CN106109483B - 具有抗肿瘤活性的二醇组/三醇组稀有人参皂苷组合物 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种具有抗肿瘤活性的二醇组/三醇组稀有人参皂苷组合物。该稀有人参皂苷组合物中,以该稀有人参皂苷组合物中的总人参皂苷100重量份计,包含:人参皂苷Rk1 5~85重量份,人参皂苷Rg5 5~85重量份,人参皂苷Rk3 5~85重量份,以及人参皂苷Rh4 5~85重量份。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药领域,具体涉及包含人参皂苷Rk1、Rg5、Rk3和Rh4的具有抗肿瘤活性的稀有人参皂苷组合物。
背景技术
癌症是仅次于脑血管疾病的第二大威胁人类的病种。我国癌症的发病人数每年超过300万人,且肺癌、乳腺癌、食管癌的发病率逐年增长,其中肺癌的发病率年增长率26.8%,乳腺癌发病率年增长率6.8%。30年以来,乳腺癌的死亡率上升了96%,肺癌的死亡率猛增465%,我国的癌症防治工作刻不容缓且形势严峻。
目前临床常用的癌症治疗方法有手术切除、放疗、化疗等,这些手段都有比较明显的局限性。其中,手术切除要考虑患者的身体承受能力、手术部位的难度、切除效果等多方面因素,有相当一部分患者身体条件有局限性(年龄、合并其他疾病等)不适宜手术治疗。放疗一般会产生局部的骨髓抑制,放射性心包炎的发生也明显增加,加之放疗部位周围组织的损伤较大,也有相当大的一部分病人不适宜做放疗。化疗是目前比较常用的癌症治疗手段,例如对非小细胞肺癌的治疗常用的药物吉非替尼(商品名:易瑞沙)和埃替尼克,都有一定的治疗作用,但是副作用也特别明显,最常见的药物不良反应有腹泻、皮疹、瘙痒、呕吐、脱发等,且发生率较高,患者在化疗的同时发生白细胞急剧下降,免疫系统破坏较为严重,患者体重下降,不思饮食,导致整体疗效不理想。因此,临床上对于抗肿瘤效果确切、副作用小的口服或者注射类药物的需求极大。
很多研究人员都把目光聚集在中药提取物或植物提取物上,其中紫杉醇和人参皂苷是比较有代表性的两种中药活性成分。紫杉醇来源于红豆杉的树枝,经提取、分离纯化得到的,由于红豆杉1994年被我国定为一级珍稀濒危保护植物,资源再生极其缓慢,所以紫杉醇的来源有限,且治疗效果有限。人参皂苷可通过五加科植物人参、三七、假人参、姜状三七、竹节参等提取获得。人参皂苷可以分为二醇组人参皂苷和三醇组人参皂苷,其中,二醇组人参皂苷包括Rb1、Rb2、Rb3、Rc、Rd、Rg3、Rh2等,三醇组人参皂苷包括Re、Rg1、Rg2、Rh1等。
国内文献中已经报道一些人参皂苷单独对具有抗肿瘤作用,但是,关于如何将特定种类的人参皂苷单体进行组合,以获得更好的抗肿瘤效果却鲜有报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种新的具有协同抗肿瘤作用的稀有人参皂苷组合物。此外,本发明的另一目的在于提供上述稀有人参皂苷组合物在制备抗肿瘤药物中的用途。
本发明人经过深入研究发现,稀有人参皂苷Rk1、Rg5、Rk3和Rh4的特定比例组合物具有广谱且增效显著的抗肿瘤作用,从而完成了本发明。
即,本发明如下。
1.一种具有抗肿瘤活性的稀有人参皂苷组合物,其中,以该稀有人参皂苷组合物中的总人参皂苷100重量份计,该稀有人参皂苷组合物包含:
2.根据项1所述的稀有人参皂苷组合物,其中,作为二醇组人参皂苷的人参皂苷Rk1和人参皂苷Rg5与作为三醇组人参皂苷的人参皂苷Rk3和人参皂苷Rh4的重量之比为10:90~90:10。
3.根据项1或2所述的稀有人参皂苷组合物,其中,该稀有人参皂苷组合物包含:
4.根据项1~3中任一项所述的稀有人参皂苷组合物,其中,以该稀有人参皂苷组合物中的总人参皂苷100重量份计,所述人参皂苷Rk1、Rg5、Rk3和Rh4合计为20重量份以上。
5.根据项1~4中任一项所述的稀有人参皂苷组合物,其中,相对于该稀有人参皂苷组合物的总量100重量份,所述人参皂苷Rk1、Rg5、Rk3和Rh4合计为1重量份以上。
6.根据项1~5中任一项所述的稀有人参皂苷组合物在制备抗肿瘤药物中的用途。
7.根据项6所述的用途,其中,所述抗肿瘤药物为口服剂型或注射剂型。
8.根据项6或7所述的用途,其中,所述肿瘤为肺癌、结肠癌、胃癌或乳腺癌。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行详细的说明。在无冲突的情况下,本说明书中的科学术语具有本领域技术人员通常理解的含义,如有冲突应以本说明书中的定义为准。
首先,在一个方面中,本发明提供一种具有抗肿瘤活性的稀有人参皂苷组合物(本发明的稀有人参皂苷组合物),其中,以该稀有人参皂苷组合物中的总人参皂苷100重量份计,该稀有人参皂苷组合物包含:
在本说明书中,人参皂苷Rg5是指下述化学式1所述的化合物。
【化学式1】
在本说明书中,人参皂苷Rk1是指下述化学式2所述的化合物。
【化学式2】
在本说明书中,人参皂苷Rk3是指下述化学式3所述的化合物。
【化学式3】
在本说明书中,人参皂苷Rh4是指下述化学式4所述的化合物。
【化学式4】
上述人参皂苷Rk1、Rg5、Rk3和Rh4是已知化合物,可以采用本技术领域已知的方法来制备。例如人参皂苷Rg5可以通过热裂解人参皂苷Rb1来制造,人参皂苷Rk3可以通过热裂解来制造,人参皂苷Rk1可以通过热裂解人参皂苷Rb1来制造,人参皂苷Rh4可以通过热裂解来制造。上述人参皂苷Rk1、Rg5、Rk3和Rh4可以通过制备级HPLC来进行纯化。
本发明人发现,将上述四种稀有人参皂苷以特定剂量、特定比例组合时,所得组合物具有广谱且增效显著的抗肿瘤作用。
具体而言,本发明的稀有人参皂苷组合物优选包含:人参皂苷Rk110~70重量份,人参皂苷Rg5 10~70重量份,人参皂苷Rk3 10~70重量份,人参皂苷Rh4 10~70重量份。本发明的稀有人参皂苷组合物更优选包含:人参皂苷Rk1 20~40重量份,人参皂苷Rg5 20~40重量份,人参皂苷Rk3 20~40重量份,人参皂苷Rh4 20~40重量份。以上均以本发明的稀有人参皂苷组合物中的总人参皂苷100重量份计。
所述人参皂苷Rk1、Rg5、Rk3和Rh4均为稀有人参皂苷,其在天然人参提取物中含量低或不存在。但在本发明的稀有人参皂苷组合物中,所述人参皂苷Rk1、Rg5、Rk3和Rh4含量高。优选地,相对于本发明的稀有人参皂苷组合物的总量100重量份,所述人参皂苷Rk1、Rg5、Rk3和Rh4合计为1重量份以上,更优选为2重量份以上,更优选为5重量份以上,更优选为10重量份以上。此外,优选地,以本发明的稀有人参皂苷组合物中的总人参皂苷100重量份计,所述人参皂苷Rk1、Rg5、Rk3和Rh4合计为20重量份以上、优选为50重量份以上、更优选为60重量份以上、更优选为70重量份以上、更优选为80重量份以上、更优选为90重量份以上、更优选为95重量份以上。
这里,所述总人参皂苷的含量可以采用香草醛法测定,所述人参皂苷Rk1、Rg5、Rk3和Rh4均可以采用HPLC法测定。
本发明的稀有人参皂苷组合物中还可以包含辅料。对于本发明的稀有人参皂苷组合物中的辅料,没有特殊限制,例如可以使用本技术领域通常用于药品或保健品的辅料。
其次,在另一个方面中,本发明提供上述本发明的稀有人参皂苷组合物在制备抗肿瘤药物中的用途。
正如前述,本发明的稀有人参皂苷组合物具有广谱且增效显著的抗肿瘤作用。
这里,“抗肿瘤”包括杀灭肿瘤细胞、促进肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤生长、抑制肿瘤转移、改善肿瘤预后或防止肿瘤复发等。这些肿瘤包括例如:脑肿瘤、头颈部癌、颈癌、腭癌、上腭癌、腭下腺癌、口腔癌、唾液腺癌、舌下腺癌、腮腺癌、鼻腔癌、副鼻腔癌、喉头癌、食道癌、肺癌、乳腺癌、胰腺癌(包括胰管癌)、胃癌、胆道癌、小肠癌或十二指肠癌、大肠癌、膀胱癌、肾癌(包括肾细胞癌)、肝癌、前列腺癌、子宫癌(包括子宫颈癌、子宫体癌)、卵巢癌、甲状腺癌、咽头癌、肉瘤、恶性淋巴瘤、白血病、淋巴瘤、皮肤癌以及黑色素瘤等。
抗肿瘤效果可通过例如X光照片、CT等的观察结果、及活检的病理组织诊断、或肿瘤标志物的值等确认。
对所述抗肿瘤药物的剂型没有特殊限制,例如可以是口服剂型或注射剂型。所述口服剂型可以是液体剂型,也可以是固体剂型。
制备口服用固体制剂时,可以在向主药中加入赋形剂以及视需要而定的粘合剂、崩解剂、滑润剂、着色剂、矫味剂等后,按照常规方法制成片剂、包衣片剂、颗粒剂、细粒剂、散剂、胶囊剂等。
作为赋形剂,可使用例如乳糖、玉米淀粉、白糖、葡萄糖、山梨糖醇、结晶纤维素、二氧化硅等;作为粘合剂,可使用例如聚乙烯醇、乙基纤维素、甲基纤维素、阿拉伯胶、羟基丙基纤维素、羟基丙基甲基纤维素等;作为滑润剂,可使用例如硬脂酸镁、滑石、二氧化硅等;作为着色剂,可使用允许在药品中添加的着色剂;作为矫味剂,可使用可可粉、薄荷脑、芳香酸、薄荷油、龙脑、桂皮粉。当然,也可以在上述片剂、颗粒剂上包覆糖衣、明胶衣、以及其它的必要外衣。
制备注射剂时,可以根据需要向主药中添加pH调节剂、缓冲剂、悬助剂、增溶剂、稳定剂、等渗剂、防腐剂等,再按照常规方法制成静脉、皮下、肌肉内注射剂。此时,也可以根据需要,利用常规方法制成冷冻干燥物。
作为悬助剂,可列举例如甲基纤维素、吐温80、羟基乙基纤维素、阿拉伯胶、黄蓍树胶粉、羧甲基纤维素钠、聚氧乙烯山梨糖醇单月桂酸盐等。
作为增溶剂,可列举例如聚氧化乙烯氢化蓖麻油、吐温80、烟酰胺、聚氧乙烯山梨糖醇单月桂酸盐、聚乙二醇、蓖麻油脂肪酸乙酯等。
另外,作为稳定剂,可列举例如亚硫酸钠、偏亚硫酸钠等;作为防腐剂,可列举例如对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、山梨酸、苯酚、甲酚、氯甲酚等。
对于所述抗肿瘤药物的作用机理没有特殊限制,可以是例如抑制肿瘤细胞增殖、抗肿瘤细胞转移、促进肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤新生血管生成和/或提高机体的免疫力。
此外,在另一方面中,本发明还提供一种治疗对象中的肿瘤的方法,其包括给所述对象使用本发明的稀有人参皂苷组合物的步骤。
这里,所述对象可以是哺乳动物,例如可以是人、大鼠、兔、羊、猪、牛、猫、狗、猴等,优选为人。
本发明的稀有人参皂苷组合物,可以口服或非口服施用。施用量因症状程度、患者年龄、性别、体重、敏感性差异、施用方法、施用时期、施用间隔、药物制剂的性质、有效成分的种类等而异,无特殊限制,:但通常成人(体重60Kg)每日1mg~3000mg、优选10mg~1000mg、更优选100mg~500mg,上述施用量通常可每日分1~3次施用。较好的剂量是每日300mg。
实施例
下面给出的实施例,是为了便于理解本发明,并不以任何方式限定本发明的权利要求的范围。
实施例1
分别配制浓度500ug/ml的Rk1、Rg5、Rk3和Rh4的水溶液,分别将其称作Rk1-1、Rg5-1、Rk3-1和Rh4-1。
按Rk1:Rg5:Rk3:Rh4=15:50:10:25(重量比)配制总浓度500ug/ml的包含Rk1、Rg5、Rk3和Rh4的水溶液,将其称作组合物1。
使用上述Rk1-1、Rg5-1、Rk3-1、Rh4-1和组合物1,以及肺癌细胞Nci-H460、结肠癌细胞Caco-2、胃癌细胞SGC-7901、乳腺癌细胞MCF-7这四种癌细胞分别进行癌细胞抑制实验。具体步骤如下:
(1)人雌激素受体阳性乳腺癌细胞株MCF-7,人肺癌细胞株NCI-H460,人胃癌细胞株SGC-7901,人结肠癌细胞株Caco-2,用RPMI 1640细胞培养液,这四种细胞均为贴壁细胞。将冻存的细胞液1500rpm离心5min,弃上清,加入新鲜细胞培养液,吹匀,将其加到培养皿中,放进含5%C02,37℃的生化培养箱中,待细胞贴壁生长24h或者48h,细胞数目达到80%左右时,加入PBS洗涤2-3遍,再加入3mL胰蛋白酶,37℃消化2min,待细胞变圆之后,加入等体积细胞培液终止消化,并将细胞从培养皿底部吹下来。收集细胞液,离心,弃上清,加入一定的培养液,吹匀,将细胞液分别加进两个25cm培养皿中,继续培养。
(2)待肿瘤细胞生长至皿底面积80%左右时,加入PBS洗涤2-3遍,再加入3mL胰蛋白酶,37℃消化2min,待细胞变圆之后,加入等体积细胞培养液终止消化,并将细胞从培养皿底部吹下来。收集细胞液,离心,弃上清,加入一定的培养液,吹匀,取大约50μL加到细胞计数板上,在倒置显微镜上计数。细胞密度=(四大格细胞数之和)×104/4。调整细胞密度至(7-10)×104/mL,将细胞接种与96孔板中,每孔加入0.1mL,放入培养箱中24h。
(3)24h后,吸去每个孔中的培养液,加入皂苷样品,每个浓度设置5个复孔。接着放进培养箱中孵育48h,48小时后,吸去孔中旧培养液,每孔依次加入100μL培养液和50μL MTT溶液,摇匀,放进培养箱中孵育4h,4h之后,吸出混合液,加入150μL DMSO来溶解紫色晶体甲瓒,震荡10min,放进酶标仪中,检测波长570nm,测定每孔的吸光度值A。
(4)抑制率=(空白组A-实验组A)×100%/空白组。
上述Rk1-1、Rg5-1、Rk3-1、Rh4-1和组合物1对各种癌细胞的抑制率如表1所示。
表1
表中的数值为抑制率,单位%
实施例2
分别配制浓度250ug/ml的Rk1、Rg5、Rk3和Rh4的水溶液,分别将其称作Rk1-2、Rg5-2、Rk3-2和Rh4-2。
按Rk1:Rg5:Rk3:Rh4=10:20:60:10(重量比)配制总浓度250ug/ml的包含Rk1、Rg5、Rk3和Rh4的水溶液,将其称作组合物2。
使用上述Rk1-2、Rg5-2、Rk3-2、Rh4-2和组合物2像实施例1那样进行癌细胞抑制实验。
上述Rk1-2、Rg5-2、Rk3-2、Rh4-2和组合物2对各种癌细胞的抑制率如表2所示。
表2
表中的数值为抑制率,单位%
实施例3
分别配制浓度125ug/ml的Rk1、Rg5、Rk3和Rh4的水溶液,分别将其称作Rk1-3、Rg5-3、Rk3-3和Rh4-3。
按Rk1:Rg5:Rk3:Rh4=25:25:25:25(重量比)配制总浓度125ug/ml的包含Rk1、Rg5、Rk3和Rh4的水溶液,将其称作组合物3。
使用上述Rk1-3、Rg5-3、Rk3-3、Rh4-3和组合物3像实施例1那样进行癌细胞抑制实验。
上述Rk1-3、Rg5-3、Rk3-3、Rh4-3和组合物3对各种癌细胞的抑制率如表3所示。
表3
表中的数值为抑制率,单位%
由上述实施例1~3的结果可知,与Rk1-3、Rg5-3、Rk3-3、Rh4-3单体相比,本发明的组合物能够显著提高癌细胞抑制率,且通过调整组合物中Rk1-3、Rg5-3、Rk3-3、Rh4-3单体的量及比例,能够取得更佳的癌细胞抑制效果。
实施例4本发明的稀有人参皂苷组合物对S180皮下荷瘤小鼠抑瘤实验
参考中国专利公告CN101695513B实施例8设计,稍有改动。
实验材料:本发明的稀有人参皂苷组合物(按照实施例3中的比例制备,纯度≥95%),实验室自制;环磷酰胺(CTX),200mg/瓶,江苏恒瑞医药股份有限公司产品。实验动物和细胞系:昆明种小鼠,雌性,体重20g-24g,购自西安交通大学医学院实验动物中心。Sarcoma 180腹水型瘤株(S180),购自中国科学院上海药物研究所。
方法
瘤种保存与传代:自腹腔荷瘤小鼠无菌取瘤细胞,经灭菌生理盐水(NS)稀释后无菌操作接种于正常成年小鼠腹腔,每7天传1代。
荷瘤模型制作方法:处死腹腔传代7天的S180荷瘤小鼠,无菌操作取腹水。灭菌NS稀释腹水调整瘤细胞浓度至8×106个/mL,瘤细胞死亡率<5%。按无菌操作要求将瘤细胞悬液接种于小鼠腹腔,0.2mL/只。
对皮下荷瘤鼠的实验观察:50只小鼠,均皮下荷瘤,次日随机分为5组,每组10只。分组包括:CTX治疗组;空白对照组;稀有人参皂苷组合物低、中、高剂量组;各组都在腹腔荷瘤次日起灌胃给药,每天一次,每次给药0.1mL/10g。CTX为腹腔注射给药,30mg/kg,连用7天;稀有人参皂苷组合物低、中、高剂量分别为250mg/kg、500mg/kg、1000mg/kg,用至死亡前1天,于皮下荷瘤后第12天处理。用药过程观测一般情况。各批次动物处理时,先称体重,处死后取瘤、胸腺、脾脏并称重,进而换算出抑瘤率、胸腺指数、脾脏指数。
统计学处理:计量资料以均数±标准差(x±s)表示。采用单因素方差分析,组间两两比较采用q检验。
结果
CTX组、稀有人参皂苷组合物小、中、高剂量组均能显著延长S180小鼠生长。其中CTX组抑瘤作用显著,稀有人参皂苷组合物小剂量组和中剂量组也有一定的抑制效果,高剂量的抑瘤率作用极显著。稀有人参皂苷组更能促进胸腺指数、脾脏指数的回升。结果见表4和表5。由此可见,稀有人参皂苷组合物具有肿瘤治疗作用。
表4稀有人参皂苷组合物对皮下荷瘤小鼠的抑瘤作用(n=10,x±s)
表5稀有人参皂苷组合物对皮下荷瘤小鼠免疫器官的影响(n=10,x±s)
还需要说明的是,在可实施且不明显违背本发明的主旨的前提下,在本说明书中作为某一技术方案的构成部分所描述的任一技术特征或技术特征的组合同样也可以适用于其它技术方案;并且,在可实施且不明显违背本发明的主旨的前提下,作为不同技术方案的构成部分所描述的技术特征之间也可以以任意方式进行组合,来构成其它技术方案。本发明也包含在上述情况下通过组合而得到的技术方案,并且这些技术方案相当于记载在本说明书中。
以上通过具体实施方式和实施例对本发明进行了说明,但本领域技术人员应该理解的是,这些并非意图对本发明的范围进行限定,本发明的范围应由权利要求书确定。
工业实用性
根据本发明,能够提供一种具有增效显著抗肿瘤作用的稀有人参皂苷组合物。
Claims (6)
2.根据权利要求1所述的稀有人参皂苷组合物,其中,作为二醇组人参皂苷的人参皂苷Rk1和人参皂苷Rg5与作为三醇组人参皂苷的人参皂苷Rk3和人参皂苷Rh4的重量之比为10:90~90:10。
3.根据权利要求1或2所述的稀有人参皂苷组合物,其中,该稀有人参皂苷组合物包含:
4.根据权利要求1~3中任一项所述的稀有人参皂苷组合物在制备抗肿瘤药物中的用途。
5.根据权利要求4所述的用途,其中,所述抗肿瘤药物为口服剂型或注射剂型。
6.根据权利要求4或5所述的用途,其中,所述肿瘤为肺癌、结肠癌、胃癌或乳腺癌。
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- 2016-07-29 CN CN201610616139.8A patent/CN106109483B/zh active Active
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