CN103130644B - 提取分离海州香薷中迷迭香酸、芹菜素和木犀草素的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种提取分离海州香薷中迷迭香酸、芹菜素和木犀草素的方法，依次包括以下步骤：（1）、乙醇浸提：将盛花期收获的海州香薷花枝和叶片风干后粉碎，经浸提和萃取，得棕黑色浸膏；（2）、将棕黑色浸膏进行大孔树脂粗分离，浓缩后，得到黄棕色浸膏；（3）、将所得的黄棕色浸膏进行聚酰胺柱分离，分别得到浸膏A、浸膏B、浸膏C；（4）、浸膏A、浸膏B和浸膏C分别进行硅胶柱层析纯化精制，从而对应的得到芹菜素、芹菜素和迷迭香酸。采用本发明的方法能获取高纯度的迷迭香酸、芹菜素和木犀草素。
Description
技术领域
本发明属于天然产物的生物资源化利用领域，涉及提取分离环境特异植物海州香薷中迷迭香酸、芹菜素和木犀草素的方法。
背景技术
从植物中提取抗肿瘤活性成分，一直是天然产物化学研究的热门领域。天然抗肿瘤药物的有效成分种类多样，主要为生物碱类、中药多糖类、多酚类、蛋白质类、醌类、萜类等；植物多酚类成分具有抗肿瘤作用已经得到证明。据报道，选取白血病细胞、肺部肿瘤细胞和乳腺癌细胞作为研究对象，发现即使只有微量的多酚也能够抑制肿瘤细胞里的酶，而这些酶对引发肿瘤细胞生长“信号”分子的产生是必需的（德科学家发现多酚抑制肿瘤细胞机理，《中成药》，2005, 27(4):455）。植物多酚被认为是植物药疗法中预防和抑制肿瘤的成分。天然多酚类衍生物苯丙素类（phenylpropanoids）咖啡酸的抗肿瘤侵袭和转移活性与其对基质金属蛋白酶-9（MMP 9）的强烈抑制作用有关。由蜂胶乙醇提取液得到的纯咖啡酸苯乙酯（CAPE）是MMP 9的强抑制剂（IC50值为1.0~2.0nmol/L）。苯丙素衍生物迷迭香酸( rosmarinic acid)、紫草酸（lithospermic acid）对基质金属蛋白酶-2（MMP 2）有强烈抑制作用，其IC50值分别为27.2、10.2μmol/L。植物黄酮类化合物（Flavonoids）是植物体内多酚类的信号分子及中间体或代谢物，以唇形科、爵麻科、苦苣苔科、玄参科、菊科等植物中存在较多。研究发现其中相当一部分黄酮具有显著的生理及药理活性，如抗氧化性，提高机体内分泌、清除自由基活性等，可以用于研究细胞信号传导的分子机制，开发黄酮在抗癌、抗肿瘤和心血管保护等方面的功能。由于黄酮的急性、亚急性毒性远远低于雌二醇，决定了其在医药中的广阔发展潜力。
海州香薷（Elsholtzia splendens）为唇形科香薷属植物，多年生草本，分布辽宁、河北、山东、河南、安徽、江苏、浙江、江西、湖北、四川、贵州、云南、陕西、甘肃等地。海州香薷的民间应用较为广泛，功效似香薷。已经证实抗肿瘤成分苯丙素类咖啡酸是海州香薷植物中的一类主要活性成分，咖啡酸含量为海州香薷植物花叶干重的0.1305%；海州香薷植物体内存在与铜有关的苯丙素类咖啡酸代谢物。发明专利（ZL201110136277.3：提取海州香薷中抗肿瘤成份咖啡酸的方法）中公开了从海州香薷植物中提取到产率较高的咖啡酸成分的方法。实验发现海州香薷中存在苯丙素类衍生物迷迭香酸，一种水溶性多酚类化合物。迷迭香酸是具有多种功能的天然活性物质，具有抗氧化、抗炎、抗菌、免疫调节等广泛的药理学作用。同时，发明专利（ZL201010151950.6：铜污染土壤的海州香薷总黄酮提取物在制备血管扩张药物中的应用）中公开了海州香薷中总黄酮提取物在血管扩张中的药用活性，明显优于杭白菊总黄酮提取物、银杏总黄酮提取物和大豆总黄酮提取物。目前研究发现海州香薷中有两种重要的生物黄酮成分芹菜素和木犀草素。芹菜素具有抑制致癌物质的致癌活性，作为治疗HIV和其它病毒感染的抗病毒药物；用于治疗各种炎症；也是抗氧化剂；同时具有镇静、安神、降压作用。与其他黄酮类物质（槲皮素、山奈黄酮）相比，芹菜素具有低毒、无诱变性等特点。木犀草素是很具有代表性的天然黄酮，在植物界分布较广；木犀草素在临床上具有止咳、祛痰及消炎等作用，在体内具有抗菌、抗病毒、心血管保护作用，解痉、抗癌、抑酶作用，抗氧化剂、利尿利胆作用及降低血脂和胆固醇等作用。因此，有效地提取开发环境特异植物海州香薷中的苯丙素类衍生物迷迭香酸、生物黄酮类芹菜素和木犀草素，制备植物源低毒高效的抗肿瘤天然药物，是其高附加值资源化利用的有效途径。
至今为止，国内尚无报道关于从环境特异植物海州香薷中同时提取分离迷迭香酸、芹菜素和木犀草素的方法。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种提取分离海州香薷中迷迭香酸、芹菜素和木犀草素的方法，采用本发明的方法能获取高纯度的迷迭香酸、芹菜素和木犀草素。
为了解决上述技术问题，本发明提供一种提取分离海州香薷中迷迭香酸、芹菜素和木犀草素的方法，依次包括以下步骤：
（1）乙醇浸提：将盛花期收获的海州香薷花枝和叶片风干后粉碎，用体积浓度≥95%的乙醇溶液浸提，所得的提取液经真空浓缩后得粗浸膏；将粗浸膏用水溶解，得溶解液；在溶解液中加入石油醚萃取，所述石油醚与溶解液的体积比为1:0.9~1.1，弃石油醚层；在所得的水层中加入乙酸乙酯反复萃取，直至乙酸乙酯萃取层无颜色；所述每次萃取时乙酸乙酯的用量是溶解液体积的0.9~1.1倍；将所有的乙酸乙酯萃取层合并后浓缩（为常规的减压浓缩），得棕黑色浸膏；
（2）大孔树脂粗分离：将所得的棕黑色浸膏制成水溶液，上样于D101大孔树脂并充分吸附，依次用水以及体积浓度为10%、20%、30%、40%的乙醇溶液以1.4~1.6BV/h梯度进行洗脱分离；收集体积浓度为30%和40%乙醇溶液对应的洗脱液，浓缩得到黄棕色浸膏；
所述棕黑色浸膏与D101大孔树脂的用量比为：1g棕黑色浸膏/10~15mlD101大孔树脂；
所述每100ml水溶液中含有15~25g的棕黑色浸膏；
所述水、体积浓度分别为10%、20%、30%、40%的乙醇溶液的用量分别为：0.8~1.2BV、1.8~2.2BV、4.8~5.2BV、5.8~6.2BV、3.8~4.2BV；
（3）聚酰胺柱分离：将所得的黄棕色浸膏用甲醇溶解，得溶液，所述黄棕色浸膏与甲醇的用量比为1g/2~5ml；按黄棕色浸膏与聚酰胺粉为1:1~2的质量比，在所述溶液中加入聚酰胺粉，得到的悬浊液在20~30℃下减压浓缩至干，得粉状上样物；
按黄棕色浸膏与聚酰胺的质量比1:30~50的比例，取依次经乙醇和水处理后的聚酰胺溶液倒入层析柱中，并用二氯甲烷置换聚酰胺溶液中的水；
将粉状上样物均匀上样于聚酰胺柱顶端，以CH2Cl2:CH3OH:HCOOH=(60:1:3)，(50:1:2.5)，(40:1:2)，(30:1:1.5)，(20:1:1)的体积比浓度梯度进行加压梯度洗脱，（一般而言，每4~6g的黄棕色浸膏对应每梯度使用洗脱液150~400ml）；用TLC分析，以CH2Cl2:CH3OH:HCOOH=20:2:1为展开剂，通过质量浓度3%的FeCl3乙醇溶液显色指示，根据显色斑点分布情况，收集成份相似的洗脱液；分别减压浓缩，25~50℃逐渐升温旋蒸至干，从而分别得到浸膏A、浸膏B、浸膏C；其中，
浸膏A对应浓度梯度为CH2Cl2:CH3OH:HCOOH=60:1:3；
浸膏B对应浓度梯度为CH2Cl2:CH3OH:HCOOH=50:1:2.5以及CH2Cl2:CH3OH:HCOOH =40:1:2；
浸膏C对应浓度梯度为CH2Cl2:CH3OH:HCOOH=30:1:1.5，CH2Cl2:CH3OH:HCOOH= 20:1:1；
（4）硅胶柱层析纯化精制：
①、将硅胶（例如为200目）用乙酸乙酯或石油醚溶解后加压装柱，硅胶与乙酸乙酯或石油醚的质量体积比为1g/4~8ml；所述配套浸膏A的硅胶用乙酸乙酯溶解，配套浸膏B和配套浸膏C的硅胶均用石油醚溶解（即，浸膏A的层析用硅胶用乙酸乙酯溶解，浸膏B和浸膏C的层析硅胶用石油醚溶解）；
②、将上述所得的浸膏A、浸膏B和浸膏C，分别进行以下操作：用甲醇溶解后加入硅胶进行拌样，硅胶与浸膏A、浸膏B和浸膏C的重量比均为2:1~4:1；旋干后将所得的3种拌样分别装在柱顶端，上样后分别进行硅胶柱层析纯化精制；从而分别对应的得到芹菜素、木犀草素和迷迭香酸；
所述步骤①所用的硅胶的总重量与步骤②拌样用硅胶的重量比为20~30:1。
作为本发明的提取分离海州香薷中迷迭香酸、芹菜素和木犀草素的方法的改进：步骤（4）中将所得的浸膏A上样，以乙酸乙酯:甲醇:甲酸=20:3:1的体积比的混合液为洗脱体系，收集各管流出液，并随时进行TLC点板跟踪，以紫外灯下显蓝色荧光、质量浓度1% AlCl3溶液显亮黄色和碘熏硅胶板无杂质三项指标为准，不能同时满足这3项标准的流出液作废液处理，将Rf=0.5(斑点在硅胶板上的比移值)，且为单一斑点的各管合并；重复过柱（即对“废液”重新进行上样洗脱）直至无目标化合物；25~50℃逐渐升温旋蒸至干，得到黄色粉末状的芹菜素，纯度为100%。一般而言，每1g的浸膏A配用400~600ml的洗脱体系。
作为本发明的提取分离海州香薷中迷迭香酸、芹菜素和木犀草素的方法的进一步改进：步骤（4）中将所得的浸膏B上样，以石油醚:乙酸乙酯:甲酸=10:10:1的体积比的混合液为洗脱体系，收集各管流出液，并随时进行TLC点板跟踪，以紫外灯下显蓝色荧光、质量浓度1% 的AlCl3溶液显亮黄色和碘熏硅胶板无杂质三项指标为准，不能同时满足这3项标准的流出液作废液处理，将Rf=0.65(斑点在硅胶板上的比移值)，且为单一斑点的各管合并；重复过柱（即对“废液”重新进行上样洗脱）直至无目标化合物；25~50℃逐渐升温旋蒸至干，得到淡黄色粉末状的木犀草素，纯度为100%。一般而言，每1g的浸膏B配用400~600ml的洗脱体系。
作为本发明的提取分离海州香薷中迷迭香酸、芹菜素和木犀草素的方法的进一步改进：步骤（4）中将所得的浸膏C上样，以石油醚:乙酸乙酯:甲酸=(20:10:1)，(15:10:1)，(10:10:1)的体积比的混合液为展开体系进行梯度洗脱，收集各管流出液，并随时进行TLC点板跟踪，以紫外灯下显蓝色荧光、1% AlCl3溶液显亮黄色和碘熏硅胶板无杂质三项指标为准，不能同时满足这3项标准的流出液作废液处理，以石油醚:乙酸乙酯:甲酸=20:10:1为展开剂，将Rf=0.55(斑点在硅胶板上的比移值)，且为单一斑点的各管合并；重复过柱直至无目标化合物；25~50℃逐渐升温旋蒸至干，得到淡黄色结晶状的迷迭香酸，纯度为98.3%。一般而言，每1g的浸膏C配用的每种梯度的洗脱剂为150~250ml。
在上述步骤2）的“大孔树脂粗分离”的发明过程中，上述收集步骤具体如下：收集流出液并分别对每管中的流出液进行TLC分析（展开剂CH2Cl2:CH3OH:HCOOH=20:4:1的体积比），通过质量浓度1%的AlCl3乙醇溶液显亮黄色，3%FeCl3乙醇溶液显灰绿色，观察到体积浓度30%和40%乙醇洗脱后的流出液成分变化，从而合并上述30%和40%乙醇流出液（即，体积浓度为30%和40%乙醇溶液对应的洗脱液）；浓缩得到黄棕色浸膏。
在本发明步骤3）的“聚酰胺柱分离”中，将处理好的聚酰胺层析柱以气泵加压，使其更加紧密，水面不低于聚酰胺床的高度。待加压至聚酰胺高度保持不变之后，用3~5BV的二氯甲烷，以1BV/h的流速将聚酰胺中的水全部置换为二氯甲烷。
在本发明步骤（1）的“乙醇浸提”中，用体积浓度≥95%的乙醇溶液浸提（于30~50KHz的超声频率处理0.8~1.2小时），所得的提取液抽滤，得滤液；将抽滤所得的残渣重复上述过程1~3次(即以残渣替代干粉末，重复上述浸提)。合并上述浸提所得的全部滤液；再经45℃真空浓缩，得粗浸膏。粗浸膏例如可用超纯水进行溶解。
本发明采用乙醇浸提、大孔树脂粗分离、聚酰胺柱分离、硅胶柱层析纯化精制方法，从环境特异植物海州香薷的花叶干粉中，同时得到迷迭香酸、芹菜素和木犀草素产品，纯度均高于98.3%。
本发明利用海州香薷提取所得的迷迭香酸、芹菜素和木犀草素，均能用于制备抗肿瘤药物。本发明所得到的迷迭香酸、芹菜素和木犀草素，都表现出一定的抗肿瘤活性，其中木犀草素的抗肿瘤活性最好，对肺腺癌细胞A549、表皮癌细胞A431、人乳腺癌Bcap37的抑制率分别达到71.94%、37.41%、46.78%，具有多靶标活性。
在本发明中，采用MTT比色法测定目标化合物（迷迭香酸、木犀草素、芹菜素）对肿瘤细胞的抑制活性。MTT是一种能接受氢原子的染料，化学名为3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐。MTT比色法是一种检测细胞存活和生长的方法，其原理为外源性MTT能够被活细胞线粒体中琥珀酸脱氢酶还原为不溶于水的蓝紫色结晶甲瓒(Formazan)并在细胞中沉积，而死细胞无此现象。二甲基亚砜(DMSO)能溶解甲瓒，在570nm波长下用酶联免疫检测仪测定其吸光值，可间接反映其活细胞数量。本发明将受试化合物（迷迭香酸、木犀草素、芹菜素）配成一定的浓度，与人癌细胞株（人乳腺癌Bcap37、肺腺癌细胞A549、表皮癌细胞A431）共孵72小时后，测定其对癌细胞株的抑制率。
测定方法如下：(1)将肿瘤细胞(人乳腺癌Bcap37、肺腺癌细胞A549、表皮癌细胞A431)培养于含10%新生牛血清的RPMI-1640培养基，置37℃、5% CO2培养箱内常规传代培养，2~3d后分瓶扩增，取对数生长期的细胞进行实验。(2) 分别取对数生长期的人乳腺癌Bcap37、肺腺癌细胞A549、表皮癌细胞A431，0.05%胰酶消化，用含10%新生牛血清的RPMI-1640培养基稀释成50000/ml的单细胞悬液，将其接种于96孔板，每孔100μl，每组设3个复孔。(3)培养24h后加药（加入目标化合物）。加药浓度设定为50μmol/L的DMSO溶液，同时设吉非替尼阳性对照，同时设DMSO作溶剂对照，每个浓度设3个复孔。37℃、5%CO2培养箱孵育，加药72h后，每孔加入含有MTT溶液的RPMI-1640培养基100μl，在细胞培养箱中继续培养3h后，产生蓝紫色结晶甲瓒。(4)离心6min，小心吸干96孔板中的上清液，每孔加入DMSO至少100μl，摇床轻微振荡至少5min，使甲瓒溶解，用酶联免疫检测仪于562nm或570nm处测定每孔吸光度(OD值)，参比波长620nm。取3复孔OD值，求平均值，计算细胞抑制率。
本发明的显著优点和效果：
本发明的海州香薷植物中提取分离迷迭香酸、芹菜素和木犀草素的方法，为天然植物酚类，通过室温浸提与超声提取相结合，再以石油醚、乙酸乙酯深度萃取，大孔树脂粗分离、聚酰胺柱层析－硅胶柱层析多次分离，得到的产物纯度高。本发明中所提取到的迷迭香酸、芹菜素和木犀草素，具有较好的抗肿瘤活性，其效果明显优于咖啡酸。而且木犀草素是多靶标的抗肿瘤天然药物。
综上所述，本发明提供的海州香薷中提取分离迷迭香酸、芹菜素和木犀草素的方法，对环境特异植物海州香薷中天然活性成分的开发利用具有现实意义。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
图1为海州香薷中迷迭香酸、芹菜素和木犀草素提取分离流程图；
图2为本发明的迷迭香酸、芹菜素和木犀草素的红外光谱图；
图3为本发明的迷迭香酸、芹菜素和木犀草素的HPLC-ESI-MS谱图。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。海州香薷中迷迭香酸、芹菜素和木犀草素提取分离流程如图1所示。
实施例1、本发明的海州香薷中花叶干粉的溶剂提取和分离
（1）醇提
将盛花期收获的海州香薷花枝和叶片风干后磨成干粉末(含水率低于0.5%，重量比)，过100目的筛。取上述500g干粉末，置于10L的塑料桶中，加入95%(V/V)乙醇5L，搅拌均匀浸泡3天至材料完全吸涨，40KHz的超声频率处理1小时，抽滤，得滤液。将抽滤所得的残渣重复上述过程2次(即以残渣替代干粉末，重复上述浸提)。合并3次浸提所得的滤液；再经45℃真空浓缩，得126.1g的浸膏①（即，粗浸膏）；产率25.22%。
将上述126.1g的浸膏①用定容至750ml超纯水溶解，用石油醚萃取3次(每次石油醚的用量为750ml)。弃石油醚层；将3次的水层进行合并。将合并后所得的水层用乙酸乙酯萃取3次(每次乙酸乙酯的用量是750ml)，此时乙酸乙酯萃取层无颜色；将3次的乙酸乙酯萃取层合并，35℃旋转蒸发回收乙酸乙酯，得到19.755g棕黑色的浸膏②（即，棕黑色浸膏），产率3.951%。
（2）大孔树脂的粗分离
准备D101型大孔吸附树脂250ml，用大量的蒸馏水冲洗，除去漂浮的碎树脂颗粒后装于层析柱(3cm×50cm)中，用95%（体积浓度）的乙醇置换树脂柱中的水，在层析柱中用上述乙醇浸泡过夜，再用95%（体积浓度）的乙醇以1.5BV/h的流速淋洗至流出液与水按1:5比例混合无浑浊。再将上述D101型大孔吸附树脂中的乙醇用大量的蒸馏水冲干净，至流出液无醇味。
将上述19.755g的浸膏②加超纯水制成100ml水溶液，加入在上述洗干净的D101型大孔树脂层析柱的上部；使上述水溶液被充分吸收。
分别以1BV(BV指树脂床体积)的水、2BV的10%(V/V)乙醇、5BV的20%(V/V)乙醇、6BV的30%(V/V)乙醇、4BV的40%(V/V)乙醇对D101型大孔树脂进行梯度洗脱，流速控制在1.5BV/h。每管大约50ml，收集各管洗脱液。分别对每管中的洗脱液进行TLC点板(聚酰胺薄层层析，展开剂CH2Cl2:CH3OH:HCOOH=20:4:1的体积比)，通过质量浓度1%AlCl3乙醇溶液显亮黄色，质量浓度3%FeCl3乙醇溶液显灰绿色，观察到30%和40%乙醇洗脱后的流出液中成分相似，合并上述含有30%和40%乙醇流出液，浓缩后得到5.213g黄棕色的浸膏③（即，黄棕色浸膏），产率1.042%；不符合上述标准的其他洗脱液作废液处理。
（3）聚酰胺柱再分离
取100目的聚酰胺200g，用300ml的95%（体积浓度）乙醇浸泡过夜，加热回流2h，倒入烧杯中静置，待聚酰胺沉淀后倒掉上层乙醇及漂浮物，用300ml的95%（体积浓度）乙醇溶解后加入层析柱(3cm×50cm)中，并加入超纯水反复置换乙醇，至流出液无醇味。将处理好的聚酰胺层析柱以气泵加压，使其更加紧密，水面不低于聚酰胺床的高度。待加压至聚酰胺高度保持不变之后，用4BV的二氯甲烷液体，以1BV/h的流速将聚酰胺中的水全部置换为二氯甲烷。
将5.213g浸膏③用15ml甲醇溶解，并加入8g聚酰胺粉，得到的悬浊液在20~30℃下减压浓缩至干，获得红棕色粉末15g。
将红棕色粉末上样于聚酰胺柱的顶端，以CH2Cl2:CH3OH:HCOOH（体积比）=(60:1:3), (50:1:2.5), (40:1:2), (30:1:1.5), (20:1:1)的体积比浓度梯度进行加压梯度洗脱，每梯度使用洗脱液300ml，每50ml收集1管。用聚酰胺薄层分析，以CH2Cl2:CH3OH:HCOOH=20:2:1的体积比为展开剂，质量浓度3%的FeCl3乙醇溶液显色为指示，根据显色斑点的分布情况，合并成份相似的洗脱液。
收集第1~6管（即，对应体积浓度梯度为CH2Cl2:CH3OH:HCOOH=60:1:3），减压浓缩得浸膏A为0.782g；
收集第7~18管（即，对应体积浓度梯度为CH2Cl2:CH3OH:HCOOH= 50:1:2.5以及CH2Cl2:CH3OH:HCOOH=40:1:2），减压浓缩得浸膏B为0.927g；
收集第19~30管（即，对应体积浓度梯度为CH2Cl2:CH3OH:HCOOH= 30:1:1.5 CH2Cl2:CH3OH:HCOOH= 20:1:1），减压浓缩得浸膏C为0.821g。
上述浸膏A、浸膏B和浸膏C进一步过硅胶柱精制纯化。
实施例2、本发明的海州香薷中芹菜素、木犀草素、迷迭香酸的薄层硅胶纯化精制
（1）芹菜素的薄层硅胶纯化精制
将50g的200目硅胶用250ml乙酸乙酯溶解，搅拌去气泡，加压装柱。
将实施例1中所得的0.782g浸膏A用4ml甲醇溶解，并加入2g的硅胶拌样，旋干后将其装在柱顶端。以乙酸乙酯:甲醇:甲酸=20:3:1的体积比为展开体系进行加压过柱洗脱，共需洗脱液400ml，收集各管流出液（每10ml收集1管），并随时进行TLC点板跟踪，以紫外灯下显蓝色荧光、1%AlCl3溶液显亮黄色和碘熏硅胶板无杂质三项指标为准，将Rf=0.5(斑点在硅胶板上的比移值)，且为单一斑点的各管合并（即将第30~36管合并），25~50℃逐渐升温旋蒸至干，得到黄色粉末（化合物ａ——芹菜素），约0.033g，产率0.0066%。 纯度为100%。
（2）木犀草素的薄层硅胶纯化精制
将65g的200目硅胶用350ml石油醚溶解，搅拌去气泡，加压装柱。将实施例1中所得的0.927g浸膏B用5ml甲醇溶解，并加入3g的硅胶拌样，旋干后将其装在柱顶端。以石油醚:乙酸乙酯:甲酸=10:10:1的体积比为展开体系进行加压过柱洗脱，共需洗脱液500ml，收集各管流出液（每10ml收集1管），并随时进行TLC点板跟踪，以紫外灯下显蓝色荧光、1% AlCl3溶液显亮黄色和碘熏硅胶板无杂质三项指标为准，将Rf=0.65(斑点在硅胶板上的比移值)，且为单一斑点的各管合并（即将第40~47管合并），25~50℃逐渐升温旋蒸至干，得到淡黄色粉末（化合物ｂ——木犀草素），约0.062g，产率0.0124%。纯度为100%。
（3）迷迭香酸的薄层硅胶纯化精制
将50g的200目硅胶用250ml石油醚溶解，搅拌去气泡，加压装柱。将实施例1中所得的0.821g浸膏C用4ml甲醇溶解，并加入2g的硅胶拌样，旋干后将其装在柱顶端。将浸膏C以石油醚:乙酸乙酯:甲酸=(20:10:1)，(15:10:1)，(10:10:1)的体积比为展开体系进行梯度洗脱，每梯度洗脱液200ml，收集各管流出液，每10ml收集1管；并以石油醚:乙酸乙酯:甲酸=20:10:1为展开剂，随时进行TLC点板跟踪。以紫外灯下显蓝色荧光、1%（质量浓度）的 AlCl3溶液显亮黄色和碘熏硅胶板无杂质三项指标为准，将Rf=0.55(斑点在硅胶板上的比移值)，且为单一斑点的各管合并（即将第45~56管合并），25~50℃逐渐升温旋蒸至干，得到淡黄色结晶（化合物ｃ——迷迭香酸），约0.154g，产率0.0308%。纯度为98.3%。
实施例3、本发明的海州香薷中芹菜素、木犀草素、迷迭香酸的化学结构鉴定
将实施例2中得到的淡黄色化合物（化合物ａ、ｂ、ｃ）用20ml的超纯水溶解，-40℃冰冻2小时，真空冷冻（-80℃）干燥得到产品。分别用氘代DMSO溶解，测定核磁共振氢谱、碳谱，并用压片法测定了红外光谱，用于鉴定结构。数据如下：
芹菜素（纯度100%）的核磁共振氢谱、碳谱特征峰归属如下：1H-NMR(500MHz, DMSO-d6) δ (ppm) : 12.975(s,1H)，10.605 (s,1H)，7.936(d,J=8.0Hz,2H)，6.938(d,J=8.3Hz,2H)，6.785(s,1H)，6.487(s, 1H)，6.199(s,1H)。13C-NMR (125 MHz, DMSO-d6) δ(ppm): 182.208, 164.562, 164.179, 161.914, 161.547, 157.773,128.927,121.653,116.369, 116.369, 104.126, 103.37,99.26, 94.464, 94.391。红外光谱(KBr压片)中主要特征峰如图2所示。HPLC-ESI/MS（图3）：m/z 270.8[M+H]+，分子量为270。
木犀草素（纯度100%）的核磁共振氢谱、碳谱特征峰归属如下：1HNMR (500MHz, DMSO-d6): δ 12.98(s, 1H), 10.05(br), 7.42(s, 1H), 7.41(d, J=8.5Hz, 1H), 6.89(d, J=8.5Hz, 1H), 6.67(s, 1H), 6.44(s, 1H),6.19(s, 1H)。13C NMR (125MHz, DMSO-d6): δ 182.1, 164.7, 164.4, 162.0, 157.8,150.2, 146.2, 122.0, 119.4, 116.5, 113.8, 104.2, 103.3, 99.3, 94.3。红外光谱(KBr压片)中主要特征峰如图2所示。HPLC-ESI/MS（图3）：m/z 286.8[M+H]+，分子量为286。
迷迭香酸（纯度98.3%）的核磁共振氢谱、碳谱的特征峰归属如下：1H-NMR(500MHz, DMSO-d6): 7.47(d, J=16Hz), 7.07(d, J=2Hz), 7.01(dd, J=8Hz, 2Hz), 6.78(d, J=8Hz), 6.69(d, J=2Hz), 6.65(d, J=8Hz), 6.54(dd, J=8Hz, 2Hz), 6.25(d, J=16Hz), 5.04(dd, J=8.5Hz, 4Hz), 3.00(dd, J=14.5Hz,4Hz), 2.91(dd, J=14.5Hz, 8.5Hz)。13C-NMR (125MHz, DMSO-d6): δ171.4, 166.4, 149.1, 146.3, 146.1, 145.4, 144.5, 127.9, 125.9, 122.0, 120.5, 117.2, 116.3, 115.9, 115.4,113.8, 73.4, 36.6。红外光谱(KBr压片)中主要特征峰（图2）：酚羟基(-OH)的伸缩振动(3367cm-1)、酚羟基-OH弯曲振动(1353cm-1)、酚羟基C-OH伸缩振动(1220 cm-1)，苯环上的酯基团的-C=O伸缩振动(1692cm-1)、酯基团的-C=C伸缩振动(1605cm-1)，苯环=C-H 伸缩振动(3239cm-1)、苯环C=C伸缩振动(1524cm-1)和苯环=C-H面外弯曲振动(813cm-1)，Ar-C=C的=C-H面外弯曲振动(980-960cm-1)，芳香酸的特征峰(1284cm-1, 2600cm-1, 950cm-1)。HPLC-ESI/MS（图3）：m/z 383.1[M+23]+，359 [M-1]-，分子量为360，分子式为C18H16O8。
实施例4：本发明的海州香薷中迷迭香酸、木犀草素、芹菜素对人乳腺癌细胞Bcap37、肺腺癌细胞A549和表皮癌细胞A431的抑制活性
采用MTT法测定目标化合物(迷迭香酸、木犀草素、芹菜素)对人乳腺癌细胞Bcap37、肺腺癌细胞A549和表皮癌细胞A431抑制活性。将受试化合物（迷迭香酸、木犀草素、芹菜素）配成一定的浓度，与人癌细胞株（人乳腺癌Bcap37、肺腺癌细胞A549、表皮癌细胞A431）共孵72小时后，测定其对癌细胞株的抑制率。测定方法如下：
(1)将肿瘤细胞(人乳腺癌Bcap37、肺腺癌细胞A549、表皮癌细胞A431)培养于含10%新生牛血清的RPMI-1640培养基，置37℃、5% CO2培养箱内常规传代培养，2~3d后分瓶扩增，取对数生长期的细胞进行实验。(2) 分别取对数生长期的人乳腺癌Bcap37、肺腺癌细胞A549、表皮癌细胞A431，0.05%胰酶消化，用含10%新生牛血清的 RPMI-1640培养基稀释成50000/ml的单细胞悬液，将其接种于96孔板，每孔100μl，每组设3个复孔。(3)培养24h后加药（加入目标化合物）。加药浓度设定为50μmol/L的DMSO溶液，同时设吉非替尼阳性对照，同时设DMSO作溶剂对照，每个浓度设3个复孔。37℃、5%CO2培养箱孵育，加药72h后，每孔加入含有MTT溶液的RPMI-1640培养基100μl，在细胞培养箱中继续培养3h后，产生蓝紫色结晶甲瓒。(4)离心6min，小心吸干96孔板中的上清液，每孔加入DMSO至少100μl，摇床轻微振荡至少5min，使甲瓒溶解，用酶联免疫检测仪于562nm或570nm处测定每孔吸光度(OD值)，参比波长620nm。取3复孔OD值，求平均值，计算细胞抑制率。
抑制率(IR%)=(1-TOD/COD)×100%；其中，TOD：给药组OD均值；COD：溶剂对照组OD均值。测定海州香薷中提取的活性物质如咖啡酸、迷迭香酸、芹菜素、芹菜素糖苷和木犀草素，在50μmol/l浓度下对肿瘤细胞株（肺腺癌细胞A549、表皮癌细胞A431、人乳腺癌Bcap37）的抑制率（如表1）。
表1 50μmol浓度下活性化合物对肿瘤细胞株的细胞毒活性(用抑制率表示)
注：NA表示没有检测到抑制活性
由表1可知，在50μmol/L浓度下，木犀草素的抗肿瘤活性最好，对肺腺癌细胞A549、表皮癌细胞A431、人乳腺癌Bcap37的抑制率分别达到71.94%、37.41%、46.78%，具有多靶标活性，可用于抗肿瘤药物的制备。芹菜素对肺腺癌细胞A549、表皮癌细胞A431、人乳腺癌Bcap37的抑制率分别达到77.07%、5.63%、24.3%，其中对肺腺癌细胞A549的抑制效果在测定结果中最佳，与成品药吉非替尼（抑制率80%）效果相当，具有很好的开发前景。芹菜素糖苷和迷迭香酸对特定的肿瘤细胞有一定的抑制效果，明显好于咖啡酸。
对比实施例1：将实施例1步骤3）的“聚酰胺柱再分离”改成以下内容：
取100目的聚酰胺200g，洗涤，装入层析柱(3cm×50cm) 的方法同实施例1。
将实施例1中大孔树脂分离得到的5.213g浸膏③用15ml甲醇溶解，并加入8g聚酰胺粉，得到的悬浊液在20~30℃下减压浓缩至干，直接获得红棕色粉末15g。将红棕色粉末上样于聚酰胺柱的顶端，以CH2Cl2:CH3OH:HCOOH（体积比）=(70:1:3), (60:1:2.5), (50:1:2), (40:1:1.5), (30:1:1)的浓度梯度进行加压梯度洗脱，每梯度使用洗脱液400ml，每50ml收集1管。用聚酰胺薄层分析，以CH2Cl2:CH3OH:HCOOH=20:2:1的体积比为展开剂，3%FeCl3乙醇溶液显色为指示，根据显色斑点的分布情况，合并成份相似的洗脱液。
收集第1~8管，减压浓缩得浸膏A为0.750g；
收集第9~27管，减压浓缩得浸膏B为0.901g；
收集第28~40管，减压浓缩得浸膏C为0.795g。
上述浸膏A、浸膏B和浸膏C进一步过硅胶柱精制纯化。
对比实施例2：海州香薷中芹菜素、木犀草素和迷迭香酸的薄层硅胶纯化精制
（1）芹菜素的薄层硅胶纯化精制
将50g的200目硅胶用250ml乙酸乙酯溶解，搅拌去气泡，加压装柱。将对比实施例1中所得的0.750g浸膏A用4ml甲醇溶解，并加入2g的硅胶拌样，旋干后将其装在柱顶端。以乙酸乙酯:甲醇:甲酸=15:3:1的体积比为展开体系进行加压过柱洗脱，共需洗脱液350ml，收集各管流出液（每10ml收集1管），并随时进行TLC点板跟踪，以紫外灯下显蓝色荧光、1%AlCl3溶液显亮黄色和碘熏硅胶板无杂质三项指标为准，将Rf=0.5(斑点在硅胶板上的比移值)，且为单一斑点的各管合并（即将第29~33管合并），25~50℃逐渐升温旋蒸至干，得到黄色粉末（化合物ａ——芹菜素），约0.029g，产率0.0058%。
（2）木犀草素的薄层硅胶纯化精制
将65g的200目硅胶用350ml石油醚溶解，搅拌去气泡，加压装柱。将对比实施例1中所得的0.901g浸膏B用5ml甲醇溶解，并加入3g的硅胶拌样，旋干后将其装在柱顶端。以石油醚:乙酸乙酯:甲酸=10:15:1的体积比为展开体系进行加压过柱洗脱，共需洗脱液430ml，收集各管流出液（每10ml收集1管），并随时进行TLC点板跟踪，以紫外灯下显蓝色荧光、1% AlCl3溶液显亮黄色和碘熏硅胶板无杂质三项指标为准，将Rf=0.65(斑点在硅胶板上的比移值)，且为单一斑点的各管合并（即将第37~41管合并），25~50℃逐渐升温旋蒸至干，得到淡黄色粉末（化合物ｂ——木犀草素），约0.0536g，产率0.0107%。
（3）迷迭香酸的薄层硅胶纯化精制
将50g的200目硅胶用250ml石油醚溶解，搅拌去气泡，加压装柱。将对比实施例1中所得的0.795g浸膏C用4ml甲醇溶解，并加入2g的硅胶拌样，旋干后将其装在柱顶端。将浸膏C以石油醚:乙酸乙酯:甲酸=(15-10-5):10:1的体积比为洗脱液进行梯度洗脱，每梯度洗脱液180ml，收集各管流出液，每10ml收集1管；并以石油醚:乙酸乙酯:甲酸=20:10:1为展开剂，随时进行TLC点板跟踪。以紫外灯下显蓝色荧光、1% AlCl3溶液显亮黄色和碘熏硅胶板无杂质三项指标为准，将Rf=0.55(斑点在硅胶板上的比移值)，且为单一斑点的各管合并（即将第46~52管合并），25~50℃逐渐升温旋蒸至干，得到淡黄色结晶（化合物ｃ——迷迭香酸），约0.143g，产率0.0286%。
对比实施例3：海州香薷中芹菜素、木犀草素和迷迭香酸的薄层硅胶纯化精制
（1）芹菜素的薄层硅胶纯化精制
将50g的200目硅胶用250ml乙酸乙酯溶解，搅拌去气泡，加压装柱。将实施例1中所得的0.782g浸膏A用4ml甲醇溶解，并加入2g的硅胶拌样，旋干后将其装在柱顶端。以乙酸乙酯:甲醇:甲酸=25:3:1的体积比为展开体系进行加压过柱洗脱，共需洗脱液500ml，收集各管流出液（每10ml收集1管），并随时进行TLC点板跟踪，以紫外灯下显蓝色荧光、1%AlCl3溶液显亮黄色和碘熏硅胶板无杂质三项指标为准，将Rf=0.5(斑点在硅胶板上的比移值)，且为单一斑点的各管合并（即将第39~48管合并），25~50℃逐渐升温旋蒸至干，得到黄色粉末（化合物ａ——芹菜素），约0.027g，产率0.0054%。
（2）木犀草素的薄层硅胶纯化精制
将65g的200目硅胶用350ml石油醚溶解，搅拌去气泡，加压装柱。将实施例1中所得的0.927g浸膏B用5ml甲醇溶解，并加入3g的硅胶拌样，旋干后将其装在柱顶端。以石油醚:乙酸乙酯:甲酸=15:12:1的体积比为展开体系进行加压过柱洗脱，共需洗脱液600ml，收集各管流出液（每10ml收集1管），并随时进行TLC点板跟踪，以紫外灯下显蓝色荧光、1% AlCl3溶液显亮黄色和碘熏硅胶板无杂质三项指标为准，将Rf=0.65(斑点在硅胶板上的比移值)，且为单一斑点的各管合并（即将第43~57管合并），25~50℃逐渐升温旋蒸至干，得到淡黄色粉末（化合物ｂ——木犀草素），约0.060g，产率0.012%。
（3）迷迭香酸的薄层硅胶纯化精制。
将50g的200目硅胶用250ml石油醚溶解，搅拌去气泡，加压装柱。将实施例1中所得的0.821g浸膏C用4ml甲醇溶解，并加入2g的硅胶拌样，旋干后将其装在柱顶端。将浸膏C以石油醚:乙酸乙酯:甲酸=(25-20-15):10:1的体积比为洗脱液进行梯度洗脱，每梯度洗脱液250ml，收集各管流出液，每10ml收集1管；并以石油醚:乙酸乙酯:甲酸=20:10:1为展开剂，随时进行TLC点板跟踪。以紫外灯下显蓝色荧光、1% AlCl3溶液显亮黄色和碘熏硅胶板无杂质三项指标为准，将Rf=0.55(斑点在硅胶板上的比移值)，且为单一斑点的各管合并（即将第55~70管合并），25~50℃逐渐升温旋蒸至干，得到淡黄色结晶（化合物ｃ——迷迭香酸），约0.150g，产率0.03%。
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
Claims (4)
1.提取分离海州香薷中迷迭香酸、芹菜素和木犀草素的方法，其特征在于依次包括以下步骤：
(1)、乙醇浸提：将盛花期收获的海州香薷花枝和叶片风干后粉碎，用体积浓度≥95％的乙醇溶液浸提，所得的提取液经真空浓缩后得粗浸膏；将粗浸膏用水溶解，得溶解液；在溶解液中加入石油醚萃取，所述石油醚与溶解液的体积比为1:0.9～1.1，弃石油醚层；在所得的水层中加入乙酸乙酯反复萃取，直至乙酸乙酯萃取层无颜色；所述每次萃取时乙酸乙酯的用量是溶解液体积的0.9～1.1倍；将所有的乙酸乙酯萃取层合并后浓缩，得棕黑色浸膏；
(2)、大孔树脂粗分离：将所得的棕黑色浸膏制成水溶液，上样于D101大孔树脂并充分吸附，依次用水以及体积浓度为10％、20％、30％、40％的乙醇溶液以1.4～1.6BV/h梯度进行洗脱分离；收集体积浓度为30％和40％乙醇溶液对应的洗脱液，浓缩得到黄棕色浸膏；
所述棕黑色浸膏与D101大孔树脂的用量比为：1g棕黑色浸膏/10～15mlD101大孔树脂；
所述每100ml水溶液中含有15～25g的棕黑色浸膏；
所述水、体积浓度分别为10％、20％、30％、40％的乙醇溶液的用量分别为：0.8～1.2BV、1.8～2.2BV、4.8～5.2BV、5.8～6.2BV、3.8～4.2BV；
(3)、聚酰胺柱分离：将所得的黄棕色浸膏用甲醇溶解，得溶液，所述黄棕色浸膏与甲醇的用量比为1g/2～5ml；按黄棕色浸膏与聚酰胺粉为1:1～2的质量比，在所述溶液中加入聚酰胺粉，得到的悬浊液在20～30℃下减压浓缩至干，得粉状上样物；
按黄棕色浸膏与聚酰胺的质量比1:30～50的比例，取依次经乙醇和水处理后的聚酰胺溶液倒入层析柱中，并用二氯甲烷置换聚酰胺溶液中的水；
将粉状上样物均匀上样于聚酰胺柱顶端，以CH2Cl2:CH3OH:HCOOH＝(60:1:3)，(50:1:2.5)，(40:1:2)，(30:1:1.5)，(20:1:1)的体积比浓度梯度进行加压梯度洗脱，用TLC分析，以CH2Cl2:CH3OH:HCOOH＝20:2:1为展开剂，通过质量浓度3％的FeCl3乙醇溶液显色指示，根据显色斑点分布情况，收集成份相似的洗脱液；分别减压浓缩，25～50℃逐渐升温旋蒸至干，从而分别得到浸膏A、浸膏B、浸膏C；其中，
浸膏A对应浓度梯度为CH2Cl2:CH3OH:HCOOH＝60:1:3；
浸膏B对应浓度梯度为CH2Cl2:CH3OH:HCOOH＝50:1:2.5以及CH2Cl2:CH3OH:HCOOH＝40:1:2；
浸膏C对应浓度梯度为CH2Cl2:CH3OH:HCOOH＝30:1:1.5CH2Cl2:CH3OH:HCOOH＝20:1:1；
(4)、硅胶柱层析纯化精制：
①、将硅胶用乙酸乙酯或石油醚溶解后加压装柱，硅胶与乙酸乙酯或石油醚的质量体积比为1g/4～8ml；配套浸膏A的硅胶用乙酸乙酯溶解，配套浸膏B和配套浸膏C的硅胶均用石油醚溶解；
②、将上述所得的浸膏A、浸膏B和浸膏C，分别进行以下操作：用甲醇溶解后加入硅胶进行拌样，硅胶与浸膏A、浸膏B和浸膏C的重量比均为2:1～4:1；旋干后将所得的3种拌样分别装在柱顶端，上样后分别进行硅胶柱层析纯化精制；从而分别对应的得到芹菜素、木犀草素和迷迭香酸；
所述步骤①所用的硅胶的总重量与步骤②拌样用硅胶的重量比为20～30:1。
2.根据权利要求1所述的提取分离海州香薷中迷迭香酸、芹菜素和木犀草素的方法，其特征在于所述步骤(4)中：将所得的浸膏A上样，以乙酸乙酯:甲醇:甲酸＝20:3:1的体积比的混合液为洗脱体系，收集各管流出液，并随时进行TLC点板跟踪，以紫外灯下显蓝色荧光、质量浓度1％AlCl3溶液显亮黄色和碘熏硅胶板无杂质三项指标为准，不能同时满足这3项标准的流出液作废液处理，将Rf＝0.5，且为单一斑点的各管合并；重复过柱直至无目标化合物；25～50℃逐渐升温旋蒸至干，得到黄色粉末状的芹菜素。
3.根据权利要求1或2所述的提取分离海州香薷中迷迭香酸、芹菜素和木犀草素的方法，其特征在于所述步骤(4)中：将所得的浸膏B上样，以石油醚:乙酸乙酯:甲酸＝10:10:1的体积比为洗脱体系，收集各管流出液，并随时进行TLC点板跟踪，以紫外灯下显蓝色荧光、质量浓度1％的AlCl3溶液显亮黄色和碘熏硅胶板无杂质三项指标为准，不能同时满足这3项标准的流出液作废液处理，将Rf＝0.65，且为单一斑点的各管合并；重复过柱直至无目标化合物；25～50℃逐渐升温旋蒸至干，得到淡黄色粉末状的木犀草素。
4.根据权利要求3所述的提取分离海州香薷中迷迭香酸、芹菜素和木犀草素的方法，其特征在于所述步骤(4)中：将所得的浸膏C上样，以石油醚:乙酸乙酯:甲酸＝(20:10:1)，(15:10:1)，(10:10:1)的体积比为展开体系进行梯度洗脱，收集各管流出液，并随时进行TLC点板跟踪，以紫外灯下显蓝色荧光、1％AlCl3溶液显亮黄色和碘熏硅胶板无杂质三项指标为准，不能同时满足这3项标准的流出液作废液处理，以石油醚:乙酸乙酯:甲酸＝20:10:1为展开剂，将Rf＝0.55，且为单一斑点的各管合并；重复过柱直至无目标化合物；25～50℃逐渐升温旋蒸至干，得到淡黄色结晶状的迷迭香酸。
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