CN102961428B - 八角莲提取物、含该提取物的药物组合物及其制法和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及八角莲提取物、含该提取物的药物组合物及其制备方法和用途。本发明的目的是提供一种化学成分明确较明确的八角莲提取物,含有活性成分总木脂素和总黄酮等,所得提取物杂质少,有效成分含量高。该八角莲提取物以提取物重量计含有鬼臼毒素20wt%~50wt%,山奈酚3wt%~8wt%,总黄酮8wt%~15wt%。本发明八角莲提取物中有效成分含量高、杂质少。八角莲提取物或含该提取物的药物组合物用于皮肤杀菌、治疗尖锐湿疣时,效果明确,副作用小。本发明制备方法与现有技术相比,具有工艺先进,大生产实用性强,成本相对较低、环境污染小的优点。
Description
技术领域
本发明涉及八角莲提取物、含该提取物的药物组合物及其制法和用途。
背景技术
八角莲分布于我国藏东南、川西、秦岭、淮河以南海拔300~1500米的山区。已知湖北、湖南、河南、四川、江西、安徽、浙江、广东、广西、云南、贵州、山西诸省均有分布,但每个地区的分布量不多。八角莲属是我国特有的属,约有12种1变种。多年来人们滥采乱挖的现象十分严重,目前该属几种植物已被列为国家三级保护珍稀濒危植物。
八角莲属类植物普遍含有鬼臼毒素等芳香四氢萘类木脂素,具有较强的抗肿瘤和抗病毒等活性。此类木脂素类化合物是八角莲的主要活性成分,包括鬼臼毒素(podophyllotoxin)、去氧鬼臼(deoxypodophyllotoxin)、苦鬼臼素葡萄糖苷(picropodophyllotoxin4-O-glucoside)、鬼臼毒素萄糖苷(podophyllotoxin4-O-glucoside)、鬼臼酮(podophyllotoxone)、异苦鬼臼毒素(isopicropodophyllone)、4-去甲基异鬼臼毒素(4-demethylisopodophyllotoxin)等。此外还有黄耆甙(Astragalin)、金丝桃甙(Hyperin)、槲皮素(quercetin)、山柰酚(Kaempferol)等黄酮类成分。以及β-谷甾醇(β-sitosterol)、胡萝卜苷(daucosterol)等甾体成分及多种微量元素即铁、铜、锌、锰、锶、硒、碘、铝、钴、镍等。
八角莲所含化合物具有抗病毒、抗菌、抗肿瘤、免疫等多种药理作用。八角莲中的山奈酚、山奈酚苷、槲皮素、苦鬼臼毒素与八角莲注射剂对CBV、HSV-1(I型单纯疱疹病毒)、CB1-6V(柯萨奇B组病毒1~6型)病毒均有抑制作用。鬼臼毒素能有效抑制疱疹病毒,抑制细胞中期的有丝分裂,可用于病毒性性病。观察了5种含鬼臼毒素成分的八角莲类中药八角莲、秕鳞八角莲、川八角莲及桃儿七和南方山荷叶根茎的50%甲醇及二氯甲烷提取物抗单纯疱疹病毒的作用,结果显示50%甲醇提取物中除川八角莲外,其余各种对单纯疱疹病毒皆有较好的抑制作用。二氯甲烷提取物除八角莲外,均因药物本身毒性太大而未显示抑制作用。研究表明,八角莲煎剂体外对金黄色葡萄球菌有一定的抑菌作用。
八角莲中主要有效成分之一鬼臼毒素有一定毒性。鬼臼毒素给猫灌服,能刺激胃肠道蠕动增强反应,引起呕吐、腹泻,甚至血便,导致严重衰竭性虚脱死亡。用鬼臼毒素注射液注入动物体内,能引起中枢神经系统抑制状态的表现:即抽搐、继之嗜睡、昏迷、瞳孔散大、呼吸麻痹、心跳停搏致死亡。
HSV(单纯疱疹病毒)的感染十分普遍,呈全球性分布。人是HSV唯一的自然宿主,主要通过直接密切接触和性接触传播。病毒可经口腔、呼吸道、生殖道粘膜和破损皮肤等多种 途径侵入机体,孕妇生殖道疱疹可在分娩时传染新生儿。两种不同血清型HSV的感染部位及临床表现各不相同,HSV-1主要引起咽炎、唇疱疹、角膜结膜炎,而HSV-2则主要导致生殖器疱疹。
八角莲中以木脂素为主的化学成分表现出对各种疱疹病毒的良好的抵抗作用,故考虑将此有效部位提炼出来,配合其黄酮类成分,制成如洗液等各种外用剂型。提取工艺经过创新改进,与传统中药水煎洗液相比,提取时弃去了大量无效杂质,降低了洗液使用的未知风险。产品在外观、气味、使用时肌肤感觉上更容易为消费者所接受。同时总木脂素和总黄酮协同作用,增效减毒,大大降低了鬼臼毒素类成分对皮肤的刺激作用。
公开号为CN1258530A、CN1418685A等多项专利以鬼臼毒素配比其它化学成分制成治疗皮肤疣的药物或消毒用品,公开号为CN1883622等专利以含八角莲的复方制成皮肤病的外用药。但尚无八角莲有效部位总木脂素和总黄酮制成药物或消毒用品的相关报道。
发明内容
本发明所解决的技术问题是提供一种化学成分较明确的八角莲提取物,含有活性成分总木脂素和总黄酮等,所得提取物杂质少,有效成分含量高。
本发明八角莲提取物,以提取物重量计含有鬼臼毒素20wt%~50wt%,山奈酚3wt%~8wt%,总黄酮8wt%~15wt%。
其中,所述八角莲为小檗科八角莲属植物八角莲Dysosm versipellis(Hance)、六角莲D.Pleiantha(Hance)或川八角莲D.veitchii(Hemsl.et Wis.)的根茎。
本发明所解决的第二个技术问题是提供本发明八角莲提取物的制备方法,通过控制混合有机溶剂的构成比例,以控制提取物内可测定有效成分的含量比例,得到了杂质少,有效成分含量高的八角莲提取物。
本发明八角莲提取物的制备方法步骤如下:
A、以八角莲为原料,以乙醇为提取溶剂,提取液浓缩后得浸膏a;
B、浸膏a用乙酸乙酯洗涤、过滤,浓缩滤液得浸膏b;
C、浸膏b用混合有机溶剂加热回流洗涤,过滤,浓缩滤液得浸膏c;
D、浸膏c干燥粉碎即得八角莲提取物;
其中,步骤C所述混合有机溶剂为低极性有机溶剂和中极性有机溶剂的混合溶剂,其中,所述低极性有机溶剂为石油醚、乙醚、正己烷、环己烷中的至少一种,中极性有机溶剂为丙酮、乙酸乙酯中的至少一种;进一步优选混合有机溶剂采用乙酸乙酯和环己烷的混合溶剂,其中乙酸乙酯和环己烷的体积比为1:1~4:1,优选体积比为2:1。
其中,步骤A中用乙醇提取时采用渗漉提取,乙醇用量为八角莲用量的6-10倍;乙醇用 量优选为八角莲用量的8倍。
步骤A所述乙醇浓度为至少90%v/v;乙醇浓度优选95%v/v。
八角莲在提取前粉碎至10-50目;优选粉碎至20目。
本发明所解决的第三个技术问题是提供一种含有权利要求1所述的八角莲提取物以及药学上可接受的辅料制成的药物组合物;所述药物组合物优选剂型为外用制剂;进一步优选外用制剂为洗液、软膏剂、凝胶剂。
本发明解决的第四个技术问题是提供本发明八角莲提取物和药物组合物的新用途,即八角莲提取物或药物组合物在制备具有皮肤杀菌功效的产品中的用途,具体可杀灭白色念珠球菌,大肠杆菌,金黄色葡萄球菌,外用可用于妇女外阴部的杀菌止痒。以及八角莲提取物或药物组合物在制备治疗尖锐湿疣的药物中的用途。
本发明八角莲提取物中有效成分含量高、杂质少。八角莲提取物或含该提取物的药物组合物用于皮肤杀菌、治疗尖锐湿疣时,效果明确,副作用小。本发明制备方法与现有技术相比,具有工艺先进,大生产实用性强,成本相对较低、环境污染小的优点。
具体实施方式
本发明八角莲提取物的制备方法步骤如下:
A、以八角莲为原料,以乙醇为提取溶剂,提取液浓缩后得浸膏a;
B、浸膏a用乙酸乙酯洗涤、过滤,浓缩滤液得浸膏b;
C、浸膏b用混合有机溶剂加热回流洗涤,过滤,浓缩滤液得浸膏c;
D、浸膏c干燥粉碎即得八角莲提取物。
本发明的关键在于采用了混合有机溶剂提取,减少提取物中的杂质含量,提高了有效成分在提取物中的含量比例。
混合有机溶剂为低极性有机溶剂和中极性有机溶剂的混合溶剂,其中,所述低极性有机溶剂为石油醚、乙醚、正己烷、环己烷中的至少一种,中极性有机溶剂为丙酮、乙酸乙酯中的至少一种。
以下实施例1-4是采用不同低极性有机溶剂和中极性有机溶剂得到的混合有机溶剂,考察提取物中各有效成分的含量及比例。
实施例1 八角莲提取物的制备
(1)八角莲药材10KG,粉碎为20目,用95%乙醇渗漉,回收乙醇。
(2)浸膏用乙酸乙酯洗涤过滤,滤液回收溶剂;浸膏用混合有机溶剂(乙酸乙酯:环己烷=2:1)加热回流洗涤,过滤。
(3)滤液回收溶剂,浸膏烘干粉碎,得八角莲提取物A522g,经HPLC法测定,提取 物中鬼臼毒素含量为33.2%,山奈酚含量为4.5%。经紫外分光光度法测得总黄酮含量为10.8%。
实施例2 八角莲提取物的制备
(1)八角莲药材1KG,粉碎为10目,用95%乙醇渗漉,回收乙醇。
(2)浸膏用乙酸乙酯洗涤过滤,滤液回收溶剂;浸膏用混合有机溶剂(石油醚:丙酮=1:1)加热回流洗涤,过滤。
(3)滤液回收溶剂,浸膏烘干粉碎,得八角莲提取物41g,经HPLC法测定,提取物中鬼臼毒素含量为49.5%,山奈酚含量为3.1%。经紫外分光光度法测得总黄酮含量为8.7%。
实施例3 八角莲提取物的制备
(1)八角莲药材1KG,粉碎为50目,用95%乙醇渗漉,回收乙醇。
(2)浸膏用乙酸乙酯洗涤过滤,滤液回收溶剂;浸膏用混合有机溶剂(丙酮:正己烷=2:1)加热回流洗涤,过滤。
(3)滤液回收溶剂,浸膏烘干粉碎,得八角莲提取物62g,经HPLC法测定,提取物中鬼臼毒素含量为25.2%,山奈酚含量为6.5%。经紫外分光光度法测得总黄酮含量为14.1%。
实施例4 八角莲提取物的制备
(1)八角莲药材1KG,粉碎为20目,用95%乙醇渗漉,回收乙醇。
(2)浸膏用乙酸乙酯洗涤过滤,滤液回收溶剂;浸膏用混合有机溶剂(乙酸乙酯:环己烷=1:2)加热回流洗涤,过滤。
(3)滤液回收溶剂,浸膏烘干粉碎,得八角莲提取物26g,经HPLC法测定,提取物中鬼臼毒素含量为29.2%,山奈酚含量为3.9%。经紫外分光光度法测得总黄酮含量为8.6%。
通过上述实施例1-4可见,采用上述方法所得八角莲提取物,以提取物重量计含有鬼臼毒素20wt%~50wt%,山奈酚3wt%~8wt%,总黄酮8wt%~15wt%。采用乙酸乙酯:环己烷=2:1(体积比)作为混合有机溶剂所得提取物的抗病毒实验最优,故优选乙酸乙酯:环己烷=2:1(体积比)。
实施例5 八角莲洗液的制备
取八角莲提取物干粉(按实施例1制备)80g,加热溶于1200ml吐温80中,加入丙二醇4000ml、卡松40g、乙氧基化烷基硫酸钠(AES)200g,加热搅拌至溶液清亮。逐步加入纯化水,边加边搅拌,加至溶液总体积为40L,分装,每瓶装200ml溶液,密封,得八角莲洗液样品199瓶。
实施例6 八角莲提取物杀菌试验
1、材料
供试样品:八角莲洗液(按实施例5制备)
大肠杆菌(8099)、金黄色葡萄球菌(ATCC6538)、白色念珠菌(ATCC10231)
中和剂:0.5%硫代硫酸钠+0.5%卵磷脂+0.5%甘氨酸+0.5%吐温-80的0.03mol/L的PBS溶液。
动物:由四川省实验动物专委会养殖场提供的健康、初成年的雌性家兔6只,体重2.0kg~2.3kg,生产许可证号:SCXK[川]2008-14.普通级,动物采用单笼喂养。
2、方法
2.1检验依据:《消毒技术规范》(2002年版)2.1.1.5.5中和剂悬液定量鉴定试验操作程序,2.1.1.9真菌杀灭试验,2.1.1.7.4悬液定量杀菌试验操作程序,2.2.3消毒产品稳定性测定(微生物法),2.3.5阴道粘膜刺激试验。
2.2中和剂鉴定试验:试验菌为金黄色葡萄球菌和白色念珠菌。试验用样浓度100%。试验温度20℃,重复次数3次。
2.3杀菌试验:白色念珠菌采用2.1.1.9真菌杀灭试验,大肠杆菌和金黄色葡萄球菌采用2.1.1.7.4悬液定量杀菌试验操作程序。试验用样浓度100%。试验温度20℃,重复次数3次。
2.4阴道刺激性试验:试验分染毒组及空白对照组,每组3只雌性家兔。操作程序参见《消毒技术规范》(2002年版)2.3.5.4。根据《消毒技术规范》(2002年版)中表2-16、2-17进行阴道粘膜刺激反应评分分级和强度分级。2.5稳定性实验:样品原包装PE瓶密封,于36℃恒温箱中放置90天。观察存放后对白色念珠菌杀灭效果变化。
3、结果:见表1。
3.1中和剂鉴定试验结果:试验表明,用0.5%硫代硫酸钠+0.5%卵磷脂+0.5%甘氨酸+0.5%吐温-80的0.03mol/L的PBS溶液作为中和剂,可有效中和该样品100%浓度对金黄色葡萄球菌和白色念珠菌的杀灭作用,且该中和剂及中和产物对受试细菌生长繁殖和培养基无影响。
3.2杀菌效果:试验表明,该样品100%浓度分别对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和白色念珠菌作用2min,平均杀灭率分别为88.3%、83.6%和83.35%,由此表明:本发明八角莲提取物可杀灭白色念珠球菌,大肠杆菌,金黄色葡萄球菌。外用可用于妇女外阴部的杀菌止痒。
表1 八角莲洗液对三种菌株的杀灭作用
阴性对照无菌生长
3.3阴道刺激性试验
试验组家兔阴道黏膜接触该洗液之后,肉眼观察未见充血和水肿。组织病理学检查结果,阴道黏膜刺激反应评分为0,属无刺激性。
3.4稳定性试验(微生物)
结果见表2,结果显示,该样品经36℃放置90天后,对白色念珠菌的杀灭效果与存放前基本一致。故该产品贮存有效期可定为两年。
表2 八角莲洗液存放后对白色念珠菌的杀灭效果
阳性对照组平均菌落数及范围:1.66×106(1.26×106~2.06×106)cfu/ml。
阴性对照无菌生长。
实施例7 八角莲提取物体外抗HSV-1作用
1.1材料:
八角莲提取物经过离子交换树脂处理,分别得到八角莲总木脂素提取物和八角莲总黄酮提取物:
取八角莲提取物(按实施例1制备),98%乙醇溶解,过D201型强碱性阴离子交换树脂,用树脂三倍体积的98%乙醇洗脱,收集洗脱液,回收溶剂,烘干,得到八角莲总木脂素;然后继续用树脂三倍体积的含5%冰乙酸的98%乙醇洗脱树脂,收集洗脱液,回收溶剂,烘干,得到八角莲总黄酮。
各供试样品编号如下:
1、八角莲提取物(鬼臼毒素含量为33.2%,山奈酚含量为4.5%。经紫外分光光度法测得总黄酮含量为10.8%):按实施例1制备。
2、八角莲提取物(鬼臼毒素含量为25.2%,山奈酚含量为6.5%。经紫外分光光度法测得总黄酮含量为14.1%):按实施例3制备。
3、八角莲总木脂素提取物。
4、市售鬼臼毒素(98%)。
5、八角莲总黄酮提取物。
2.2方法:
1)细胞毒性测定:将消化后的Vero细胞加入96孔板中,每孔1.5×105个细胞。待细胞长成致密单层后,弃去生长液,用维持液将提取物倍比稀释成8个浓度,起始浓度为500μg/ml, 每个浓度100μl,设4个复孔,同时设立正常细胞对照组,置于37℃,5%CO2培养箱培养48h,每天观察细胞的变化,计算药物的最大无毒浓度TC0。
2)药物抗病毒的药效学实验(CPE法):Vero细胞孔板培养至单层,弃生长液,用维持液分别将样品稀释成各个系列浓度(从样品的最大无毒浓度开始),每孔加入含样品维持液和病毒稀释液各50μl,每个浓度设4个复孔,同时设病毒对照组和正常细胞对照组,置5%CO2孵箱中37℃培养36~48h,其间置倒置显微镜下观察细胞病变的情况。观察并记录各孔的CPE。
3.3结果:见表3和表4。
表3 Vero细胞毒性结果
样品 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
TC0(μg/ml) | 125 | 125 | 31.3 | 31.3 | 500 |
表4 抑制HSV-1病毒所致细胞病变作用结果
CPE的记录方法为:无细胞病变为“-”;1%~25%细胞出现病变为“+”;26%~50%细胞病变为“++”;51%~75%细胞病变为“+++”;76%~100%的细胞病变为“++++”。
由试验结果可知,八角莲提取物(按实施例1制备)体外抗HSV-1病毒的活性与鬼臼毒素和总木脂素相近,但细胞毒性远小于鬼臼毒素和总木脂素。总黄酮抗HSV-1病毒的活性不如前三者。这可能是由于总木脂素和总黄酮协同增效减毒的结果。
Claims (12)
1.八角莲提取物,其特征在于:以提取物重量计含有鬼臼毒素20wt%~50wt%,山奈酚3wt%~8wt%,总黄酮8wt%~15wt%;
所述八角莲提取物采用如下步骤制备:
A、以八角莲为原料,以95%v/v乙醇为提取溶剂,提取液浓缩后得浸膏a;
B、浸膏a用乙酸乙酯洗涤、过滤,浓缩滤液得浸膏b;
C、浸膏b用混合有机溶剂加热回流洗涤,过滤,浓缩滤液得浸膏c;
D、浸膏c干燥粉碎即得八角莲提取物;
其中,步骤C所述混合有机溶剂采用乙酸乙酯和环己烷的混合溶剂,其中乙酸乙酯和环己烷的体积比为2:1。
2.权利要求1所述的八角莲提取物的制备方法,其特征在于步骤如下:
A、以八角莲为原料,以95%v/v乙醇为提取溶剂,提取液浓缩后得浸膏a;
B、浸膏a用乙酸乙酯洗涤、过滤,浓缩滤液得浸膏b;
C、浸膏b用混合有机溶剂加热回流洗涤,过滤,浓缩滤液得浸膏c;
D、浸膏c干燥粉碎即得八角莲提取物;
其中,步骤C所述混合有机溶剂采用乙酸乙酯和环己烷的混合溶剂,其中乙酸乙酯和环己烷的体积比为2:1。
3.根据权利要求2所述的八角莲提取物的制备方法,其特征在于:步骤A中用乙醇提取时采用渗漉提取,乙醇用量为八角莲用量的6-10倍。
4.根据权利要求3所述的八角莲提取物的制备方法,其特征在于:步骤A中用乙醇提取时采用渗漉提取,乙醇用量为八角莲用量的8倍。
5.根据权利要求2所述的八角莲提取物的制备方法,其特征在于:八角莲在提取前粉碎至10-50目。
6.根据权利要求5所述的八角莲提取物的制备方法,其特征在于:八角莲在提取前粉碎至20目。
7.药物组合物,由权利要求1所述的八角莲提取物以及药学上可接受的辅料制成。
8.根据权利要求7所述的药物组合物,其特征在于:所述药物组合物的剂型为外用制剂。
9.根据权利要求8所述的药物组合物,其特征在于:所述外用制剂为洗液、软膏剂、凝胶剂。
10.根据权利要求9所述的药物组合物,其特征在于:所述外用制剂为洗液。
11.权利要求1所述的八角莲提取物或权利要求7所述的药物组合物在制备具有皮肤杀菌功效的产品中的用途。
12.权利要求1所述的八角莲提取物或权利要求7所述的药物组合物在制备治疗尖锐湿疣的药物中的用途。
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