CN105859538B - 一种甘草查尔酮a的提纯方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种甘草查尔酮A的提纯方法，包括以下步骤：A)将粉碎的甘草与溶剂混合后进行回流提取，减压蒸出溶剂后，得到浓缩物；或，将粉碎的甘草进行水提，得到的去酸草渣与溶剂混合后进行回流提取，减压蒸出溶剂后，得到浓缩物；B)将所述浓缩物进入分离柱进行分离，再采用混合溶剂进行洗脱，将得到的洗脱物减压浓缩后得到甘草查尔酮A粗品；C)将所述甘草查尔酮A粗品与结晶溶剂混合，抽滤后干燥，得到甘草查尔酮A。本申请提供的甘草查尔酮A的提纯方法步骤简单，自原料至提取得到甘草查尔酮A，只需2天时间，生产周期短，且提取的甘草查尔酮A的含量与收率均较高。

Description

一种甘草查尔酮A的提纯方法

技术领域

本发明涉及分离纯化的技术领域，尤其涉及一种甘草查尔酮A的提纯方法。

背景技术

甘草查尔酮A是从甘草中提取的一种甘草黄酮，其在甘草中的含量为0.4％左右，结构式如下式所示：

甘草查尔酮A作为甘草黄酮的一种，其具有多种功效：(1)崔永明的研究表明甘草查尔酮A对鼠炎症具有明显的消炎作用，能显著抑制COX-2的合成和活性，且持续时间较长，其抑制作用强于阳性药吲哚美辛；(2)金黄色葡萄球菌是引起肠胃炎和食物中毒的治病原因之一，Jiazhang Qiu在实验研究中证明甘草查尔酮A对金黄色葡萄球菌的两个主要分泌物有抑制作用；(3)Lin Zhai用浓度依赖性方式，观察甘草查尔酮A可改变杜氏利什曼原虫鞭毛体和无鞭毛体的亚显微结构，由此表明，甘草查尔酮A通过抑制氧气的吸收和二氧化碳的排出，抑制寄生虫的呼吸，同时抑制寄生虫线粒体脱氢酶的活性，起到抗寄生虫的作用；(4)朱绍华通过比色法脂质过氧化物研究甘草查尔酮的抗脂质过氧化作用，由此表明，甘草查尔酮含量50～200mg/L时，可明显抑制家兔脑组织在温育下引起的丙二醛升高，对Fenton反应生成的羟基自由基清除率达68.3％，具有明显的抗自由基和抗氧化作用；(5)栾阳在浅表性膀胱癌治疗中，甘草查尔酮类物质能显著抑制膀胱癌细胞的增殖和转移，甘草查尔酮A能够提高膀胱癌T24细胞中活性氧的浓度，从而诱发氧化应激反应，进而抑制膀胱癌细胞的增殖；(6)李宏智对甘草查尔酮A对宫颈癌SiHa细胞的印制作用进行了细致研究，发现在5～50μg/ml的范围内，甘草查尔酮A浓度越大，抑制SiHa细胞增殖的作用越明显，5μg/ml的甘草查尔酮A对SiHa细胞的抑制率达到75.28％，相同浓度下化疗药物顺铂对SiHa细胞的抑制率仅为57.00％。由此可知，甘草查尔酮A在抗菌、消炎、抗氧化方面以及在抗肿瘤方面具有明显的作用，使甘草查尔酮A在保健品、食品、药品以及化妆品中均会有较广泛的应用。

但是，目前关于甘草查尔酮A的提取纯化报道较少，已知文献如下：(1)王淑杰等人将粉碎的甘草用95％乙醇浸提三次，每次24h，浓缩物用石灰水处理，并用大孔树脂梯度洗脱；洗脱液浓缩后，采用乙酸乙酯和5％的Na₂CO₃溶液反复萃取3～5次，过聚酰胺层析柱，再次浓缩后拌样过硅胶层析柱，再用甲苯、氯仿、丙酮的混合溶剂进行洗脱，可得纯度较高的甘草查尔酮A；(2)张娟等人把甘草渣的醇提物超声水溶，再采用大孔树脂梯度洗脱，所得的洗脱物用制备TLC进行分离，后用制备的HPLC进行分离，可得到6种单体黄酮，其中包含甘草查尔酮A；(3)王巧娥利用高速逆流色谱法也纯化出甘草查尔酮A，具体方法是将粉碎的甘草醇提3次，通过碱溶酸沉得到的棕黄色粉末，进行高速逆流色谱法分离，可得到纯度99％以上的甘草查尔酮A，可作为甘草查尔酮A的化学对照品的制备分离方法；(4)李国钟采用超临界萃取法萃取甘草查尔酮A，研发结果显示，只用CO₂溶剂，不用夹带剂时，仅可萃取出查尔酮A；使用CO₂-H₂O体系可以萃取出甘草查尔酮A和甘草查尔酮B；若使用用CO₂-H₂O-C₂H₅OH萃取体系，则萃取率明显提高，且随着乙醇浓度的增大，甘草查尔酮A和甘草查尔酮B的萃取率增大，温度及固液比均对萃取率有一定的影响。

上述几种制备甘草查尔酮A的方法为分离纯化甘草查尔酮A提供了很好的借鉴。但现存技术存在耗时长，生产成本高，步骤繁琐，未对原材料进行充分有效利用，无法大规模生产等缺点，关键是甘草查尔酮A的含量与纯度较低。

发明内容

本发明解决的技术问题在于提供一种甘草查尔酮A的提纯方法，采用本发明提供的方法提取的甘草查尔酮A的含量与纯度较高，进一步的，本申请提供的提纯方法耗时短，且步骤简单。

有鉴于此，本申请提供了一种甘草查尔酮A的提纯方法，包括以下步骤：

A)，将粉碎的甘草与溶剂混合后进行回流提取，减压蒸出溶剂后，得到浓缩物；

或，将粉碎的甘草进行水提，得到的去酸草渣与溶剂混合后进行回流提取，减压蒸出溶剂后，得到浓缩物；

B)，将所述浓缩物进入分离柱进行分离，再采用混合溶剂进行洗脱，将得到的洗脱物减压浓缩后得到甘草查尔酮A粗品；

C)，将所述甘草查尔酮A粗品与结晶溶剂混合，抽滤后干燥，得到甘草查尔酮A。

优选的，步骤A)中，所述溶剂选自甲醇、乙醇、甲酸乙酯、乙酸乙酯、二氯甲烷、二氧六环与丙酮中的一种或多种。

优选的，步骤B)中，所述混合溶剂包括第一溶剂与第二溶剂，所述第一溶剂选自石油醚、己烷、辛烷、苯、甲苯和二甲苯中的一种或多种，所述第二溶剂选自甲醇、乙醇、甲酸乙酯、乙酸乙酯、二氯甲烷、二氧六环和丙酮中的一种或多种。

优选的，所述第一溶剂与所述第二溶剂的体积比为1:1～10:1。

5、根据权利要求1～3任一项所述的提纯方法，其特征在于，步骤C)中，所述结晶溶剂选自甲醇、乙醇、丙酮、二氧六环、四氢呋喃、吡啶和二甲基甲酰胺中的一种或多种与水的混合物。

优选的，所述分离柱为硅胶与石油醚。

优选的，步骤B)中所述减压的温度为30～70℃。

优选的，所述回流提取的次数为2～3次。

本申请提供了一种甘草查尔酮A的提纯方法，其包括提取、分离与析晶的过程，其首先将粉碎的甘草与溶剂混合，进行回流提取，减压蒸出溶剂后，得到浓缩物与草渣，或将粉碎的甘草进行水提，得到的去酸草渣与溶剂混合后进行回流提取，减压蒸出溶剂后，得到浓缩物；然后将所述浓缩物进入分离柱进行分离，再采用混合溶剂进行洗脱，将得到的洗脱物减压浓缩后得到甘草查尔酮A粗品；将所述甘草查尔酮A粗品与结晶溶剂混合，抽滤，得到的滤饼冲洗干燥后得到甘草查尔酮A。本申请提供的甘草查尔酮A的提纯方法步骤简单，且自原料至提取得到甘草查尔酮A，只需2天时间，生产周期短，且提取的甘草查尔酮A的含量与收率均较高；进一步的，本申请通过提取、分离与析晶之后，将甘草中含量0.4％左右的甘草查尔酮A富集至含量75％以上。另外，本申请在提取甘草查尔酮A后的草渣，可继续进行甘草酸的提取，且不影响甘草酸及后续产品的质量，提高了甘草的利用率。

附图说明

图1为本发明甘草查尔酮A的提纯方法1的流程示意图；

图2为本发明甘草查尔酮A的提纯方法2的流程示意图。

具体实施方式

为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明优选实施方案进行描述，但是应当理解，这些描述只是为进一步说明本发明的特征和优点，而不是对本发明权利要求的限制。

本发明实施例公开了一种甘草查尔酮A的提纯方法，包括以下步骤：

A)，将粉碎的甘草与溶剂混合，进行回流提取，减压蒸出溶剂后，得到浓缩物与草渣；

或，将粉碎的甘草进行水提，得到的去酸草渣与溶剂混合后进行回流提取，减压蒸出溶剂后，得到浓缩物；

B)，将所述浓缩物进入分离柱进行分离，再采用混合溶剂进行洗脱，将得到的洗脱物减压浓缩后得到甘草查尔酮A粗品；

C)，将所述甘草查尔酮A粗品与结晶溶剂混合，抽滤后干燥，得到甘草查尔酮A。

本申请提供了一种甘草查尔酮A的提纯方法，在甘草查尔酮A的提纯的过程中，本申请将甘草依次进行了提取、分离与析晶，最终得到的含量与纯度均较高的甘草查尔酮A。

在甘草查尔酮A的分离纯化过程中，本申请首先进行了甘草查尔酮A的提取，具体的，将粉碎的甘草与溶剂混合后进行回流提取，减压蒸出溶剂后，得到浓缩物与草渣。在提取的过程中，为了将甘草查尔酮A充分提取出来，所述回流提取的次数优选为2～3次。所述回流提取与所述减压均为本领域技术人员熟知的技术手段，此处不进行特别的限制，具体的，本申请优选将粉碎后的甘草回流2h提取3次。所述溶剂优选为甲醇、乙醇、甲酸乙酯、乙酸乙酯、二氯甲烷、二氧六环和丙酮中的一种或多种。在实施例中，所述溶剂优选为甲酸乙酯、乙酸乙酯、甲醇、二氯甲烷或乙醇。此步骤中的溶剂可有效富集甘草中的甘草查尔酮A，使提取后的甘草中的甘草查尔酮A的含量由0.4％以上降至0.01％以下。此步骤得到的浓缩物继续进行后续的分离过程，而得到的草渣可进行甘草酸的提取，以提高甘草的利用率。如图1所示，图1为本发明甘草查尔酮A的上述提纯方法的流程示意图。

本申请得到浓缩物的过程还可按照下述方式进行：

将粉碎的甘草进行水提，得到的去酸草渣与溶剂混合后进行回流提取，减压蒸出溶剂后，得到浓缩物。

在上述过程中，首先将粉碎的甘草进行水提，得到去酸草渣与甘草酸，其中所述去酸草渣再与溶剂混合后进行回流提取，得到提取液与废草渣，将所述提取液进行浓缩，得到浓缩液。在上述过程中，所述水提为本领域技术人员熟知的技术手段，此处不进行特别的限制。在提取的过程中，为了将甘草查尔酮A充分提取出来，所述回流提取的次数优选为2～3次。所述回流提取与所述减压均为本领域技术人员熟知的技术手段，此处不进行特别的限制，具体的，本申请优选将粉碎后的甘草回流2h提取3次。所述溶剂优选为甲醇、乙醇、甲酸乙酯、乙酸乙酯、二氯甲烷、二氧六环和丙酮中的一种或多种。在实施例中，所述溶剂优选为乙酸乙酯。如图2所示，图2为上述过程的流程示意图。

本申请提供的甘草查尔酮A的提纯过程中，得到浓缩物的过程有上述区别外，其他步骤是相同的。

按照本发明，然后将所述浓缩物进行分离，所述分离的过程具体为：将所述浓缩物进入分离柱进行分离，再采用混合溶剂进行洗脱，将得到的洗脱物减压浓缩后得到甘草查尔酮A粗品。本申请所述分离柱优选为石油醚、苯和正己烷中的一种与硅胶，再对应采用石油醚、苯和正己烷进行冲柱。所述洗脱的洗脱液优选为第一溶剂与第二溶剂的混合溶剂，所述第一溶剂优选为石油醚、己烷、辛烷、苯、甲苯和二甲苯中的一种或多种，所述第二溶剂优选为甲醇、乙醇、甲酸乙酯、乙酸乙酯、二氯甲烷、二氧六环和丙酮中的一种或多种；在实施例中，所述混合溶剂优选为石油醚与甲酸乙酯的混合溶剂、石油醚与乙酸乙酯的混合溶剂、苯与甲醇的混合溶剂、正己烷与二氯甲烷的混合溶剂或石油醚与乙醇的混合溶剂。所述第一溶剂与所述第二溶剂的体积比优选为1:1～1:10。本申请中所述第一溶剂是溶解难溶或不溶的溶剂，第二溶剂是对甘草查尔酮A溶解性较好的溶剂，本申请优选将所述第一溶剂与所述第二溶剂复配之后可调节洗脱剂的极性，控制洗脱速度，达到有效分离的目的。

按照本发明，在所述甘草查尔酮A经过分离柱分离之后，再采用混合溶剂进行洗脱，为了保证甘草查尔酮的含量，本申请优选采用TLC检测洗脱液；在洗脱液中检测出甘草查尔酮A后，再采用混合溶剂再次进行洗脱至甘草查尔酮A收集完全。在收集完洗脱液之后，本申请则进行减压浓缩，得到甘草查尔酮A粗品。所述减压蒸馏为本领域技术人员熟知的技术手段，对此本申请没有特别的限制。

本申请最后将得到的甘草查尔酮A进行析晶，得到纯品甘草查尔酮A。具体为：将所述甘草查尔酮A粗品与结晶溶剂混合，抽滤后干燥，得到甘草查尔酮A。在上述过程中，所述抽滤与干燥均为本领域技术人员熟知的技术手段，对此本申请没有特别的限制。所述结晶溶剂优选选自甲醇、乙醇、丙酮、二氧六环、四氢呋喃、吡啶和二甲基甲酰胺中的一种或多种与水的混合物；在实施例中，所述结晶溶剂选自乙醇与水的混合物、甲醇和水的混合物、二氧六环和水的混合物或二甲基甲酰胺和水的混合物。所述甲醇、乙醇、丙酮、二氧六环、四氢呋喃、吡啶和二甲基甲酰胺中的一种或多种与水的质量比优选为1:0.5～1:5。本申请所述结晶溶剂对所述甘草查尔酮A具有一定的溶解性能，且与水混溶，甘草查尔酮A在水中不溶，混合后可实现甘草查尔酮A自有机溶剂中析晶并纯化。

本申请提供了一种甘草查尔酮A的提纯方法，在提纯的过程中，依次经过提取、分离与析晶的操作，实现了甘草查尔酮A的高效提取。本申请提供的甘草查尔酮A的提纯方法具有以下优点：

(1)利用率高，降低成本：提取甘草查尔酮A后的甘草渣，可继续进行甘草酸的提取，且不影响甘草酸及后续产品的质量，提高了甘草的利用率；

(2)生产周期短：从原料甘草到制备得到甘草查尔酮A产品，只需约2天时间；

(3)样品含量高：通过提取、分离、浓缩、析晶、精制五步简易操作，将甘草中含量0.4％左右的甘草查尔酮A富集至含量75％以上；

(4)重现性好：工艺简单，可以保证甘草查尔酮A分离的重现性和稳定性；

(5)对设备及试剂要求低：所用试剂常见易得，设备简单，工艺容易实现标准化、自动化，可以实现产业化生产。

为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明提供的甘草查尔酮A的分离纯化方法进行详细说明，本发明的保护范围不受以下实施例的限制。

实施例1

(1)提取：在可加热回流的提取罐中加入2Kg甘草，采用提取溶剂甲酸乙酯10Kg回流2h提取3次，采用1Kg甲酸乙酯冲洗一次，合并滤液及冲洗液，减压浓缩甲酸乙酯，得到的浓缩物备用；

(2)分离：在柱中加入石油醚3L和硅胶1.5Kg，再加入6L石油醚冲柱，将上述浓缩物上样，采用体积比4:1的石油醚和甲酸乙酯混合液洗脱，TLC监测所收集洗脱液至出现甘草查尔酮A后，更换为体积比2:1的石油醚和甲酸乙酯混合液继续洗脱至甘草查尔酮A组分收集完全，减压浓缩，得到甘草查尔酮A粗品22.5g；

(3)析晶：在上述甘草查尔酮A粗品中加入乙醇0.2Kg和水0.4Kg，搅拌2h，过滤，干燥，得到甘草查尔酮A 10.2g，含量70.5％，纯度为93.92％。

实施例2

(1)提取：在可加热回流的提取罐中加入2Kg甘草，采用提取溶剂乙酸乙酯10Kg回流2h提取3次，采用1Kg乙酸乙酯冲洗一次，合并滤液及冲洗液，减压浓缩乙酸乙酯，得到的浓缩物备用；

(2)分离：在柱中加入石油醚3L和硅胶1.5Kg，再加入6L石油醚冲柱，将上述浓缩物上样，采用体积比3:1的石油醚和乙酸乙酯混合液洗脱，TLC监测所收集洗脱液至出现甘草查尔酮A后，更换为体积比3:2的石油醚和乙酸乙酯混合液继续洗脱至甘草查尔酮A组分收集完全，减压浓缩，得到甘草查尔酮A粗品19g；

(3)析晶：在上述甘草查尔酮A粗品中加入甲醇0.2Kg和水0.5Kg，搅拌2h，过滤，干燥，得到甘草查尔酮A10g，含量76％，纯度为99.09％。

实施例3

(1)提取：在可加热回流的提取罐中加入2Kg甘草，采用提取溶剂甲醇10Kg回流2h提取3次，使用1Kg甲醇冲洗一次，合并滤液及冲洗液，减压浓缩甲醇，得到的浓缩物备用；

(2)分离：在柱中加入苯3L和硅胶1.5Kg，再加入6L苯冲柱，将上述浓缩物上样，采用体积比5:1的苯和甲醇混合液洗脱，TLC监测所收集洗脱液至出现甘草查尔酮A后，更换为体积比4:1的苯和甲醇混合液继续洗脱至甘草查尔酮A组分收集完全，减压浓缩，得到甘草查尔酮A粗品21g；

(3)析晶：在上述甘草查尔酮A粗品中加入二氧六环0.2Kg和水0.5Kg，搅拌2h，过滤，干燥得甘草查尔酮A9.8g，含量71％，纯度为95.57％。

实施例4

(1)提取：在可加热回流的提取罐中加入2Kg甘草，采用提取溶剂二氯甲烷10Kg回流2h提取3次，采用1Kg二氯甲烷冲洗一次，合并滤液及冲洗液，减压浓缩二氯甲烷，得到的浓缩物备用；

(2)分离：在柱中加入正己烷3L和硅胶1.5Kg，再加入6L正己烷冲柱，将上述得到的浓缩物上样，采用体积比6:1的正己烷和二氯甲烷混合液洗脱，TLC监测所收集洗脱液至出现甘草查尔酮A后，更换为体积比9:2的正己烷和二氯甲烷混合液继续洗脱至甘草查尔酮A组分收集完全，减压浓缩，得到甘草查尔酮A粗品24g；

(3)析晶：在上述甘草查尔酮A粗品中加入二甲基甲酰胺0.2Kg和水0.5Kg，搅拌2h，过滤，干燥，得到甘草查尔酮A9.3g，含量69％，纯度为94.03％。

实施例5

(1)提取：在可加热回流的提取罐中加入2Kg甘草，采用提取溶剂乙醇10Kg回流2h提取3次，使用1Kg乙醇冲洗一次，合并滤液及冲洗液，减压浓缩乙醇，得到的浓缩物备用；

(2)分离：在柱中加入石油醚3L和硅胶1.5Kg，再加入6L石油醚冲柱，将上述浓缩物上样，采用体积比8:1的石油醚和乙醇混合液洗脱，TLC监测所收集洗脱液至出现甘草查尔酮A后，更换为体积比6:1的石油醚和乙醇混合液继续洗脱至甘草查尔酮A组分收集完全，减压浓缩，得到甘草查尔酮A粗品24g；

(3)析晶：在上述甘草查尔酮A粗品中加入乙醇0.2Kg和水0.5Kg，搅拌2h，过滤，干燥，得到甘草查尔酮A10.1g，含量73％，纯度为98.17％。

实施例6

(1)提取：将甘草粉碎后进行水提甘草酸，所得的去酸草渣晾干后，取2Kg加入可加热回流的提取罐中，采用提取溶剂乙酸乙酯10Kg回流2h提取3次，采用1Kg乙酸乙酯冲洗一次，合并滤液及冲洗液，减压浓缩乙酸乙酯，得到的浓缩物备用；

(2)分离：在柱中加入石油醚3L和硅胶1.5Kg，再加入6L石油醚冲柱，将上述浓缩物上样，采用体积比3:1的石油醚和乙酸乙酯混合液洗脱，TLC监测所收集洗脱液至出现甘草查尔酮A后，更换为体积比3:2的石油醚和乙酸乙酯混合液继续洗脱至甘草查尔酮A组分收集完全，减压浓缩，得到甘草查尔酮A粗品20.5g；

(3)析晶：在上述甘草查尔酮A粗品中加入甲醇0.2Kg和水0.5Kg，搅拌2h，过滤，干燥，得到甘草查尔酮A10g，含量74.5％，纯度为98.14％。

以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (3)

1.一种甘草查尔酮A的提纯方法，包括以下步骤：

A），将粉碎的甘草与溶剂混合后进行回流提取，减压蒸出溶剂后，得到浓缩物；所述溶剂为甲酸乙酯、乙酸乙酯或二氯甲烷；

或，将粉碎的甘草进行水提，得到的去酸草渣与溶剂混合后进行回流提取，减压蒸出溶剂后，得到浓缩物；所述溶剂选自甲醇、甲酸乙酯、乙酸乙酯、二氯甲烷、二氧六环或丙酮；

B），将所述浓缩物进入分离柱进行分离，再采用混合溶剂进行洗脱，将得到的洗脱物减压浓缩后得到甘草查尔酮A粗品；所述混合溶剂包括第一溶剂与第二溶剂，所述第一溶剂选自己烷、辛烷、苯、甲苯和二甲苯中的一种或多种，所述第二溶剂选自甲醇、乙醇、甲酸乙酯、二氯甲烷和二氧六环中的一种或多种；所述第一溶剂与所述第二溶剂的体积比为3:1~8:1；所述分离柱为硅胶柱；

C），将所述甘草查尔酮A粗品与结晶溶剂混合，抽滤后干燥，得到甘草查尔酮A；所述结晶溶剂选自二氧六环、四氢呋喃、吡啶和二甲基甲酰胺中的一种或多种与水的混合物。

2.根据权利要求1所述的提纯方法，其特征在于，步骤B）中所述减压的温度为30~70℃。

3.根据权利要求1所述的提纯方法，其特征在于，所述回流提取的次数为2~3次。