TWI542347B - The use of arctigenin for the preparation of anticancer agents - Google Patents
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Description
本發明係關於牛蒡苷元(arctigenin)用於製備抗癌劑之用途。更詳細言之,本發明係關於牛蒡苷元(arctigenin)用於製備抗癌劑之用途,其係以每1日之投與量成為100mg以上的方式投與牛蒡苷元(arctigenin)。
胰臓癌係難治性癌之一種,所有患者之5年存活率一般被推定為2-3%。死於胰臓癌的患者數量於最近20年間迅速地增加約2.5倍,於2009年的統計,有26,791人死於胰臓癌。發生數與死亡數幾乎為相同數量,此佔日本的癌症死因的6%,以發生部位的癌症死亡數可知,依序為肺、胃、大腸、肝,胰臓係接著為第5位。
可期待根治的治療僅為外科的切除,但胰臓癌於大多數的患者中,因以晚期癌症(第III+IV期)的狀態下表現,實際上可根治的切除可謂為所有胰臓癌患者之約10-20%。每一期的生存期間中央值在第I、II期為約12-30個月,第III期為9-11個月,第IV期為5-6個月左右,且預測後期極為不良,尤其對於不能切除的患者而言,一般認為幾乎無治癒的可能性。
對進行性胰臓癌的標準治療係吉西他濱(gemcitabine),對吉西他濱無反應的情形之標準治療法並未確立。於進行性胰臓癌患者,即使對吉西他濱無反應的時點,亦承認有全身狀態良好的病例,此態樣的患者群(對吉西他濱不反應的胰臓癌)的有效治療法之開發被認為係於所有胰臓癌之治療法開發的重要課題。
近年來,已報告PANC-1、AsPC-1、BxPC-1及KP-3等之來自胰臓癌的細胞於極度營養飢餓狀態亦可見有很強的耐性,解除其耐性有成為癌治療中新生化學的途徑之可能性(專利文獻1)。
使用胰臓癌細胞株PANC-1,進行可解除於低營養狀態中的腫瘤細胞之生存能力的物質之篩選後,已報告牛蒡苷元係有效的(非專利文獻1)。
本文中,牛蒡子於第十五改正日本藥典(日局15)中被規定為牛蒡(Arctiumlappa Linne(Compositae))之果實。又,牛蒡子係於銀翹散、驅風解毒湯、消風散等作為處方的草藥,被分類為專門醫藥品所使用的成分本質。
牛蒡子含有約7%被分類為木聚糖(lignan)配糖體的牛蒡苷(arctiin)及約0.6%之為其苷元(aglucon)的牛蒡苷元。由此等知識可知,含有牛蒡苷元的牛蒡子萃取物係被期待可使用作為用於治療癌症的抗癌劑。
[先前技術文獻]
[專利文獻]
專利文獻1:日本國公開專利公報「特開2002-065298號公報」
[非專利文獻]
非專利文獻1:S. AwaLe, J. Lu, S. K. KaLauni, Y. Kurashima, Y. Tezuka, S. Kadota, H. Esumi, Cancer Res., 2006, 66(3), 1751-1757)
[發明概要]
本發明係以提供對癌症具有效果的新穎抗癌劑為目的。
現在已知的牛蒡子,牛蒡子中之牛蒡苷元含量為約0.6%的低值。又,難溶於水。因此,以習知利用的熱水萃取法,要製造高含量含有牛蒡苷元的牛蒡子萃取物係非常困難的。
又,使用於胰臓癌等之治療時,期待提供有效成分的牛蒡苷元成為一定含量的牛蒡子萃取物,但如上述,於含有高量牛蒡苷元的牛蒡子萃取物之製造,將牛蒡苷變換為牛蒡苷元,並控制使難溶於水的牛蒡苷元含有一定量係困難的。
此外,使用於胰臓癌等之治療時,牛蒡苷元為主要有效成分的同時,含有一定含量之牛蒡苷元及牛蒡苷的牛蒡子萃取物,已知抗癌效果特別優異。因此,於含有高量牛蒡苷元的牛蒡子萃取物之製造,期望可控制牛蒡苷元及牛蒡苷成為一定含量的製造方法。尤其,期望可製造以約1:1之重量比的方式含有牛蒡苷元及牛蒡苷的牛蒡子萃取物的方法。
本發明為了解決此等課題而專心進行檢討的結果,藉由調整作為原料的牛蒡子內存在之β-葡萄糖苷酶(glucosidase)酵素活性、裁切牛蒡子的粒徑、將牛蒡苷酵素變換為牛蒡苷元時之溫度及由牛蒡子萃取牛蒡苷元及牛蒡苷時之溫度,而發現將牛蒡苷元作成一定含量的技術、以及調節牛蒡苷元及牛蒡苷之含有比的技術。
而且,本發明使用藉由此等技術所獲得的牛蒡子萃取物,將牛蒡苷元以每1日之投與量成為100mg以上的方式調製的製劑投與胰臓癌患者後,觀察腫瘤縮小效果的同時,確認腫瘤位置標記的降低。本發明係基於如此驚人的發見而完成者。
即,本發明係提供一種牛蒡苷元(arctigenin)用於製備抗癌劑之用
途,其係以每1日的投與量成為100mg以上的方式投與牛蒡苷元(arctigenin)。
又,上述用途中,其進一步以每1日的投與量成為100mg以上的方式投與牛蒡苷(arctiin)。
又,上述用途中,其中該抗癌劑係以牛蒡苷元/牛蒡苷=0.7~1.3之重量比含有牛蒡苷元及牛蒡苷。
又,上述用途中,其中前述牛蒡苷元及前述牛蒡苷係來自牛蒡子(Arctii Fructus)。
又,上述用途中,其係用於治療對吉西他濱(gemcitabine)的治療為不反應的胰臓癌。
又,本發明係提供一種牛蒡苷元用於製備抗癌幹細胞劑之用途。
又,本發明係提供一種牛蒡苷元用於製備抗癌幹細胞劑之用途,其係以每1日的投與量成為100mg以上的方式投與牛蒡苷元。
依據本發明,可提供對癌症具有效果的新穎抗癌劑。
第1圖顯示本發明之一實施例之顆粒劑投與前(A)、投與開始1個月後(B)、2個月後(C)及3個月後(D)之胸腹部電腦斷層成像的結果圖。
第2圖顯示本發明之一實施例之顆粒劑投與前(A)、投與開始1個月後(B)、2個月後(C)及3個月後(D)之胸腹部電腦斷層成像的結果圖。
第3圖顯示本發明之一實施例之顆粒劑投與前(A)、投與開始1個月後(B)、2個月後(C)及3個月後(D)之胸腹部電腦斷層成像的結果圖。
第4圖顯示腫瘤模型動物(CAPAN-1異種移植(Xenografts))中的抗腫瘤性評價之結果圖。
第5圖顯示腫瘤模型動物(PSN-1異種移植)中的抗腫瘤性評價之結果圖。
第6圖顯示對癌幹細胞之PI染色(死細胞染色)及胰臓癌幹細胞位置標記(CD44,CD24,ESA)染色之結果圖。
第7圖顯示對癌幹細胞之PI染色及胰臓癌幹細胞位置標記(CD44,c-Met)染色之結果圖。
第8圖顯示對癌幹細胞之PI染色及胰臓癌幹細胞位置標記染色的結果(與順鉑(cisplatin)處理之比較)圖。
[用以實施發明之形態]
以下,詳細說明本發明。揭示的條件為一例,並未限定於此例。
本發明之抗癌劑以每1日的投與量成為100mg以上的方式含有作為有效成分之牛蒡苷元。牛蒡苷元可為來自含有牛蒡苷元的植物,例如可來自牛蒡子。即,本發明之抗癌劑可以來自植物之萃取物,例如來自牛蒡子而得的牛蒡子萃取物中所含的牛蒡苷元作為有效成分來含有。
本發明之抗癌劑進一步以每1日的投與量成為100mg以上的方式含有作為有效成分之牛蒡苷。牛蒡苷可來自含有牛蒡苷的植物,例如可來自牛蒡子。即,本發明之抗癌劑係可以來自植物之萃取物,例如來自牛蒡子而得的牛蒡子萃取物中所含的牛蒡苷作為有效成分來含有。
本發明之抗癌劑又可以牛蒡苷元/牛蒡苷=0.7~1.3之重量比(1.0~1.9之莫耳比)的方式含有作為有效成分之牛蒡苷元及牛蒡苷。牛蒡苷元及
牛蒡苷可來自含有牛蒡苷元及牛蒡苷的植物,例如可來自牛蒡子。即,本發明之抗癌劑係以牛蒡苷元/牛蒡苷=0.7~1.3之重量比的方式含有牛蒡苷元及牛蒡苷的植物萃取物,例如可含有牛蒡子萃取物。又,於此抗癌劑,牛蒡苷元可以每1日之投與量成為100mg以上的方式含有,又牛蒡苷可以每1日之投與量成為100mg以上的方式含有。
含有牛蒡苷元及牛蒡苷的植物並未特別限定,但例如包含牛蒡(burdock)(芽(sprout)‧葉‧根莖)、紅花(safflower)、矢車菊(cornflower)、翼薊(Cirsium vulgare)、聖薊(blessed thistle)(薊屬(Cnicus))、大薊(cardon)、蘇格蘭大翅薊(Onopordum acanthium)、伊利裡亞大翅薊(Onopordum illyricum)、邊境連翹(Forsythia x intermedia)、朝鮮連翹(Forsythia ovata)、連翹(Forsythia suspensa Vahl)、支那連翹(Forsythia viridissima Lindl)、胡麻(sesame)、槭葉牽牛(Ipomoea cairica)、金不換(Polygala chinensis)、亞洲絡石(T.asiaticum var.intermedium)、日本絡石(Trachelospermum asiaticum)、絡石(Trachelospermum foetidum Nakai)、細梗絡石(Trachelospermum gracilipes)、夾竹桃(Nerium indicum Nerium)、絡石(Trachelospermum jasminoides var.pubescens)、南嶺堯花(Wikstroemia indica)、葒草(Polygonum orientale L.)、山櫻(Cerasus jamasakura)、阿拉伯芥(Arabidopsis thaliana)、千穗谷(Amaranthus hypochondriacus)、胡桃木(walnut)、燕麥(Avena sativa)、思佩耳特小麥(Triticum spelta L.)、軟質小麥、白粉柏(Cupressus lusitanica)及日本榧樹(Torreya nucifera)等。其中,牛蒡及連翹因牛蒡苷元含量高而為較佳。
於本發明,牛蒡苷元及牛蒡苷係來自牛蒡子的情形,可為使用後述的牛蒡子萃取物之製造方法而獲得的牛蒡子萃取物。因此,可使製造時之生產性提升、便宜且簡便地調製抗癌劑。又,使用牛蒡子以外之植物的情形,
亦可藉由利用後述的製造方法,容易地獲得含有牛蒡苷元及牛蒡苷的萃取物。
藉由後述的牛蒡子萃取物之製造方法所獲得的萃取物粉末係以牛蒡苷元/牛蒡苷=0.7~1.3之重量比的方式含有牛蒡苷元及牛蒡苷。從而藉由此牛蒡子萃取物之製造方所獲得的萃取物粉末,與習知之牛蒡子萃取物相比,可使用作為具有優異抗癌效果的本發明之抗癌劑。
本發明之抗癌劑可進一步含有任意成分。例如,本發明之抗癌劑可為提供含有藥學上可容許的基劑、載體、賦形劑、崩解劑、潤滑劑及著色劑等形態者。
於抗癌劑使用的載體及賦形劑之例,包含乳糖、葡萄糖、白糖、甘露糖醇(mannitol)、糊精(dextrin)、馬鈴薯澱粉、玉米澱粉、碳酸鈣、磷酸鈣、硫酸鈣及結晶纖維素等。
又,結合劑之例包含澱粉、明膠(gelatin)、糖漿、黃蓍膠(tragacanth)、聚乙烯醇(polyvinyl alcohol)、聚乙烯醚(polyvinyl ether)、聚乙烯吡咯啶酮(polyvinyl pyrrolidone)、羥基丙基纖維素(hydroxypropyl cellulose)、甲基纖維素(methyl cellulose)、乙基纖維素(ethyl cellulose)及羧基甲基纖維素(carboxymethyl cellulose)等。
又,崩壊劑之例包含澱粉、瓊脂、明膠末、結晶纖維素、碳酸鈣、碳酸氫鈉、褐藻酸鈉(sodium alginate)、羧基甲基纖維素鈉及羧基甲基纖維素鈣等。
又,潤滑劑之例包含硬脂酸鎂(magnesium stearate)、氫化植物油、滑石(talc)及聚乙二醇(macrogol)等。又,著色劑可使用可容許添加於醫藥品的任意著色劑。
又,因應必要,抗癌劑可以白糖、明膠、精製蟲膠(shellac)、明膠、甘油(glycerin)、山梨糖醇(sorbitol)、乙基纖維素、羥基丙基纖維素、羥基丙基甲基纖維素、聚乙烯吡咯啶酮、酞酸乙酸纖維素(phthalic acid cellulose acetate)、羥基丙基甲基纖維素酞酸酯(hydroxypropyl methylcellulose phthalate)、甲基丙烯酸甲酯(methyl methacrylate)及甲基丙烯酸(methacrylic acid)聚合物等,以一層以上的層加以被膜。
又,因應必要,可添加pH調節劑、緩衝劑、安定化劑及可溶化劑等。
又,抗癌劑可以任意形態之製劑來提供。例如,抗癌劑作為經口投與製劑,可為糖衣錠、口腔錠(backal)、包衣錠及可嚼錠等之錠劑、片劑(troche)、丸劑、散劑及包含軟膠囊的膠囊劑、顆粒劑、懸浮劑、乳劑、包含乾糖漿的糖漿劑、酏劑(elixir)等之液劑。
又,抗癌劑可為用以非經口投與之靜脈注射、皮下注射、腹腔內注射、肌肉內注射、經皮投與、經鼻投與、經肺投與、經腸投與、口腔內投與及經黏膜投與等之投與用之製劑。例如,可為注射劑、經皮吸收帶、氣溶膠劑及栓劑等。又,因萃取物粉末具有特殊的味道,可作成將萃取物粉末包覆的製劑、以被覆劑被覆的膜衣劑。
另一方面,藉由後述的牛蒡子萃取物之製造方法所獲得的萃取物粉末亦可以此形態下作為抗癌劑來使用。
本發明之抗癌劑可混合經純化的牛蒡苷元及其他成分來製造,亦可使用藉由以下記載的方法製造的牛蒡子萃取物來製造。
牛蒡子萃取物係經由草藥裁切步驟、萃取步驟(酵素變換步驟及藉由有機溶劑的萃取步驟)、固液分離步驟、濃縮步驟及乾燥步驟而被製造。
(草藥裁切步驟)
本發明之抗癌劑所使用的牛蒡子萃取物之製造方法中,將作為原料的牛蒡子裁切成適合萃取的大小。作為原料的草藥係有因應植物之各式各樣部位或礦物、動物等各種之大小、形狀、堅固度、特質的裁切的必要。
牛蒡子可使用本項技術領域者眾所皆知之任意手段來裁切。例如,可使用市售的裁切機。
以本發明之抗癌劑所使用的牛蒡子萃取物之製造方法,可事先測定牛蒡子內存在之酵素的β-葡萄糖苷酶之活性,而可選擇適合本發明之製造的牛蒡子。
就測定β-葡萄糖苷酶之活性的方法而言,例如將p-硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷(p-nitrophenyl-β-D-glucopyranoside)(C12H15NO8:分子量301.25)(SIGMA-ALDRICH公司製)作為基質,使其與牛蒡子粉碎品作用,經測定生成的p-硝基苯酚(p-nitrophenol)之400nm吸光度的變化,可測定酵素活性。就表示酵素活性的單位而言,可將於1分鐘生成1微莫耳之p-硝基苯酚的酵素量作為1單位(U)來表示。
為了獲得以牛蒡苷元/牛蒡苷=0.7~1.3之重量比的方式含有牛蒡苷元及牛蒡苷的牛蒡子萃取物,可使用牛蒡子內存在的β-葡萄糖苷醇之活性為例如0.4U/g以上、較佳為1U/g以上之牛蒡子。
低於0.4U/g的情形,水解變的不充份,牛蒡苷元之重量會下降,變的無法有效率地獲得所期望的牛蒡子萃取物。
又,本發明之抗癌劑所使用的牛蒡子萃取物之製造方法係可使用裁切成任意粒徑的牛蒡子。一般認為經裁切的牛蒡子之粒徑越小則酵素變換
會被促進,萃取物生產率亦提升。與此相反,粒徑過小時,酵素變換過快而製程管理變困難,於之後的步驟之正確的固液分離上有發生障礙的情形。
為了獲得以牛蒡苷元/牛蒡苷=0.7~1.3之重量比的方式含有牛蒡苷元及牛蒡苷的牛蒡子萃取物,如以下之實施例所示,牛蒡子被裁切為9.5mm以下之粒徑,例如以皆可通過9.5mm篩的方式被裁切。
又,為了獲得以牛蒡苷元/牛蒡苷=0.7~1.3之重量比的方式含有牛蒡苷元及牛蒡苷的牛蒡子萃取物,將牛蒡子之粒徑裁切成全部通過9.5mm篩,並期望例如60~100%分佈於0.85mm之篩,更佳為65~80%分佈於0.85mm之篩。
(萃取步驟)
萃取步驟係草藥萃取物粉末製造步驟中對於品質上最重要的步驟。藉由此萃取步驟,決定草藥萃取物粉末之品質。本發明之牛蒡子萃取物之製造方法,為了萃取牛蒡子萃取物,分成酵素變換步驟及藉由有機溶劑的萃取步驟之兩階段來進行萃取。
(酵素變換步驟)
酵素變換步驟係本發明之抗癌劑所使用的牛蒡子萃取物之製造方法中的重要步驟。酵素變換步驟係藉由牛蒡子內存在的酵素β-葡萄糖苷酶,將牛蒡子所含的牛蒡苷酵素變換為牛蒡苷元的步驟。
具體而言,將上述步驟準備的牛蒡子裁切物,經由保持於適當的溫度使β-葡萄糖苷酶作用,使進行由牛蒡苷至牛蒡苷元之反應。例如,於裁切的牛蒡子中添加水等之任意溶液,藉由於30℃附近的溫度加以攪拌,可將牛蒡子保持於任意溫度。
為了獲得以牛蒡苷元/牛蒡苷=0.7~1.3之重量比的方式含有牛蒡苷元及牛蒡苷的牛蒡子萃取物,將經裁切的牛蒡子保持於30℃附近之溫度,例如20~50℃之間的溫度。
低於20℃的情形,水解變的不充份,牛蒡苷元之重量比會下降,變的無法有效率地獲得所期望之牛蒡子萃取物。另一方面,較50℃更高溫的情形,酵素會失活,牛蒡苷元之重量比會降下,變的無法有效率地獲得所期望之牛蒡子萃取物。
又,保持時間只要保持於上述溫度即可,並未特別限制,例如可保持約30分鐘。藉由保持於20~50℃之間,可不需保持時間,將適當量的牛蒡苷酵素變換為牛蒡苷元,而獲得以牛蒡苷元:牛蒡苷(重量比)為約1:1的方式含有的牛蒡子萃取物。
(藉由有機溶劑之萃取步驟)
藉由有機溶劑之萃取步驟係使用任意之適當有機溶劑,而自牛蒡子萃取牛蒡苷元及牛蒡苷的步驟。即,藉由上述之酵素變換步驟,牛蒡苷元成為高含量的狀態下,添加適當溶劑,來萃取牛蒡子萃取物的步驟。例如,於牛蒡子萃取物中添加適當溶劑,以適當時間加熱攪拌而萃取牛蒡子萃取物。又,除加熱攪拌以外,亦可使用加熱回流、滴下式萃取、浸漬式萃取或加壓式萃取法等之本項技術領域者眾所皆知之任意萃取法,可萃取牛蒡子萃取物。
因牛蒡苷元為水難溶性,藉由添加有機溶劑,可使牛蒡苷元之生產率提升。有機溶劑可使用任意之有機溶劑。例如,可使用甲醇(methanol)、乙醇(ethanol)及丙醇(propanol)等之醇,以及丙酮(acetone)。考慮安全性的方面時,用於本發明之抗癌劑的牛蒡子萃取物之製造方法係使用乙醇作為有機溶劑
為較佳。
經加熱攪拌來萃取牛蒡子萃取物的情形,加熱攪拌可於任意溫度下進行,但為了獲得以牛蒡苷元/牛蒡苷=0.7~1.3之重量比的方式含有牛蒡苷元及牛蒡苷的牛蒡子萃取物,保持於80℃以上之溫度,例如80~90℃之間的溫度。
又,加熱攪拌的時間只要於上述溫度下加熱攪拌即可,並未特別限定,經由於約30分鐘,例如30~60分鐘加熱攪拌,可於溶劑中自牛蒡子萃取牛蒡苷元及牛蒡苷。
牛蒡苷元及牛蒡苷之生產率係加熱攪拌的時間越長而越提升。然而,加熱攪拌的時間長時,不必要的油脂類大多會溶出,而對濃縮步驟之負荷變大。因而,加熱攪拌的時間係因應狀況加以適宜決定為宜。
又,牛蒡苷元及牛蒡苷的生產率係因乙醇量越多而牛蒡苷元及牛蒡苷之溶解度變高,故生產率亦提升。然而,乙醇量多時,不必要的油脂類亦大多會溶出,對濃縮步驟之負荷變大。因而,投入量係因應狀況加以適宜決定為宜。此外藉由這個步驟之加熱攪拌,可同時將牛蒡子萃取物滅菌及殺菌。
(固液分離步驟)
固液分離步驟係將萃取結束的牛蒡子由萃取液加以分離的步驟。固液分離可使用本項技術領域者眾所皆知之任意方法來進行。固液分離法例如有過濾法、沈降法及離心法等。工業上以離心法為較佳。
(濃縮步驟)
濃縮步驟係在乾燥之前自牛蒡子萃取液去除溶劑的步驟。由牛蒡子萃取液之溶劑的去除可使用本項技術領域者眾所皆知之任意方法來進行。
然而,自藉由上述步驟所獲得的牛蒡子之萃取液係不進一步長時間暴露於高溫為較佳。
例如,藉由使用減壓濃縮法,不長時間暴露於高溫,可濃縮牛蒡子萃取液。
牛蒡子萃取液之濃縮係可濃縮至可獲得所期望濃度之牛蒡子萃取物的濃度。
例如,於以下之乾燥步驟,濃縮至可適當進行乾燥的程度為較佳。又,於以下之步驟,使牛蒡子萃取物乾燥而作成粉末製劑的情形,濃縮進行至獲得適當製劑特性的濃度為較佳。
因牛蒡苷元及牛蒡苷係水難溶性,牛蒡苷元及牛蒡苷附著於以下之乾燥步驟的製造裝置內的量很多,最終的生產率會大幅降低。因此,為了防止牛蒡苷元及牛蒡苷附著於製造裝置,可於此濃縮步驟所獲得的牛蒡子萃取液中添加糊精。糊精之添加量係例如相對於濃縮液之固體成分為15~30%左右為較佳。
(乾燥步驟)
將藉由上述步驟所獲得的牛蒡子萃取物完成為粉末狀的步驟。乾燥係可使用本項技術領域者眾所皆知之任意方法來進行。例如,就乾燥法而言,已知凍結乾燥及噴霧乾燥等,但若為實驗室程度者,通常使用前者,若為量產程度,則通常使用後者。
經由以上製造步驟,可獲得以牛蒡苷元/牛蒡苷=0.7~1.3之重量比的方式含有牛蒡苷元及牛蒡苷的牛蒡子萃取物。此牛蒡子萃取物之製造方法必須包含於20℃~50℃之溫度下進行酵素變換的步驟,而不需要包含全部的其他
步驟。
又,經由以上之製造步驟,可便宜且簡便地獲得牛蒡苷元之濃度為高的牛蒡子萃取物。從而藉由使用由此方法所獲得的牛蒡子萃取物,可便宜且簡便地製造本發明之抗癌劑。
又,因由以上之製造步驟所獲得的牛蒡子萃取物之牛蒡苷元濃度為高,與使用習知之牛蒡子萃取物的情形作比較,可將抗癌劑之每1日的全體量作成少量。因而可減輕患者的負擔。
又,本發明亦提供製造以牛蒡苷元/牛蒡苷=0.7~1.3之重量比(1.0~1.9之莫耳比)的方式含有牛蒡苷元及牛蒡苷的牛蒡子萃取物的方法,其包含裁切牛蒡子的步驟、藉由牛蒡子內存在的β-葡萄糖苷酶將牛蒡子內存在的牛蒡苷酵素變換為牛蒡苷元的步驟,其中前述酵素變換係於20℃~50℃之溫度下使反應的步驟。
又,本發明係提供製造上述之牛蒡子萃取物的方法,其係於裁切的步驟中,將牛蒡子裁切為0.85mm~9.5mm之粒徑。
此外,本發明係提供製造牛蒡子內存在的β-葡萄糖苷酶之酵素活性為牛蒡子1g中為0.4U以上的上述牛蒡子萃取物的方法。
又,本發明係提供包含於酵素變換步驟之後,經由添加有機溶劑,萃取含有牛蒡苷元及牛蒡苷的萃取物的步驟之製造上述牛蒡子萃取物的方法。
又,本發明係提供有機溶劑為乙醇之製造上述牛蒡子萃取物的方法。
又,本發明係提供製造上述牛蒡子萃取物之方法,其中萃取的
步驟為於約80℃下萃取。
此外,本發明提供由上述方法所獲得之牛蒡苷元/牛蒡苷以0.7~1.3之重量比的方式含有的牛蒡子萃取物。
此外,本發明提供含有由上述方法所獲得之牛蒡苷元/牛蒡苷以0.7~1.3之重量比的方式含有的牛蒡子萃取物的抗癌劑。
依據本發明,可提供牛蒡苷元以每1日之投與量成為100mg以上的方式含有之具有抗腫瘤效果的抗癌劑。又依據本發明,可提供牛蒡苷元及牛蒡苷以牛蒡苷元/牛蒡苷=0.7~1.3(重量比)的方式含有的抗癌劑。本發明之抗癌劑投與癌症患者,例如胰臓癌患者時,可期待安定的腫瘤增殖抑制或抗腫瘤效果。又,本發明之抗癌劑可使用作為用以治療對吉西他濱之治療為無反應的胰臓癌之胰臓癌治療劑。
又,於以下之試驗例7,顯示含有牛蒡苷元及牛蒡苷的顆粒劑之毒性係非常地低。因而,本發明之抗癌劑可於非常少的副作用下提供高抗癌效果。
又,於以下之試驗例8及試驗例9,顯示牛蒡苷元對胰臓及肝臓之癌幹細胞具有殺傷效果。由此可知,顯示牛蒡苷元不僅對固形癌之腫瘤本體,亦對癌幹細胞有作用而藉由殺傷發揮抗癌作用。又,顯示牛蒡苷元不僅對胰臓癌,亦會殺傷其他癌症之癌幹細胞,具有抗癌效果。因而,本發明提供用於治療各種癌症之抗癌劑。
又,本發明亦提供含有牛蒡苷元的抗癌幹細胞劑。抗癌幹細胞劑係指具有殺傷癌幹細胞效果的藥劑。癌幹細胞係指於癌細胞中具有幹細胞性的細胞。
本發明之抗癌幹細胞劑可為與上述本發明之抗癌劑相同構成者。即,抗癌幹細胞劑的牛蒡苷元可以每1日之投與量成為100mg以上的方式含有。又,抗癌幹細胞劑可進一步含有牛蒡苷,牛蒡苷以每1日之投與量可成為100mg以上的方式含有。抗癌幹細胞劑的牛蒡苷元及牛蒡苷可以牛蒡苷元/牛蒡苷=0.7~1.3之重量比的方式來含有。牛蒡苷元及牛蒡苷可為來自含有牛蒡苷元及牛蒡苷的植物,例如可為來自牛蒡子。
於以下之試驗例8及試驗例9,顯示牛蒡苷元具有選擇性殺傷癌幹細胞的效果,尤其於癌細胞之周圍環境附近且於營養飢餓條件,具有選擇性殺傷癌幹細胞的效果。因而,因本發明之抗癌幹細胞劑經由殺傷癌幹細胞,可抑制癌細胞之增殖,故可適合利用作為抗癌劑。
[實施例]
(試驗例)
驗證牛蒡子之酵素活性及酵素變換條件(溫度與時間)對牛蒡苷元/牛蒡苷(重量比)的影響,即驗證兩者之因果關係。
(酵素活性之測定)
將產地或批次相異的牛蒡子藉由Willey氏粉碎機加以粉碎,將此牛蒡子粉碎品0.1g以10mL之水稀釋,作成試料溶液。
作為基質溶液,於p-硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷0.15g中添加水而作成固定容量25mL,調製20mmol/L p-硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷水溶液。於0.1mol/L乙酸緩衝液1mL中添加20mmol/L p-硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷水溶液0.5mL,調製反應混合液,並於37℃進行預備加熱約5分鐘。
於反應混合液中添加試料溶液0.5mL並於37℃使反應15分鐘
後,添加為反應停止液的0.2mol/L碳酸鈉水溶液2mL而使反應停止。測定此液之400nm中的吸光度,由未進行酵素反應的空白組溶液之變化量藉由下式求得酵素活性。
酵素活性(U/g)=(試料溶液之吸光度-空白組溶液之吸光度)×4mL×1/18.1(p-硝基苯酚之上述測定條件下之毫莫耳分子吸光係數:cm2/μmol)×1/光路長(cm)×1/反應時間(分鐘)×1/0.5mL×1/試料溶液濃度(g/mL)
如表1所示,確認各牛蒡子之酵素活性為0.12~8.23U/g。
(試驗例1)
於酵素活性為0.12、0.27、0.40U/g(試料1-3)的經裁切牛蒡子1g中添加水7mL,於酵素反應溫度15℃、20℃之溫度條件下,將各自反應溫度之反應時間設定為30分鐘,反應後添加乙醇並於80℃進行萃取,定量獲得的萃取物之牛蒡苷元及牛蒡苷,求得牛蒡苷元/牛蒡苷重量比。結果示於表1之比較例1,2、實施例1。
酵素活性為0.40U/g之試料3係於酵素反應溫度20℃、反應時間30分鐘下獲得牛蒡苷元/牛蒡苷(重量比)=0.82之牛蒡子萃取物。
另一方面,於酵素反應溫度15℃、反應時間30分鐘,牛蒡苷元/牛蒡苷(重量比)=0.69、酵素反應溫度為20℃以上者為較佳。
又,酵素活性為低於0.40U/g之試料1及試料2,由於即使酵素反應溫度為20℃,亦無法滿足牛蒡苷元/牛蒡苷(重量比)=0.70以上,故牛蒡子之酵素活性係0.40U/g以上為較佳。
(試驗例2)
於酵素活性為4.03U/g(試料5)的經裁切牛蒡子1g中添加水7mL,於酵素反
應溫度30℃、40℃、50℃、60℃之溫度條件下,於各自反應溫度之反應時間設定為15分鐘、30分鐘(僅30℃及60℃),反應後以乙醇進行萃取,將獲得的萃取物之牛蒡苷元及牛蒡苷定量,求得牛蒡苷元/牛蒡苷重量比。
結果示於表1之實施例3。於酵素反應溫度30℃、反應時間15分鐘,獲得牛蒡苷元/牛蒡苷(重量比)=0.7,於酵素反應溫度30℃、反應時間30分鐘,獲得牛蒡苷元/牛蒡苷(重量比)=1.0,於酵素反應溫度40℃、反應時間15分鐘,獲得牛蒡苷元/牛蒡苷(重量比)=1.2,於酵素反應溫度50℃、反應時間15分鐘,獲得牛蒡苷元/牛蒡苷(重量比)=1.2之牛蒡子萃取物。
另一方面,於酵素反應溫度60℃、反應時間15分鐘,牛蒡苷元/牛蒡苷(重量比)=0.4,於酵素反應溫度60℃、反應時間30分鐘,牛蒡苷元/牛蒡苷(重量比)=0.5。由以上可知,酵素反應溫度係低於60℃為較佳。
(試驗例3)
於酵素活性為1.42U/g(試料4)的經裁切牛蒡子1g中添加水7mL,並於酵素反應溫度25℃之溫度條件下設定反應時間為10分鐘、30分鐘,反應後以乙醇進行萃取,將獲得的萃取物之牛蒡苷元及牛蒡苷定量,求得牛蒡苷元/牛蒡苷重量比。
結果示於表1之實施例2。酵素反應溫度25℃、反應時間10分鐘下,牛蒡苷元/牛蒡苷(重量比)=0.74,於相同反應時間30分鐘,獲得牛蒡苷元/牛蒡苷(重量比)=0.85之牛蒡子萃取物。
由以上可知,即使酵素活性1.42U/g,可獲得所欲結果。
(實施例6 牛蒡子萃取物之製造1)
裁切牛蒡子(酵素活性8.23U/g),將其全部通過9.5mm之篩者進一步通過0.85mm之篩,確認75%殘留。將此牛蒡子細切80kg加到保溫於29~33℃的水560L中並攪拌30分鐘。其次,添加乙醇265L而升溫至85℃,再加熱回流60分鐘。離心此溶液,而獲得牛蒡子萃取液。合併重複此操作兩次所獲得的萃取液,減壓濃縮,對萃取物固體成分添加糊精20%,並噴霧乾燥。牛蒡苷元及牛蒡苷含量係各自為6.2%及7.1%,獲得牛蒡苷元/牛蒡苷(重量比)=0.89之牛蒡子萃取物粉末(含有糊精20%)。
(實施例7 牛蒡子萃取物之製造2)
裁切牛蒡子(酵素活性8.23U/g),將其全部通過9.5mm之篩者進一步通過
0.85mm之篩,確認75%殘留。將此牛蒡子細切80kg加到保溫於30~33℃的水560L中並攪拌30分鐘後,添加乙醇265L而升溫至85℃,再加熱回流30分鐘。離心此溶液,而獲得牛蒡子萃取液。合併重複此操作兩次所獲得的萃取液,減壓濃縮,對萃取物固體成分添加糊精20%,並噴霧乾燥。牛蒡苷元及牛蒡苷含量係各自為6.0%及6.8%,獲得牛蒡苷元/牛蒡苷(重量比)=0.87之牛蒡子萃取物粉末(含有糊精20%)。
(實施例8 牛蒡子萃取物之製造3)
裁切牛蒡子(酵素活性7.82U/g),將其全部通過9.5mm之篩者進一步通過0.85mm之篩,確認75%殘留。將此牛蒡子細切80kg加到保溫於30~32℃的水560L中,並攪拌40分鐘後,60分鐘後添加乙醇258L並升溫至85℃,再加熱回流30分鐘。離心此溶液,而獲得牛蒡子萃取液。合併重覆此操作兩次所獲得的萃取液,減壓濃縮,對萃取物固體成分添加糊精20%,並噴霧乾燥。牛蒡苷元及牛蒡苷含量係各自為6.2%及6.7%,獲得牛蒡苷元/牛蒡苷(重量比)=0.93之牛蒡子萃取物粉末(含有糊精20%)。
(實施例9 牛蒡子萃取物之製造4)
裁切牛蒡子(酵素活性7.82U/g),將其全部通過9.5mm之篩者進一步通過0.85mm之篩,確認75%殘留。將此牛蒡子細切80kg加到保溫於30~32℃的水560L中,並攪拌30分鐘後,添加乙醇253L並升溫至85℃,再加熱回流40分鐘。離心此溶液,而獲得的萃取液。合並重複此操作兩次所獲得的萃取液,減壓濃縮,對萃取物固體成分添加糊精25%,噴霧乾燥。牛蒡苷元及牛蒡苷含量係各自為6.4%及7.2%,獲得牛蒡苷元/牛蒡苷(重量比)=0.89之牛蒡子萃取物粉末(含有糊精25%)。
由上述之實施例6-9之結果可知,於酵素變換步驟,於約30℃藉由酵素變換,可獲得牛蒡苷元:牛蒡苷(重量比)=約1:1之含量之牛蒡子萃取物。通常,藉由酵素的反應係進行依存於溫度及時間的反應,但若為此溫度,未經歷酵素變換時間,即可獲得牛蒡苷元:牛蒡苷(重量比)=約1:1之含量之牛蒡子萃取物。
又,由上述之實施例6-9之結果可知,於加熱回流步驟,藉由使溫度上升至約85℃來加熱回流,可獲得牛蒡苷元:牛蒡苷(重量比)=約1:1之含量之牛蒡子萃取物。通常,加熱回流而獲得萃取物的情形,萃取物中之含有物之量會依存於溫度及時間而變化,但若為此溫度,未經歷加熱回流時間,可獲得牛蒡苷元:牛蒡苷(重量比)=約1:1之含量之牛蒡子萃取物。
(實施例10 牛蒡子萃取物粉末配合顆粒劑)
(1)實施例7之牛蒡子萃取物粉末 33.3%
(製造方法)
依據「日本藥典(日局)」製劑總則,顆粒劑的項目,而製造顆粒劑。即,取上表記載之(1)-(3)之成分,作成顆粒狀。將其各1.5g填充於鋁層合薄膜,獲得每1包含有牛蒡子萃取物粉末0.5g的顆粒劑。
(實施例11 牛蒡子萃取物粉末配合顆粒劑)
(製造方法)
依據「日局」製劑總則,顆粒劑的項目,而製造顆粒劑。即,取上表記載之(1)-(3)之成分,作成顆粒狀。將其各3.0g填充於鋁層合薄膜,獲得每1包含有牛蒡子萃取物粉末2g的顆粒劑。
(實施例12 牛蒡子萃取物粉末配合錠劑)
(製造方法)
依據「日局」製劑總則,錠劑的項目,而製造錠劑。即,取上表記載之(1)-(6)成分,獲得錠劑。
(試驗例4)
使用實施例10之顆粒劑而試驗對胰臓癌的效果。
病理組織學上的腺癌(包含腺扁平上皮癌)被確認,作為前治療之1年3個月之間進行吉西他濱(Gemcitabine)+S-1療法,最佳反應(Bestresponse)為部分奏效(PR:PartialResponse),將最終以吉西他濱+S-1療法變得有抵抗性而成為漸行性疾病(PD(Progressivedisease))的患者(53歲、男性)作為對象。對此患者,每1日1次於早餐後連續數日經口投與實施例10之顆粒劑7.5g(5包)(含有牛蒡子萃取物粉末2.5g)。
又,於本試驗例所使用的顆粒劑所含的牛蒡子萃取物粉末1g中,含有牛蒡苷元59.4mg及牛蒡苷68.5mg。即,每1日投與患者之牛蒡苷元為148.5mg,牛蒡苷為171.25mg。
第1圖至第3圖係顯示此患者之顆粒劑投與前(A)、投與開始1個月後(B)、2個月後(C)及3個月後(D)之胸腹部電腦斷層成像的影像圖。藉由此等影像,連續地依據「固形癌之治療效果判定用的新準則(RECISTguideline(version1.1))」進行腫瘤縮小效果判定。其結果,於第2圖及第3圖如箭號所示,腫瘤縮小效果被確認。另一方面,於上述患者,實施例10之顆粒劑之投與後未見嚴重的副作用。
再者,檢查顆粒劑投與前後之腫瘤位置標記CA19-9及CEA之量。其結果,如表3所示,顆粒劑投與後之腫瘤位置標記CA19-9及CEA的降低被確認。
因而,本發明之抗癌劑顯示對胰臓癌有效果。尤其,顯示對吉西他濱之治療無反應的胰臓癌有效果。投與本發明之構成時,對胰臓癌有效果係並非過去已知者,又未實際上對人投與的話,並無法容易地推想得知。
又,本發明之抗癌劑不僅對胰臓癌,對大腸癌等之缺血管性且低氧、低營養狀態的癌症等亦可期待有效性。
(試驗例5)
以進行作為前治療之吉西他濱療法為不反應的胰臓癌患者3名作為對象,將實施例10之顆粒劑3g(含有牛蒡子萃取物粉末1g)以每1日1次於早餐後連續數日經口投與。即,於本試驗例,投與患者之每1日的牛蒡苷元為59.4mg,牛蒡苷為68.5mg。
此結果,於此等患者,投與開始1-2個月間雖然並未認為有腫瘤增大,但最終被判定為PD。即,腫瘤之縮小效果及腫瘤位置標記降低並未被確認。又,於任一患者,上述顆粒劑之投與後並未見到嚴重的副作用。
(實施例12切割、冷浸萃取、添加乙醇之牛蒡子萃取物之製造)
將牛蒡子細切200g添加至水(22℃)1L並攪拌1小時後,添加乙醇0.45L再
加熱回流1小時。以紗網4片(金屬網100個網孔)過濾,以30%乙醇0.5L洗淨,凍結乾燥合併的萃取液(1.5L)。如此獲得之冷浸萃取草藥切割物的牛蒡子萃取物,其牛蒡苷及牛蒡苷元含量各自為13.3%及11.4%,牛蒡苷元/牛蒡苷(重量比)=0.86。
(試驗例6:腫瘤模型動物中的抗腫瘤性之評價)
(試驗方法)
於成為供給者的裸鼠(BALB-cAJnu/nu;日本CLEA)的背皮下接種人類胰臓癌細胞株CAPAN-1或PSN-1,藉由將獲得的供給者小鼠的腫瘤塊移殖至接受者小鼠的背皮下而製作腫瘤模型動物。牛蒡苷元(AG)、牛蒡苷(A)及牛蒡子萃取物(實施例12)係將於DMSO中以10mg/ml的濃度溶解者以生理食鹽水稀釋,每1隻小鼠經口投與至胃內50μg,每1週5次。抗腫瘤性係藉由連續地測量背皮下之腫瘤塊的大小來評價。
投與開始後1個月,與對照組相比,藥劑投與組被認為有顯著的腫瘤之增殖抑制效果。又,於純化牛蒡苷元之投與組,亦可獲得抗腫瘤效果,但同時含有前驅物的牛蒡苷的牛蒡子萃取物(實施例12),可見更強的抗腫瘤效果(第4圖及第5圖)。由此結果,可確認牛蒡苷元/牛蒡苷(重量比)=0.7~1.3之牛蒡子萃取物顯示更高的抗腫瘤活性。
(試驗例7:劑量限制性毒性(dose limiting Toxicity DLT)之表現頻率)
將對進行前治療之吉西他濱療法為不反應的胰臓癌患者15名作為對象,進行用以調查劑量限制性毒性之表現頻率的含有牛蒡苷元之顆粒劑之第I期試驗。於此15名,每1日1次早餐後連續數日經口投與指定用量之牛蒡苷元含有
顆粒劑。此15名中之3名,每1次投與實施例10之顆粒劑3g(牛蒡子萃取物粉末1g,即含有牛蒡苷元59.4mg及牛蒡苷68.5mg)。於15名中的另外3名,每1次投與實施例10之顆粒劑7.5g(牛蒡子萃取物粉末2.5g,即含有牛蒡苷元148.5mg及牛蒡苷171.25mg)。又於另外9名,每1次投與實施例10之顆粒劑12g(牛蒡子萃取物粉末4g,即含有牛蒡苷元237.6mg及牛蒡苷274mg)。
其結果,對象患者15名中,劑量限制性毒性之表現頻率為0。具體而言,對抗胰癌患者的含有牛蒡苷元的顆粒劑之第I期試驗中主要的Grade 3以上的有害事項象之GGT上升、高血糖、ALP上升、血中膽紅素(bilirubin)上升上不認為有嚴重的有害事項。
由此等之結果,可知本實施例之顆粒劑係毒性非常低、安全性高。據此,本發明顯示可提供副作用較少的抗癌劑。
(試驗例8:對胰臓癌幹細胞的效果)
其次,調查牛蒡苷元對被認為與癌症的各式各樣的治療抵抗性或再發、轉移巢之出現有深切關聯的癌幹細胞樣族群(CSCs:Cancer Stem-like cells)的效果。
(培養基及試藥調製)
含葡萄糖培養基係將4.75g Dulbecco's Modifed Eagle's Medium(DMEM)培養基2(日水製藥)溶解於水中,添加12.5ml 1M HEPES pH7.4(DOJINDO、342-01375)而滅菌後,添加18.5ml 10% NAHCO3、10ml L-麩胺酸(glutamine)(SIGMA)、5ml Anti-Anti(Life technologies)、5ml MEM NON-ESSENTIAL AMINO ACID SOLUTION(SIGMA),添加於56℃下以30分鐘溫浴而失活的50ml胎牛血清(FETAL BOVINE SERUM(biowest)),最終作成500ml。
葡萄糖阻害培養基係於含葡萄糖培養基中添加最終濃度20mM之2-去氧-葡萄糖(2-Deoxy-Glucose(2-DG))(東京化成工業)而製作。
含3μM牛蒡苷元的培養基係於含葡萄糖培養基或葡萄糖阻礙培養基中添加最終濃度3μM之牛蒡苷元(Kracie製藥)而製作。
FACS緩衝液係將10g無蛋白酶之牛血清白蛋白(Bovine serum albumin Protease free)(和光純藥工業)溶解於1L之PBS(-),添加最終濃度0.1%之疊氮化鈉(sodium azide),過濾滅菌來製作。
FACS分析用之螢光標識抗體係使用CD44(338803或338807,Biolegend),CD24(311117,Biolegend),ESA(324205,Biolegend),c-Met(11-8858,e-bioscience)。又染色過程係依據附於製品的資料表單來進行。
(試驗方法及結果)
將胰臓癌細胞PANC-1(ATCC No.CRL-1469)接種於含葡萄糖培養基培育一
晚後,各別於含葡萄糖培養基、葡萄糖阻礙培養基、含有3μM牛蒡苷元的含葡萄糖培養基及含有3μM牛蒡苷元的葡萄糖阻害培養基培養24小時。回收細胞後,依照一定方法進行PI染色(死細胞染色)及癌幹細胞位置標記染色,以流式細胞分析(FACS,flow cytometry)進行解析。就位置標記而言,使用作為胰臓癌之幹細胞位置標記有報告的CD44、CD24及ESA(CD326)之3重陽性、或CD44陽性、c-Met強陽性之2重陽性。
PI染色及癌幹細胞位置標記(CD44+、CD24+及ESA+(CD326)之3重陽性)之染色結果示於第6圖。PI染色之結果,相對於細胞之存活率係於含有葡萄糖的條件下為78.20%,於葡萄糖阻礙條件下為68.53%,及含有葡萄糖的條件中的3μM牛蒡苷元存在下為69.50%,於葡萄糖阻害條件下之3μM牛蒡苷元存在下,存活率為35.71%。
又,癌幹細胞位置標記染色之結果,指示胰臓癌幹細胞的CD44+ESA+CD24+細胞之比率(生存數)係相對於全分析細胞中之含有葡萄糖的條件下為4.41%(441個)、葡萄糖阻礙條件下為6.51%(651個)、及含有葡萄糖的條件中的3μM牛蒡苷元存在下為5.01%(501個),葡萄糖阻礙條件下之3μM牛蒡苷元存在下為0.98%(98個)。據此,牛蒡苷元顯示於葡萄糖飢餓條件具有殺傷胰臓癌幹細胞的效果。
PI染色及癌幹細胞位置標記(CD44+、c-MetHigh之2重陽性)之染色結果示於第7圖。PI染色之結果,相對於細胞之存活率於含有葡萄糖的條件下為84.70%、於葡萄糖阻礙條件下為88.80%、及於含有葡萄糖的條件中的3μM牛蒡苷元存在下為83.30%,於葡萄糖阻礙條件下之3μM牛蒡苷元存在下之存活率為27.50%。
將強力腫瘤生成能力作為指標的胰臓癌幹細胞之新位置標記之接續報告的CD44陽性c-Met強陽性(CD44+,c-MetHigh)細胞之胰臓癌細胞株的陽性比率(生存數),相對於含有葡萄糖的條件下為0.63%(38個)、葡萄糖阻礙條件下為0.78%(47個)、及含有葡萄糖的條件中的3μM牛蒡苷元存在下係為0.52%(31個),於葡萄糖飢餓條件之3μM牛蒡苷元存在下為0.22%(13個)。據此,牛蒡苷元顯示於葡萄糖飢餓條件,對表現此等之幹細胞位置標記的胰臓癌癌幹細胞,顯示亦具有殺傷其之效果。
(試驗例9:與既存化學療法藥劑抗胰臓癌幹細胞之比較試驗)
進行牛蒡苷元與抗胰臓癌的既存化學療法藥劑之一的順鉑之胰臓癌幹細胞的殺傷效果之比較。
(培養基及試藥調製)
含葡萄糖培養基係將4.75g Dulbecco's Modifed Eagle's Medium(DMEM)培養基2(日水製藥)溶解於水中,添加12.5ml 1M HEPES pH7.4(DOJINDO、342-01375)而滅菌後,添加18.5ml 10% NAHCO3、10ml L-麩胺酸(SIGMA)、5ml Anti-Anti(Life technologies)、5ml MEM NON-ESSENTIAL AMINO ACID SOLUTION(SIGMA),添加於56℃以30分鐘溫浴而失活的50ml胎牛血清(FETAL BOVINE SERUM(biowest)),最終作成500ml。
葡萄糖阻害培養基係於含葡萄糖培養基中添加最終濃度15mM之2-去氧基-葡萄糖(2-DG)(東京化成工業)而製作。
含有4μM牛蒡苷元的培養基係於含葡萄糖培養基或葡萄糖阻礙培養基中添加最終濃度4μM之牛蒡苷元(Kracie製藥)而製作。
(試驗方法及結果)
將胰臓癌細胞Capan-1(ATCC No.HTB-79)接種於含葡萄糖培養基中培育一晚後,各自於含葡萄糖培養基、葡萄糖阻礙培養基、含有4μM牛蒡苷元的含葡萄糖之培養基及含有4μM牛蒡苷元的葡萄糖阻害培養基、或7μM順鉑(CDDP:和光純藥工業)中培養24小時。回收細胞後,依據一定方法進行PI染色(死細胞染色)及癌幹細胞位置標記染色,作為以流式細胞分析(FACS)進行解析的位置標記而言,使用作為胰臓癌之幹細胞位置標記之報告的CD44、CD24及ESA(CD326)的3重陽性。
PI染色及癌幹細胞位置標記之染色結果示於第8圖。PI染色之結果,相對於細胞之存活率於含有葡萄糖的條件下為67.57%、於葡萄糖阻礙條件下為79.10%、及含有葡萄糖的條件中的4μM牛蒡苷元存在下為72.80%,葡萄糖阻害條件下之4μM牛蒡苷元存在下之存活率為48.73%,順鉑處理為58.08%。
又,癌幹細胞位置標記染色之結果,指示胰臓癌幹細胞的CD44+ESA+CD24+細胞之比率(生存數)係以全細胞中分析時,相對於含有葡萄糖的條件下為0.87%(65個)、葡萄糖阻礙條件下為1.40%(105個)、及含有葡萄糖的條件中的4μM牛蒡苷元存在下為1.04%(78個),葡萄糖阻礙條件下之4μM牛蒡苷元存在下為0.24%(18個),順鉑處理為1.17%(88個)。另一方面,於生存細胞中分析時,相對於含有葡萄糖的條件為1.28%、於葡萄糖阻礙條件為1.77%、及於含有葡萄糖的條件中的4μM牛蒡苷元存在下為1.43%,於葡萄糖阻害條件之4μM牛蒡苷元存在下為0.50%,以順鉑處理則上升為2.02%。據此,牛蒡苷元顯示,於葡萄糖飢餓條件,具有殺傷以順鉑殺傷為困難的CD44+ESA+CD24+陽性胰臓癌幹細胞的效果。
由試驗例8及9之結果可知,牛蒡苷元強烈地暗示,於體內置有癌細胞的環境附近的營養飢餓條件,對癌幹細胞樣族群具有殺傷效果。又,牛蒡苷元不僅具有抑制對腫瘤本體作用之癌細胞增殖的效果,亦強烈暗示對供給癌細胞而再構築腫瘤組織的能力的癌幹細胞作用而具有殺傷之效果。
又,含試驗例7的牛蒡苷元之顆粒劑顯示非常低的毒性。牛蒡苷元因於營養飢餓條件具有殺傷效果、及不僅作用於癌本體之細胞亦對癌幹細胞作用而可使對正常的細胞的影響降低,故暗示獲得低毒性的可能性。據此,本發明可提供於少的副作用下具有高抗癌作用的抗癌劑。
[產業上的利用可能性]
本發明係可較佳利用於抗癌劑,尤其是胰臓癌治療劑。
Claims (8)
- 一種牛蒡苷元(arctigenin)用於製備抗癌劑之用途,其係以每1日的投與量成為100mg以上的方式投與牛蒡苷元(arctigenin)。
- 如申請專利範圍第1項所述之用途,其進一步以每1日的投與量成為100mg以上的方式投與牛蒡苷(arctiin)。
- 如申請專利範圍第2項所述之用途,其中該抗癌劑係以牛蒡苷元/牛蒡苷=0.7~1.3之重量比含有牛蒡苷元及牛蒡苷。
- 如申請專利範圍第2項或第3項所述之用途,其中前述牛蒡苷元及前述牛蒡苷係來自牛蒡子(Arctii Fructus)。
- 如申請專利範圍第1項至第3項中任一項所述之用途,其係用於治療對吉西他濱(gemcitabine)的治療為不反應的胰臓癌。
- 如申請專利範圍第4項中所述之用途,其係用於治療對吉西他濱(gemcitabine)的治療為不反應的胰臓癌。
- 一種牛蒡苷元用於製備抗癌幹細胞劑之用途。
- 一種牛蒡苷元用於製備抗癌幹細胞劑之用途,其係以每1日的投與量成為100mg以上的方式投與牛蒡苷元。
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