CN104402966A

CN104402966A - 一种从富硒茶叶片中提取硒蛋白的方法

Info

Publication number: CN104402966A
Application number: CN201410650029.4A
Authority: CN
Inventors: 董文宾; 王洪言; 王珺
Original assignee: Shaanxi University of Science and Technology
Current assignee: Shaanxi University of Science and Technology
Priority date: 2014-11-14
Filing date: 2014-11-14
Publication date: 2015-03-11

Abstract

本发明公开了一种从富硒茶叶片中提取硒蛋白的方法。本发明以富硒茶叶片为原料，将富硒茶叶片烘干、粉碎过筛，加入乙醇，在60℃下水浴加热30min，离心，所得沉淀重复上述步骤，然后烘干粉碎过筛；所得沉淀加入蒸馏水，在低温冰箱中冰冻3～5h，50～70℃下水浴加热30min，然后在低温冰箱中冰冻3～5h，在50～70℃下水浴加热30min，如此重复三次；加入NaOH溶液，在70～90℃下水浴加热3～4h，3500rpm离心10min，沉淀重复上述过程一次，上清液调节pH至2.5～3.5，静置，离心，干燥得粗硒蛋白。本发明制备工艺简单，操作简便易行，环境友好，所得产品硒蛋白含量较高，是有机硒可靠的来源，适用于工业化生产。

Description

一种从富硒茶叶片中提取硒蛋白的方法

技术领域

本发明属于茶叶深加工技术领域，特别涉及一种从富硒茶叶片中提取硒蛋白的方法。

背景技术

硒是人体必需的微量元素之一，现代医学研究证明，硒对癌症、心脑血管疾病、克山病、大骨节病等疾病均有防治作用。由于硒在地球上分布不均，目前已知有40多个国家和地区不同程度缺硒，我国也有2/3以上地区缺硒，涉及人口达7亿多。直接利用无机硒盐补硒具有一定的毒性，通过食物链补硒是解决缺硒问题的重要途径，但天然食物中的硒含量普遍较低。紫阳富硒茶是天然的补硒饮品，紫阳当地居民饮富硒茶历史可追朔到唐朝，说明富硒茶对人体是安全的。但是研究表明富硒茶经过两次冲泡，仅有7％～13％的硒溶解于水中而被人体吸收利用，与国际硒学会推荐人体日摄入量为60～400μg相差甚远，据中国预防医科院与第四军医大的检测推算，欲满足人体对硒的需求每人每天需饮300g富硒茶干品，而且富硒茶中有机硒含量变动较大，所以通过冲饮紫阳茶难以满足缺硒人群定量补硒需求。因此有必要开发一种有机硒硒含量更高，含硒量稳定的富硒产品以满足广大人群的补硒需求。

茶叶中有机硒占硒总量的80％以上，主要以硒蛋白形态存在(占有机硒的79.56～88.70％)。茶叶干重的15～30％为茶叶蛋白，它是由单纯蛋白和结合蛋白两大类组成。单纯蛋白主要由谷蛋白(溶于稀酸、稀碱溶液，受热不凝固，占总蛋白82.05％)、醇溶蛋白(溶于稀酸稀碱溶液中以及70～80％的酒精溶液中，占总蛋白13.61％)、清蛋白(溶于水和稀盐溶液，占总蛋白3.47％)和球蛋白(溶于稀盐溶液，占总蛋白<1％)组成。结合蛋白则由核蛋白、糖蛋白、脂蛋白等组成，数量少，易溶于稀酸。

目前国内对茶叶蛋白提取方法研究较多的为碱法提取、酶法提取、盐法提取[3]、超生辅助提取和反复冻融法辅助提取。

碱液可以破坏茶蛋白之间的某些连接集团，提高茶蛋白的溶解度，实现茶蛋白有效分离的目的，一般选择NaOH为碱液。它因工艺简单、提取率较高、处理量大、易于实现工厂自动化等特点而被广泛应用，但是对氨基酸有破坏作用，抽提液固比大，等电沉淀要消耗大量酸、脱盐纯化难度大、提取时需要消耗大量的碱和水等缺点。

近年来，酶法提取植物蛋白的研究较为活跃。常用的酶类有蛋白酶、纤维素酶和果胶酶等。蛋白酶是在特定的条件下(一般是最适温度和pH值)，将蛋白质逐步降解，变成分子量较小的短肽，从而使其溶解性增强，达到分离提取的效果。纤维素酶和果胶酶则是分别分解细胞壁中的纤维素和果胶，从而破坏细胞壁，使细胞吸水破裂，提高提取物和提取液的接触机会，从而实现提高提取率的目的。酶法提取具有反应条件温和，反应液固比小，耗能低，营养物质基本不被破坏，提取率高等优点。但是目前酶法提取的工艺条件并不成熟，而且存在对酶活力的要求比较高，酶试剂较为昂贵，不适合规模化生产。

超声辅助提取是利用超声波的机械作用、空化作用、热效应和化学效应，破坏细胞壁，加速目标物的扩散，实现提高提取率的目的。超声辅助提取具有提取时间短、提取效率较高、污染少等优点，但是根据提取物的不同有时也会出现与普通法相比提取效果不明显的结果。

发明内容

为解决现有技术问题，本发明提供了一种从富硒茶叶片中提取硒蛋白的方法，本发明制备工艺简单，操作简便易行，环境友好，适用于工业化生产。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种从富硒茶叶片中提取硒蛋白的方法包括以下步骤：

(1)将富硒茶叶片粉碎过80～100目筛得到富硒茶粉，富硒茶粉去除茶多酚后，烘干、再粉碎、再过80～100目筛，得物质A；

(2)向步骤(1)所得物质A中按照固液比1g：(5～10)mL加入蒸馏水溶解，在-30～-18℃中冰冻3～5h，50～70℃下水浴加热20～40min，重复多次，得到溶液A；

(3)按照1g溶液A加入30～70mL NaOH溶液的比例，向步骤(2)所得溶液A中加入NaOH溶液，在70～90℃下水浴加热3～4h，离心分离上清液；

(4)步骤(3)中离心所得上清液调节pH值至2.5～3.5，静置，再离心，得沉淀，沉淀烘干得到粗硒蛋白。

作为本发明的进一步改进，步骤(1)中去除茶多酚步骤具体操作为：向富硒茶粉中按照固液比1g：(20～30)mL加入乙醇，在60℃水浴加热30min，离心，分离得沉淀，所得沉淀重复以上步骤。

作为本发明的进一步改进，所述乙醇质量浓度为40～60％。

作为本发明的进一步改进，步骤(3)中NaOH溶液浓度为0.05～0.15mol/L。

作为本发明的进一步改进，步骤(3)所述的pH值用0.1mol/L HCl调节。

作为本发明的进一步改进，所述离心步骤的离心转速为3500rpm，时间为10min。

相对于现有技术，本发明具有以下优点：

本发明以富硒茶叶片为原料，先去除茶多酚，以反复冻融细胞方式，达到破碎细胞的效果，以碱提方法提取蛋白质，以pH值为2.5～3.5来沉淀硒蛋白，制得的硒蛋白粉呈浅黑色、纯度达到75％以上。其中反复冻融法辅助提取是利用低温冰箱(-30～-18℃)把提取液冰冻，然后加热溶化，反复三次，在冻融过程中实现细胞壁破碎的目的，从而提高蛋白质的提取率。

进一步，去除茶多酚采用质量浓度为40～60％的乙醇，去除完全，对后期的提取影响小。

本发明制得的硒蛋白，有机硒含量达到4.000μg/g以上，可以作为安全、有效补硒的原料进一步加工成各种补硒功能产品。本发明制备工艺简单，操作简便易行，环境友好，无污染。

附图说明

图1为硒标准曲线图；

图2为不同样品中硒含量对比图。

具体实施方式

本发明以富硒茶叶片为原料，用40～60％乙醇去除茶多酚，以反复冻融细胞方式，达到破碎细胞的效果，以碱提方法提取蛋白质，以pH2.5～3.5来沉淀硒蛋白，本发明内容包括以下步骤：

(1)将富硒茶叶片粉碎过80～100目筛，按照1：(20～30)(g:mL)加入40～60％乙醇，在60℃下水浴加热30min，3500rpm离心10min，所得沉淀重复步骤(1)后烘干粉碎过80～100目筛；

(2)步骤(1)所得沉淀按照料液比1：(5～10)(g:mL)加入蒸馏水，在低温冰箱(-30～-18℃)中冰冻3～5h，50～70℃下水浴加热30min，然后在低温冰箱(-30～-18℃)中冰冻3～5h，在50～70℃下水浴加热30min，如此重复三次；

(3)向步骤(2)中按照料液比1：(30～70)(g:mL)加入0.05～0.15mol/L NaOH溶液，在70～90℃下水浴加热3～4h，3500rpm离心10min；

(4)步骤(3)中离心所得上清液用0.1mol/L HCl调节pH至2.5～3.5，静置10min，3500rpm离心10min，所得沉淀烘干得到粗硒蛋白。

实施例1

一种从富硒茶叶片中提取硒蛋白的方法，包括以下步骤：

(1)将富硒茶叶片粉碎过100目筛，按照1：25(g:mL)加入60％乙醇，在60℃下水浴加热30min，3500rpm离心10min，所得沉淀重复步骤(1)后烘干粉碎过100目筛；

(2)步骤(1)所得沉淀按照料液比1：7(g:mL)加入蒸馏水，在低温冰箱中冰冻4h，60℃下水浴加热30min，然后在低温冰箱中冰冻4h，在60℃下水浴加热30min，如此重复三次；

(3)向步骤(2)中按照料液比1：50(g:mL)加入0.10mol/L NaOH溶液，在70℃下水浴加热3.5h，3500rpm离心10min；

(4)步骤(3)中离心所得上清液用0.1mol/L HCl调节pH至3.5，静置10min，3500rpm离心10min，所得沉淀烘干得到粗硒蛋白。

实施例2

一种从富硒茶叶片中提取硒蛋白的方法，包括以下步骤：

(1)将富硒茶叶片粉碎过80目筛，按照1：20(g:mL)加入60％乙醇，在60℃下水浴加热30min，3500rpm离心10min，所得沉淀重复步骤(1)后烘干粉碎过80目筛；

(2)步骤(1)所得沉淀按照料液比1：5(g:mL)加入蒸馏水，在低温冰箱中冰冻3h，50℃下水浴加热30min，然后在低温冰箱中冰冻3h，在50℃下水浴加热30min，如此重复三次；

(3)向步骤(2)中按照料液比1：50(g:mL)加入0.10mol/L NaOH溶液，在80℃下水浴加热4h，3500rpm离心10min；

(4)步骤(3)中离心所得上清液用0.1mol/L HCl调节pH至2.5，静置10min，3500rpm离心10min，所得沉淀烘干得到粗硒蛋白。

实施例3

一种从富硒茶叶片中提取硒蛋白的方法，包括以下步骤：

(1)将富硒茶叶片粉碎过90目筛，按照1：30(g:mL)加入50％乙醇，在60℃下水浴加热30min，3500rpm离心10min，所得沉淀重复步骤(1)后烘干粉碎过90目筛；

(2)步骤(1)所得沉淀按照料液比1：10(g:mL)加入蒸馏水，在低温冰箱中冰冻5h，70℃下水浴加热20min，然后在低温冰箱中冰冻5h，在70℃下水浴加热30min，如此重复三次；

(3)向步骤(2)中按照料液比1：70(g:mL)加入0.15mol/L NaOH溶液，在80℃下水浴加热4h，3500rpm离心10min；

(4)步骤(3)中离心所得上清液用0.1mol/L HCl调节pH至3.0，静置10min，3500rpm离心10min，所得沉淀烘干得到粗硒蛋白。

实施例4

一种从富硒茶叶片中提取硒蛋白的方法，包括以下步骤：

(1)将富硒茶叶片粉碎过100目筛，按照1：25(g:mL)加入40％乙醇，在60℃下水浴加热30min，3500rpm离心10min，所得沉淀重复步骤(1)后烘干粉碎过100目筛；

(2)步骤(1)所得沉淀按照料液比1：10(g:mL)加入蒸馏水，在低温冰箱中冰冻4h，60℃下水浴加热40min，然后在低温冰箱中冰冻4h，在60℃下水浴加热30min，如此重复三次；

(3)向步骤(2)中按照料液比1：60(g:mL)加入0.10mol/L NaOH溶液，在90℃下水浴加热3h，3500rpm离心10min；

实施例5

一种从富硒茶叶片中提取硒蛋白的方法，包括以下步骤：

(2)步骤(1)所得沉淀按照料液比1：10(g:mL)加入蒸馏水，在低温冰箱中冰冻5h，70℃下水浴加热30min，然后在低温冰箱中冰冻5h，在70℃下水浴加热30min，如此重复三次；

(3)向步骤(2)中按照料液比1：30(g:mL)加入0.05mol/L NaOH溶液，在90℃下水浴加热4h，3500rpm离心10min；

本发明所用原料为富硒茶叶片，特别是老叶效果更好。

测试1：硒含量检测

1)试验材料

富硒茶粉、未纯化硒蛋白(用冻融法提取蛋白质)、纯化硒蛋白、粗多酚、二次提取蛋白后茶渣

2)试验方法：利用微波消解-紫外分光光度法测定硒含量

3)结果与分析

3.1硒标准曲线的绘制

由图1可知，硒含量在1-5μg时具有线性相关性，其线性方程为y＝0.0191x-0.003，相关系数R2＝0.9994。

3.2各种样品硒含量检测

由图2和表1可知，在陕西紫阳县“硒谷”采集的富硒茶含硒量为2.110μg/g；粗蛋白质中硒含量为4.002μg/g，占样品总硒的71.1％，并且经纯化后蛋白质中硒含量可达5.174μg/g；二次提取蛋白后茶渣中硒含量为0.930μg/g，这可能是因为茶渣中还存在硒核酸、部分硒蛋白、硒多糖以及无机态游离硒；粗多酚中硒含量为0.053μg/g，这可能是由于粗多酚中含有部分硒多糖而使多酚中存在硒。

表1

以上所述仅为本发明的一种实施方式，不是全部或唯一的实施方式，本领域普通技术人员通过阅读本发明说明书而对本发明技术方案采取的任何等效的变换，均为本发明的权利要求所涵盖。

Claims

1.一种从富硒茶叶片中提取硒蛋白的方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的一种从富硒茶叶片中提取硒蛋白的方法，其特征在于，步骤(1)中去除茶多酚步骤具体操作为：向富硒茶粉中按照固液比1g：(20～30)mL加入乙醇，在60℃水浴加热30min，离心，分离得沉淀，所得沉淀重复以上步骤。

3.根据权利要求2所述的一种从富硒茶叶片中提取硒蛋白的方法，其特征在于，所述乙醇质量浓度为40～60％。

4.根据权利要求1所述的一种从富硒茶叶片中提取硒蛋白的方法，其特征在于，步骤(3)中NaOH溶液浓度为0.05～0.15mol/L。

5.根据权利要求1所述的一种从富硒茶叶片中提取硒蛋白的方法，其特征在于，步骤(3)所述的pH值用0.1mol/L HCl调节。

6.根据权利要求1或2所述的一种从富硒茶叶片中提取硒蛋白的方法，其特征在于，所述离心步骤的离心转速为3500rpm，时间为10min。