CN115677581B - 一种伏毛铁棒锤中新乌头碱Aconflasin B的分离制备方法 - Google Patents
一种伏毛铁棒锤中新乌头碱Aconflasin B的分离制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种伏毛铁棒锤中新乌头碱Aconflasin B的分离制备方法。具体方法：提取、微孔树脂柱富集、Fr2的反相C18液相色谱富集、Fr2‑20的反相C18液相色谱分离及Fr2‑20‑5的反相C18液相色谱纯化五个步骤。制备方法中的提取溶剂、微孔树脂富集使用的溶剂、反相C18液相分离纯化溶剂及色谱分离材料均可以回收重复利用，保证了分离过程中平均成本比较低廉，一步中压分离和反相C18液相分离纯化可以保证产品的纯度大于98％；原料要求不高、成本低廉，全国种植广泛，易于批量备料；乙酸乙酯室温提取，易于操作；采用微孔树脂柱富集，该分离材料可以装于中压柱系统并接在制备液相色谱上，易于规模化；纯化中使用的反相C18液相色谱，为快速的等度方法，非常适宜大规模生产。
Description
技术领域
本发明涉及伏毛铁棒锤中乌头碱的分离制备技术领域，具体涉及一种伏毛铁棒锤中新乌头碱Aconflasin B的分离制备方法。
背景技术
伏毛铁棒锤(Aconitum flavum Hand.-Mazz.)属于毛茛科(Ranunculaceae)乌头属(Aconitum L.)植物。别名为断肠草、乌药和一支蒿等，是我国传统民族药材和民间中草药，具有活血祛瘀、止痛、祛风湿、消肿败毒、止血、治跌打损伤、风湿性关节炎、腰腿痛等功效。现代研究表明其化学成分主要含有生物碱类、糖类、黄酮类、甾体类等。现代药理毒理实验研究表明，生物碱类是伏毛铁棒锤的主要活性成分，具有较强的镇痛、局麻、解热、抗炎、抗肿瘤等多种药理作用。为了加快伏毛铁棒锤的种质资源评价和相关新药的研发步伐，发展其化学成分的高效制备方法，尤其规模化制备技术显得尤为重要。
关于伏毛铁棒锤化学成分研究的报道集中在生物碱类，2021年由Na Zhang等人(Zhang,N.,Xia,F.,Li,SY.et al.Diterpenoid Alkaloids from the Aerial Parts ofAconitum flavum Hand.-Mazz.Nat.Prod.Bioprospect.2021，11,421–429)分离出5个新的生物碱类化合物，此后并未见伏毛铁棒锤中新乌头碱的文献或专利报道。因此，亟需建立一种工艺简单、规模化从伏毛铁棒锤中分离制备新化合物的方法。
发明内容
基于上述技术问题，本发明的目的是提供一种伏毛铁棒锤中新乌头碱AconflasinB的分离制备方法。
本发明保护一种伏毛铁棒锤中新乌头碱Aconflasin B的分离制备方法，具体包括如下步骤：
步骤1，提取：将伏毛铁棒锤全草干燥，粗碎后按料液比1g：5～100mL的乙酸乙酯提取，在室温下提取2～4次，每次6～10h，过滤，合并滤液，即得滤液A，该滤液A按硅胶的量：伏毛铁棒锤药材的量＝1:5拌样并干燥，即得伏毛铁棒锤提取物拌样样品；
步骤2，微孔树脂富集：所述伏毛铁棒锤提取物拌样样品，该样品经装有微孔树脂的中压液相色谱分离，经检测波长为210nm的紫外检测器检测，收集制备色谱图中第二个主要的色谱峰馏分，该馏分经减压干燥即得目标组分Fr2；
步骤3，Fr2的反相C18液相色谱富集：所述含有目标成分的组分样品按料液比1g：5～50mL的甲醇溶解，过滤，得到滤液，即滤液B，该滤液B按硅胶的量：样品的量＝1:3拌样并干燥，即得伏毛铁棒锤组分Fr2拌样样品；该样品经装有反相C18的色谱柱分离，经检测波长为210nm的紫外检测器检测，收集制备色谱图中第二十个主要的色谱峰，该馏分经减压干燥即得目标组分Fr2-20；
步骤4，Fr2-20的反相C18液相色谱分离：所述含有目标成分的组分Fr2-20用甲醇溶解，配制样品浓度为0.5～1.0g/mL，经0.45μm微孔滤膜过滤，得到滤液，即滤液C，该滤液C经反相C18液相色谱分离，经检测波长为210nm的紫外检测器检测，收集滤液C反相色谱图中对应的色谱峰馏分Fr2-20-5，经减压干燥即得目标组分Fr2-20-5；
步骤5，Fr2-20-5的反相C18液相色谱纯化：所述含有目标成分的组分Fr2-20-5用甲醇溶解，配制样品浓度为100.0～150.0mg/mL，经0.45μm微孔滤膜过滤，得到滤液，即滤液D，该滤液D经反相C18液相色谱纯化，经检测波长为210nm的紫外检测器检测，收集滤液D反相色谱图中对应的色谱峰馏分Fr2-20-5-2，经减压干燥即得纯度大于98％的新乌头碱Aconflasin B；其中，化学结构式为：
进一步的，所述步骤2-5中，减压干燥的条件均为：真空度100～200mbar，温度40～55℃。
进一步的，所述步骤2中，微孔树脂柱的中压色谱分离工作参数为：色谱柱柱长460mm，直径15～49mm，微孔树脂柱固定相为CHP20P，流动相A为色谱纯水，B为甲醇，色谱条件为0～90min，0～100％B，单次进样量为10～50g，流速为10～57mL/min。
进一步的，所述步骤3中，所述反相C18液相色谱分离的工作参数为：色谱柱尺寸为250×20mm，固定相为5μm耐纯水的Reprosil-pur 120C18 AQ色谱柱填料，流动相A为色谱纯水，B为乙腈，色谱条件为0～60min，5～100％B，单次进样量为1～10g，流速为19mL/min。
进一步的，所述步骤4中，所述反相C18液相色谱分离的工作参数为：色谱柱尺寸为250×20mm，固定相为5μm耐纯水的Reprosil-pur 120C18 AQ色谱柱填料，流动相A为0.1％甲酸-水，B为甲醇，色谱条件为0～60min，30～85％B，进样体积为0.1～0.8mL，流速为19mL/min。
进一步的，所述步骤5中，反相C18液相色谱纯化的工作参数为：色谱柱尺寸为250×20mm，固定相为5μm的ACE Excel C18 PFP反相色谱柱填料，流动相A为0.1％甲酸-水，B为甲醇，色谱条件为0～40min，60％B，进样体积为0.1～0.8mL，流速为19mL/min。
相比于现有的技术，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明成本低廉、产品纯度高
使用的提取溶剂，微孔树脂富集使用的溶剂、反相C18液相分离纯化溶剂均可以回收利用；使用的色谱分离材料(微孔树脂)可以重复利用，回收利用的溶剂和重复利用的分离材料保证了分离过程中平均成本比较低廉，一步中压分离(微孔树脂柱富集)和反相C18液相分离纯化可以保证产品的纯度大于98％。
(2)本发明的制备方法可实现规模化生产需要
原料要求不高、成本低廉，全国种植广泛，易于批量备料；乙酸乙酯室温提取，易于操作；采用微孔树脂柱富集，该分离材料可以装于中压柱系统并接在制备液相色谱上，易于规模化；纯化中使用的反相C18液相色谱，为快速的等度方法，非常适宜大规模生产。
附图说明
图1为本发明样品的微孔树脂富集色谱图；
图2为本发明微孔树脂组分Fr2的反相C18液相富集色谱图；
图3为本发明目标组分Fr2-20的反相C18液相分离色谱图；
图4为本发明目标组分Fr2-20-5的反相C18液相纯化色谱图；
图5为本发明分离得到的新乌头碱Aconflasin B的纯度验证图；
图6为本发明制备得到的新乌头碱Aconflasin B的化学结构式；
图7为本发明分离得到的新乌头碱Aconflasin B的ESI+分子离子峰质谱图；
图8为本发明分离得到的新乌头碱Aconflasin B的1H NMR核磁图；
图9为本发明分离得到的新乌头碱Aconflasin B的13C NMR核磁图；
图10为本发明分离得到的新乌头碱Aconflasin B的HSQC图谱；
图11为本发明分离得到的新乌头碱Aconflasin B的HMBC图谱；
图12为本发明分离得到的新乌头碱Aconflasin B的H-HCOSY图谱；
图13为本发明分离得到的新乌头碱Aconflasin B的ROESY图谱；
图14为本发明分离得到的新乌头碱Aconflasin B的DEPT图谱；
图15为本发明分离得到的新乌头碱Aconflasin B的红外光谱图；
图16为本发明分离得到的新乌头碱Aconflasin B的紫外光谱图；
图17为本发明分离得到的新乌头碱Aconflasin B的旋光图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
一种伏毛铁棒锤中新乌头碱Aconflasin B的分离制备方法，具体包括如下步骤：
步骤1，提取：将370g伏毛铁棒锤全草干燥，粗碎后按料液比1g：10mL的乙酸乙酯提取，在室温下提取3次，每次6h，过滤，合并滤液，即得滤液A，该滤液A按硅胶的量：伏毛铁棒锤药材的量＝1:5拌样并干燥，即得伏毛铁棒锤提取物拌样样品共108.13g；
步骤2，微孔树脂富集：伏毛铁棒锤提取物拌样样品108.13g，该样品经装有微孔树脂的中压液相色谱分离，经检测波长为210nm的紫外检测器检测，收集制备色谱图(详见附图1)中第二个主要的色谱峰馏分，该馏分经减压干燥即得目标组分Fr2共15.07g；其中，减压干燥的条件为真空度100mbar，温度40℃；微孔树脂柱的中压色谱分离工作参数为：色谱柱柱长460mm，直径49mm，微孔树脂柱固定相为CHP20P，流动相A为色谱纯水，B为甲醇，色谱条件为0～90min，0～100％B，单次进样量为30g，流速为57mL/min；
步骤3，Fr2的反相C18液相色谱富集：所述含有目标成分的组分样品按料液比1g：5mL的甲醇溶解，过滤，得到滤液，即滤液B，该滤液B按硅胶的量：样品的量＝1:3拌样并干燥，即得伏毛铁棒锤组分Fr2拌样样品共60.2g；该样品经装有反相C18的色谱柱分离，经检测波长为210nm的紫外检测器检测，收集制备色谱图(详见附图2)中第二十个主要的色谱峰，该馏分经减压干燥即得目标组分Fr2-20共158.93mg；其中，减压干燥的条件为真空度100mbar，温度40℃；反相C18液相色谱分离的工作参数为：色谱柱尺寸为250×20mm，固定相为5μm耐纯水的Reprosil-pur120 C18 AQ色谱柱填料，流动相A为色谱纯水，B为乙腈，色谱条件为0～60min，5～100％B，单次进样量为4g，流速为19mL/min；
步骤4，Fr2-20的反相C18液相色谱分离：所述含有目标成分的组分Fr2-20用甲醇溶解，配制样品浓度为0.5g/mL，经0.45μm微孔滤膜过滤，得到滤液，即滤液C，该滤液C经反相C18液相色谱分离，经检测波长为210nm的紫外检测器检测，收集滤液C反相色谱图(详见附图3)中对应的色谱峰馏分Fr2-20-5，经减压干燥即得目标组分Fr2-20-5共10.71mg；其中，减压干燥的条件为真空度100mbar，温度40℃；反相C18液相色谱分离的工作参数为：色谱柱尺寸为250×20mm，固定相为5μm耐纯水的Reprosil-pur 120C18 AQ色谱柱填料，流动相A为0.1％甲酸-水，B为甲醇，色谱条件为0～60min，30～85％B，进样体积为0.5mL，流速为19mL/min；
步骤5，Fr2-20-5的反相C18液相色谱纯化：所述含有目标成分的组分Fr2-20-5用甲醇溶解，配制样品浓度为100.0mg/mL，经0.45μm微孔滤膜过滤，得到滤液，即滤液D，该滤液D经反相C18液相色谱纯化，经检测波长为210nm的紫外检测器检测，收集滤液D反相色谱图(详见附图4)中对应的色谱峰馏分Fr2-20-5-2，经减压干燥即得纯度大于98％的新乌头碱Aconflasin B，质量为1.06mg；其中，减压干燥的条件为真空度100mbar，温度40℃；反相C18液相色谱纯化的工作参数为：色谱柱尺寸为250×20mm，固定相为5μm的ACE Excel C18PFP反相色谱柱填料，流动相A为0.1％甲酸-水，B为甲醇，色谱条件为0～40min，60％B，进样体积为0.1mL，流速为19mL/min。其中新乌头碱Aconflasin B纯度验证图如附图5所示，其结构表征及结构见图6-17。核磁信号归属为：(c0.02,MeOH)；ESI-MS m/z:702.31[M+H]+,1H NMR(600MHz,CD3OD):δ3.31(1H,overlapped,1-H),1.27(1H,m,2-Ha),2.48(1H,m,2-Hb),4.87(1H,dd,J＝13.1,5.5Hz,3-H),2.55(1H,d,J＝6.9Hz,5-H),4.24(1H,d,J＝6.9Hz,6-H),2.69(1H,brs,7-H),2.91(1H,dd,J＝7.5,5.1Hz,9-H),2.39(1H,m,10-H),2.11(1H,dd,J＝15.0,12.8Hz,12-Ha),2.93(1H,dd,J＝15.0,5.5Hz,12-Hb),4.94(1H,d,J＝5.1Hz,14-H),4.51(1H,d,J＝5.5Hz,15-H),3.26(1H,d,J＝5.5Hz,16-H),4.19(1H,brs,17-H),3.12(1H,d,J＝9.0Hz,18-Ha),3.99(1H,d,J＝9.0Hz,18-Hb),2.87(1H,d,J＝14.2Hz,19-Ha),4.20(1H,d,J＝14.2Hz,19-Hb),2.35(3H,s,21-H),8.07(2H,d,J＝8.0Hz,2'-H,6'-H),7.51(2H,dd,J＝8.0,7.5Hz,3'-H,5'-H),7.64(1H,t,J＝7.5Hz,4'-H),3.28(3H,s,1-OCH3),3.22(3H,s,6-OCH3),3.71(3H,s,16-OCH3),3.23(3H,s,18-OCH3),2.05(3H,s,3-CH3CO),1.34(3H,s,8-CH3CO)。13C NMR(151MHz,CD3OD):δ173.4(C-8-CH3CO),173.0(C-20),171.9(C-3-CH3CO),167.4(C-7'),134.7(C-4'),131.2(C-1'),130.8(C-2',6'),129.9(C-3',5'),92.6(C-16),91.6(C-8),84.7(C-6),80.5(C-1),80.0(C-14,C-15),75.9(C-13),72.5(C-18),72.1(C-3),61.9(C-16-OCH3),59.2(C-18-OCH3),58.9(C-17),58.8(C-6-OCH3),56.0(C-1-OCH3),52.3(C-7),50.5(C-11),46.8(C-5),44.9(C-9),42.3(C-4),41.3(C-10),41.0(C-19),36.6(C-12),32.3(C-2),22.6(C-21),21.5(C-8-CH3CO),21.0(C-3-CH3CO)。
实施例2
一种伏毛铁棒锤中新乌头碱Aconflasin B的分离制备方法，具体包括如下步骤：
步骤1，提取：将3700g伏毛铁棒锤全草干燥，粗碎后按料液比1g：30mL的乙酸乙酯提取，在室温下提取2次，每次8h，过滤，合并滤液，即得滤液A，该滤液A按硅胶的量：伏毛铁棒锤药材的量＝1:5拌样并干燥，即得伏毛铁棒锤提取物拌样样品共1081.3g；
步骤2，微孔树脂富集：伏毛铁棒锤提取物拌样样品1081.3g，该样品经装有微孔树脂的中压液相色谱分离，经检测波长为210nm的紫外检测器检测，收集制备色谱图中第二个主要的色谱峰馏分，该馏分经减压干燥即得目标组分Fr2共150.7g；其中，减压干燥的条件为真空度150mbar，温度50℃；微孔树脂柱的中压色谱分离工作参数为：色谱柱柱长460mm，直径36mm，微孔树脂柱固定相为CHP20P，流动相A为色谱纯水，B为甲醇，色谱条件为0～90min，0～100％B，单次进样量为50g，流速为30mL/min；
步骤3，Fr2的反相C18液相色谱富集：所述含有目标成分的组分样品按料液比1g：10mL的甲醇溶解，过滤，得到滤液，即滤液B，该滤液B按硅胶的量：样品的量＝1:3拌样并干燥，即得伏毛铁棒锤组分Fr2拌样样品共602g；该样品经装有反相C18的色谱柱分离，经检测波长为210nm的紫外检测器检测，收集制备色谱图中第二十个主要的色谱峰，该馏分经减压干燥即得目标组分Fr2-20共1.59g；其中，减压干燥的条件为真空度150mbar，温度50℃；反相C18液相色谱分离的工作参数为：色谱柱尺寸为250×20mm，固定相为5μm耐纯水的Reprosil-pur 120C18 AQ色谱柱填料，流动相A为色谱纯水，B为乙腈，色谱条件为0～60min，5～100％B，单次进样量为10g，流速为19mL/min；
步骤4，Fr2-20的反相C18液相色谱分离：所述含有目标成分的组分Fr2-20用甲醇溶解，配制样品浓度为0.9g/mL，经0.45μm微孔滤膜过滤，得到滤液，即滤液C，该滤液C经反相C18液相色谱分离，经检测波长为210nm的紫外检测器检测，收集滤液C反相色谱图中对应的色谱峰馏分Fr2-20-5，经减压干燥即得目标组分Fr2-20-5共107.1mg；其中，减压干燥的条件为真空度150mbar，温度50℃；反相C18液相色谱分离的工作参数为：色谱柱尺寸为250×20mm，固定相为5μm耐纯水的Reprosil-pur 120C18 AQ色谱柱填料，流动相A为0.1％甲酸-水，B为甲醇，色谱条件为0～60min，30～85％B，进样体积为0.7mL，流速为19mL/min；
步骤5，Fr2-20-5的反相C18液相色谱纯化：所述含有目标成分的组分Fr2-20-5用甲醇溶解，配制样品浓度为150.0mg/mL，经0.45μm微孔滤膜过滤，得到滤液，即滤液D，该滤液D经反相C18液相色谱纯化，经检测波长为210nm的紫外检测器检测，收集滤液D反相色谱图中对应的色谱峰馏分Fr2-20-5-2，经减压干燥即得纯度大于98％的新乌头碱AconflasinB，质量为10.6mg；其中，减压干燥的条件为真空度150mbar，温度50℃；反相C18液相色谱纯化的工作参数为：色谱柱尺寸为250×20mm，固定相为5μm的ACE Excel C18PFP反相色谱柱填料，流动相A为0.1％甲酸-水，B为甲醇，色谱条件为0～40min，60％B，进样体积为0.5mL，流速为19mL/min。
实施例3
一种伏毛铁棒锤中新乌头碱Aconflasin B的分离制备方法，具体包括如下步骤：
步骤1，提取：将740g伏毛铁棒锤全草干燥，粗碎后按料液比1g：40mL的乙酸乙酯提取，在室温下提取4次，每次7h，过滤，合并滤液，即得滤液A，该滤液A按硅胶的量：伏毛铁棒锤药材的量＝1:5拌样并干燥，即得伏毛铁棒锤提取物拌样样品共216.26g；
步骤2，微孔树脂富集：伏毛铁棒锤提取物拌样样品108.13g，该样品经装有微孔树脂的中压液相色谱分离，经检测波长为210nm的紫外检测器检测，收集制备色谱图中第二个主要的色谱峰馏分，该馏分经减压干燥即得目标组分Fr2共30.14g；其中，减压干燥的条件为真空度180mbar，温度55℃；微孔树脂柱的中压色谱分离工作参数为：色谱柱柱长460mm，直径15mm，微孔树脂柱固定相为CHP20P，流动相A为色谱纯水，B为甲醇，色谱条件为0～90min，0～100％B，单次进样量为20g，流速为10mL/min；
步骤3，Fr2的反相C18液相色谱富集：所述含有目标成分的组分样品按料液比1g：8mL的甲醇溶解，过滤，得到滤液，即滤液B，该滤液B按硅胶的量：样品的量＝1:3拌样并干燥，即得伏毛铁棒锤组分Fr2拌样样品共120.5g；该样品经装有反相C18的色谱柱分离，经检测波长为210nm的紫外检测器检测，收集制备色谱图中第二十个主要的色谱峰，该馏分经减压干燥即得目标组分Fr2-20共318mg；其中，减压干燥的条件为真空度180mbar，温度55℃；反相C18液相色谱分离的工作参数为：色谱柱尺寸为250×20mm，固定相为5μm耐纯水的Reprosil-pur 120C18 AQ色谱柱填料，流动相A为色谱纯水，B为乙腈，色谱条件为0～60min，5～100％B，单次进样量为8g，流速为19mL/min；
步骤4，Fr2-20的反相C18液相色谱分离：所述含有目标成分的组分Fr2-20用甲醇溶解，配制样品浓度为0.8g/mL，经0.45μm微孔滤膜过滤，得到滤液，即滤液C，该滤液C经反相C18液相色谱分离，经检测波长为210nm的紫外检测器检测，收集滤液C反相色谱图中对应的色谱峰馏分Fr2-20-5，经减压干燥即得目标组分Fr2-20-5共21.42mg；其中，减压干燥的条件为真空度180mbar，温度55℃；反相C18液相色谱分离的工作参数为：色谱柱尺寸为250×20mm，固定相为5μm耐纯水的Reprosil-pur 120C18 AQ色谱柱填料，流动相A为0.1％甲酸-水，B为甲醇，色谱条件为0～60min，30～85％B，进样体积为0.6mL，流速为19mL/min；
步骤5，Fr2-20-5的反相C18液相色谱纯化：所述含有目标成分的组分Fr2-20-5用甲醇溶解，配制样品浓度为130.0mg/mL，经0.45μm微孔滤膜过滤，得到滤液，即滤液D，该滤液D经反相C18液相色谱纯化，经检测波长为210nm的紫外检测器检测，收集滤液D反相色谱图中对应的色谱峰馏分Fr2-20-5-2，经减压干燥即得纯度大于98％的新乌头碱AconflasinB，质量为2.12mg；其中，减压干燥的条件为真空度180mbar，温度55℃；反相C18液相色谱纯化的工作参数为：色谱柱尺寸为250×20mm，固定相为5μm的ACE Excel C18PFP反相色谱柱填料，流动相A为0.1％甲酸-水，B为甲醇，色谱条件为0～40min，60％B，进样体积为0.6mL，流速为19mL/min。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
Claims (6)
1.一种伏毛铁棒锤中新乌头碱Aconflasin B的分离制备方法，其特征在于，具体包括如下步骤：
步骤1，提取：将伏毛铁棒锤全草干燥，粗碎后按料液比1g：5～100mL的乙酸乙酯提取，在室温下提取2～4次，每次6～10h，过滤，合并滤液，即得滤液A，该滤液A按硅胶的量：伏毛铁棒锤药材的量＝1:5拌样并干燥，即得伏毛铁棒锤提取物拌样样品；
步骤2，微孔树脂富集：所述伏毛铁棒锤提取物拌样样品，该样品经装有微孔树脂的中压液相色谱分离，经检测波长为210nm的紫外检测器检测，收集制备色谱图中第二个主要的色谱峰馏分，该馏分经减压干燥即得目标组分Fr2；
步骤3，Fr2的反相C18液相色谱富集：所述含有目标成分的组分样品按料液比1g：5～50mL的甲醇溶解，过滤，得到滤液，即滤液B，该滤液B按硅胶的量：样品的量＝1:3拌样并干燥，即得伏毛铁棒锤组分Fr2拌样样品；该样品经装有反相C18的色谱柱分离，经检测波长为210nm的紫外检测器检测，收集制备色谱图中第二十个主要的色谱峰，该馏分经减压干燥即得目标组分Fr2-20；
步骤4，Fr2-20的反相C18液相色谱分离：所述含有目标成分的组分Fr2-20用甲醇溶解，配制样品浓度为0.5～1.0g/mL，经0.45μm微孔滤膜过滤，得到滤液，即滤液C，该滤液C经反相C18液相色谱分离，经检测波长为210nm的紫外检测器检测，收集滤液C反相色谱图中对应的色谱峰馏分Fr2-20-5，经减压干燥即得目标组分Fr2-20-5；
步骤5，Fr2-20-5的反相C18液相色谱纯化：所述含有目标成分的组分Fr2-20-5用甲醇溶解，配制样品浓度为100.0～150.0mg/mL，经0.45μm微孔滤膜过滤，得到滤液，即滤液D，该滤液D经反相C18液相色谱纯化，经检测波长为210nm的紫外检测器检测，收集滤液D反相色谱图中对应的色谱峰馏分Fr2-20-5-2，经减压干燥即得纯度大于98％的新乌头碱Aconflasin B；其中，化学结构式为：
2.根据权利要求1所述的一种伏毛铁棒锤中新乌头碱Aconflasin B的分离制备方法，其特征在于，所述步骤2-5中，减压干燥的条件均为：真空度100～200mbar，温度40～55℃。
3.根据权利要求1所述的一种伏毛铁棒锤中新乌头碱Aconflasin B的分离制备方法，其特征在于，所述步骤2中，微孔树脂柱的中压色谱分离工作参数为：色谱柱柱长460mm，直径15～49mm，微孔树脂柱固定相为CHP20P，流动相A为色谱纯水，B为甲醇，色谱条件为0～90min，0～100％B，单次进样量为10～50g，流速为10～57mL/min。
4.根据权利要求1所述的一种伏毛铁棒锤中新乌头碱Aconflasin B的分离制备方法，其特征在于，所述步骤3中，所述反相C18液相色谱分离的工作参数为：色谱柱尺寸为250×20mm，固定相为5μm耐纯水的Reprosil-pur 120 C18 AQ色谱柱填料，流动相A为色谱纯水，B为乙腈，色谱条件为0～60min，5～100％B，单次进样量为1～10g，流速为19mL/min。
5.根据权利要求1所述的一种伏毛铁棒锤中新乌头碱Aconflasin B的分离制备方法，其特征在于，所述步骤4中，所述反相C18液相色谱分离的工作参数为：色谱柱尺寸为250×20mm，固定相为5μm耐纯水的Reprosil-pur 120 C18 AQ色谱柱填料，流动相A为0.1％甲酸-水，B为甲醇，色谱条件为0～60min，30～85％B，进样体积为0.1～0.8mL，流速为19mL/min。
6.根据权利要求1所述的一种伏毛铁棒锤中新乌头碱Aconflasin B的分离制备方法，其特征在于，所述步骤5中，反相C18液相色谱纯化的工作参数为：色谱柱尺寸为250×20mm，固定相为5μm的ACE Excel C18 PFP反相色谱柱填料，流动相A为0.1％甲酸-水，B为甲醇，色谱条件为0～40min，60％B，进样体积为0.1～0.8mL，流速为19mL/min。
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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