CN110357847A - 一种异黄烷类化合物及其制备方法和用途 - Google Patents

一种异黄烷类化合物及其制备方法和用途 Download PDF

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Abstract

本发明提供了式Ⅰ所示的化合物、或其立体异构体、或其药学上可接受的盐、或其溶剂合物、或其前体药物、或其代谢产物。本发明化合物为异黄烷类化合物，本发明异黄烷类化合物具有良好的抗肿瘤效果，特别是对于肺癌和乳腺癌的抗肿瘤效果良好。本发明异黄烷类化合物为临床上筛选和/或制备抗肿瘤药物，特别是抗肺癌和乳腺癌的药物提供了一种新的选择。

Description

一种异黄烷类化合物及其制备方法和用途
技术领域
本发明涉及化学医药领域，具体涉及一种异黄烷类化合物及其制备方法和用途。
背景技术
鸡血藤药材为豆科(Leguminosae)植物密花豆Spatholobus suberectus Dunn的干燥藤茎，为传统的活血化瘀中药，具有活血补血，调经止痛，舒筋活络的作用，临床上用于月经不调，痛经，经闭，风湿痹痛，麻木瘫痪，血虚萎黄。现代研究表明，鸡血藤的提取物和次级代谢产物能够抑制肿瘤细胞生长，黄酮类成分是鸡血藤的明确活性成分，已报道的黄酮类型有黄酮类、二氢黄酮类、异黄酮类、异黄烷类、二氢黄酮醇类、查耳酮类等，其中异黄烷类成分目前的报道较少。
鸡血藤总黄酮表现出的多种药理活性，包括防治心脑血管疾病、改善血液系统疾病、抗肿瘤作用及抗菌等作用。Wang Li-Xia等报道鸡血藤中的一个异黄烷成分对多种肿瘤细胞具有细胞毒作用。然而，目前从鸡血藤中分离得到的异黄烷类成分较少，具有抗肿瘤作用的报道则更为罕见。因此，从鸡血藤药材中分离提取出新的化合物并且以此为基础发现活性物质，具有重要的现实意义。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了一种异黄烷类化合物及其制备方法和用途。
本发明提供了式Ⅰ所示的化合物、或其立体异构体、或其盐、或其溶剂合物、或其前体药物、或其代谢产物：
其中，
R6为羟基；R7为甲氧基；
R8为羟基或甲氧基；
R1、R2、R3、R4、R5、R9、R10各自独立地选自氢、卤素、羟基、氨基、甲氧基，或相邻碳原子的两取代基组合成亚甲二氧基。
进一步地，R9、R10各自独立地选自氢、羟基、甲氧基，或R9、R10组合成亚甲二氧基。
进一步地，所述化合物如式Ⅱ所示：
其中，R9、R10各自独立地选自氢、甲氧基，或R9、R10组合成亚甲二氧基。
进一步地，所述化合物的结构式如下：
本发明还提供了一种前述的化合物A的制备方法，步骤如下：
a.取鸡血藤干燥饮片95％乙醇加热回流提取，减压浓缩，得到鸡血藤提取物，将其用热水混悬，采用乙酸乙酯萃取，减压浓缩，得到乙酸乙酯萃取部位；
b.步骤a所得的乙酸乙酯萃取部位经硅胶柱层析，依次以二氯甲烷：甲醇＝100:0、100:1、50:1、25:1、10:1、3:1、0:100(v/v)为洗脱剂进行梯度洗脱，取二氯甲烷：甲醇＝25:1(v/v)时的洗脱液，利用薄层色谱，收集展开剂为石油醚：乙酸乙酯＝2:1(v/v)薄层展开，Rf为0.20～0.80的相似流份，得F5；
c.取步骤b所得的F5，上聚酰胺色谱，依次以甲醇:水＝0:100、25:75、40:60、50:50、75:25、95:5(v/v)为洗脱剂进行梯度洗脱，取甲醇：水＝25:75、40:60、50:50(v/v)时的洗脱液，利用薄层色谱，收集展开剂为二氯甲烷：丙酮＝10:1(v/v)，Rf为0.40～0.80的相似的流份，得F5-2；
d.取步骤c所得的F5-2,经正相Sephadex LH-20柱色谱，以二氯甲烷：甲醇＝1:1(v/v)为洗脱剂，得到的洗脱液利用薄层色谱，收集展开剂为二氯甲烷：丙酮＝10:1(v/v)，Rf为0.35～0.80的相似的流份，得F5-2-2；
e.取步骤d所得的F5-2-2,经正相Sephadex LH-20柱色谱，以石油醚：二氯甲烷：甲醇＝2:2:1(v/v/v)为洗脱剂，得到的洗脱液利用薄层色谱，收集展开剂为二氯甲烷：乙酸乙酯＝30:1(v/v)，Rf为0.30～0.50的相似的流份，得F5-2-2-4；
f.取步骤e所得的F5-2-2-4，经反相Sephadex LH-20柱色谱，以70％甲醇水溶液为洗脱剂，得到的洗脱液利用薄层色谱，收集展开剂为二氯甲烷：乙酸乙酯＝30:1(v/v)，Rf为0.30～0.45的相似的流份，得F5-2-2-4-3；
g.取步骤f所得的F5-2-2-4-3，经正相Sephadex LH-20柱色谱，以二氯甲烷：甲醇＝1:1(v/v)为洗脱剂，得到的洗脱液利用薄层色谱，收集展开剂为二氯甲烷：乙酸乙酯＝10:1(v/v)，Rf为0.35～0.70的相似的流份，得F5-2-2-4-3-2；
h.取步骤g所得的F5-2-2-4-3-2，先经薄层色谱制备，以二氯甲烷：甲醇＝5:1(v/v)为展开剂，再采用半制备高效液相色谱纯化，以58％甲醇水溶液为洗脱剂，tR＝102.0min，分离得到化合物A。
进一步地，
步骤a中，所述95％乙醇用量为鸡血藤干燥饮片的6倍(v/w)；所述提取为提取3次，每次提取时间为3h；
和/或，步骤b中，所述梯度洗脱条件如下：
和/或，步骤c中，所述梯度洗脱的条件如下：
和/或，步骤d中，组分F5-2为5.4g时，收集所述洗脱剂二氯甲烷：甲醇＝1:1(v/v)的体积为0.18L；
和/或，步骤e中，组分F5-2-2为1.2g时，收集所述洗脱剂石油醚：二氯甲烷：甲醇＝2:2:1(v/v/v)的体积为0.10L；
和/或，步骤f中，组分为F5-2-2-4为0.3g时，收集所述洗脱剂70％甲醇水溶液的体积为0.15L；
和/或，步骤g中，组分为F5-2-2-4-3为0.10g时，收集所述洗脱剂二氯甲烷：甲醇＝1:1(v/v)的体积为0.10L。
本发明还提供了一种前述的化合物B的制备方法，步骤如下：
A.取鸡血藤干燥饮片95％乙醇加热回流提取，减压浓缩，得到鸡血藤提取物，将其用热水混悬，采用乙酸乙酯萃取，减压浓缩，得到乙酸乙酯萃取部位；
B.取步骤A所得的乙酸乙酯部位经硅胶柱层析，依次以二氯甲烷：甲醇＝100:0、100:1、50:1、25:1、10:1、3:1、0:100(v/v)为洗脱剂进行梯度洗脱，取二氯甲烷：甲醇＝25:1(v/v)时的洗脱液，利用薄层色谱，收集展开剂为石油醚：乙酸乙酯＝2:1(v/v)薄层展开，Rf为0.20～0.80的相似流份，得F5；
C.取步骤B所得的F5，上聚酰胺色谱，依次以甲醇:水＝0:100、25:75、40:60、50:50、75:25、95:5(v/v)为洗脱剂进行梯度洗脱，取甲醇：水＝25:75、40:60、50:50(v/v)时的洗脱液，利用薄层色谱，收集展开剂为二氯甲烷：丙酮＝10:1(v/v)，Rf为0.40～0.85的相似的流份，得F5-1；
D.取步骤C所得的F5-1,经溶剂二氯甲烷：甲醇＝1:1重结晶操作后，过滤，得到母液部分F5-1-2；
E.取步骤D所得的F5-1-2,经正相Sephadex LH-20柱色谱，以二氯甲烷：甲醇＝1:1(v/v)为洗脱剂，得到的洗脱液利用薄层色谱，收集展开剂为二氯甲烷：丙酮＝30:1(v/v)，Rf为0.20～0.90的相似的流份，得F5-1-2-4；
F.取步骤E所得的F5-1-2-4，经硅胶柱层析，依次以石油醚：乙酸乙酯＝20:1、10:1、5:1、1:1(v/v)为洗脱剂进行梯度洗脱，得到的洗脱液利用薄层色谱，收集展开剂为二氯甲烷：丙酮＝20:1(v/v)，Rf为0.40～0.60的相似的流份，得F5-1-2-4-3；
G.取步骤F所得的F5-1-2-4-3，先经薄层色谱制备，以二氯甲烷：甲醇＝20:1(v/v)为展开剂，再采用半制备高效液相色谱纯化，以80％甲醇水溶液为洗脱剂，tR＝30.4min，分离得到化合物B。
进一步地，
步骤A中，所述95％乙醇用量为鸡血藤干燥饮片的6倍(v/w)；所述提取为提取3次，每次提取时间为3h；
和/或，步骤B中，所述梯度洗脱条件如下：
和/或，步骤C中，所述梯度洗脱的条件如下：
和/或，步骤D中，所述重结晶操作次数为3次；
和/或，步骤E中，组分F5-1-2为1.9g时，收集所述洗脱剂二氯甲烷：甲醇＝1:1的体积为0.16L；
和/或，步骤F中，所述梯度洗脱的条件如下：
本发明还提供了一种前述的化合物C的制备方法，步骤如下：
I.取鸡血藤干燥饮片95％乙醇加热回流提取，减压浓缩，得到鸡血藤提取物，将其用热水混悬，采用乙酸乙酯萃取，减压浓缩，得到乙酸乙酯萃取部位；
II.取步骤I所得的乙酸乙酯部位经硅胶柱层析，依次以二氯甲烷：甲醇＝100:0、100:1、50:1、25:1、10:1、3:1、0:100(v/v)为洗脱剂进行梯度洗脱，取二氯甲烷-甲醇25:1(v/v)时的洗脱液，利用薄层色谱，收集展开剂为石油醚：乙酸乙酯＝2:1(v/v)薄层展开，Rf为0.20～0.80的相似流份，得F5；
III.取步骤II所得的F5，上聚酰胺色谱，依次以甲醇:水＝0:100、25:75、40:60、50:50、75:25、95:5(v/v)为洗脱剂进行梯度洗脱，取甲醇：水＝25:75、40:60、50:50(v/v)时的洗脱液，利用薄层色谱，收集展开剂为二氯甲烷：丙酮＝10:1(v/v)，Rf为0.40～0.85的相似的流份，得F5-1；
IV.取步骤III所得的F5-1,经溶剂二氯甲烷-甲醇＝1:1重结晶操作后，过滤，得到母液部分F5-1-2；
V.取步骤IV所得的F5-1-2,经正相Sephadex LH-20柱色谱，以二氯甲烷：甲醇＝1:1(v/v)为洗脱剂，得到的洗脱液利用薄层色谱，收集展开剂为二氯甲烷：丙酮＝30:1(v/v)，Rf为0.20～0.90的相似的流份，得F5-1-2-4；
VI.取步骤IV所得的F5-1-2-4，经硅胶柱层析，依次以石油醚：乙酸乙酯＝20:1、10:1、5:1、1:1(v/v)为洗脱剂进行梯度洗脱，得到的洗脱液利用薄层色谱，收集展开剂为二氯甲烷：丙酮＝20:1(v/v)，Rf为0.40～0.60的相似的流份，得F5-1-2-4-3；
VII.取步骤VI所得的F5-1-2-4-3，先经薄层制备色谱制备，以二氯甲烷：甲醇＝20:1(v/v)为展开剂，再采用半制备高效液相色谱纯化，以80％甲醇水溶液为洗脱剂，分离得到化合物C。
进一步地，
步骤I中，所述95％乙醇用量为鸡血藤干燥饮片的6倍(v/w)；所述提取为提取3次，每次提取时间为3h；
和/或，步骤II中，所述梯度洗脱条件如下：
和/或，步骤III中，所述梯度洗脱的条件如下：
和/或，步骤IV中，所述重结晶操作次数为3次；
和/或，步骤V中，组分F5-1-2为1.9g时，收集所述洗脱剂二氯甲烷：甲醇＝1:1的体积为0.16L；
和/或，步骤VI中，所述梯度洗脱的条件如下：
本发明还提供了前述的化合物、或其立体异构体、或其盐、或其溶剂合物、或其前体药物、或其代谢产物在制备抗肿瘤药物中的用途。
进一步地，所述肿瘤为肺癌、乳腺癌。
本发明还提供了一种药物，它是以前述的化合物、或其立体异构体、或其盐、或其溶剂合物、或其前体药物、或其代谢产物，加上药学上可接受的辅料制备而成的制剂。
本发明异黄烷类化合物具有良好的抗肿瘤效果，特别是对于肺癌和乳腺癌的抗肿瘤效果良好。本发明异黄烷类化合物为临床上筛选和/或制备抗肿瘤药物，特别是抗肺癌和乳腺癌的药物提供了一种新的选择。
本发明中，“相邻碳原子的两取代基组合成亚甲二氧基”是指取代基R6～R10所连的碳原子的任意两相邻碳原子的取代基组合形成的亚甲二氧基。
本发明中v/v和v/v/v均是指体积比，单位为mL/mL和mL/mL/mL；v/w是指体积质量比，单位为mL/g。
本发明中95％乙醇是指乙醇水溶液。
本发明化合物A～C不仅可以从鸡血藤中分离得到，也按照化学领域中常规的方法取代而制得，例如，苯基苄基酮途径等。
本发明的一种或多种化合物可以彼此联合使用，也可选择将本发明的化合物与任何其它的活性试剂结合使用。如果使用的是一组化合物，则可将这些化合物同时、分别或有序地对受试对象进行给药。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1为本发明化合物A的HRESIMS图；
图2为本发明化合物A的1H-NMR图；
图3为本发明化合物A的13C-NMR图；
图4为本发明化合物A的IR图；
图5为本发明化合物B的HRESIMS图；
图6为本发明化合物B的1H-NMR图；
图7为本发明化合物B的13C-NMR图；
图8为本发明化合物B的IR图；
图9为本发明化合物C的HRESIMS图；
图10为本发明化合物C的1H-NMR图；
图11为本发明化合物C的13C-NMR图；
图12为本发明化合物C的IR图。
具体实施方式
本发明具体实施方式中使用的原料、设备均为已知产品，通过购买市售产品获得。
1)药材
鸡血藤于2013年6月购于四川新荷花中药饮片股份有限公司，经成都中医药大学中药鉴定教研室龙飞博士鉴定为豆科崖豆藤属植物密花豆(SpatholobussuberectusDunn)的干燥藤茎。
2)试剂
柱层析硅胶，200～300目(试剂级)，购于青岛海洋硅胶干燥剂厂；
薄层层析硅胶G、GF254和H(化学纯)，购于青岛海洋硅胶干燥剂厂；
中压液相色谱仪：Búchi Gradient Former B-687，Rp C18，43-60μm；
Welch Ultimate XB-C18(10×250mm，5μm)半制备型柱；
Sephadex LH-20葡聚糖凝胶，购于瑞典Amersham公司；
GF254硅胶制备薄层，购于烟台江友硅胶开发有限公司；
石油醚、正己烷、二氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮、甲醇等分析纯试剂，购于成都科龙化工试剂厂。
3)主要仪器
Agilent 1220高效液相色谱仪(美国安捷伦)；
Waters Synapt G2HDMS高分辨飞行时间质谱(美国Waters)；
Bruker-AVIIIHD-600、Bruker-AVIIIHD-600核磁共振仪(瑞士Bruker)；
Agilent Cary 600FTIR红外光谱仪(美国安捷伦)；
Shimadzu UV-260紫外-可见分光光度仪(日本Shimadzu)；
安东帕MCP 200旋光测定仪(奥地利安东帕)；
BP211D十万分之一电子天平(瑞士Sartorius)；
R-210旋转蒸发器(瑞士BUCHI)；
DZG-6050型真空干燥箱(上海森信)。
实施例1、本发明化合物A(2',7-dihydroxy-4',8-dimethoxy isoflavanone；2',7-二羟基-4',8-二甲氧基异黄烷)的制备
1)成分的分离纯化
①药材的提取：取鸡血藤干燥饮片15kg，鸡血藤干燥饮片6倍量(v/w)的95％乙醇加热回流提取3次，每次提取3小时，提取后减压浓缩，得到鸡血藤提取物，将其用热水混悬，采用乙酸乙酯萃取，减压浓缩，得到乙酸乙酯萃取部位。
②采用硅胶柱层析色谱(200～300目，2.5kg，14×150cm)对所得的鸡血藤乙酸乙酯部位进行色谱分离，以不同体积比的二氯甲烷-甲醇(100:0～0:100)为流动相(洗脱剂)进行梯度洗脱，具体洗脱条件见表1，洗脱液经薄层色谱检测，合并组成相似的流份：取二氯甲烷-甲醇体积比为25:1时的洗脱液，利用薄层色谱，收集展开剂为石油醚：乙酸乙酯＝2:1(v/v)薄层展开，Rf为0.20～0.80的相似流份，得F5。
表1硅胶柱层析色谱的洗脱条件
表1的洗脱条件是按照不同体积比的洗脱剂从上到下的顺序依次收集相应体积的洗脱液，例如鸡血藤乙酸乙酯部位为100g，洗脱剂为二氯甲烷：甲醇＝100:0时，收集5L；洗脱剂为二氯甲烷：甲醇＝100:1时，收集10L；依次类推。故步骤②中“取二氯甲烷：甲醇＝25:1时的洗脱液”是经过表1中在其上方的三种洗脱剂洗脱且收集相应洗脱体积后，再收集洗脱液为取二氯甲烷：甲醇＝25:1时的洗脱液30L。
③F5(48g)通过聚酰胺色谱，依次以甲醇:水＝0:100、25:75、40:60、50:50、75:25、95:5(v/v)为洗脱剂进行梯度洗脱，具体洗脱条件见表2，得到F5-1～F5-7共7个部分；取甲醇：水＝25:75、40:60、50:50(v/v)时的洗脱液，利用薄层色谱法，收集展开剂为二氯甲烷：丙酮＝10:1(v/v)，Rf为0.40～0.80的相似的流份，得F5-2。
表2聚酰胺色谱的洗脱条件
表2的洗脱条件是按照不同体积比的洗脱剂从上到下的顺序依次收集相应体积的洗脱液，例如组分F5为48g，洗脱剂为甲醇：水＝0:100时，收集8L；洗脱剂为甲醇：水＝25:75时，收集4.5L；依次类推。
④F5-2经正相Sephadex LH-20柱色谱，以二氯甲烷：甲醇(1:1，v/v)为洗脱剂，其中，组分F5-2为5.4g，收集0.18L洗脱液。得到的洗脱液利用薄层色谱，收集展开剂为二氯甲烷：丙酮＝10:1(v/v)，Rf为0.35～0.80的相似的流份，得F5-2-2。
F5-2-2经正相Sephadex LH-20柱色谱，以石油醚：二氯甲烷：甲醇＝2:2:1(v/v/v)为洗脱剂，其中，组分F5-2-2为1.2g，收集0.10L洗脱液。得到的洗脱液利用薄层色谱，收集展开剂为二氯甲烷：乙酸乙酯＝30:1(v/v)，Rf为0.30～0.50的相似的流份，得F5-2-2-4。
F5-2-2-4经反相Sephadex LH-20柱色谱，以70％甲醇水溶液为洗脱剂，其中，组分F5-2-2-4为0.3g，收集0.15L洗脱液。得到的洗脱液利用薄层色谱，收集展开剂为二氯甲烷：乙酸乙酯＝30:1(v/v)，Rf为0.30～0.45的相似的流份，得F5-2-2-4-3。
F5-2-2-4-3经正相Sephadex LH-20柱色谱，以二氯甲烷：甲醇＝1:1(v/v)为洗脱剂，其中，组分F5-2-2-4-3为0.10g，收集0.10L洗脱液。得到的洗脱液利用薄层色谱，收集展开剂为二氯甲烷：乙酸乙酯＝10:1(v/v)，Rf为0.35～0.70的相似的流份，得F5-2-2-4-3-2。
F5-2-2-4-3-2先经薄层色谱(展开剂为二氯甲烷：甲醇＝5:1(v/v))制备，再采用半制备高效液相色谱(洗脱剂为58％甲醇水溶液，tR＝102.0min)纯化，分离得到化合物A。
2)目标化合物的鉴定
化合物A为淡白色粉末。-7.85(c＝0.051,MeOH)。HR-ESI-MS给出准分子离子峰m/z 325.1052[M+Na]+，提示分子式为C17H18O5(calcd for C17H18O5Na,325.1052)，见图1。IR光谱显示有2920、2851、1740、1462、1165、1039、959、794cm-1，见图4。根据图2中化合物A的1HNMR谱显示的信号，可归属于一个1,2,3,4-四取代苯环[δH6.72(d,8.4Hz)和6.51(d,8.4Hz)]、一个1',2',4'-三取代苯环[δH 7.01(d,8.4Hz),6.48(dd,8.4,2.4Hz)和6.36(d,2.4Hz)]、两个甲氧基[δH 3.91(s)和3.77(s)]、一个连氧亚甲基[δH4.44(ddd,10.2,3.6,1.8Hz),4.07(t,10.2Hz)]、一个亚甲基[δH3.02(ddd,15.6,10.8,1.2Hz)和2.90(ddd,15.6,4.8,1.8Hz)]和一个次甲基(δH3.51m)(见表3)。结合图3中13C NMR谱显示17个碳信号(表4)，在δC 30～32ppm有2个碳信号，在δC 55～62ppm有2个碳信号，在δC 70.1ppm有1个碳信号，在δC 102～160之间共有12个碳信号，其中包含7个季碳，5个次甲基，以上信号说明化合物A为1个异黄烷类化合物。为确定取代基的位置，进一步通过2D NMR数据分析。化合物A的1H-1HCOSY谱显示了H-5'/H-6'，H-5/H-6，H2-2/H-3/H2-4具有相关信号，揭示了3个质子偶合体系。在HMBC谱中，H-2a与C-4,C-8a,C-1'相关；H-3与C-2,C-4,C-1',C-2',C-6'相关，表明2'位连有羟基；H-6'与C-3,C-2',C-4'相关，且OMe-4'与C-4'有相关，说明OMe-4'是连在C-4'上；通过H-5与C-4,C-7,C-8a有相关，以及H-6与C-5a,C-7,C-8有相关，可以确定OH连在C-7位上，OMe-8连在C-8位上。最终，确定化合物A的结构，命名为2',7-二羟基-4',8-二甲氧基异黄烷。
因此，本发明新化合物的化学结构得到了确定，如式A所示：
进行核磁共振氢谱(1H-NMR)：Bruker-AVIII HD-600spectrometer测定后，数据见表3。
表3化合物A～C的1H NMR核磁数据
(测定溶剂：aCDCl3；δ：ppm；J：Hz)
进行核磁共振碳谱(13C-NMR)：Bruker-AVIII HD-600spectrometer测定后数据见表4。
表4化合物A～C的13C NMR(150MHz)核磁数据
(测定溶剂：aCDCl3；δ：ppm；J：Hz)
实施例2、本发明化合物B(7-hydroxy-2',4',8-trimethoxy isoflavanone；7-羟基-2',4',8-三甲氧基异黄烷)的制备
1)成分的分离纯化
①药材的提取：按照实施例1中①的提取方法得到乙酸乙酯萃取部位。
②按照实施例1中步骤②的方法，得到F5。
③F5(48g)通过聚酰胺色谱，依次以甲醇:水＝0:100、25:75、40:60、50:50、75:25、95:5(v/v)为洗脱剂进行梯度洗脱，具体洗脱条件见表5，得到F5-1～F5-7共7个部分；取甲醇：水＝25:75、40:60、50:50(v/v)时的洗脱液，利用薄层色谱法，收集展开剂为二氯甲烷：丙酮＝10:1(v/v)，Rf为0.40～0.85的相似的流份，得F5-1。
表5聚酰胺色谱的洗脱条件
表5的洗脱条件是按照不同体积比的洗脱剂从上到下的顺序依次收集相应体积的洗脱液，例如组分F5为48g，洗脱剂为甲醇：水＝0:100时，收集8L；洗脱剂为甲醇：水＝25:75时，收集4.5L；依次类推。
④F5-1经溶剂二氯甲烷：甲醇＝1:1(v/v)重结晶操作3次后，过滤，得到母液部分F5-1-2。
F5-1-2经正相Sephadex LH-20柱色谱，以二氯甲烷：甲醇＝1:1(v/v)为洗脱剂，其中，组分F5-1-2为1.9g，收集0.16L洗脱液。得到的洗脱液利用薄层色谱，收集展开剂为二氯甲烷：丙酮＝30:1(v/v)，Rf为0.20～0.90的相似的流份，得F5-1-2-4。
F5-1-2-4(0.8g)经硅胶柱层析，依次以石油醚：乙酸乙酯＝20:1、10:1、5:1、1:1(v/v)为洗脱剂进行梯度洗脱，具体洗脱条件见表6，得到的洗脱液利用薄层色谱，收集展开剂为二氯甲烷：丙酮＝20:1(v/v)，Rf为0.40～0.60的相似的流份，得F5-1-2-4-3。
表6硅胶柱色谱的洗脱条件
表6的洗脱条件是按照不同体积比的洗脱剂从上到下的顺序依次收集相应体积的洗脱液，例如组分F5-1-2-4为0.8g，洗脱剂为石油醚：乙酸乙酯＝20:1时，收集1.8L；洗脱剂为石油醚：乙酸乙酯＝10:1时，收集2.5L；依次类推。
⑤F5-1-2-4-3先经薄层色谱(展开剂为二氯甲烷：甲醇＝20:1(v/v))制备，再采用半制备高效液相色谱(洗脱剂为80％甲醇水溶液，tR＝30.4min)纯化，分离得到化合物B。
2)目标化合物的鉴定
化合物B为淡白色粉末，易溶于二氯甲烷、甲醇、丙酮等有机溶剂。-27.44(c＝0.076,MeOH)。IR光谱显示有3445、2938、2838、1613、1494、1462、1035、824、803cm-1，见图8。图5中，HR-ESI-MSm/z 339.1208[M+Na]+提示分子式为C18H20O5(calcd for C18H20O5Na,339.1208)，不饱和度为9。根据图6中化合物B的1H NMR谱信号，可看出有三个明显的甲氧基信号[δH 3.91(s),3.82(s)和3.80(s)]；结合1H NMR和图7的13C NMR数据提供信息(见表3、表4)可以看出，化合物B是化合物A的类似物，区别在于化合物B多了一个甲氧基，提示化合物B可能是化合物A的一个羟基被一个甲氧基取代。在1H-1H COSY谱中根据质子相关体系，可得到H2-2/H-3/H2-4、H-5/H-6和H-5'/H-6'相关片段。在HMBC谱中，H-3与C-2,C-4,C-1',C-2',C-6'相关，OMe-2'与C-2'相关，证明化合物B为A的基础上将OH-2'取代成OMe-2'。最终，确定化合物B的结构，命名为7-羟基-2',4',8-三甲氧基异黄烷。
因此，本发明新化合物的化学结构得到了确定，如式B所示：
核磁共振氢谱(1H-NMR)：Bruker-AVIII HD-600spectrometer测定，数据见表3。核磁共振碳谱(13C-NMR)：Bruker-AVIII HD-600spectrometer测定，数据见表4。
实施例3、本发明化合物C(7-hydroxy-2',8-dimethoxy-4',5'-methylenedioxyisoflavanone；7-羟基-2',8-二甲氧基-4',5'-亚甲二氧基异黄烷)的制备
1)成分的分离纯化
①药材的提取：按照实施例2中①的提取方法得到乙酸乙酯萃取部位。
②按照实施例2中步骤②的方法，得到F5。
③按照实施例2中步骤③的方法，得到F5-1。
④照实施例2中步骤④的方法，得到F5-1-2-4-3；
⑤F5-1-2-4-3先经薄层色谱(展开剂为二氯甲烷：甲醇＝20:1(v/v))纯化，再采用半制备高效液相色谱(洗脱剂为80％甲醇水溶液，tR＝27.9min)纯化，分离得到化合物C。
2)目标化合物的鉴定
化合物C为淡白色粉末，易溶于二氯甲烷、甲醇、丙酮等有机溶剂。+11.15(c＝0.023,MeOH)。IR光谱显示有3369、2919、2851、1739、1579、1466、1041、721cm-1，见图12。图9中，HR-ESI-MSm/z 353.1000[M+Na]+提示分子式为C18H18O6(calcd for C18H18O6Na,353.1001)，不饱和度为9。根据图10中化合物C的1H NMR谱信号，发现5个特征的氢谱信号[δH4.36(ddd,10,3.0,1.5Hz),4.00(t,10.0Hz),3.59(m),2.92(dd,15.5,5.5Hz)和2.86(dd,15.5,5.5Hz)]，表明化合物C也为一个异黄烷类化合物。结合1H NMR和图11的13C NMR数据提供信息(见表3、表4)可以看出，化合物C是化合物B的类似物，区别在于化合物C多了一个亚甲二氧基，提示化合物C可能是化合物B中的一个甲氧基与相邻碳的取代基组合成亚甲二氧基。在1H-1H COSY谱中根据质子相关体系，可得到H2-2/H-3/H2-4与H-5/H-6相关片段。在HMBC谱中，OCH2O-与C-4',C-5'相关，H-6'与C-3,C-2',C-4',C-5'，H-3'与C-1',C-2',C-4',C-5'相关，证明亚甲二氧基连接在C-4',C-5'位置上。最终，确定化合物C的结构，命名为7-羟基-2',8-二甲氧基-4',5'-亚甲二氧基异黄烷。
因此，本发明新化合物的化学结构得到了确定，如式C所示：
核磁共振氢谱(1H-NMR)：Bruker-AVIII HD-500spectrometer测定，数据见表3。核磁共振碳谱(13C-NMR)：Bruker-AVIII HD-600spectrometer测定，数据见表4。
以下用实验例的方式说明本发明的有益效果：
实验例1、本发明异黄烷类化合物的抗肺癌A549活性试验
①、细胞接种
用0.25％胰酶消化对数生长期的A549肿瘤细胞。用含10％FBS的RPMI-1640培养基培养配成单细胞悬液。采用细胞计数板计数，将状态良好的A549肿瘤细胞接种于96孔板，使细胞密度为4×103个/mL，每孔加入细胞悬液100μL，置于37℃，5％CO2培养箱内培养24h。
②、药物处理
每个样品从100μM开始，用培养基梯度稀释样品，2倍稀释，设置5个药物浓度，每个浓度做复孔测试。以浓度为100、50、25、12.5、6.25μM每孔加药100μL，每个浓度设3个复孔，重复3次。阴性对照组为含有适量DMSO的培养基溶液，空白对照组为不含细胞的培养基和溶媒。将96孔板放回培养箱，37℃作用72h。
③、显色及IC50的计算
72h作用完毕后，避光条件下每孔加入MTT溶液(5g/L)20μL，继续温育培养4h后，弃掉上清液，每孔加入150μL DMSO，置于摇床上慢速振摇10min，使甲瓒充分溶解后，用酶标仪测量570nm波长处的OD值，按下列公式计算增殖抑制率。
采用抑制率的计算公式进行计算，抑制率＝(1-待测OD值/空白组OD值)×100％。通过重复三次试验，计算得到3次抑制率的平均值，得到本发明实施例1所得化合物A在100μM时的抑制率为31.47％，本发明实施例2所得化合物B在100μM时抑制率为32.04％，本发明实施例3所得化合物C在100μM时抑制率为63.76％。
采用改良寇氏法IC50＝log-1[Xm-i(∑P-0.5)]进行计算，其中Xm：设计的最大浓度的对数值；i：各浓度倍比浓度的对数值；ΣP：各组生长抑制率之和；0.5：经验常数。通过重复三次试验，计算得到3个IC50值(保留两位小数)，求平均值。本发明实施例3所得化合物C的IC50值为68.38μM。
上述结果表明，本发明异黄烷类化合物，对肺癌细胞的增殖具有显著的抑制活性，能够用于治疗和/或预防肺癌，具有良好的临床应用前景。
实验例2本发明异黄烷类化合物的抗乳腺癌MDA-MB-231活性试验
①、细胞接种
用0.25％胰酶消化对数生长期的MDA-MB-231肿瘤细胞。用含10％FBS的DMEM细胞培养基培养配成单细胞悬液。采用细胞计数板计数，将状态良好的MDA-MB-231肿瘤细胞接种于96孔板，使细胞密度为4×103个/mL，每孔加入细胞悬液100μL，置于37℃，5％CO2培养箱内培养24h。
②、药物处理
每个样品从100μM开始，用培养基梯度稀释样品，2倍稀释，设置5个药物浓度，每个浓度做复孔测试。以浓度为100、50、25、12.5、6.25μM每孔加药100μL，每个浓度设3个复孔，重复3次。阴性对照组为含有适量DMSO的培养基溶液，空白对照组为不含细胞的培养基和溶媒。将96孔板放回培养箱，37℃作用72h。
③、显色及IC50的计算
72h作用完毕后，避光条件下每孔加入MTT溶液(5g/L)20μL，继续温育培养4h后，弃掉上清液，每孔加入150μL DMSO，置于摇床上慢速振摇10min，使甲瓒充分溶解后，用酶标仪测量570nm波长处的OD值，按下列公式计算增殖抑制率。
采用抑制率的计算公式进行计算，抑制率＝(1-待测OD值/空白组OD值)×100％。通过重复三次试验，计算得到3次抑制率的平均值，得到本发明实施例1所得化合物A无明显活性；本发明实施例2所得化合物B在100μM时抑制率为23.04％；本发明实施例3所得化合物C无明显活性。
上述结果表明，本发明的异黄烷类化合物，对MDA-MB-231乳腺癌细胞的增殖具有显著的抑制活性，能够用于治疗和/或预防乳腺癌，具有良好的临床应用前景。
实验例3本发明异黄烷类化合物的抗乳腺癌MCF-7活性试验
①、细胞接种
用0.25％胰酶消化对数生长期的MCF-7肿瘤细胞。用含10％FBS的DMEM细胞培养基培养配成单细胞悬液。采用细胞计数板计数，将状态良好的MCF-7肿瘤细胞接种于96孔板，使细胞密度为4×103个/mL，每孔加入细胞悬液100μL，置于37℃，5％CO2培养箱内培养24h。
②、药物处理
每个样品从100μM开始，用培养基梯度稀释样品，2倍稀释，设置5个药物浓度，每个浓度做复孔测试。以浓度为100、50、25、12.5、6.25μM每孔加药100μL，每个浓度设3个复孔，重复3次。阴性对照组为含有适量DMSO的培养基溶液，空白对照组为不含细胞的培养基和溶媒。将96孔板放回培养箱，37℃作用72h。
③、显色及IC50的计算
72h作用完毕后，避光条件下每孔加入MTT溶液(5g/L)20μL，继续温育培养4h后，弃掉上清液，每孔加入150μL DMSO，置于摇床上慢速振摇10min，使甲瓒充分溶解后，用酶标仪测量570nm波长处的OD值，按下列公式计算增殖抑制率。
采用抑制率的计算公式进行计算，抑制率＝(1-待测OD值/空白组OD值)×100％。通过重复三次试验，计算得到3次抑制率的平均值，得到本发明实施例1所得化合物A在100μM时抑制率为17.51％，，本发明实施例2所得化合物B在100μM时抑制率为59.26％，本发明实施例3所得化合物C在100μM时抑制率为51.61％。
采用改良寇氏法IC50＝log-1[Xm-i(∑P-0.5)]进行计算，其中Xm：设计的最大浓度的对数值；i：各浓度倍比浓度的对数值；ΣP：各组生长抑制率之和；0.5：经验常数。通过重复三次试验，计算得到3个IC50值(保留两位小数)，求平均值。得到本发明实施例2所得化合物B的IC50值为59.04μM，本实施例3所得化合物C的IC50值为为93.59μM。
上述结果表明，本发明的异黄烷类化合物，对MCF-7乳腺癌细胞的增殖具有显著的抑制活性，能够用于治疗和/或预防乳腺癌，具有良好的临床应用前景。
综上，本发明异黄烷类化合物具有良好的抗肿瘤效果，特别是对于肺癌和乳腺癌的抗肿瘤效果良好。本发明异黄烷类化合物为临床上筛选和/或制备抗肿瘤药物，特别是抗肺癌和乳腺癌的药物提供了一种新的选择。

Claims (13)

1.式Ⅰ所示的化合物、或其立体异构体、或其盐、或其溶剂合物、或其前体药物、或其代谢产物：
其中，
R6为羟基；R7为甲氧基；
R8为羟基或甲氧基；
R1、R2、R3、R4、R5、R9、R10各自独立地选自氢、卤素、羟基、氨基、甲氧基，或相邻碳原子的两取代基组合成亚甲二氧基。
2.根据权利要求1所述的化合物、或其立体异构体、或其盐、或其溶剂合物、或其前体药物、或其代谢产物，其特征在于：R9、R10各自独立地选自氢、羟基、甲氧基，或R9、R10组合成亚甲二氧基。
3.根据权利要求2所述的化合物、或其立体异构体、或其盐、或其溶剂合物、或其前体药物、或其代谢产物，其特征在于：所述化合物如式Ⅱ所示：
其中，R9、R10各自独立地选自氢、甲氧基，或R9、R10组合成亚甲二氧基。
4.根据权利要求1～3任一项所述的化合物、或其立体异构体、或其盐、或其溶剂合物、或其前体药物、或其代谢产物，其特征在于：所述化合物的结构式如下：
5.一种权利要求4所述的化合物A的制备方法，其特征在于：步骤如下：
a.取鸡血藤干燥饮片95％乙醇加热回流提取，减压浓缩，得到鸡血藤提取物，将其用热水混悬，采用乙酸乙酯萃取，减压浓缩，得到乙酸乙酯萃取部位；
b.步骤a所得的乙酸乙酯萃取部位经硅胶柱层析，依次以二氯甲烷：甲醇＝100:0、100:1、50:1、25:1、10:1、3:1、0:100(v/v)为洗脱剂进行梯度洗脱，取二氯甲烷：甲醇＝25:1(v/v)时的洗脱液，利用薄层色谱，收集展开剂为石油醚：乙酸乙酯＝2:1(v/v)薄层展开，Rf为0.20～0.80的相似流份，得F5；
c.取步骤b所得的F5，上聚酰胺色谱，依次以甲醇:水＝0:100、25:75、40:60、50:50、75:25、95:5(v/v)为洗脱剂进行梯度洗脱，取甲醇：水＝25:75、40:60、50:50(v/v)时的洗脱液，利用薄层色谱，收集展开剂为二氯甲烷：丙酮＝10:1(v/v)，Rf为0.40～0.80的相似的流份，得F5-2；
d.取步骤c所得的F5-2,经正相Sephadex LH-20柱色谱，以二氯甲烷：甲醇＝1:1(v/v)为洗脱剂，得到的洗脱液利用薄层色谱，收集展开剂为二氯甲烷：丙酮＝10:1(v/v)，Rf为0.35～0.80的相似的流份，得F5-2-2；
e.取步骤d所得的F5-2-2,经正相Sephadex LH-20柱色谱，以石油醚：二氯甲烷：甲醇＝2:2:1(v/v/v)为洗脱剂，得到的洗脱液利用薄层色谱，收集展开剂为二氯甲烷：乙酸乙酯＝30:1(v/v)，Rf为0.30～0.50的相似的流份，得F5-2-2-4；
f.取步骤e所得的F5-2-2-4，经反相Sephadex LH-20柱色谱，以70％甲醇水溶液为洗脱剂，得到的洗脱液利用薄层色谱，收集展开剂为二氯甲烷：乙酸乙酯＝30:1(v/v)，Rf为0.30～0.45的相似的流份，得F5-2-2-4-3；
g.取步骤f所得的F5-2-2-4-3，经正相Sephadex LH-20柱色谱，以二氯甲烷：甲醇＝1:1(v/v)为洗脱剂，得到的洗脱液利用薄层色谱，收集展开剂为二氯甲烷：乙酸乙酯＝10:1(v/v)，Rf为0.35～0.70的相似的流份，得F5-2-2-4-3-2；
h.取步骤g所得的F5-2-2-4-3-2，先经薄层色谱制备，以二氯甲烷：甲醇＝5:1(v/v)为展开剂，再采用半制备高效液相色谱纯化，以58％甲醇水溶液为洗脱剂，tR＝102.0min，分离得到化合物A。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于：
步骤a中，所述95％乙醇用量为鸡血藤干燥饮片的6倍(v/w)；所述提取为提取3次，每次提取时间为3h；
和/或，步骤b中，所述梯度洗脱条件如下：
和/或，步骤c中，所述梯度洗脱的条件如下：
和/或，步骤d中，组分F5-2为5.4g时，收集所述洗脱剂二氯甲烷：甲醇＝1:1(v/v)的体积为0.18L；
和/或，步骤e中，组分F5-2-2为1.2g时，收集所述洗脱剂石油醚：二氯甲烷：甲醇＝2:2:1(v/v/v)的体积为0.10L；
和/或，步骤f中，组分为F5-2-2-4为0.3g时，收集所述洗脱剂70％甲醇水溶液的体积为0.15L；
和/或，步骤g中，组分为F5-2-2-4-3为0.10g时，收集所述洗脱剂二氯甲烷：甲醇＝1:1(v/v)的体积为0.10L。
7.一种权利要求4所述的化合物B的制备方法，其特征在于：步骤如下：
A.取鸡血藤干燥饮片95％乙醇加热回流提取，减压浓缩，得到鸡血藤提取物，将其用热水混悬，采用乙酸乙酯萃取，减压浓缩，得到乙酸乙酯萃取部位；
B.取步骤A所得的乙酸乙酯部位经硅胶柱层析，依次以二氯甲烷：甲醇＝100:0、100:1、50:1、25:1、10:1、3:1、0:100(v/v)为洗脱剂进行梯度洗脱，取二氯甲烷：甲醇＝25:1(v/v)时的洗脱液，利用薄层色谱，收集展开剂为石油醚：乙酸乙酯＝2:1(v/v)薄层展开，Rf为0.20～0.80的相似流份，得F5；
C.取步骤B所得的F5，上聚酰胺色谱，依次以甲醇:水＝0:100、25:75、40:60、50:50、75:25、95:5(v/v)为洗脱剂进行梯度洗脱，取甲醇：水＝25:75、40:60、50:50(v/v)时的洗脱液，利用薄层色谱，收集展开剂为二氯甲烷：丙酮＝10:1(v/v)，Rf为0.40～0.85的相似的流份，得F5-1；
D.取步骤C所得的F5-1,经溶剂二氯甲烷：甲醇＝1:1重结晶操作后，过滤，得到母液部分F5-1-2；
E.取步骤D所得的F5-1-2,经正相Sephadex LH-20柱色谱，以二氯甲烷：甲醇＝1:1(v/v)为洗脱剂，得到的洗脱液利用薄层色谱，收集展开剂为二氯甲烷：丙酮＝30:1(v/v)，Rf为0.20～0.90的相似的流份，得F5-1-2-4；
F.取步骤E所得的F5-1-2-4，经硅胶柱层析，依次以石油醚：乙酸乙酯＝20:1、10:1、5:1、1:1(v/v)为洗脱剂进行梯度洗脱，得到的洗脱液利用薄层色谱，收集展开剂为二氯甲烷：丙酮＝20:1(v/v)，Rf为0.40～0.60的相似的流份，得F5-1-2-4-3；
G.取步骤F所得的F5-1-2-4-3，先经薄层色谱制备，以二氯甲烷：甲醇＝20:1(v/v)为展开剂，再采用半制备高效液相色谱纯化，以80％甲醇水溶液为洗脱剂，tR＝30.4min，分离得到化合物B。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于：
步骤A中，所述95％乙醇用量为鸡血藤干燥饮片的6倍(v/w)；所述提取为提取3次，每次提取时间为3h；
和/或，步骤B中，所述梯度洗脱条件如下：
和/或，步骤C中，所述梯度洗脱的条件如下：
和/或，步骤D中，所述重结晶操作次数为3次；
和/或，步骤E中，组分F5-1-2为1.9g时，收集所述洗脱剂二氯甲烷：甲醇＝1:1的体积为0.16L；
和/或，步骤F中，所述梯度洗脱的条件如下：
9.一种权利要求4所述的化合物C的制备方法，其特征在于：步骤如下：
I.取鸡血藤干燥饮片95％乙醇加热回流提取，减压浓缩，得到鸡血藤提取物，将其用热水混悬，采用乙酸乙酯萃取，减压浓缩，得到乙酸乙酯萃取部位；
II.取步骤I所得的乙酸乙酯部位经硅胶柱层析，依次以二氯甲烷：甲醇＝100:0、100:1、50:1、25:1、10:1、3:1、0:100(v/v)为洗脱剂进行梯度洗脱，取二氯甲烷-甲醇25:1(v/v)时的洗脱液，利用薄层色谱，收集展开剂为石油醚：乙酸乙酯＝2:1(v/v)薄层展开，Rf为0.20～0.80的相似流份，得F5；
III.取步骤II所得的F5，上聚酰胺色谱，依次以甲醇:水＝0:100、25:75、40:60、50:50、75:25、95:5(v/v)为洗脱剂进行梯度洗脱，取甲醇：水＝25:75、40:60、50:50(v/v)时的洗脱液，利用薄层色谱，收集展开剂为二氯甲烷：丙酮＝10:1(v/v)，Rf为0.40～0.85的相似的流份，得F5-1；
IV.取步骤III所得的F5-1,经溶剂二氯甲烷-甲醇＝1:1重结晶操作后，过滤，得到母液部分F5-1-2；
V.取步骤IV所得的F5-1-2,经正相Sephadex LH-20柱色谱，以二氯甲烷：甲醇＝1:1(v/v)为洗脱剂，得到的洗脱液利用薄层色谱，收集展开剂为二氯甲烷：丙酮＝30:1(v/v)，Rf为0.20～0.90的相似的流份，得F5-1-2-4；
VI.取步骤IV所得的F5-1-2-4，经硅胶柱层析，依次以石油醚：乙酸乙酯＝20:1、10:1、5:1、1:1(v/v)为洗脱剂进行梯度洗脱，得到的洗脱液利用薄层色谱，收集展开剂为二氯甲烷：丙酮＝20:1(v/v)，Rf为0.40～0.60的相似的流份，得F5-1-2-4-3；
VII.取步骤VI所得的F5-1-2-4-3，先经薄层制备色谱制备，以二氯甲烷：甲醇＝20:1(v/v)为展开剂，再采用半制备高效液相色谱纯化，以80％甲醇水溶液为洗脱剂，分离得到化合物C。
10.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于：
步骤I中，所述95％乙醇用量为鸡血藤干燥饮片的6倍(v/w)；所述提取为提取3次，每次提取时间为3h；
和/或，步骤II中，所述梯度洗脱条件如下：
和/或，步骤III中，所述梯度洗脱的条件如下：
和/或，步骤IV中，所述重结晶操作次数为3次；
和/或，步骤V中，组分F5-1-2为1.9g时，收集所述洗脱剂二氯甲烷：甲醇＝1:1的体积为0.16L；
和/或，步骤VI中，所述梯度洗脱的条件如下：
11.权利要求1～4任一项所述的化合物、或其立体异构体、或其盐、或其溶剂合物、或其前体药物、或其代谢产物在制备抗肿瘤药物中的用途。
12.根据权利要求11所述的用途，其特征在于：所述肿瘤为肺癌、乳腺癌。
13.一种药物，其特征在于：它是以权利要求1～4任一项所述的化合物、或其立体异构体、或其盐、或其溶剂合物、或其前体药物、或其代谢产物，加上药学上可接受的辅料制备而成的制剂。
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