所述肠溶性药物组合物还含有药学上可接受的载体。
在另一优选例中，所述药学上可接受的载体包括： 虫胶、聚醋酸乙烯苯二甲酸酯、 纤维素类肠溶材料及其衍生物、 丙烯酸树脂类、 可可豆脂、 半合成甘油脂肪酸酯、 甘 油明胶、 聚乙二醇、 淀粉。
在另一优选例中，所述人参皂苷 Rd或肠溶性药物组合物的单位剂量为 l-150mg/剂； 禾口 /或
按大鼠单位体重计算， 所述人参皂苷 Rd或肠溶性药物组合物的施用剂量为 0.1-30 mg/kg; 禾口 /或
按患者单位体重计算， 所述人参皂苷 Rd 或肠溶性药物组合物的施用剂量为 0.016-2.5mg/kg。
在另一优选例中，所述人参皂苷 Rd或肠溶性药物组合物的单位剂量为 25-50mg/剂。 在另一优选例中， 按小鼠单位体重计算， 所述人参皂苷 Rd或肠溶性药物组合物的 施用剂量为 0.1-15mg/kg 或 0.2-30mg/kg; 较佳地， 为 5-10mg/kg 或 2.5-5 mg/kg。
在另一优选例中， 按患者单位体重计算， 所述人参皂苷 Rd或肠溶性药物组合物的 施用剂量为 0.4-0.8mg/kg。
在另一优选例中， 所述人参皂苷 Rd为从三七中提取的人参皂苷 Rd单体； 所述 人参皂苷 Rd单体的纯度≥95 %。
在另一优选例中， 所述从三七中提取的人参皂苷 Rd单体还含有人参皂苷 Rb l、 人参皂苷 Rb2、 人参皂苷 Rc。
在另一优选例中， 所述人参皂苷 Rd 还可以是从五加科人参属植物 (如人参、 西 洋参等)的根、 花、 叶、 芦头、 茎、 果实中提取的人参皂苷 Rd单体。
在另一优选例中， 所述肠溶性药物组合物还含有其它的治疗剂， 所述其它的治疗 剂包括： 5-氟尿嘧啶、 维生素 D及其衍生物、 盐酸二甲双胍、 阿司匹林。
在另一优选例中， 所述的药物组合物中， 人参皂苷 Rd的含量为 0.1-95wt% (较佳 地 l-90wt%)， 而其它的治疗剂的含量为 0.1-95wt% (较佳地 l-90wt%)。
在另一优选例中， 人参皂苷 Rd与其它的治疗剂的质量比为 1-1000: 1 - 1000； 较佳地为 1-100： 1— 100。
在另一优选例中，所述肠溶性药物组合物含有人参皂苷 Rd和 5-氟尿嘧啶；或 所 述肠溶性药物组合物含有人参皂苷 Rd 和阿司匹林； 或 所述肠溶性药物组合物含有 人参皂苷 Rd和维生素 D及其衍生物和二甲双胍。
在另一优选例中， 所述肠溶性药物组合物含有人参皂苷 Rd和 5-氟尿嘧啶； 且人 参皂苷 Rd和 5-氟尿嘧啶的用量比为 1-100 μΜ: 1-ΙΟΟμΜ; 或
所述肠溶性药物组合物含有人参皂苷 Rd和阿司匹林； 且人参皂苷 Rd和阿司匹 林的用量比为 1 -80 mg/kg ： 1-150 mg/kg; 或
所述肠溶性药物组合物含有人参皂苷 Rd和维生素 D及其衍生物和二甲双胍；且 人参皂苷 Rd和维生素 D及其衍生物和二甲双胍的用量比为 1-100 mg/kg ： 100-400 IU: 50-1000 mg/kg。
在另一优选例中， 所述肠溶性药物组合物含有人参皂苷 Rd和 5-氟尿嘧啶； 且人 参皂苷 Rd和 5-氟尿嘧啶的用量比为 12.5-50 μΜ: 10-40 μΜ。
在另一优选例中， 所述肠溶性药物组合物含有人参皂苷 Rd和阿司匹林； 且人参 皂苷 Rd和阿司匹林的用量比为 10-40mg/kg: 7.5- 130 mg/kg 或 10-40mg/kg: 32.5- 130 mg/kg。
在另一优选例中，所述肠溶性药物组合物含有人参皂苷 Rd和维生素 D及其衍生 物和二甲双胍； 且人参皂苷 Rd和维生素 D及其衍生物和二甲双胍的用量比为 5-50 mg/kg ： 100-400 IU: 120-480 mg/kg;较佳地，为 10-40 mg/kg : 200-400 IU: 120-360 mg/kg。
在本发明第三方面提供了一种药物组合物， 其特征在于， 所述药物组合物含有人 参皂苷 Rd和 5-氟尿嘧啶； 或所述药物组合物含有人参皂苷 Rd和阿司匹林； 或所述 药物组合物含有人参皂苷 Rd和维生素 D及其衍生物和二甲双胍。
在另一优选例中， 所述药物组合物含有人参皂苷 Rd和 5-氟尿嘧啶； 且人参皂苷
Rd和 5-氟尿嘧啶的用量比为 1-100 μΜ: 1-100μΜ; 或
所述药物组合物含有人参皂苷 Rd和阿司匹林； 且人参皂苷 Rd和阿司匹林的用 量比为 1 -80 mg/kg ： 1-150 mg/kg; 或
所述药物组合物含有人参皂苷 Rd和维生素 D及其衍生物和二甲双胍；且人参皂 苷 Rd和维生素 D及其衍生物和二甲双胍的用量比为 1-100 mg/kg ： 100-400 IU: 50-1000 mg/kg。
在另一优选例中， 所述药物组合物含有人参皂苷 Rd和 5-氟尿嘧啶； 且人参皂苷 Rd和 5-氟尿嘧啶的用量比为 12.5-50 μΜ: 10-40 μΜ。 在另一优选例中， 所述药物组合物含有人参皂苷 Rd 和阿司匹林； 且人参皂苷 Rd 和阿司匹林的用量比为 10-40mg/kg: 7.5- 130 mg/kg 或 10-40mg/kg: 32.5- 130 mg/kg。
在另一优选例中，所述药物组合物含有人参皂苷 Rd和维生素 D及其衍生物和二 甲双胍； 且人参皂苷 Rd和维生素 D及其衍生物和二甲双胍的用量比为 5-50 mg/kg ： 100-400 IU: 120-480 mg/kg;较佳地，为 10-40 mg/kg ： 200-400 IU: 120-360 mg/kg。
在本发明第四方面提供了一种药盒， 所述药盒包括一容器， 以及位于所述容器 内的第一药物和第二药物， 其中第一药物为本发明第二方面所述的肠溶性药物组合 物； 而第二药物为含有其它的治疗剂作为活性成分的药物组合物， 其中所述其它治疗 剂包括： 5-氟尿嘧啶、 维生素 D及其衍生物、 盐酸二甲双胍、 或阿司匹林。
在另一优选例中， 所述的第一药物和第二药物是相互独立的。
在本发明第五方面中， 提供了一种预防和 /或治疗结肠肿瘤的方法， 包括步骤： 给需 要预防和 /或治疗的对象施用安全有效量的人参皂苷 Rd 或本发明第二方面所述的肠溶 性药物组合物。
在另一优选例中， 所述需要治疗的对象为患有结肠肿瘤的哺乳动物或人。
在另一优选例中， 按大鼠单位体重计算， 所述安全有效量为 0.1-30 mg/kg; 较佳地， 为 0.1-15mg/kg 或 0.2-30mg/kg; 更佳地， 为 5-10mg/kg 或 2.5-5 mg/kg。
在另一优选例中， 按患者单位体重计算， 所述安全有效量为 0.016-2.5mg/kg; 较佳 地， 0.16— 1.6mg/kg或 0.4-0.8mg/kg。
应理解， 在本发明范围内中， 本发明的上述各技术特征和在下文 (如实施例）中具 体描述的各技术特征之间都可以互相组合， 从而构成新的或优选的技术方案。 限于篇 幅， 在此不再一一累述。 附图说明
图 1为正常腺窝。
图 2为 ACF(AC=1)。
图 3为 ACF(AC=2)。
图 4为 ACF(AC=3)。
图 5为 ACF(AC≥4)。
图 6为粘膜溃疡。
图 7为大肠粘膜 (正常)。
图 8为大肠粘膜 (发生肿瘤)。
图 9 为鼠结直肠粘膜 ACF 形态。 正常腺窝 (A) ; ACF: lCrypt(B), 2Crypt(C), 3Crypt(D), ≥4Crypt(E)。
图 10 为鼠结直肠粘膜 ACF 形态； 正常腺窝 (A) ; ACF: lCrypt(B), 2Crypt(C),
3Crypt(D), ≥4Crypt(E)。
图 1 1为 Rd对 HCT-1 16结肠癌细胞的抑制作用 (24 h， 48 h， 72 h， 与阴性组比 较， P< 0.05)。 图 12为 5-FU 对 HCT-116结肠癌细胞的抑制作用 (24h、 48 h、 72 h， 与阴性组 比较， P< 0.05)。
图 13为 MTT法检测 Rd+5-FU联用与 5-FU相关剂量在不同时间点对结肠癌细 胞 HCT-116 的抑制作用。 图中， *示与 5-FU 20 μΜ组相比较 P<0.05 ; #示与 CF 20 M+5-FU 20 μΜ组相比较！>< 0.05。 Rd:人参皂苷 Rd; 5-FU: 5-氟尿嘧啶； CF : 亚叶 酸钙。 具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究， 意外地发现人参皂苷 Rd具有优异的预防和治 疗结肠肿瘤的作用，尤其是人参皂苷 Rd肠溶性药物组合物，其在较低的施用剂量下， 即可显示出优异的预防和 /或治疗效果， 因此毒副作用更低、 药物安全性更高。 在此 基础上， 发明人完成了本发明。
本文中， 人参皂苷 Rd、 Rd或 GRd可互换使用。 人参皂苷 Rd单体
人参皂苷 Rd单体是从三七总皂苷中分离提取出来的单体， 三七总皂苷是五加科 植物三七的有效成分。 人参皂苷 Rd单体占总皂苷的 4.07%， 是其中主要具有显著药 理活性成分的四种皂苷之一 (Rgl、 Rbl、 Rl、 Rd)。 人参皂苷 Rd单体还广泛存在于五 加科人参属植物的根、 花、 叶、 芦头、 茎、 果实中。 提取方法以梯度洗脱进行分离纯 化为主。
人参皂苷 Rd单体 (Ginsenoside Rd)是四环三萜类衍生物， 属原人参二醇型皂苷。 它的中文化学名为 20-(S)-原人参二醇 -3 [0-β-ϋ-吡喃葡萄糖 (1→2)-β-ϋ-吡喃葡萄糖苷] -20-Ο-β-ϋ-吡 喃 葡 萄糖苷 （20(S)-Protopanaxadiol-3[O-p-D-glucopyranosyl(l→2) -p-D-glucopyranosyl]-20-O-p-D-glucopyranoside) , 分子式： C48H82018， 相对分子量 947.15； 外观为白色至微黄色粉末， 无臭， 易溶于甲醇、 乙醇、 丙二醇及正丁醇， 溶 于丙酮、氯仿及热水。主要理化常数为： 熔点 206-209°C， 在甲醇介质中紫外吸收 λ Χ = 203nm。 人参皂苷 Rd单体的结构见式 1。
Figure imgf000006_0001
药物组合物
本发明的肠溶性药物或肠溶性药物组合物 (如人参皂苷 Rd肠溶制剂或肠道栓剂、 灌肠制剂等)包含安全有效量范围内的活性成分人参皂苷 Rd。
所述活性成分可以为纯化或合成的人参皂苷 Rd单体 (式 1化合物)； 所述活性成 分还可以是含有人参皂苷 Rd 单体的三七提取物 (优选地， 所述提取物中， 人参皂苷 Rd单体的含量≥95 %)。 优选地， 所述提取物还含有人参皂苷 Rbl、 人参皂苷 Rb2、 人 参皂苷 Rc等。
其中"安全有效量"指的是： 活性成分的量足以明显改善病情， 而不至于产生严重 的副作用。 通常， 药物组合物含有 l-150mg 活性成分 /剂， 更佳地， 含有 25-50mg 活性成分 /剂。 较佳地， 所述的 "一剂 "为一个胶囊 (如肠溶胶囊)或片剂 (如肠溶片剂)、 一个肠道栓剂、 一份灌肠制剂或一份肠溶滴丸剂。
本发明的药物组合物还包含药学上可以接受的赋形剂或载体。 "药学上可以接受 的载体 "指的是： 一种或多种相容性固体或液体填料或凝胶物质， 它们适合于人使用， 而且必须有足够的纯度和足够低的毒性。 "相容性"在此指的是组合物中各组份能和活 性成分以及它们之间相互掺和， 而不明显降低活性成分的药效。 通常， 药学上可以接 受的载体部分例子有纤维素及其衍生物 (如羧甲基纤维素钠、 乙基纤维素钠、 纤维素 乙酸酯等)、 明胶、 滑石粉、 固体润滑剂 (如硬脂酸、 硬脂酸镁)、 硫酸钙、 植物油 (如 豆油、 芝麻油、 花生油、 橄榄油等)、 多元醇 (如丙二醇、 甘油、 甘露醇、 山梨醇等)、 乳化剂 (如吐温)、 润湿剂 (如十二垸基硫酸钠)、 着色剂、 调味剂、 稳定剂、 抗氧化剂、 防腐剂、 无热原水、 乙醇等。
本发明所述药学上可接受的载体优选为肠溶性的， 例如包括： 虫胶、 聚醋酸乙 烯苯二甲酸酯、 纤维素类肠溶材料及其衍生物 (如邻苯二甲酸乙酸纤维素、 1,2,4-苯三 甲酸乙酸纤维素、 邻苯二甲酸羟丙基甲基纤维素、 1,2,4-苯三甲酸羟丙基甲基纤维素、 琥珀酸乙酸纤维素、 琥珀酸乙基羟丙基甲基纤维素、 欧巴代等)、 丙烯酸树脂类 (如丙 烯酸树脂 I号、 II号、 III等)、 可可豆脂、 半合成甘油脂肪酸酯、 甘油明胶、 聚乙二 醇、 明胶、 淀粉等。
本发明活性或药物组合物的施用方式没有特别限制， 代表性的施用方式包括 (但 并不限于)： 口服、 瘤内、 肠内给药 (结肠或直肠)等。
用于口服给药的固体剂型包括肠溶的胶囊剂、 片剂、 丸剂、 散剂、 滴丸剂和颗 粒剂。 在这些固体剂型中， 活性化合物与至少一种常规惰性赋形剂 (或载体)混合， 如 柠檬酸钠或磷酸二钙， 或与下述成分混合： （a) 填料或增容剂， 例如， 淀粉、 乳糖、 蔗糖、 葡萄糖、 甘露醇和硅酸； （b) 粘合剂， 例如， 羟甲基纤维素、 藻酸盐、 明胶、 聚乙烯基吡咯垸酮、 蔗糖和阿拉伯胶； （c) 保湿剂， 例如， 甘油； （d) 崩解剂， 例如， 琼脂、 碳酸钙、 马铃薯淀粉或木薯淀粉、 藻酸、 某些复合硅酸盐、 和碳酸钠； （e) 缓 溶剂， 例如石蜡； （f) 吸收加速剂， 例如， 季胺化合物； （g) 润湿剂， 例如鲸蜡醇和 单硬脂酸甘油酯； （h) 吸附剂， 例如， 高岭土； 和 (i) 润滑剂， 例如， 滑石、 硬脂酸 钙、 硬脂酸镁、 固体聚乙二醇、 十二垸基硫酸钠， 或其混合物。 胶囊剂、 片剂和丸剂 中， 剂型也可包含缓冲剂。 固体剂型如片剂、 糖丸、 胶囊剂、 丸剂、 滴丸剂和颗粒剂可采用包衣和壳材制 备， 如肠衣和其它本领域公知的材料。 它们可包含不透明剂， 并且， 这种组合物中活 性化合物或化合物的释放可以延迟的方式在消化道内的某一部分中释放。可采用的包 埋组分的实例是聚合物质和蜡类物质。 必要时， 活性化合物也可与上述赋形剂中的一 种或多种形成微胶囊形式。
本发明化合物可以单独给药， 或者与其他药学上可接受的治疗剂联合给药。 所 述其他的治疗剂包括： 维生素 D及其衍生物、 盐酸二甲双胍、 叶酸、 阿司匹林。 治疗方法
本发明提供了一种治疗方法， 包括步骤： 给需要治疗的对象施用安全有效量的人参 皂苷 Rd或其肠溶性药物组合物。
所述需要治疗的对象优选为患有结肠肿瘤的哺乳动物 (如人、 鼠、 兔等等)。 所述安全有效量为活性成分的量足以明显改善病情， 而不至于产生严重的副作 用。 如按大鼠单位体重计算， 所述活性成分或药物组合物的施用剂量为 0.1-15mg/kg; 较 佳地， 2.5-5 mg/kg; 或按小鼠单位体重计算， 所述活性成分或药物组合物的施用剂量为 0.2-30mg/kg; 较佳地， 5-10mg/kg; 或如按患者单位体重计算， 所述活性成分或药物组合 物的施用剂量为 0.016-2.5mg/kg; 较佳地， 0.4-0.8mg/kg。 当然， 具体剂量还应考虑给药 途径、 病人健康状况等因素， 这些都是熟练医师技能范围之内的。 本发明的优点主要包括：
1. 提供了一种人参皂苷 Rd在制备预防和 /或治疗结肠肿瘤肠溶性药物中的新用 途， 人参皂苷 Rd可显著减轻致癌物质引起的腹泻症状、 抑制致癌物质引起的大肠炎 症现象， 减少 ACF数量和肿瘤数量。
2. 提供了一种用于预防和治疗结肠肿瘤的人参皂苷 Rd 肠溶性药物组合物。 与 非肠溶性制剂相比，本发明的人参皂苷 Rd肠溶性制剂施用剂量显著降低 (约为非肠溶 性制剂的施用量的四分之一)、 毒副作用低、 安全性高， 且效果更优异。 下面结合具体实施， 进一步阐述本发明。 应理解， 这些实施例仅用于说明本发 明而不用于限制本发明的范围。 下列实施例中未注明具体条件的实验方法， 通常按照 常规条件，例如 Sambrook等人，分子克隆：实验室手册 (New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明， 否则百分比和份数按重量计算。 生物样品分析方法
HPLC法色谱条件：
色谱柱： 岛津 VP-ODS C 18柱（150x4.6 mm, 5 μιη);流动相： 乙腈-水 (35 :65， v/v) ; 流速： l .O ml/min; 检测波长： 203 nm; 柱温： 25 °C； 室温： 20-23 °C； 进样 量： 10 μ1。 实施例 1 人参皂苷 Rd对小鼠灌胃后在肠中药物含量试验
1.1 实验材料：
人参皂苷 Rd (广东泰禾医药科技有限公司生产， 批号 20100808， 纯度 95.9%)， 用热水溶解制成溶液； 甲醇， 默克， 色谱纯； 乙腈， 默克， 色谱纯； 氯化钠注射液， 广东利泰药业有限公司；
1.2 实验方法：
1.2.1 给药与样品采集
健康 KM小鼠 45只， 雄性， 体重 18〜24g， 按体重随机分为 9组， 每个时间点
5只。 小鼠灌胃人参皂苷 Rd溶液 80mg/kg。
分别于灌胃后 1、 2、 4、 5、 6、 7、 8、 9和 10 h， 取十二指肠、 空肠、 回肠、 结 肠后称重， 用生理盐水冲出其内容物后再称重， 计算肠内容物质量按 1 :3或 1 :6(W/V， g/ml)倍加入生理盐水制备匀浆， 吸取 200 μΐ冻存， 待用。
另外， 分别于灌胃后 1、 2、 4、 5、 6、 7、 8、 9和 10 h， 采眼眶静脉血， 离心 (3000 rpm)10 min, 分离血浆 200 μΐ冻存， 待用。
1.2.2 样品的处理
取上述匀浆后的各个肠内容物样品 200μ1， 加入乙腈 400μ1， 涡流混合 1 min， 离 心（12000 rpm)10 min， 0.45 μιη滤器过滤， HPLC法测定药物浓度。
取上述血浆样品 200μ1，加入乙腈 400μ1，涡流混合 1 min，离心（12000 rpm)10 min,
0.45 μιη滤器过滤， HPLC法测定药物浓度。
1.2.3 数据处理
采用 Excel 2003软件进行统计学分析， 所得数据用均值±标准差 (. ±S)表示。 1.3 实验结果：
1.3.1 肠内检测结果
人参皂苷 Rd对小鼠灌胃给药 1小时后， 在小肠的药物含量为给药量的 25.0%。 灌胃给药 2 小时后， 空肠中的药物大部分转移到回肠， 空肠中的药物含量为给 药量的 5.5%。 回肠的药量为给药量的 24.3%。
灌胃给药 5小时后， 结肠内的药物含量为药量的 7.5%。
灌胃给药 6 小时后， 小肠的药物浓度已基本检测不到， 结肠中检测到药物含量 为给药量的 20.0%。 灌胃给药 10小时后， 结肠内检测不到药物。
1.3.2 血液内检测结果
各时间点血液中均未检测到原形药物及其代谢物。
比较 1.3.1和 1.3.2， 结果表明： 人参皂苷 Rd口服给药基本不被肠道吸收， 生物 利用度低， 口服不能用于全身性疾病的治疗； 但由于其进入小肠后绝大部分可以原型 进入结肠， 可用于结肠疾病 (如结肠炎、 结肠癌、 结肠息肉)的治疗。
药动学研究时体内经小肠和结肠测得的药物浓度仅有人参皂苷 Rd给药量的 24% 左右， 不符合质量守恒定律。 因而发明人考察了人参皂苷 Rd 在 37°C下在人工胃液 的稳定性 (如实施例 2)。 实施例 2 人参皂苷 Rd在人工胃液中稳定性研究
2.1 实验材料：
人参皂苷 Rd， 由广东泰禾医药科技有限公司生产， 批号 20100808， 纯度 95.9%。 甲醇， 默克， 色谱纯； 乙腈， 默克， 色谱纯； 胃蛋白酶， 重庆健辰生物工程公司产品; 盐酸， 广东光华化学厂有限公司， 分析纯； 2.2 实验方法：
2.2.1 人工胃液的配制
稀盐酸的配制： 取盐酸 2.34ml， 加水至 10ml。
人工胃液的配制： 取稀盐酸 0.164ml， 加水约 8ml及胃蛋白酶 0.1g， 搅匀后加水 定容至 10ml， 待用。
2.2.2 稳定性考察
称取人参皂苷 Rd粉末 0.016g， 加入 2ml超纯水溶解， 配制成浓度为 8mg/ml的 溶液，将上述浓度为 8mg/ml的溶液吸取 600μ1分别加入到 5400μ1人工胃液中，混匀， 放入 37 °C恒温振荡中， 分别于 0h、 0.17h、 0.33h、 0.5h、 lh、 1.5h从中吸取 200μ1， 加入 400μ1沉淀剂乙腈， 涡旋 3min， 12000rpm在 20〜25 °C室温条件下离心 10min， 取上清用 0.45μιη滤器过滤至样品瓶， 进样 10μ1。
比较不同时间点各峰面积变化。
2.3 实验结果：
结果显示人参皂苷 Rd在 37°C人工胃液条件下， 放置 30min降解 56.14%， 1.5h 降解达 72%以上， 这与前期实验结果相吻合。 见表 1。
表 1不同时间点 37°C人工胃液中人参皂苷 Rd (8 mg/ml)峰面积变化率
Figure imgf000010_0001
人参皂苷 Rd极易被胃酸水解， 而且人参皂苷 Rd分子量大， 在肠粘膜渗透性较 差， 口服给药的生物利用度很低， 皂苷类由于影响其口服吸收的因素很多， 普通口服 制剂疗效较差。因此有必要寻找生物利用度高且剌激性小、病人顺应性好的新型制剂。 为此， 发明人进行了实施例 3。 实施例 3 人参皂苷 Rd对小鼠十二指肠注射后在肠中药物的含量
3.1 实验材料：
人参皂苷 Rd (广东泰禾医药科技有限公司生产， 批号 20100808， 纯度 95.9%)， 用热水溶解制成溶液； 甲醇， 默克， 色谱纯； 乙腈， 默克， 色谱纯； 氯化钠注射液， 广东利泰药业有限公司；
3.2 实验方法：
3.2.1 人参皂苷 Rd溶液的配制
称取人生皂苷 Rd粉末 64mg， 加入丙二醇溶液 4.4ml， 在沸水浴中溶解完全后， 再加入 3.6ml注射用水， 混匀， 备用。
3.2.2 给药与样品采集
健康 KM小鼠 40只， 雄性， 体重 18〜24g， 按体重随机分为 8组， 每个时间点 5只， 小鼠乙醚麻醉后经十二指肠注射人参皂苷 Rd溶液 80mg/kg， 缝皮， 分别于注 射后 0、 4、 5、 6、 7、 8、 9和 l lh， 取小肠及结肠后称重， 用生理盐水冲出其内容物 后再称重， 计算肠内容物质量按 1 :6(W/V， g/ml)倍加入 NS制备匀浆， 吸取 200 μΐ冻 存， 待用。
另夕卜，分别于注射后 0、 4、 5、 6、 7、 8、 9和 l lh，采眼眶静脉血，离心 (3000 rpm)10 min, 分离血浆 200 μΐ冻存， 待用。
3.2.3 样品的处理
取上述各个肠内容物样品 200μ1， 加入乙腈 400μ1， 涡流混合 1 min， 离心（12000 rpm)10 min, 0.45 μιη滤器过滤， HPLC法测定药物浓度。
取上述血浆样品 200 μΐ，加入乙腈 400 μΐ，涡流混合 1 min，离心（ 12000 rpm) 10 min, 0.45 μιη滤器过滤， HPLC法测定药物浓度。
3.2.4 数据处理
采用 Excel 2003软件进行统计学分析， 所得数据用均值±标准差 (、¾±S)表示。
3.3 实验结果：
3.3.1 肠内容物中药物浓度测定结果
小鼠十二指肠注射给药 Oh在小肠的药物含量为给药量的 99.25±4.27%。 6h后, 在小肠的药物含量为给药量的 90.67±24.84%， 结肠中未检测到药物。 7h后， 在结肠 中的药物含量为给药量的 3.80±2.95%。 l lh后， 在结肠的药物含量达到最大值， 为给 药量的 81.25±9.74%。 见表 2。
Figure imgf000011_0001
8.0 2540.10 286.48 320.16 1359.18 1126.48±1065.87
9.0 1113.57 3701.02 2298.05 1993.47 2276.65±1074.28
11.0 10692.42 8295.22 16224.65 13376.46 12147.19±3420.08 小鼠十二指肠注射给予人参皂苷 Rd溶液后， 原型药物在肠中稳定且大量聚集在 结肠部位。 这为人参皂苷 Rd治疗结肠肿瘤的提供了药动学基础。
小鼠灌胃给予人参皂苷 Rd后 6h在结肠中测定药物含量的最大值 (约 20 % )，而小 鼠十二指肠注射给予人参皂苷 Rd后 10h在小肠中测定药物含量为 80.40±28.88%，14h 后小肠中仍能检测到人参皂苷 Rd原型药物。
与以前实验结果灌胃给药后 6h在结肠中测得药物含量最大值比较， 发现两种给 药途径不同， 药物到达结肠的时间不同。这主要因为使用麻醉剂及对动物进行手术等 操作而引起。 3.3.2 血液内检测结果
各时间点血液中均未检测到原形药物及其代谢物。说明口服人参皂苷 Rd后药物 不吸收。 综上可知， 人参皂苷 Rd的稳定性易受 pH值的影响， 对酸不稳定 (在人体正常胃 液 pH条件下可快速降解)， 而在偏碱性环境 (如肠道)中较为稳定， 这些性质提示可将 该类药物开发成肠溶制剂， 从而提供一种生物利用度高、 剌激性小、 病人顺应性好的 人参皂苷 Rd新型制剂。 人参皂苷 Rd的普通口服制剂因其在胃内被胃液破坏， 用于 治疗肠道疾病时会使用药量增大， 而肠溶制剂、灌肠剂与栓剂是 Rd给药的优选剂型。 实施例 4 人参皂苷 Rd及其肠溶制剂对结肠癌的预防和治疗作用
结直肠癌是常见的恶性肿瘤之一， 近年来在我国的发病率呈快速上升趋势， 预 后不良， 使化学预防作为对结直肠癌的一个防癌途径受到重视。 自从 Bird提出异常 隐窝病灶 (ACF)概念以来， ACF已被认为是能观察的最早最小的结直肠癌癌前病变， 其数目与肿瘤的发生率呈显著正相关。 DMH为动物特异性肠道肿瘤诱发剂， 尤其是 结肠肿瘤。 以 DMH诱发的结直肠癌模型， 具有节省时间、 费用和动物的优点， 目前 广泛应用于结直肠癌发生机制和防治药物的研究。 本实施例以二甲基肼 (DMH)诱发 Wistar大鼠结直肠癌为模型， 探讨人参皂苷 Rd 对结直肠癌的化学预防作用和对大肠肿瘤的影响。
4.1 药品与试剂：
二甲基肼（1,2-Dimethylhydrazine dihydrochloride, DMH), 东京仁成工业株式会 社； 人参皂苷 Rd， 广东泰禾医药科技有限公司 (批号： 20100808， 纯度 95.9%); 肠溶 空心小动物胶囊， 潮州市强基制药厂 (批号： 20101201); 亚甲蓝， 天津市大茂化学试 剂厂。 4.2 实验动物分组及处理：
雄性 SPF级 Wistar大鼠 96只，体重 80〜120g (；购自南方医科大学实验动物中心）。 大鼠在室温 22 °C ±2 °C、 每日光照 12小时的洁净环境中用塑料笼词养， 可自由食用词 料和水。
大鼠随机分为 6组 = 16) :
空白对照组；
模型对照组；
人参皂苷 Rd正常灌胃组 (10 mg/kg) ;
人参皂苷 Rd肠溶胶囊低剂量组 (2.5 mg/kg) ;
人参皂苷 Rd肠溶胶囊中剂量组 (5 mg/kg) ;
人参皂苷 Rd肠溶胶囊高剂量组 (10 mg/kg) o
除空白对照组外， 其余各组每周用 DMH(30 mg/kg)皮下注射 1次， 连续 18周， 诱发为结直肠癌模型。 DMH用氯化钠注射液溶解，加 5%NaOH溶液调 pH至 6.5〜7.0， 制成每 1 ml含 20mg的溶液， 0.22μιη滤过， 现配现用。 人参皂苷 Rd加热蒸熘水制成 溶液， 或制成肠溶胶囊， 灌词给药， 一日 1次。
各组动物于给药后第 18 周末颈部脱白处死一半动物， 剩余动物除不注射 DMH 外继续按原给药方法词养至 24周。 实验期间每周记录体重 1次， 根据体重计算给药 量。 各实验组给药剂量见表 3。
表 3.实验动物分组及给药剂量
组别 动物数 DMH(mg/kg) ,人 ，苷 Rd ； (mg/kg)
#1.空白对照组 16
#2.模型对照组 16 30
#3.人参皂苷 Rd正常灌胃组 16 30 10
#4.人参皂苷 Rd肠溶胶囊低剂 t组 16 30 2.5
#5.人参皂苷 Rd肠溶胶囊中剂 t组 16 30 5
#6.人参皂苷 Rd肠溶胶囊高剂 t组 16 30 10
4.3 结果观察：
18 周后处死一半大鼠， 观察炎症发生情况， 计数肿瘤和异常腺窝病灶 (Aberrant crypt foci , ACF)个数。 24周处死全部大鼠， 观察炎症发生情况， 计数肿瘤个数。
每天观察记录动物精神活动、 进食、 粪便、 毛发等一般情况。 动物处死后立即 分离大肠， 用生理盐水冲洗肠内容物， 肉眼观察大肠粘膜溃疡情况， 计算肿瘤数目。 将整根大肠铺平夹于两层滤纸之间， 放入 10%中性甲醛固定 24h。 将固定后的大肠组 织放入 0.2%亚甲蓝溶液中染色 10s。立即在光学显微镜下观察大整根大肠的异常腺窝 病灶 (Aberrant crypt foci, ACF) , 按病灶内异常腺窝为 1个、 2个、 3个及大于等于 4 个分别计数。 数据处理采用 Excel 2003软件进行统计学分析， 所得数据用均值±标准 差 ( ea«±«))表示。 对组间差异进行 t检验， P< 0.05表示差异具有统计学意义。
4.4 实验结果 一般情况： 实验第 18周末， 各组大鼠均无一例动物死亡； 精神活动、 进食、 粪 便、 毛发等其它情况无显著差异； 空白对照组体重增加高于注射二甲基肼的各组； 解 剖各组大鼠腹膜、 肝脏、 脾脏等脏器大体观察， 均未见明显异常病灶。 至实验第 21 周模型对照组有 1只大鼠死亡， 不纳入统计。 24周末各组动物体重变化趋势同第 18 周， 模型对照组动物个别大鼠见精神不振、 腹泻。 体重情况见表 4。
表 4.各组动物体重变化情况
18周 24周
组别 0周 动物 动物
体重 增加 体重 增加
#1 103.1±4.3 16 370.4±24.1 259.3% 8 422.6±27.1 309.9%
#2 101.4±5.1 16 309.5±20.9 205.2% 7 317.8±19.7 213.4%
100.3±3.9 16 331.6±15.4 230.6% 8 360.2±18.1 259.1%
#4 99.9±6.2 16 329.7±17.8 230.0% 8 364.9±20.4 265.3%
#5 102.8±6.6 16 345.3±15.9 235.9% 8 389.4±17.6 278.8%
#6 100.7±5.7 16 360.2±19.3 257.7% 8 405.7±15.3 302.9% 炎症： 以词养过程见腹泻， 解剖后见肠粘膜有明显炎症并有 1 个以上溃疡病灶 作为发生溃疡性炎症的判定标准。
实验第 18周末， 空白对照组未见大肠粘膜溃疡性炎症， 注射 DMH各组见有大 肠粘膜溃疡性炎症 (图 6)， 模型对照组所有动物均有发生， 人参皂苷 Rd正常灌胃组与 肠溶胶囊低剂量组情况相当， 随肠溶胶囊中人参皂苷 Rd剂量增加， 溃疡性炎症发生 比例降低。 实验 24周末， 人参皂苷 Rd肠溶胶囊中、 高剂量组的溃疡性炎症发生比例 显著降低。 相同剂量人参皂苷 Rd(10mg/kg)肠溶胶囊给药与正常灌胃比较， 炎症发生 比例显著降低 (P< 0.01)。 见表 5。
表 5各组动物大肠炎症发生情况
18周 24周
组别 动 物 大肠粘膜发生炎 发生比例 大肠粘膜发生炎症 发生比例 数 症溃烂动物数 （％) )m^ 溃烂动物数 （％)
#1 8 0 8 0
#2 8 8 100.0 7 7 100.0
#3 8 6 75.0# 8 3 37.5##
#4 8 6 75.0# 8 3 37.5##
#5 8 5 62.5## 8 1 12.5##
#6 8 4 50.0## 8 1 12.5## 注： 与模型对照组比较: #P< 0.05， # # P< 0.01
ACF: 实验第 18周末， 空白对照组未发现 ACF (如图 1所示)， 其它组都有 ACF 出现 (如图 2、 图 3、 图 4、 图 5所示)。 与模型对照组相比， 各用药组中含不同腺窝数 的各型 ACF数均减少， ACF总数显著减少。 人参皂苷 Rd肠溶胶囊组随剂量增大， 对 ACF的抑制效果增大 (P< 0.01); 低剂量即与正常灌胃（10mg/kg)相当。 相同剂量人 参皂苷 Rd(10mg/kg)肠溶胶囊给药与正常灌胃比较， ACF总数显著减少 (P< 0.01)。 至 第 24周， 模型对照组的 ACF逐步发展为肿瘤， 溃疡病灶面积也增大， 典型 ACF数 量变少， 不作统计。 ACF结果见表 6。
表 6 18周各组动物 ACF数量
组 动物 ACF
ACF总数 ·
别 数 AC=1 AC=2 AC=2 AC>4
#1 8 0 0 0 0 0
#2 8 139.3±14.9 96.3±10.5 18.2±7.2 10.1±3.2 20.5±4.9
#3 8 125.4±13.5# 78.6±8.7 17.3±5.6 9.7±2.1 19.6±4.8
#4 8 123.7±14.6# 81.3±7.9 16.5±6.2 10.4±3.1 16.8±3.7
#5 8 93.3±1 1.2## 53.1±9.2 13.7±7.1 5.5±1.3 9.9±2.6
#6 8 69.3±4.7## 43.9±3.6 12.7±1.4 4.0±1.1 7.9±1.7
注： 与模型对照组比较: #P< 0.05， # # P< 0.01 肿瘤： 实验第 18 周末， 空白对照组无一只大鼠发现肿瘤 (图 7)， 模型对照组大 鼠全部发生肿瘤 (图 8)， 平均肿瘤数 3.1个 /只。 与模型对照组相比， 各用药组的肿瘤 数均有减少。 人参皂苷 Rd随剂量增大， 对肿瘤的抑制率增大， 与模型对照组相比， 中剂量与高剂量组的肿瘤数显著减少 (P< 0.01)。 24周末， 在所有注射过 DMH的大鼠 大肠粘膜均发现有肿瘤， 人参皂苷 Rd对大鼠大肠肿瘤有抑制性， 随着剂量的增加， 抑制率也相应增加。 相同剂量人参皂苷 Rd(10mg/kg)肠溶胶囊给药与正常灌胃比较， 肿瘤抑制率显著增加 < 0.01)。 见表 7。
表 7各组动物肿瘤数量
18周 24周 组别 动物 发生肿瘤大 平均肿瘤 抑制 动物 发生肿瘤 平均肿瘤数 抑制率 数 鼠数】 1 数目 率(％) 数 巨 (%)
#1 8 0 0 8 0 0
#2 8 8 3.1±0.9 7 7 5.75±0.96
8 8 1.9±0.9 38.7 8 8 4.00±1.73 30.4
#4 8 8 1.8±0.7 41.9 8 8 3.25±0.58 43.5
#5 8 7 1.5±0.5 51.6 8 8 2.75±0.50 52.2
#6 8 6 1.1±0.6 64.5 8 8 2.25±0.53 60.9 结果显示：
1. 给药人参皂苷 Rd各组炎症发生和 ACF均显著减少 (P<0.05)， 人参皂苷 Rd各 组均有抑制肿瘤 (P<0.05)， 作用与剂量相关。
2. 人参皂苷 Rd肠溶胶囊的作用显著优于人参皂苷 Rd水溶液。 人参皂苷 Rd肠 溶胶囊低剂量 (2.5mg/kg，约为水溶液剂量的四分之一；)已经优于人参皂苷 Rd水溶液正 常灌胃 (10mg/kg)， 且随着剂量的增加， 肠溶胶囊抑制炎症和肿瘤的作用显著增强。 综上，人参皂苷 Rd肠溶性制剂可以显著改善致癌物质导致的肠道疾病 (如结直肠 癌)， 可以显著减少结直肠癌模型中 ACF和肿瘤数量。 且与非肠溶性制剂相比， 人参 皂苷 Rd肠溶性制剂的有效剂量更低， 且有效性与剂量呈正相关。 因此， 安全性更高。 实施例 5 人参皂苷 Rd与阿司匹林的联用对炎症相关小鼠结直肠肿瘤形成的作 用
本实验参照文献方法 (Tanaka, T.等人， Cancer science, 2003, 94(11): 965-973. Wang: J.-G.等人， World Journal of Gastroenterology, 2004, 10(20): 2958-2962.)， 建立了小鼠 结直肠炎相关的结直肠肿瘤模型， 评价含人参皂苷 Rd及阿司匹林的组合对结肠炎相 关的小鼠结直肠肿瘤形成的协同作用。 材料与方法
1.主要材料
I, 2-二甲肼 （DMH, 1 ,2-Dimethylhydrazine Dihy drochloride) ,购自东京仁成工业株 式会社， EC NO. 206-183-5， 用 0.9%氯化钠注射液溶解； 右旋葡聚糖苷钠 (DSS；)， 相 对分子质量为 36 000-50 000, 购于 MP biomedicals, CAT NO. 160110；人参皂苷 Rd (批 号： 20120718)、 阿司匹林 (批号 20120603)， 均由广东泰禾生物药业有限公司购买、 提供。 2.实验动物
CD-I (ICR) 小鼠， 4周龄， 165只， 6 由湖南斯莱克景达实验动物有限公司供 应， 合格证号 SCXK (湘) 2011-0003。 适应词养 7 d后， 按照体质量被随机分为给药组 和对照组。 每周记录动物摄食量及动物体质量。 3.实验方法
3.1实验分组
实验动物分组： 小鼠 165只， 雄性， 4周龄， 体重约 30g, 随机分为正常对照组、 DMH对照组， DSS对照组， 模型对照组 (DMH+DSS), Rd等 7个给药组， 共 11组， 每组 15只小鼠。
1 . 正常对照组： 小鼠 i.p. 生理盐水 (NS)， 服正常饮水。
2. DMH对照： 小鼠 i.p. 20 mg/kg剂量的 DMH， 服正常饮水。
3. DSS对照： 小鼠 i.p. NS , 饮水中添加 DSS， 。
4. 模型对照组： i.p. 20 mg/kg剂量的 DMH， 饮水中添加 DSS。
不用药物治疗。 在药物治疗期间， 仅用药物溶媒灌胃 (i.g.)。
以下为药物治疗组： 均与模型对照组一样， 制备小鼠结直肠肿瘤模型， 用药物治 疗。
5. Rd组： 人参皂苷 Rd 20 mg/kg, i.g. ;
6. ASP (阿司匹林)低剂量组： ASP 15 mg/kg, i.g. ;
7. ASP中剂量组： ASP 31.2 mg/kg, i.g. ;
8. ASP高剂量组： ASP 65 mg/kg, i.g. ;
9. Rd+ASP低剂量组： 人参皂苷 Rd 20 mg/kg, i.g.+ASP 15 mg/kg, i.g. ;
10. Rd+ASP中剂量组： 人参皂苷 Rd 20 mg/kg, i.g.+ASP 31.2 mg/kg, i.g. ;
I I . Rd+ASP高剂量组： 人参皂苷 Rd 20 mg/kg, i.g.+ASP 65 mg/kg, i.g. ; 3.2 小鼠结直肠肿瘤模型复制
模型对照组小鼠与药物治疗组小鼠 i.p. 20 mg/kg DMH一次。 1 wk后， 小鼠的饮 水中添加 DSS (浓度为 20 g/L), 给予小鼠连续饮用 7 d o
正常对照组： 小鼠 i.p. 生理盐水， 服正常饮水。
DMH对照组： 小鼠 i.p. 20 mg/kg剂量的 DMH 1次， 服正常饮水。
DSS对照组： 小鼠 i.p. NS， 在饮水中添加 DSS， 但不注射 DMH。
3.3给药
Rd和阿司匹林加水制成混悬液， 灌胃给药， 0.1 ml/10 g体重， 一日 1 次。 上述 药物从注射 DMH的第 2天开始给药，直至实验第 20 周实验结束。正常对照组、 DMH 对照组、 DSS对照组与模型对照组在药物治疗期间， 仅用药物溶媒灌胃。 实验期间每 周记录体重 1 次， 根据体重计算给药量。
3.4 样品收集
(1) 血清收集
小鼠眼球取血， 取血后静置， 4摄氏度保存， 6000转低温离心 8分钟， 取上清分 装至合适的体积， 置 -80摄氏度冰箱保存备用。
(2) 肠组织收集
动物处死后立即分离结直肠， 用生理盐水冲洗肠内容物， 肉眼观察结直肠肿瘤， 计算肿瘤数目。游标卡尺测量每个肉眼可见肿瘤的长和宽。将整根结直肠铺平夹于两 层滤纸之间， 放入 10%中性甲醛固定。
3.5 大体观察指标：
每鼠肿瘤数为每鼠全部肿瘤数；
肿瘤体积 (V): 使用测量瘤径的方法， V nm3)的计算公式为： V = l/2xaxb2， 式中 a、 b分别表示肿瘤的长和宽度 (mm)。
每鼠肿瘤体积 (V)=每鼠肿瘤总体积。
3.6 畸变隐窝灶 (Aberrant Crypt focus, ACF)计数：
将整根大肠铺平夹于两层滤纸之间， 放入 10%中性甲醛固定 24h。 将固定后的大 肠组织放入 0.2%亚甲蓝溶液中染色 10s。立即在光学显微镜下观察大整根大肠的畸形 隐窝灶 (Aberrant crypt foci, ACF；)， 按病灶内畸形隐窝为 1个、 2个、 3个及大于等于 4 个分别计数 ACF， 各按 1、 2、 3、 4分进行评分。
3.7统计学分析
实验数据以 Mean ±SD表示， 应用 Excels软件或卡方检验进行统计学处理。 P值 小于 0.05被定义为有显著性差异。
4. 实验结果
4.1 对小鼠结直肠粘膜 ACF形成的影响
结果见表 8。 低倍镜下观察 ACF如图 9所示。
与模型对照组比， 人参皂苷 Rd组、 ASP低、 中、 高剂量组 ACF总数减小、 评分 下降， 差别有显著性； 与模型对照组比， 人参皂苷 Rd和 ASP联合用药各组小鼠结直肠 ACF总数减小、 评分下降， 差别均有显著性。
与 ASP低剂量组比， 人参皂苷 Rd组、 人参皂苷 Rd和 ASP联合用药低、 中、 高 剂量组小鼠结直肠 ACF总数减小、 评分下降， 差别有显著性；
与 ASP中剂量组比， 人参皂苷 Rd组、 人参皂苷 Rd和 ASP联合用药低、 中、 高 剂量组小鼠结直肠 ACF总数减小、 评分下降， 差别有显著性；
与 ASP高剂量组比， 人参皂苷 Rd组、 人参皂苷 Rd和 ASP联合用药低、 中、 高 剂量组小鼠结直肠 ACF总数减小、 评分下降， 差别有显著性。
表 8 人参皂苷 Rd 与阿司匹林单用或联用对结肠炎相关的小鼠结肠肿瘤模型 ACF形成的影响（ ±s)
ACF总数 ACF评分
组别 鼠数
(个 /鼠） (分 /鼠）
1. 正常对照组 11 0 0
2. DMH对照组 11 0 0
3. DSS对照组 11 0 0
4. 模型对照组 11 5.74±1.60 15.21±3.55
5. Rd组 11 1.31±0.32** 2.60±0.80** ""··
6. ASP低剂量组 10 3.40±0.35** 7.76±2.78**
7. ASP中剂量组 10 3.12±0.56** 7.56±2.41 **
8. ASP高剂量组 10 2.98±0.57** 7.00±1.22**
9. Rd+ASP低剂邐 ：组 10 0.98±0.45** 2 40±1 14**
10. Rd+ASP中剂:匱组 9 0.74±0.32** # #"" 1.65±1.23 **
11. Rd+ASP高剂:匱组 9 0.71±0.40** 1.53±0.98**
与模型对照组相比， * * ρ<ο.οι ; 与 ASP低剂量组比， # p<o.o5、 # # p<om ; 与
ASP中剂量组比， A A P<0.01 ; 与 ASP高剂量组比， **?<0.01。
结果表明： 人参皂苷 Rd与阿司匹林联用可抑制 DMH和 DSS联合诱导的小鼠结 直肠 ACF形成， 且二药联用协同作用明显。
4.2 对小鼠结直肠肿瘤数目的影响
小鼠结直肠肿瘤主要出现在结肠远端与直肠部位。 结果见表 9。
正常对照组、 DMH及 DSS单独处理组均未出现结肠肿瘤， 模型对照组肿瘤发生 小鼠数为 14/14。
和模型对照组比， 人参皂苷 Rd组肿瘤发生小鼠数为 8/14， Rd+ASP高剂量组肿 瘤发生小鼠数为 5/11， 有显著性差别；
和模型对照组比， 人参皂苷 Rd组小鼠肿瘤数目明显减少， 差别有显著性； ASP 低、 中、 高剂量组小鼠肿瘤数目减少， 但差别不显著；
和模型对照组比， 联合用药组小鼠结直肠肿瘤数目均明显减少， 差别有显著性。 和人参皂苷 Rd组比， Rd+ASP低、 中剂量组差别不显著， Rd +ASP高剂量联合 给药能减少肿瘤形成数目， 差别具有显著性。 表 9 人参皂苷 Rd与阿司匹林单用或联用对结肠炎相关的小鼠结直肠肿瘤模型肿 瘤数目的影响 ^士 S )
每鼠肿瘤数目
组别 鼠数 患肿瘤鼠数
(个 /鼠）
1 . 正常对照组 14 0 0
2. DMH对照组 14 0 0
3 . DSS对照组 14 0 0
4. 模型对照组 14 14 2.64±1.50
5. Rd组 14 8* 1.07±0.27**
8. ASP高剂量组 12 12 1.85±0.90
1 1 . Rd+ASP高剂 J t组 1 1 5** 0.50±0.53**## 和模型对照组比， *P<0.05， **P<0.01 ; 和 Rd组比， ##P<0.01
结果说明， Rd有抑制小鼠结直肠肿瘤形成的作用， 且和 ASP高剂量协同。 实施例 6 含人参皂苷 Rd、 叶酸、 维生素 D及二甲双胍组合物对炎症相关小鼠 结直肠肿瘤形成的作用
本实验参考文献 (参考文献： 1. 李宇华等， 世界华人硝化杂质， 2007, 15(3): 234-239； 2. Bird, R. P等人， Cancer letters, 1987, 37(2): 147-151； 3. Bird, R. P.等 人, Toxicology letters, 2000, 112: 395-402.4. Kinzler, K. W.等， Cell, 1996, 87: 159-170； 5. Takayama, T.等， New England Journal of Medicine, 1998, 339(18): 1277-1284； 6. Caderni, G.等, Carcinogenesis, 2002, 23(2): 323-327.)建立了结肠炎相关的小鼠结肠肿 瘤模型， 评价含 Rd、 叶酸、 维生素 D3和 /或二甲双胍的组合对结肠炎相关的小鼠结 肠肿瘤形成的预防作用。 材料与方法
1扁
1.1 主要材料
1,2-二甲肼 （DMH, 1 ,2-Dimethylhydrazine Dihy drochloride) ,购自东京仁成工业株 式会社， EC NO. 206-183-5， 用 0.9%氯化钠注射液溶解； 右旋葡聚糖苷钠 (DSS), 相 对分子质量为 36 000-50 000, 购于 MP biomedicals, CAT NO. 160110; 人参皂苷 Rd， 由广东泰禾生物药业有限公司提供， 批号： 20120718。 叶酸： 购自郑州安誉生物科技 有限公司， 批号： 20130132， 有效期 2年。 胆钙化醇 (Cholecalciferol,VD3结晶， D)， 购自浙江花园生物高科股份有限公司， 批号： 20120101011A, 保质期 24 个月， 分 子量 384.64， 40 IU/ g。 盐酸二甲双胍 (Metformin Hydrochloride, M)， 购自曲阜迈德 森精细化工有限公司， 批号 20130807， 保质期 3 年； 大豆油， 药用级， 购自南海油 脂工业 (赤湾)有限公司， 批号： 20130901。
1.2 实验动物
CD-I (ICR) 小鼠， 4周龄， 195只， 6 由湖南斯莱克景达实验动物有限公司供 应， 合格证号 SCXK (湘) 2011-0003。 适应词养 7 d后， 按照体质量被随机分为给药组 和对照组。 每周记录动物摄食量及动物体质量。 2.方法
2.1实验分组
实验动物分组：
小鼠 195只， 雄性， 5周龄， 体重约 30g, 随机分为正常对照组、 DMH对照组，
DSS对照组， 模型对照组 (DMH+DSS), 二甲双胍 (M；)、 维生素 D3(D；)、 Rd、 叶酸 (Folic acid)单药组， M+D组， M+D+Rd组， M+D+叶酸 +Rd组， 共 13组， 每组 15只小鼠。
1 . 正常对照组： 小鼠 i.p. 生理盐水， 服正常饮水。
2. DMH对照： 小鼠 i.p. 20 mg/kg剂量的 DMH， 服正常饮水。
3. DSS对照： 小鼠 i.p. NS , 在饮水中添加 DSS。
4. 模型对照组： i.p. 20 mg/kg剂量的 DMH， 饮水中添加 DSS。
不用药物治疗。 在药物治疗期间， 仅用药物溶媒灌胃 (i.g.)。
以下为药物治疗组： 均与模型对照组一样， 制备小鼠结直肠肿瘤模型， 用药物治 疗。
5. Rd组： Rd 20 mg/kg， i.g.。
6. 二甲双胍 (M)组： 二甲双胍 240 mg/kg， i.g.。
7. VD3(D)组: VD3 200 IU/kg， i.g.。
8. M+D组： VD3 200 IU/kg +二甲双胍 240 mg/kg， i.g.。
9. Rd+M+D组： Rd 20 mg/kg+VD3 200 IU/kg+二甲双胍 240 mg/kg, i.g
10. 叶酸组： 叶酸 6 mg/kg。
11 . Rd+叶酸组： Rd 20 mg/kg+叶酸 6 mg/kg, i.g.。
12. VD3+二甲双胍 +叶酸组：叶酸 6 mg/kg+VD3 200 IU/kg+二甲双胍 240 mg/kg, i.g.。
13. Rd+ VD3+二甲双胍 +叶酸组： Rd 20 mg/kg+叶酸 6 mg/kg+VD 200 IU/kg+二 甲双胍 240 mg/kg, i.g.。
2.2 小鼠结直肠肿瘤模型复制
模型对照组小鼠与药物治疗组小鼠 i.p. 20 mg/kg DMH一次。 1 wk后， 小鼠的饮 水中添加 DSS (浓度为 20 /L), 给予小鼠连续饮用 7
正常对照组： 小鼠 i.p. 生理盐水， 服正常饮水。
DMH对照组： 小鼠 i.p. 20 mg/kg剂量的 DMH 1次， 服正常饮水。
DSS对照组： 小鼠仅在饮水中添加 DSS， i.p. NS但不注射 DMH。
2.3给药
维生素 D3 加大豆油溶解， 灌胃给药， 一日 1 次。
二甲双胍、 叶酸加水制成水溶液， 灌胃给药， 一日 1 次。
上述药物从注射 DMH的第 2天开始给药， 直至实验第 20 周实验结束。 正常对 照组、 DMH对照组、 DSS对照组与模型对照组在药物治疗期间， 仅用药物溶媒灌胃。 实验期间每周记录体重 1 次， 根据体重计算给药量。
2.4样品收集： 同实施例 5的 3.4部分。 2.5 大体观察指标： 同实施例 5的 3.5部分。
2.6 畸变隐窝灶 (Aberrant Crypt focus, ACF )计数： 同实施例 5的 3.6部分。 2.7统计学分析： 同实施例 5的 3.7部分。 3. 实验结果
3.1 对小鼠结直肠粘膜 ACF形成的影响
结果见表 10。 低倍镜下观察 ACF之形态如图 10所示。
与模型对照组比， 人参皂苷 Rd、 二甲双胍、 VD3、 叶酸单独给药， VD3+二甲双 胍、 Rd+VD3+二甲双胍、 Rd+叶酸组、 叶酸 +VD3+二甲双胍组、 Rd+叶酸 +VD3+二甲 双胍均使小鼠结直肠粘膜 ACF总数减小、 评分下降， 差别均有显著性；
与二甲双胍组比， Rd与叶酸单用或人参皂苷 Rd+二甲双胍和维生素 D3联合用药 组小鼠结直肠粘膜 ACF总数减小、 评分下降， 差别有显著性；
与二甲双胍组比， 人参皂苷 Rd+二甲双胍、 维生素 D3和叶酸联合用药组小鼠结 直肠粘膜 ACF总数减小、 评分下降， 差别有显著性；
与维生素 D3组比， Rd与叶酸单用或人参皂苷 Rd加二甲双胍、 Rd加二甲双胍 和维生素 D3联合用药组小鼠结直肠粘膜 ACF总数减小、 评分下降， 差别有显著性； 与维生素 D3组比， 人参皂苷 Rd+叶酸联合用药组、 人参皂苷 Rd+二甲双胍、 维 生素 D3和叶酸联合用药组小鼠结直肠粘膜 ACF总数减小、评分下降，差别有显著性。
表 10 含人参皂苷 Rd、 叶酸、 维生素 D3和二甲双胍的药物组合物对结肠炎相 关的小鼠结直肠肿瘤模型 ACF形成的影响 s， n=10~12 )
ACF总数 ACF评分
组别 鼠数
(个 /鼠） (分 /鼠）
1. 正常对照组 12 0 0
2. DMH对照组 12 0 0
3. DSS对照组 12 0 0
4. 模型对照组 12 5.25±1.60 14.15±3.54
5. Rd组 12 1.42±0.51 **A A 2.54±0.80** A A
6. 二甲双胍组 12 1.67±0.98**A 3.90±1.75**
7. VD3组 11 2.45±0.82** 4.52±1.33**
8. VD3+二甲双胍组 10 1.50±0.71 **A A 2.89±1.25** A A
9. Rd+VD3+二甲双胍组 10 0.80±0.42** #A A 1.65±1.11 **
10. 叶酸组 11 1.00±0.77**A A 1.98±1.23** A A
11. Rd+叶酸组 10 1.40±0.70**A A 2.75±1.63*
12. VD3+二甲双胍 +叶酸组 11 1.45±0.69**A A 3.25±1.53**
13. Rd+VD3+二甲双胍 +叶酸组 11 0.82±0.40** #A A 1.98±1.08** # " 与模型对照组相比， **P<0.01 ; 与二甲双胍组比， # #P<0.01 ; 与维生素 D3组比， ▲ P<0.05， A AP<0.01
实验结果显示，抑制 ACF形成的作用， 以单用 Rd或叶酸作用较强， 以 Rd+VD3 + 二甲双胍组合作用最强。 Rd+叶酸或 Rd+VD3+二甲双胍 +叶酸后未显示出协同作用。 3.3 对大肠肿瘤发生小鼠数与肿瘤数目的影响
结果见表 11。
小鼠大肠肿瘤主要出现在结肠远端与直肠部位。 正常对照组、 DMH及 DSS单独 处理组均未出现结直肠肿瘤， 模型对照组肿瘤发生小鼠数为 100%。
和模型对照组比，人参皂苷 Rd组与 VD3组肿瘤发生小鼠数下降，差别有显著性； 和模型对照组比， Rd+VD3+二甲双胍组、 叶酸组、 Rd+叶酸组、 VD3+二甲双胍 + 叶酸组、 Rd+VD3+二甲双胍 +叶酸组结直肠肿瘤发生小鼠数明显减少，有显著性差别。
和模型对照组比， 人参皂苷 Rd组、 叶酸组、 VD3组和二甲双胍组小鼠结直肠肿 瘤明显数目减少， 差别有显著性；
和模型对照组比， 联合用药组小鼠结直肠肿瘤数目均明显减少， 差别有显著性。 表 11 含人参皂苷 Rd、 叶酸、 维生素 D3和二甲双胍的药物组合物对结肠炎相 关的小鼠结直肠肿瘤模型肿瘤数目的影响（ ±s )
每鼠肿瘤数目 组别 鼠数 患肿瘤鼠数
(个 /鼠）
1. 正常对照组 14 0 0
2. DMH对照组 14 0 0
3. DSS对照组 14 0 0
4. 模型对照组 14 14 2.64±1.56
5. Rd组 14 9* 0.90±0.78**
6. 二甲双胍组 14 12 0.90±0.43 **
7. VD3组 14 10* 0.94±0.75*
8. VD3+二甲双胍组 1 1 8 0.83±0.58**
9. Rd+VD3+二甲双胍组 14 2 * * 0.35±0.55**
10. 叶酸组 14 0.41±0.48**
11. Rd+叶酸组 13 0.86±1.02**
12. VD3+二甲双胍 +叶酸组 14 0.80±1.25**
13. Rd+VD3+二甲双胍 +叶酸组 14 0.70±0.82**
*和模型对照组比， Ρ<0.05 ; **和模型对照组比， Ρ<0.01
实验结果显示， 抑制小鼠结直肠肿瘤形成的作用， 以单用叶酸作用较强， 以 Rd+VD3+二甲双胍组合作用最强。 Rd+叶酸或 Rd+VD3+二甲双胍 +叶酸后未显示出 协同作用。 实施例 7 人参皂苷 Rd协同 5-FU对 HCT-116结肠癌细胞的抑制作用研究 本试验研究了 Rd与 5-FU的协同抗结肠癌作用。
1.实验材料
1.1药物和实验对象：
人参皂苷 Rd(Rd)， 由广东泰禾生物药业有限公司提供， 批号： 080312， 用丙二 醇溶解， 使用时用水稀释至所需浓度； 人结肠癌细胞 HCT-1 16, 由上海市东方医院俞 作仁教授课题组提供；
1.2主要试剂： DMEM, 胎牛血清， 双抗， 噻唑蓝 (5 mg/ml)， 异丙醇， 37% HC1。
1.3主要仪器： 96孔细胞培养板， 细胞培养箱， 移液枪， 枪头， 生物安全柜， 摇 床， 酶联免疫检测仪。
2.方法及步骤
2.1实验分组：
2.1.1 Rd 量效关系研究： Rd O M组、 Rd 25 μΜ ^1 Rd 50 μΜ ^1 Rd 100 μΜ 组、 Rd 200 μΜ ^1 Rd 400 μΜ ^1；
2.1.2 5-FU量效关系研究： 5-FU 10 μΜ组、 5-FU 20 μΜ组、 5-FU 30 μΜ组、 5-FU 40 μΜ组、 5-FU 50 μΜ组；
2.1.3 协同作用研究： Rd 25 μΜ+5-FU 20 μΜ组、 5-FU 20 μΜ组、 5-FU 40 μΜ 组、 亚叶酸钙 (CF)20 M+5-FU 20 μΜ组。
2.2 ΜΤΤ法实验步骤：
2.2.1人结肠癌细胞 HCT-116用 DMEM培养基培养。 收集对数期细胞， 计数， 调 整细胞悬液浓度， 每孔加入 150 μί， 铺板使待测细胞调密度为 5000个 /孔。 共铺 4个 96孔板。
2.2.2 孵育 3-4 h， 至细胞贴壁后， 即加药， 加入浓度梯度的 Rd和 5-FU药物。 2.2.3 分别在 24 h、 48 h、 72 h后， 加 10 MTT/孔， 最后一排不加 MTT作为 对照组。
2.2.4 在 5%C02、 37°C条件下孵育 3h， 倒置显微镜下观察。
2.2.5 终止培养， 除去孔内培养基。
2.2.6 每孔加入 100 Mix(40 mL异丙醇 +44 37% HC1), 一直轻轻拍板， 待 全溶解。 室温下速度 180、 摇动 10 min， 使结晶物充分溶解 (中途拿起轻拍；)。
2.2.7 在酶联免疫检测仪 OD570 nm处测量各孔的吸光值。 3. 结果
3.1 Rd对结肠癌细胞 HCT-1 16增殖的抑制作用
实验中观察了 5个浓度的 Rd在 3个不同时间点对 HCT-116细胞增值抑制的量效 关系和时效关系， 结果 (表 12， 图 11)表明， Rd单用有抑制结肠癌细胞增殖的作用， 在 25、 50、 100 μΜ时， 随着 Rd浓度增加和作用时间延长， 抑瘤作用增加， 有药物 浓度依赖性和时间依赖性， 但其最大抑瘤率不超过 50%; 但超过 100 μΜ后， Rd 200、 300 μΜ抑制肿瘤细胞增殖的作用逐渐减弱， 这可能和其作用机理有关， 需进一步探 讨。
表 12 ΜΤΤ法 Rd不同剂量在不同时间点对结肠癌细胞 HCT-1 16 的抑瘤率
Rd浓度 0 μΜ 25 μΜ 50 μΜ 100 μΜ 200 μΜ 400 μΜ
1.359 1.231 1.023 0.944 1.031 1.027
24 h 0D值 ±0.386 ±0.084* ±0.031 * ±0.053* ±0.142* ±0.094*
抑瘤率 9.4 24.8 30.5 24.2 24.4
1.566 1.153 1.139 1.021 1.119 1.145
48 h OD值
±0.343 ±0.056* ±0.105* ±0.136* ±0.029* ±0.077* 抑瘤率 26.3 27.2 34.8 28.5 26.9
倍 2.427 1.687± 1.482 1.217 1.359 1.491
72 h ±0.166 0.065* ±0.125 * ±0.066* ±0.021 * ±0.020*
抑瘤率 30.5 38.9 49.8 44 38.6
备注： * 示与阴性对照组相比较P< 0.05,mean±s,n=4。
3.2 5-FU对结肠癌细胞 HCT-1 16增殖的抑制作用
实验中观察了 5个浓度的 5-FU在 3个不同时间点对 HCT-1 16细胞增值抑制的量 效关系和时效关系 (见表 13及图 12)， 结果表明在 10、 20、 30、 40、 50 μΜ的 5-FU 抑制作用， 随着其浓度增加和作用时间延长， 细胞存活率逐渐降低， 呈较明显的浓度 和时间依赖性。 作用 24 h、 48 h、 72 h时的 IC50值分别为 46.9±0.36 μΜ、 26.8±1.12 μΜ、 16.1±0.28 μΜ。
表 13 5-FU不同剂量在不同时间点对结肠癌细胞 HCT-1 16 的抑瘤率
5-FU浓度 0 μΜ 10 μΜ 20 μΜ 30 μΜ 40 μΜ 50 μΜ
0.875 0.647 0.634 1.036 0.588 0.405
24 h 0D值 ±0.164 ±0.135* ±0.062* ±0.1 1 1 * ±0.049* ±0.032*
抑瘤率 26 27.5 32.8 47.2 53.7
1.342 0.904 0.793 0.607 0.457 0.366
48 h 0D值 ±0.302 ±0.084* ±0.127* ±0.056* ±0.078* ±0.063 *
抑瘤率 32.6 40.9 54.8 66 72.7
1.845 1.080 0.823 0.669 0.495 0.252
, OD值
72 h ±0.478 ±0.140* ±0.100* ±0.066* ±0.059* ±0.040*
抑瘤率 41.5 55.4 63.7 73.2 86.3
备注： * 示与阴性对照组相比较！>< 0.05, mean±s,n=4。
3.3 Rd+5-FU联用对 HCT-1 16细胞增殖抑制的协同作用
实验中观察了 Rd 25 μΜ+5-FU 20 μΜ、 5-FU 20 μΜ、 5-FU 40 μΜ、 CF 20 μΜ+5-FU
20 μΜ等 4个组在 3个不同时间点对 HCT-1 16细胞增值抑制的量效关系和时效关系 (见表 14及图 13)。
表 14 Rd+5-FU联用与 5-FU各剂量在不同时间点对结肠癌细胞 HCT-1 16 的抑瘤率 阴性 Rd 25 μΜ CF 20 μΜ 药物浓度 5-FU 20 μΜ 5-FU 40 μΜ
对照组 +5-FU 20 μΜ +5-FU 20 μΜ
1.401 0.764 1.036 0.827 0.765
24 h 0D值 ±0.353 ±0.031Δ* ±0.122Δ ±0.042Δ ±0.041Δ
抑瘤率 45.5 26 40.9 45.4
1.589 0.744 1.041 0.718 0.721
48 h 0D值 ±0.313 ±0.032Δ* ±0.129Δ ±0.064Δ ±0.025Δ
抑瘤率 53.1 32.6 54.8 54.6
2.376 0.741 1.167 0.798 0.956
, OD值
72 h ±0.152 ±0.178Δ*# ±0.059Δ ±0.084Δ ±0.141Δ
抑瘤率 68.8 50.9 66.4 59.8 备注： Δ示与阴性对照组相比较1><0.05， *示与 5-FU 20 μΜ组相比较！>< 0.05； #示与 CF 20 M+5-FU 20 μΜ组相比较 P< 0.05, mean±s， n=6; Rd=Rd
结果表明： 各组随着作用时间延长， 细胞存活率逐渐降低， 呈较明显的时间依赖 性。
Rd 25 μΜ+5-FU 20 μΜ组在 24 h、 48 h、 72 h各时间点的抑瘤率与 5-FU 20 μΜ 组各时间点的抑瘤率相比较， 各时间点 Rd 25 μΜ+5-FU 20 μΜ组抑瘤率均高于 5-FU 20 μΜ组 (在 24 h、 48 h、 72 h各时间点 p值均小于 0.05)， 说明 5-FU联用 Rd的效果 优于单用 5-FU;
Rd 25 μΜ+5-FU 20 μΜ组在 24 h、48 h、72 h各时间点的抑瘤率与 CF 20 μΜ+5-FU 20 μΜ组各时间点的抑瘤率相比较， 在 24 h、 48 h时间点 Rd 25 μΜ+5-FU 20 μΜ组抑 瘤率未表现出高于 CF 20 μΜ+5-FU 20 μΜ组 (在 24 h、 48 h各时间点 p值均未小于 0.05)， 但在 72 h时间点 Rd 25 μΜ+5-FU 20 μΜ组抑瘤率高于 CF 20 μΜ+5-FU 20 μΜ 组 (在 72 h时间点 p值小于 0.05)， 说明随时间延长， 5-FU联用 Rd的抑瘤效果也是优 于目前公认的 CF与 5-FU联用协同作用；
Rd 25 μΜ+5-FU 20 μΜ组在 24 h、 48 h、 72 h各时间点的抑瘤率与 5-FU 40 μΜ 组各时间点的抑瘤率相比较未见统计学差异 (在 24 h、 48 h、 72 h各时间点 p值未小于 0.05)， 说明降低 5-FU剂量联用 Rd的效果并不差于高剂量的 5-FU。
4. 结论与讨论
药物对肿瘤细胞作用 24 h， 5-FU 20 μΜ的抑瘤率 (％；) 26， 5-FU和 Rd两药联用 后抑瘤率(％)增强至 45.5， 有明显的协同作用；
药物对肿瘤细胞作用 48 h， 5-FU 20 μΜ的抑瘤率 (％；)为 32.6， 5-FU和 Rd两药联 用后抑瘤率(％)增至 53.1 ;
药物对肿瘤细胞作用 72 h， 5-FU 20 μΜ的抑瘤率 (％；)为 50.9， 5-FU和 Rd两药联 用后抑瘤率(％)增至 68.8。
结果证明： 加入低浓度的 Rd可增强低浓度 5-FU的抑瘤作用， 72h时， 此作用强 于亚叶酸钙加 5-FU组合的抑瘤作用。
本申请率先研究其对人结肠癌细胞的抗肿瘤细胞增殖活性及与传统细胞毒药物 5-FU的协同抗结肠癌作用， 为开发新的结肠癌治疗药物提供新的思路。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考， 就如同每一篇文献被单 独引用作为参考那样。 此外应理解， 在阅读了本发明的上述讲授内容之后， 本领域技 术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求 书所限定的范围。

Claims

权 利 要 求
I. 人参皂苷 Rd 的用途， 其特征在于， 用于制备预防和 /或治疗结肠肿瘤的肠溶 性药物。
2. 如权利要求 1所述的用途， 其特征在于， 所述肠溶性药物为选自下组的剂型： 肠 溶性口服制剂、 肠道栓剂、 灌肠制剂。
3. 如权利要求 1或 2所述的用途， 其特征在于，
所述人参皂苷 Rd或肠溶性药物的单位剂量为 l-150mg/剂； 和 /或
按大鼠单位体重计算， 所述人参皂苷 Rd或肠溶性药物的施用剂量为 0.1-30 mg/kg; 和 /或
按患者单位体重计算， 所述人参皂苷 Rd 或肠溶性药物的施用剂量为 0.016-2.5 mg/kg。
4. 如权利要求 1所述的用途， 其特征在于， 所述肠溶性药物还具有以下特性： (1) 抑制结肠肿瘤数的增加； 和 /或
(2) 抑制结肠异常隐窝病灶数的增加。
5. 如权利要求 1所述的用途， 其特征在于， 所述肠溶性药物还具有以下特性：
(a) 减轻致癌物质引起的腹泻症状； 和 /或
(b) 抑制致癌物质引起的大肠炎症。
6. 一种用于预防和 /或治疗结肠肿瘤的肠溶性药物组合物， 其特征在于， 以人参皂 苷 Rd为活性成分。
7. 如权利要求 6所述的肠溶性药物组合物，其特征在于，所述肠溶性药物组合物为 选自下组的剂型： 肠溶性口服制剂、 肠道栓剂、 灌肠制剂。
8. 如权利要求 6所述的肠溶性药物组合物， 其特征在于，
所述人参皂苷 Rd或肠溶性药物组合物的单位剂量为 l-150mg/剂； 和 /或
按大鼠单位体重计算， 所述人参皂苷 Rd或肠溶性药物组合物的施用剂量为 0.1-30 mg/kg; 禾口 /或
按患者单位体重计算， 所述人参皂苷 Rd 或肠溶性药物组合物的施用剂量为 0.016-2.5mg/kg。
9. 如权利要求 6所述的肠溶性药物组合物， 其特征在于， 所述人参皂苷 Rd为从 三七中提取的人参皂苷 Rd单体； 所述人参皂苷 Rd单体的纯度≥95 %。
10. 如权利要求 6所述的肠溶性药物组合物， 其特征在于， 所述肠溶性药物组合 物还含有其它的治疗剂，所述其它的治疗剂包括： 5-氟尿嘧啶、维生素 D及其衍生物、 盐酸二甲双胍、 阿司匹林。
I I . 如权利要求 6所述的肠溶性药物组合物， 其特征在于，
所述肠溶性药物组合物含有人参皂苷 Rd和 5-氟尿嘧啶； 或
所述肠溶性药物组合物含有人参皂苷 Rd和阿司匹林； 或
所述肠溶性药物组合物含有人参皂苷 Rd和维生素 D及其衍生物和二甲双胍。
12. 如权利要求 6所述的肠溶性药物组合物， 其特征在于，
所述肠溶性药物组合物含有人参皂苷 Rd和 5-氟尿嘧啶； 且人参皂苷 Rd和 5-氟 尿嘧啶的用量比为 1-100 μΜ: 1-100μΜ; 或
所述肠溶性药物组合物含有人参皂苷 Rd和阿司匹林； 且人参皂苷 Rd和阿司匹 林的用量比为 1 -80 mg/kg ： 1-150 mg/kg; 或
所述肠溶性药物组合物含有人参皂苷 Rd和维生素 D及其衍生物和二甲双胍；且 人参皂苷 Rd和维生素 D及其衍生物和二甲双胍的用量比为 1-100 mg/kg ： 100-400 IU: 50-1000 mg/kg。
13. 一种药物组合物， 其特征在于， 所述药物组合物含有人参皂苷 Rd和 5-氟尿 嘧啶； 或所述药物组合物含有人参皂苷 Rd和阿司匹林； 或所述药物组合物含有人参 皂苷 Rd和维生素 D及其衍生物和二甲双胍。
14. 一种药盒， 其特征在于， 所述药盒包括一容器， 以及位于所述容器内的第一 药物和第二药物， 其中第一药物为权利要求 6所述的肠溶性药物组合物； 而第二药物为 含有其它的治疗剂作为活性成分的药物组合物， 其中所述其他治疗剂包括： 5-氟尿嘧 啶、 维生素 D及其衍生物、 盐酸二甲双胍、 或阿司匹林。
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