CN105218605B - 提取分离海州香薷中假荆芥属苷、高车前苷和芹菜素糖苷的方法 - Google Patents
提取分离海州香薷中假荆芥属苷、高车前苷和芹菜素糖苷的方法 Download PDFInfo
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Landscapes
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Abstract
本发明公开了一种提取分离海州香薷中假荆芥属苷、高车前苷和芹菜素糖苷的方法；本发明采用乙醇浸提/溶液萃取、大孔树脂粗分离、凝胶柱筛分、聚酰胺柱分离纯化，并结合采用半制备液相色谱精制，从环境特异植物海州香薷的花叶中，分离得到假荆芥属苷、高车前苷、芹菜素‑7‑O‑β‑D‑糖苷产品。本发明中所提取到的假荆芥属苷、高车前苷，均是首次从海州香薷植物体内提取得到。
Description
技术领域
本发明属于天然产物的生物资源化利用领域，涉及提取分离海州香薷中黄酮苷化合物的方法，该黄酮苷化合物为假荆芥属苷、高车前苷、芹菜素-7-O-β-D-糖苷。
背景技术
黄酮类化合物是一类在植物界广泛分布的酚性组分，目前已知的黄酮类化合物单体已达8000多种，且结构复杂多样。黄酮类化合物因其独特化学结构而对哺乳动物和其它细胞具有重要生理生化作用。例如，黄酮类化合物不仅能清除生物体内的自由基，具有抗氧化作用。黄酮类化合物又具有很多重要药理作用，拥有抗癌、抗菌、抗病毒、抗炎症、抗过敏、抗糖尿病并发症等功能，对人类肿瘤、衰老、心血管病等疾病治疗和预防有重要意义。当黄酮类化合物在不同碳位上发生羟基或甲氧基取代，即成为各种类黄酮色素，有不同的理化性质，与糖相连则形成苷类化合物，也因不同化学结构产生不同药理作用。大豆异黄酮金雀异黄素-4'-葡萄糖苷可降低谷丙转氨酶，异黄酮类成分可抑制肝脏微粒体脂质过氧化，金雀异黄素可降低肝细胞的mRNA水平。黄酮苷类化合物是植物总黄酮的重要组成部分。因而黄酮苷类化合物对了解黄酮类化合物的构效关系，从自然界中寻找黄酮先导化合物和进行结构改造或修饰，以及对创制新药都具有重要意义。
海州香薷(Elsholtzia splendens)为唇形科香薷属植物。海州香薷的民间应用较为广泛，功效似香薷。发明专利(CN201310042896.5：提取分离海州香薷中迷迭香酸、芹菜素和木犀草素的方法)公开了海州香薷迷迭香酸、黄酮化合物芹菜素和木犀草素的提取分离纯化方法。发明专利(ZL201010151950.6：铜污染土壤的海州香薷总黄酮提取物在制备血管扩张药物中的应用)公开了海州香薷的总黄酮提取物在血管扩张中的药用活性，明显优于杭白菊总黄酮提取物、银杏总黄酮提取物和大豆总黄酮提取物。而且研究表明海州香薷总黄酮提取物对大鼠离体心脏缺血与再灌注损伤均具有保护作用(Wang Hui-Ping,Lu Jian-Feng,Zhang Guo-Lin,Li Xu-Yun,Peng Hong-Yun,Lu Yuan,Zhao Liang,Ye Zhi-Guo,Bruce Lain C,Xia Qiang.Endothelium-dependent and-independent vasorelaxantactions and mechanisms induced by total flavonoids of Elsholtzia splendens inrat aortas.Environmental Toxicology and Pharmacology.2014.38(2):453-459)。黄酮苷类化合物具有心血管活性作用，由此推测海州香薷中也存在黄酮苷类化合物。但是目前的现有技术没有告知如何从海州香薷提取黄酮苷类化合物的相应方法。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种提取分离海州香薷中假荆芥属苷、高车前苷和芹菜素糖苷的方法，
为了解决上述技术问题，本发明提供一种提取分离海州香薷中假荆芥属苷、高车前苷和芹菜素糖苷的方法，依次包括以下步骤：
(1)、浸提和萃取：
将收获(盛花期收获)的海州香薷的花枝和叶片风干后粉碎，用体积浓度为60％的乙醇溶液浸提，所得提取液经真空浓缩后得粗浸膏；
将粗浸膏用超纯水溶解，得溶解液；将溶解液依次用石油醚、乙酸乙酯、水饱和正丁醇(即，水饱和的正丁醇溶液)进行萃取，浓缩(水饱和正丁醇萃取层进行浓缩)，得深棕色浸膏；
备注说明：一般，上述萃取至少反复三次；每次萃取时，石油醚用量、乙酸乙酯用量、水饱和正丁醇用量分别是溶解液的0.9～1.5体积倍；将三次萃取所得到的水饱和正丁醇萃取层合并、浓缩，得深棕色浸膏；
(2)、大孔树脂粗分离：
将所得的深棕色浸膏用超纯水溶解，制成水溶液，上样于D101大孔树脂(并充分吸附)，依次用水以及体积浓度为10％、20％、40％、70％和95％的乙醇溶液以1.4～1.6BV/h梯度进行洗脱分离；
收集40％乙醇溶液对应的洗脱液，旋蒸浓缩，得黄棕色浸膏Ⅰ；
收集70％乙醇溶液对应的洗脱液，旋蒸浓缩，得黄棕色浸膏Ⅱ；
所述深棕色浸膏与D101大孔树脂的用量比为：1g棕黑色浸膏/5～15ml(较佳为1g棕黑色浸膏/8～9ml)D101大孔树脂；
所述每100ml水溶液中含有15～40g的深棕色浸膏；
所述水的用量为0.8～1.2BV，所述体积浓度为10％、20％、40％、70％和95％的乙醇溶液的用量分别为：1.8～2.2BV、1.8～2.2BV、4.8～5.2BV、3.8～4.2BV、3.8～4.2BV；
(3)、凝胶柱筛分：
①、将所得的黄棕色浸膏Ⅰ(即，40％乙醇提取物)用40％甲醇/水溶液溶解，离心取上清液，得溶解状上样物Ⅰ；所述黄棕色浸膏Ⅰ与40％甲醇/水溶液的用量比为1g/2～5ml；
将所得的黄棕色浸膏Ⅱ(即，70％乙醇提取物)用70％甲醇/水溶液溶解，得溶解状上样物Ⅱ；黄棕色浸膏Ⅱ与70％甲醇/水溶液的用量比为1g/2～5ml；
将溶解状上样物Ⅰ，均匀上样于凝胶柱顶端，用体积浓度为40％、70％、95％的甲醇/水溶液进行常压梯度洗脱；
将溶解状上样物Ⅱ，均匀上样于凝胶柱顶端，用体积浓度比为70％、95％的甲醇/水进行常压梯度洗脱；
所用每一种体积浓度洗脱液的量为相应柱床体积的2～4倍；流速均控制为1～1.5BV/h；
洗脱流出液用聚酰胺薄层分析，以甲醇:水:乙酸＝5:1:1的体积比为展开剂，通过质量浓度3％的FeCl3乙醇溶液显色指示，根据显色斑点分布情况，收集成份相似的洗脱液(然后，可分别减压浓缩，25～45℃水浴加热旋蒸至干)；
黄棕色浸膏Ⅰ经过上述凝胶柱筛分后，依次得到浸膏A、浸膏B、浸膏C、浸膏D；
备注说明：浸膏B的甲醇溶解性良好，可使用凝胶柱进行筛分。
黄棕色浸膏Ⅱ经过凝胶柱初筛分后，依次得到浸膏E、浸膏F、浸膏G。
作为本发明的提取分离海州香薷中假荆芥属苷、高车前苷和芹菜素糖苷的方法的改进：将步骤(3)将所得的浸膏B进行凝胶柱再筛分：
将50g SephadexTM LH-20填料用200ml甲醇溶解，搅拌去气泡，常压装柱；0.69g的浸膏B用5ml 50％甲醇/水溶解，上样于凝胶柱顶端；以甲醇:水＝1:1的体积比为展开体系进行常压过柱洗脱，共需洗脱液500ml，收集各瓶流出液(每50ml收集1瓶)，并用聚酰胺薄层点板跟踪，以紫外灯365nm下显暗红色、质量浓度3％FeCl3溶液显深绿色两项指标为准，将Rf＝0.5(斑点在聚酰胺膜上的比移值)，且为单一斑点的各管合并，合并液于25～45℃水浴升温旋蒸至干，得到假荆芥属苷粗品(浸膏B2)，纯度为82％。
备注说明：纯度中的％均为质量％，以下同。
作为本发明的提取分离海州香薷中假荆芥属苷、高车前苷和芹菜素糖苷的方法的进一步改进：
将假荆芥属苷粗品(浸膏B2)，用甲醇(色谱级甲醇)溶解后，用安捷伦半制备液相色谱精制，Sepax amethyst C18-H色谱柱(21.2×250mm×5μm)，流动相为40％甲醇/水，流速为10ml/min，单次用量为1ml，检测波长230nm；检测时长40min；收集时段为10～15min的馏分，旋蒸(40～45℃)至干，得到黄色粉末(化合物A——假荆芥属苷)，纯度≥95.0％。
作为本发明的提取分离海州香薷中假荆芥属苷、高车前苷和芹菜素糖苷的方法的进一步改进：将步骤(3)将所得的浸膏E，进行聚酰胺柱层析分离；所述的浸膏E的聚酰胺粉用甲醇溶浸；即：
将步骤(3)所得的浸膏E，用甲醇溶解后加入聚酰胺粉中干法拌样，聚酰胺粉与浸膏E的重量比为2:1～4.2:1；旋干后的浸膏E拌样，上样在聚酰胺柱顶端，以甲醇:水＝3:1体积比的混合液为洗脱体系进行洗脱分离；收集各瓶流出液，点板跟踪，以365nm紫外灯照射显暗红色、质量浓度3％FeCl3溶液显黑色斑点两项指标为准，将Rf＝0.4且为单一斑点的组分合并，可重复过柱直至无目标化合物；合并液旋蒸至干得到黄色粉末；
上述黄色粉末重复上样，以二氯甲烷:甲醇＝20:1的体积比为展开体系进行洗脱，收集各瓶流出液，点板跟踪(两项指标同上)，将Rf＝0.6且为单一斑点的各组分合并；合并液旋蒸至干，得到高车前苷粗品(浸膏E2，纯度约为80％)。
作为本发明的提取分离海州香薷中假荆芥属苷、高车前苷和芹菜素糖苷的方法的进一步改进：
高车前苷粗品(浸膏E2)再次上样，以二氯甲烷:乙酸乙酯＝8:1或5:1体积比的混合液作为洗脱体系进行洗脱分离；收集各管流出液，点板跟踪(两项指标同上)，将Rf＝0.6且为单一斑点的各组分合并；合并液旋蒸至干，得到高车前苷(黄色粉末，纯度≥95％)。
作为本发明的提取分离海州香薷中假荆芥属苷、高车前苷和芹菜素糖苷的方法的进一步改进：
步骤(3)中所得的浸膏G，进行半制备液相分离；安捷伦半制备液相分析仪：Sepaxamethyst C18-H色谱柱(21.2×250mm×5μm)，流动相为40％甲醇/水，流速10ml/min，用量为1ml，检测波长230nm，检测时长40min，收集时段为10～15min的馏分，制备分离后，得到浸膏G1(Fraction 7.1)；
将浸膏G1用甲醇溶解后，用聚酰胺柱层析，以乙酸乙酯:甲醇＝5:1体积比的混合液为洗脱体系；收集各管流出液，点板跟踪，以紫外灯365nm下显暗红色、3％FeCl3溶液显深绿色两项指标为准，将Rf＝0.6且为单一斑点的各组分合并；25～45℃水浴加热升温旋蒸至干，得到的芹菜素-7-O-β-D-糖苷(黄色粉末状，纯度≥98％)。
在本发明步骤(2)的“大孔树脂粗分离”过程中，所述收集步骤为：分别收集各不同浓度的乙醇洗脱液过柱后的流出液，合并后经20～45℃水浴加热真空浓缩，得浸膏；高效液相分析浸膏中的流出液成分，通过特殊紫外吸收峰的分析，确定重点分析了40％乙醇提取物和70％乙醇提取物。
在本发明步骤3)的“凝胶柱筛分”的过程中，按黄棕色样品浸膏与凝胶粉的质量比为1:25～100的比例，取相应量的凝胶粉用甲醇溶浸倒入玻璃层析柱内，先用纯水置换层析柱内甲醇，直至流出液无醇味为止，再用每一浸膏对应比例的甲醇/水置换凝胶柱中的水。
在本发明步骤的“聚酰胺柱分离纯化”的过程中，聚酰胺粉(100～200目)用甲醇、二氯甲烷或乙酸乙酯溶浸后，以气泵加压装柱，使其更加紧密，液面不低于聚酰胺床的高度。所述的聚酰胺粉与甲醇、二氯甲烷或乙酸乙酯的质量体积比为1g/(4～8)ml。所述的聚酰胺总重量与浸膏样品的重量比例如可为20～100:1。
备注说明：在本发明中，40％甲醇/水溶液即为40％的甲醇与60％的水的混合液；上述％为体积％。其余，以此类推。
本发明采用乙醇浸提/溶液萃取、大孔树脂粗分离、凝胶柱筛分、聚酰胺柱分离纯化，并结合采用半制备液相色谱精制，从环境特异植物海州香薷的花叶中，分离得到假荆芥属苷、高车前苷、芹菜素-7-O-β-D-糖苷产品，纯度均高于95％。
本发明人在长期的海州香薷植物的研究过程中发现，海州香薷中有3种天然黄酮苷成分：假荆芥属苷、高车前苷、芹菜素-7-O-β-D-糖苷；其中，假荆芥属苷和高车前苷均为首次发现于海州香薷植物内。至今为止，国内尚无报道关于从海州香薷植物中分离提取假荆芥属苷、高车前苷、芹菜素-7-O-β-D-糖苷的方法。
本发明的显著优点和效果：
本发明的海州香薷植物中提取分离假荆芥属苷、高车前苷、芹菜素-7-O-β-D-糖苷的方法，为天然植物黄酮苷类化合物，通过室温浸提，再以石油醚、乙酸乙酯、水饱和正丁醇深度萃取，大孔树脂粗分离、凝胶SephadexTM LH-20筛分、聚酰胺柱层析多次分离，得到的产物纯度较高，并结合半制备液相色谱分离精制。本发明中所提取到的假荆芥属苷和高车前苷，均是首次从海州香薷植物体内提取得到。
综上所述，本发明提供的海州香薷中提取分离假荆芥属苷、高车前苷、芹菜素-7-O-β-D-糖苷的方法，对环境特异植物海州香薷中天然活性成分的开发利用具有重要意义。采用本发明的方法能获取高纯度的假荆芥属苷、高车前苷、芹菜素-7-O-β-D-糖苷。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式做进一步详细说明。
图1为本发明的海州香薷中假荆芥属苷、高车前苷、芹菜素-7-O-β-D-糖苷提取分离流程图。
图2为本发明的假荆芥属苷的化学结构和HPLC/ESI-MS图。
图3是本发明的高车前苷化学结构和HPLC/ESI-MS图。
图4为本发明的芹菜素-7-O-β-D-糖苷的化学结构和HPLC/ESI-MS图。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。海州香薷中假荆芥属苷、高车前苷、芹菜素-7-O-β-D-糖苷提取分离流程如图1所示。
实施例1、本发明的海州香薷花叶的醇提/萃取、大孔树脂分离、凝胶柱筛分：
(1)醇提和液液萃取(即，浸提和萃取)：
将盛花期收获的海州香薷花枝和叶片风干(至含水量≤0.5％，重量％)后粉碎(粉碎至过60目筛)。取上述2kg样品，置于50L的塑料桶中，加入60％(V/V)乙醇30L，搅拌均匀至少浸泡30天，纱布过滤得滤液。将过滤所得的剩余残渣重复上述浸提过程2次。合并3次浸提所得的滤液；在40℃水浴加热条件下真空浓缩，得520g的粗浸膏；产率26.00％(干重计)。
将上述520g的浸膏用3000ml超纯水溶解，得溶解液；溶解液先用石油醚萃取3次(每次石油醚的用量为3000ml)；弃石油醚层(位于上层)，将3次的水层(位于下层)合并，得石油醚萃取后水层。将石油醚萃取后水层用乙酸乙酯萃取3次(每次乙酸乙酯的用量是3000ml)后，继续将3次的水层(位于下层)合并，得乙酸乙酯萃取后水层。将石油醚萃取后水层用水饱和正丁醇萃取3次(每次水饱和正丁醇层的用量是3000ml)；将3次的水饱和正丁醇萃取层(位于上层)合并后，40℃旋转蒸发回收正丁醇后，得到144g的深棕色浸膏，产率7.20％(干重)。
备注说明：水饱和正丁醇即为水饱和的正丁醇溶液。
(2)大孔树脂粗分离：
准备D101型大孔吸附树脂1200ml，用大量的蒸馏水冲洗后，装于层析柱(10cm×80cm)中，用体积浓度为95％的乙醇置换树脂柱中的水，并用上述乙醇浸泡过夜后，再用体积浓度为95％的乙醇以1.5BV/h的流速淋洗，至流出液与水按1:5比例混合无浑浊。再将上述D101型大孔吸附树脂中的乙醇用大量的蒸馏水冲干净，至流出液无醇味。
将所得144g的深棕色浸膏(水饱和正丁醇层提取物)，加超纯水制成400ml水溶液，加入上述洗干净的D101型大孔树脂层析柱的上部；使上述水溶液被充分吸收。
分别以1BV(BV指树脂床体积)的水、2BV的10％(V/V)乙醇、2BV的20％(V/V)乙醇、5BV的40％(V/V)乙醇、4BV的70％(V/V)乙醇、4BV的95％(V/V)乙醇对D101型大孔树脂进行梯度洗脱，流速控制在1.5BV/h；每瓶大约500ml，收集各瓶洗脱液。
将40％乙醇对应的洗脱液合并，在40℃的水浴加热下旋蒸浓缩，得黄棕色浸膏Ⅰ，质量是41.2g，得率为2.06％(干重)。
将70％乙醇溶液对应的洗脱液合并，在40℃的水浴加热下旋蒸浓缩，得黄棕色浸膏Ⅱ，质量是20.2g，得率为1.01％(干重)。
(3)凝胶柱筛分
取1200g的凝胶SephadexTM LH-20，用1000ml的100％甲醇浸泡过夜，加入层析柱(10cm×100cm)中，并加入超纯水反复置换甲醇至流出液无醇味。将处理好的凝胶层析柱以气泵加压，使其更加紧密，液面不低于凝胶柱床的高度。待加压至凝胶柱床高度保持不变后，用4BV的40％甲醇/水，以1BV/h的流速将凝胶柱中的甲醇全部置换为40％甲醇/水。
①、将41.2g的黄棕色浸膏Ⅰ(40％乙醇提取物)，用200ml的40％甲醇/水溶解，离心(11000转/分)取上清液，缓慢而均匀上样于凝胶柱顶端，用体积比浓度40％、70％、95％的甲醇/水溶液进行常压梯度洗脱，每梯度使用洗脱液2BV，流速均控制为1BV/h。洗脱流出液用聚酰胺薄层分析，以CH3OH:H2O:CH3COOH＝5:1:1的体积比为展开剂，质量浓度3％的FeCl3乙醇溶液显色为指示，根据显色斑点的分布情况，合并成份相似的洗脱液。具体如下：
收集第1～6瓶，25～45℃水浴加热旋蒸至干，得Fraction 1，为2.48g(为浸膏A)；
收集第7～8瓶，25～45℃水浴加热旋蒸至干，得Fraction 2，为2.76g(为浸膏B)；
收集第9～10瓶，25～45℃水浴加热旋蒸至干，得Fraction 3，为1.84g(为浸膏C)；
收集第11～14瓶，25～45℃水浴加热旋蒸至干，得Fraction 4，为6.88g(为浸膏D)。
浸膏B在甲醇中的溶解性较好，可以进行凝胶柱再筛分。
备注说明：每瓶约500ml。
表1
| 序号 | Fraction 1 | Fraction2 | Fraction 3 | Fraction 4 |
| 浸膏A | 浸膏B | 浸膏C | 浸膏D | |
| 重量(g) | 2.48 | 2.76 | 1.84 | 6.88 |
| 得率(％干重) | 0.124 | 0.138 | 0.092 | 0.344 |
| 保留时间(min) | 29.75 | 32.68 | 33.09 | 30.18 |
| 特殊紫外吸收值(nm) | 198/271/347 | 267/337 | 267/338 | 198/255/350 |
②将20.1g的黄棕色浸膏Ⅱ(70％乙醇提取物)，用100ml的70％甲醇/水完全溶解，样品溶液缓慢而均匀上样于凝胶柱顶端，用体积浓度70％、95％的甲醇/水溶液进行常压梯度洗脱，每梯度使用洗脱液2BV，流速均控制为1BV/h。洗脱流出液用聚酰胺薄层分析，以CH3OH:H2O:CH3COOH＝5:1:1的体积比为展开剂，质量浓度3％的FeCl3乙醇溶液显色为指示，根据显色斑点的分布情况，合并成份相似的洗脱液。具体如下：
收集第1～8瓶，25～45℃水浴加热旋蒸至干，得Fraction 5，为1.22g(为浸膏E)；
收集第9～10瓶，25～45℃水浴加热旋蒸至干，得Fraction 6，为0.65g(为浸膏F)；
收集第11～12瓶，25～45℃水浴加热旋蒸至干，得Fraction 7，为0.58g(为浸膏G)。
备注说明：每瓶约500ml。
表2
实施例2、本发明的海州香薷中假荆芥属苷、高车前苷、芹菜素-7-O-β-D-糖苷分离纯化
(1)假荆芥属苷的分离纯化
①凝胶柱再筛分：将50g的SephadexTM LH-20用200ml甲醇溶解，搅拌去气泡，常压装柱。将实施例1所得的0.69g的浸膏B(Fraction2)，用5ml的50％甲醇/水溶解，缓慢上样于凝胶柱顶端。以甲醇:水＝1:1的体积比为展开体系，进行常压过柱洗脱，共需洗脱液500ml，收集各瓶流出液(每50ml收集1管)，点板跟踪，以紫外灯365nm下显暗红色、质量浓度3％FeCl3溶液显深绿色两项指标为准，将Rf＝0.5(斑点在聚酰胺膜上的比移值)且为单一斑点的各管合并(即，将第4管～第6管进行合并)，25～45℃逐渐水浴升温旋蒸至干，得到假荆芥属苷粗品(Fraction 2.2)，即为浸膏B2，320mg，纯度为82％，得率为0.016％(干重)。
②半液相制备纯化：取上述假荆芥属苷粗品(浸膏B2)，色谱级甲醇20ml溶解后，采用安捷伦半制备液相制备纯化(Sepax amethyst C18-H色谱柱：21.2×250mm 5μm；流动相：40％甲醇/水；流速：10ml/min；单次用量为1ml；检测波长：230nm；检测时长：40min；收集时段：10～15min)。将制备后收集的对应纯化物的溶液，旋蒸(40℃)至干，得到黄色粉末(化合物A——假荆芥属苷)，约40mg，纯度为95％。
(2)高车前苷的分离纯化
①、聚酰胺柱粗分离：将50g的100目聚酰胺粉用250ml甲醇溶解，搅拌去气泡，加压装柱。将实施例1所得的1.22g的浸膏E(Fraction 5)用10ml甲醇溶解，加入到5g的聚酰胺粉中拌样，随即旋干后装样于柱顶端。以甲醇:水＝3:1的体积比为展开体系进行加压过柱洗脱，共需洗脱液500ml，流速为2BV/h；收集各瓶流出液(每25ml收集1管)，点板跟踪，以紫外灯365nm下显暗红色、质量浓度3％FeCl3溶液显深绿色两项指标为准，将Rf＝0.4(斑点在聚酰胺膜上的比移值)，且为单一斑点的各管合并(即，将第12管～16管合并)，25～45℃逐渐水浴升温旋蒸至干，得到黄色粉末，0.47g。
②、聚酰胺柱再分离：将25g的100目聚酰胺粉用100ml二氯甲烷溶解，搅拌去气泡，加压装柱。将所得的0.47g的黄色粉末，用5ml甲醇溶解，并加入至2.5g的聚酰胺粉中拌样，旋干后将其装于柱顶端。以二氯甲烷:甲醇＝20:1的体积比为展开体系进行加压过柱洗脱，共需洗脱液300ml，流速为2BV/h；收集各瓶流出液(每20ml收集1瓶)，点板跟踪，以紫外灯365nm下显暗红色、3％FeCl3溶液显深绿色两项指标为准，将Rf＝0.6(斑点在聚酰胺膜上的比移值)，且为单一斑点的各管合并(即，将第3管～8管合并)，25～45℃逐渐水浴升温旋蒸至干，得到高车前苷粗品(Fraction 5.2)，即为浸膏E2，共0.19g，纯度80％，得率为0.010％(干重)。
③、将15g的100目聚酰胺粉用100ml二氯甲烷溶解，搅拌去气泡，加压装柱。取上述0.19g的高车前苷粗品(浸膏E2)，用3ml甲醇溶解，并加入至2.5g的聚酰胺粉中拌样，旋干后将其装于柱顶端。以二氯甲烷:乙酸乙酯＝5:1的体积比为展开体系进行加压过柱洗脱，共需洗脱液200ml，流速为2BV/h；收集各瓶流出液(每20ml收集1管)，点板跟踪，以紫外灯365nm下显暗红色、3％FeCl3溶液显深绿色两项指标为准，将Rf＝0.6(斑点在聚酰胺膜上的比移值)，且为单一斑点的各管合并(即，将第3管～8管合并)，25～45℃逐渐水浴升温旋蒸至干，得到黄色粉末(化合物B——高车前苷)，约12mg，纯度为95％。
(3)芹菜素糖苷的分离纯化
①将实施例1所得的0.58g的浸膏G(Fraction 7)，进行半制备液相分离(安捷伦半制备液相分析仪：色谱柱为Sepax amethyst C18-H，21.2×250mm 5μm，流动相为40％甲醇/水，流速10ml/min，用量为1ml；检测波长230nm；检测时长：40min；收集时段：10～15min)。制备分离后，得到Fraction 7.1(浸膏G1)和Fraction 7.2。
表3
②聚酰胺柱再精制：将50g的100目聚酰胺粉用250ml乙酸乙酯溶解，搅拌去气泡，加压装柱。将所得的100mg的浸膏G1用5ml甲醇溶解，并加入至1g的聚酰胺粉中拌样，旋干后将其装于柱顶端。以乙酸乙酯:甲醇＝5:1的体积比为展开体系，进行加压过柱洗脱，共需洗脱液400ml，流速为2BV/h；收集各管流出液(每20ml收集1管)，点板跟踪，以紫外灯365nm下显暗红色、3％FeCl3溶液显深绿色两项指标为准，将Rf＝0.6且为单一斑点的各管合并(即，第3管～8管合并)，25～45℃逐渐水浴升温旋蒸至干，得到黄色粉末(化合物D——芹菜素糖苷)，约12mg，产率0.0012％。纯度为98％。
实施例3、本发明的海州香薷中假荆芥属苷、高车前苷、芹菜素-7-O-β-D-糖苷化学结构鉴定
将实施例2中得到的黄色粉末的纯化物(化合物A——假荆芥属苷、B——高车前苷、C——芹菜素-7-O-β-D-糖苷)，分别用氘代DMSO溶解，测定核磁共振氢谱、碳谱、HPLC/ESI-MS质谱，用于鉴定结构。数据如下：
假荆芥属苷(纯度95％)：黄色粉末。紫外吸收最大峰λmax(nm)(甲醇)：270,344。IR(KBr,cm-1):3384(-OH),1357(苯环-OH),1267(苯环-OH),2925(糖苷饱和C-H),1650(C＝O),1602(苯环C＝C),1498(苯环C-H),1451,1400,1124,1069,1010,910,837,772。核磁共振氢谱、碳谱特征峰归属为：1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ(ppm):3.90(3H,s,6-OCH3),6.72(1H,s,H-3),6.87(1H,s,H-8),6.89(1H,d,J＝8.8Hz,H-5'),7.43(1H,s,H-2'),7.44(1H,d,J＝8.4Hz,H-6'),9.39(1H,s,OH-3'),10.00(1H,s,OH-4'),13.07(1H,s,OH-5),5.02(1H,d,J＝7.2Hz,H-1”),3.21-3.39(6H,m,H2”-H6”)；13C-NMR(125MHz,DMSO-d6)δ(ppm):164.9(s,C-2),102.6(s,C-3),182.2(s,C-4),152.4(s,C-5),132.3(s,C-6),158.9(s,C-7),95.1(s,C-8),152.6(s,C-9),104.5(s,C-10),121.7(s,C-1'),113.6(s,C-2'),150.1(s,C-3'),146.5(s,C-4'),116.4(s,C-5'),119.5(s,C-6'),57.0(C-6-OCH3),100.0(s,C-1”),74.7(s,C-2”),77.7(s,C-3”),70.5(s,C-4”),77.1(s,C-5”),60.7(s,C-6”)。HPLC-ESI/MS(图3)：m/z479.1[M+H]+，分子量478。
高车前苷(纯度95％)：黄色粉末。紫外吸收最大峰λmax(nm)(甲醇)：273,336。IR(KBr,cm-1):3384(-OH),1395(苯环-OH),1279(苯环-OH),2925(饱和C-H),1638(C＝O),1592(苯环C＝C),1451,1400,1124,1062,910,836,773。核磁共振氢谱、碳谱特征峰归属为：1HNMR(500MHz,DMSO-d6)δ(ppm):3.89(3H,s,6-OCH3),6.84(1H,s,H-3),6.93(1H,s,H-8),6.93(d,2H,J＝9.0Hz,H3',H5'),7.95(2H,d,J＝9.0Hz,H2',H6'),10.38(1H,s,OH-4'),13.05(1H,s,OH-5),5.03(1H,d,J＝7.1Hz,H-1”),3.16-3.58(6H,m,H2”-H6”)；13C-NMR(125MHz,DMSO-d6)δ(ppm):166.3(s,C-2),102.6(s,C-3),182.7(s,C-4),152.2(s,C-5),133.2(s,C-6),159.0(s,C-7),95.6(s,C-8),153.1(s,C-9),105.4(s,C-10),121.6(s,C-1'),129.0(d,C-2',C-6'),116.4(d,C-3',C-5'),161.7(s,C-4'),60.2(C-6-OCH3),100.7(s,C-1”),72.9(s,C-2”),77.8(s,C-3”),70.4(s,C-4”),75.9(s,C-5”),61.4(s,C-6”)。HPLC-ESI/MS：m/z461.10[M-H]-,463.20[M-H]+，分子量462。
芹菜素-7-O-β-D-糖苷(纯度98％)：黄色粉末。紫外吸收最大峰λmax(nm)(甲醇)：267,337；IR(KBr,cm-1):3423(-OH),1371(苯环-OH),1276(苯环-OH),2925(饱和C-H),1654(C＝O),1608(苯环C＝C),1498(苯环C-H),1451,1416,1176,1082,1050,1030,910,834,772。核磁共振氢谱、碳谱特征峰归属为：1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ(ppm):6.87(s,H-3),6.43(d,J＝2.2Hz,H-6),6.82(d,J＝2.2Hz,H-8),6.92(d,J＝8.6Hz,H-3',H-5'),7.94(d,J＝8.6Hz,H-2',H-6'),10.51(1H,s,OH-4'),12.97(1H,s,OH-5),5.06(d,J＝7.4Hz,H-1”),5.10(d,J＝3.9,12.5Hz,Ha-6”),5.05(dd,J＝3.9,12.5Hz,Hb-6”),3.21-3.47(6H,m,H2”-H6”)；13C-NMR(125MHz,DMSO-d6)(ppm)δ:163.4(s,C-2),103.5(s,C-3),182.5(s,C-4),157.4(s,C-5),100.0(s,C-6),164.7(s,C-7),95.3(s,C-8),161.9(s,C-9),105.8(s,C-10),121.4(s,C-1'),129.1(d,C-2',C-6'),116.5(d,C-3',C-5'),161.6(s,C-4'),100.3(s,C-1”),73.5(s,C-2”),77.6(s,C-3”),70.0(s,C-4”),76.9(s,C-5”),61.1(s,C-6”)。HPLC-ESI/MS：m/z 433.2[M-H]+/431.1[M-H]-，分子量432。
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
Claims (6)
1.提取分离海州香薷中假荆芥属苷浸膏、高车前苷浸膏和芹菜素糖苷浸膏的方法，其特征是依次包括以下步骤：
(1)、浸提和萃取：
将收获的海州香薷的花枝和叶片风干后粉碎，用体积浓度为60％的乙醇溶液浸提，所得提取液经浓缩后得粗浸膏；
将粗浸膏用超纯水溶解，得溶解液；将溶解液依次用石油醚、乙酸乙酯、水饱和正丁醇进行萃取，浓缩，得深棕色浸膏；
(2)、大孔树脂粗分离：
将所得的深棕色浸膏用超纯水溶解，制成水溶液，上样于D101大孔树脂，依次用水以及体积浓度为10％、20％、40％、70％和95％的乙醇溶液以1.4～1.6BV/h梯度进行洗脱分离；
收集40％乙醇溶液对应的洗脱液，浓缩，得黄棕色浸膏Ⅰ；
收集70％乙醇溶液对应的洗脱液，浓缩，得黄棕色浸膏Ⅱ；
所述深棕色浸膏与D101大孔树脂的用量比为：1g棕黑色浸膏/5～15ml D101大孔树脂；
所述每100ml水溶液中含有15～40g的深棕色浸膏；
所述水的用量为0.8～1.2BV，所述体积浓度为10％、20％、40％、70％和95％的乙醇溶液的用量分别为：1.8～2.2BV、1.8～2.2BV、4.8～5.2BV、3.8～4.2BV、3.8～4.2BV；
(3)、凝胶柱筛分：
①、将所得的黄棕色浸膏Ⅰ用40％甲醇/水溶液溶解，离心取上清液，得溶解状上样物Ⅰ；所述黄棕色浸膏Ⅰ与40％甲醇/水溶液的用量比为1g/2～5ml；
将所得的黄棕色浸膏Ⅱ用70％甲醇/水溶液溶解，得溶解状上样物Ⅱ；黄棕色浸膏Ⅱ与70％甲醇/水溶液的用量比为1g/2～5ml；
将溶解状上样物Ⅰ，均匀上样于凝胶柱顶端，用体积浓度为40％、70％、95％的甲醇/水溶液进行常压梯度洗脱；
将溶解状上样物Ⅱ，均匀上样于凝胶柱顶端，用体积浓度比为70％、95％的甲醇/水进行常压梯度洗脱；
所用每一种体积浓度洗脱液的量为相应柱床体积的2～4倍；流速均控制为1～1.5BV/h；
洗脱流出液用聚酰胺薄层分析，以甲醇:水:乙酸＝5:1:1的体积比为展开剂，通过质量浓度3％的FeCl3乙醇溶液显色指示，根据显色斑点分布情况，收集成份相似的洗脱液；
黄棕色浸膏Ⅰ经过上述凝胶柱筛分后，依次得到浸膏A、浸膏B、浸膏C、浸膏D；
黄棕色浸膏Ⅱ经过凝胶柱初筛分后，依次得到浸膏E、浸膏F、浸膏G；
浸膏B对应假荆芥属苷，浸膏E对应高车前苷，浸膏G对应芹菜素-7-O-β-D-糖苷；
浸膏B的保留时间为32.68min，浸膏E的保留时间为33.08min，浸膏G的保留时间为30.02min。
2.根据权利要求1所述的提取分离海州香薷中假荆芥属苷浸膏、高车前苷浸膏和芹菜素糖苷浸膏的方法，其特征是进一步地包括：将步骤(3)所得的浸膏B进行凝胶柱再筛分：
将50g SephadexTM LH-20填料用200ml甲醇溶解，搅拌去气泡，常压装柱；0.69g的浸膏B用5ml 50％甲醇/水溶解，上样于凝胶柱顶端；以甲醇:水＝1:1的体积比为展开体系进行常压过柱洗脱，共需洗脱液500ml，收集各瓶流出液，并用聚酰胺薄层点板跟踪，以紫外灯365nm下显暗红色、质量浓度3％FeCl3乙醇溶液显深绿色两项指标为准，将Rf＝0.5，且为单一斑点的各管合并，合并液旋蒸至干，得到假荆芥属苷粗品，即为浸膏B2。
3.根据权利要求2所述的提取分离海州香薷中假荆芥属苷浸膏、高车前苷浸膏和芹菜素糖苷浸膏的方法，其特征是进一步地包括：
将假荆芥属苷粗品，用甲醇溶解后，用安捷伦半制备液相色谱精制，采用Sepaxamethyst C18-H色谱柱21.2×250mm×5μm，流动相为40％甲醇/水，流速为10ml/min，单次用量为1ml，检测波长230nm，检测时长40min，收集时段为10～15min的馏分，旋蒸至干，得到假荆芥属苷纯品。
4.根据权利要求1所述的提取分离海州香薷中假荆芥属苷浸膏、高车前苷浸膏和芹菜素糖苷浸膏的方法，其特征是进一步地包括：
将步骤(3)所得的浸膏E，用甲醇溶解后加入聚酰胺粉中干法拌样，聚酰胺粉与浸膏E的重量比为2:1～4.2:1；旋干后的浸膏E拌样，上样在聚酰胺柱顶端，以甲醇:水＝3:1体积比的混合液为洗脱体系进行洗脱分离；收集各瓶流出液，点板跟踪，以365nm紫外灯照射显暗红色、质量浓度3％FeCl3乙醇溶液显黑色斑点两项指标为准，将Rf＝0.4且为单一斑点的组分合并，合并液旋蒸至干得到黄色粉末；
上述黄色粉末重复上样，以二氯甲烷:甲醇＝20:1的体积比为展开体系进行洗脱，收集各瓶流出液，点板跟踪，将Rf＝0.6且为单一斑点的各组分合并；合并液旋蒸至干，得到高车前苷粗品，即为浸膏E2。
5.根据权利要求4所述的提取分离海州香薷中假荆芥属苷浸膏、高车前苷浸膏和芹菜素糖苷浸膏的方法，其特征是进一步地包括：
高车前苷粗品再次上样，以二氯甲烷:乙酸乙酯＝8:1或5:1体积比的混合液作为洗脱体系进行洗脱分离；收集各管流出液，点板跟踪，将Rf＝0.6且为单一斑点的各组分合并；合并液旋蒸至干，得到高车前苷。
6.根据权利要求1所述的提取分离海州香薷中假荆芥属苷浸膏、高车前苷浸膏和芹菜素糖苷浸膏的方法，其特征是进一步地包括：步骤(3)所得的浸膏G，进行半制备液相分离；采用安捷伦半制备液相分析仪，色谱柱为Sepax amethyst C18-H，21.2×250mm×5μm，流动相为40％甲醇/水，流速10ml/min，用量为1ml，检测波长230nm，检测时长40min；收集时段为10～15min的馏分，制备分离后，得到浸膏G1；
将上述浸膏G1用甲醇溶解后，用聚酰胺柱层析，以乙酸乙酯:甲醇＝5:1体积比的混合液为洗脱体系；收集各管流出液，点板跟踪，以紫外灯365nm下显暗红色、3％FeCl3乙醇溶液显深绿色两项指标为准，将Rf＝0.6且为单一斑点的各组分合并；旋蒸至干，得到芹菜素-7-O-β-D-糖苷。
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