CN102775466A - 富硒酵母中含硒蛋白的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种富硒酵母中含硒蛋白的制备方法。主要包括下述步骤:(1)富硒酵母高压均质破碎后离心;(2)向离心上清液中加入质量百分比75%~90%的硫酸铵搅拌后离心收集沉淀,用缓冲液溶解沉淀后放入透析袋中透析,用聚乙二醇脱水浓缩至较小体积,真空冷冻干燥制得粗蛋白。(3)将粗蛋白干粉溶于少量Tris-HCl缓冲液,过0.22μm的微孔滤膜后上葡聚糖凝胶柱,在流速为0.5-3ml/min,检测波长为280nm,洗脱液为50-150mmol/LTris-HCl缓冲液条件下洗脱收集蛋白组分。本发明相对于现有技术破碎率高,粗蛋白提取充分,纯化后获得蛋白中硒含量高,同时指标的含硒蛋白纯度高。
Description
技术领域
本发明涉及一种富硒酵母中含硒蛋白的制备方法。
背景技术
硒是人和动物体必需的微量元素,是谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)的组成成分。硒还具有多种生物学功能,如具有抗氧化、抗癌、防衰老、提高人体免疫力、保护心脑血管等作用,它的生物学功能主要是以硒蛋白表现的。已发现的硒蛋白大多数是具有重要作用的酶,又称之为硒酶。目前已有大量研究表明人体40多种疾病如克山病、甲状腺肿、关节炎、糖尿病、白内障、癌症等与硒的营养状况有密切的关系,因此,对硒蛋白的研究已成为近年来的热点研究课题。如,陈汉杰等通过反复冻融提取酵母中的硒蛋白(陈汉杰等.硒酵母中硒蛋白的色谱分离和分析.暨南大学学报,1993,14(1):60-62.),Laure等人利用超声破碎酵母细胞后提取含硒蛋白(Laure et al.Identification of selenium-containing proteins in selenium-rich yeast aqueous extract by 2D gel lectrophoresis, nanoHPLC–ICPMS and nanoHPLC–ESI MS/MS,Talanta, 2008,75:1140-1145.)等,现有富硒酵母中含硒蛋白的制备方法通常采用超声、酸提或反复冻融来破碎酵母细胞后提取含硒蛋白,但因为酵母细胞壁厚,超声破碎效率不高,化学方法提取后蛋白质易失活,后期纯化的蛋白较少,极大的限制了硒蛋白的应用。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术存在的不足,提供一种酵母破碎率高,蛋白提取失活少,提取含硒蛋白纯度高的方法。
本发明富硒酵母中含硒蛋白的制备方法包括以下步骤:酵母的高压匀质破碎,离心,沉淀,含硒粗蛋白收集,含硒蛋白洗脱收集。具体操作步骤如下:
1. 富硒酵母菌体浸泡在5~10倍体积的50-150 mmol/L,pH为7.4-7.8的Tris-HCl缓冲液中,高压均质破碎,破碎后5000-15000 rpm/min,2-6℃,离心15-45 min,收集上清液。再向离心上清液中加入质量百分比75%~90%的硫酸铵,在3~5℃条件下磁力搅拌直至无蛋白沉淀产生,静置,然后5000-15000 rpm/min,2-6℃,离心15-45 min,收集沉淀,再用少了缓冲液溶解沉淀,将溶解后的溶液放入透析袋中,透析,直至蒸馏水中无SO4 2-,透析完毕。用聚乙二醇脱水浓缩至较小体积,真空冷冻干燥制得粗蛋白。
作为优选,Tris-HCl缓冲液pH为7.6,浓度为100 mmol/L,离心转速为10000 rpm/min,温度为4℃,离心时间为30 min。
2. 将粗蛋白干粉溶于少量Tris-HCl缓冲液,离心去除不溶物,上清液过0.22 μm的微孔滤膜后上葡聚糖凝胶柱,在流速为0.5-3 ml/min,检测波长为280 nm,洗脱液为50-150 mmol/LTris-HCl缓冲液条件下洗脱收集蛋白组分。
作为优选,过葡聚糖凝胶柱条件参数为:流速1 ml/min作为洗脱液的缓冲液为100 mmol/LTris-HCl。
本发明以富硒酵母菌体为原料,首先制备水溶性粗蛋白,并通过硫酸铵沉淀蛋白,葡聚糖凝胶层析、阴离子交换层析对水溶性粗蛋白进行纯化,即制备得到目标含硒蛋白。
本发明的有益效果在于:因破碎率高,粗蛋白提取充分,纯化后获得蛋白中硒含量高,同时利用SDS-PAGE电泳后均为均一条带,说明制备的蛋白纯度高。
具体实施方式:
本发明技术方案不局限于以下所列举实施方案,还包括具体实施方式间的任意组合。
实施例一:
因酵母细胞壁较厚,细胞壁破碎的效率对蛋白提取的效率有很大的影响,因此对不同破碎条件下提取蛋白含量进行测定,以优选出破碎的方法。
表1.不同破碎条件下从富硒酵母中提取蛋白和硒的含量
名称 | 超声破碎 | 高压均质 | 反复冻融 | 酸-热水处理 |
蛋白含量(g/100ml) | 0.216±0.05 | 0.365±0.11 | 0.113±0.06 | 0.214±0.04 |
硒含量(mg/kg) | 630±13 | 986±16 | 321±10 | 587±13 |
注:n=3
从上述实验结果可知,高压均质破碎富硒酵母效率最高,比超声破碎、酸-热水处理高约1.7倍,比反复冻融破碎富硒酵母高越3.2倍。
实施例二:
本实验方式富硒酵母中硒蛋白的制备按照以下步骤进行:
1. 富硒酵母的培养是通过液体发酵培养,在发酵液中添加亚硒酸钠,通过酵母在生长过程中对无机硒的吸收、富集、转化为有机形态的硒,最后离心收集富集酵母菌体,收集的富硒酵母菌体,测定菌体的硒含量为1000 μg/g。取富硒酵母菌体10 g浸泡在50ml的100 mmol/L,pH7.6的Tris-HCl缓冲液中,超声破碎1h,破碎后10000 rpm/min,4℃,离心30 min,收集上清液。再向离心上清液中加入质量百分比75%的硫酸铵,在3~5℃条件下磁力搅拌直至无蛋白沉淀产生,静置,然后10000 rpm/min,4℃,离心30 min,收集沉淀,再用少了缓冲液溶解沉淀,将溶解后的溶液放入透析袋中,透析,直至蒸馏水中无SO42-,透析完毕。用聚乙二醇脱水浓缩至较小体积,真空冷冻干燥制得粗蛋白,粗蛋白含硒量为900 μg/g。
2. 将粗蛋白干粉溶于少量Tris-HCl缓冲液,离心去除不溶物,上清液过0.22 μm的微孔滤膜后取2 ml上葡聚糖凝胶柱(SephadexG-75),在流速为1 ml/min,检测波长为280 nm,洗脱液为100 mmol/LTris-HCl缓冲液条件下洗脱收集蛋白组分,即得到富硒酵母含硒蛋白。
实施例三:
本实验方式富硒酵母中硒蛋白的制备按照以下步骤进行:
1. 富硒酵母的培养是通过液体发酵培养,在发酵液中添加亚硒酸钠,通过酵母在生长过程中对无机硒的吸收、富集、转化为有机形态的硒,最后离心收集富集酵母菌体,收集的富硒酵母菌体,测定菌体的硒含量为1000 μg/g。取富硒酵母菌体10 g浸泡在50ml的100 mmol/L,pH7.6的Tris-HCl缓冲液中,高压均质破碎,破碎后10000 rpm/min,4℃,离心30 min,收集上清液。再向离心上清液中加入质量百分比75%的硫酸铵,在3~5℃条件下磁力搅拌直至无蛋白沉淀产生,静置,然后10000 rpm/min,4℃,离心30 min,收集沉淀,再用少了缓冲液溶解沉淀,将溶解后的溶液放入透析袋中,透析,直至蒸馏水中无SO42-,透析完毕。用聚乙二醇脱水浓缩至较小体积,真空冷冻干燥制得粗蛋白,粗蛋白含硒量为1200 μg/g。
2. 将粗蛋白干粉溶于少量Tris-HCl缓冲液,离心去除不溶物,上清液过0.22 μm的微孔滤膜后取2 ml上葡聚糖凝胶柱(SephadexG-75),在流速为1 ml/min,检测波长为280 nm,洗脱液为100 mmol/LTris-HCl缓冲液条件下洗脱收集蛋白组分,即得到富硒酵母含硒蛋白。
实施例四:
本实验方式富硒酵母中硒蛋白的制备按照以下步骤进行:
1. 将10 g总硒含量为1000μg/g的富硒酵母菌体浸泡在50 ml的100 mmol/L,pH7.6的Tris-HCl缓冲液中,高压均质破碎,破碎后10000 rpm/min,4℃,离心30 min,收集上清液。再向离心上清液中加入质量百分比90%的硫酸铵,在3~5℃条件下磁力搅拌直至无蛋白沉淀产生,静置,然后10000 rpm/min,4℃,离心30 min,收集沉淀,再用少了缓冲液溶解沉淀,将溶解后的溶液放入透析袋中,透析,直至蒸馏水中无SO42-,透析完毕。用聚乙二醇脱水浓缩至较小体积,真空冷冻干燥制的粗蛋白。
2. 将粗蛋白干粉溶于少量Tris-HCl缓冲液,离心去除不溶物,上清液过0.22 μm的微孔滤膜后上葡聚糖凝胶柱(SephadexG-75),在流速为1 ml/min,检测波长为280 nm,洗脱液为100 mmol/LTris-HCl缓冲液条件下洗脱收集蛋白组分。即得到富硒酵母含硒蛋白。
实施例五:
本实验方式富硒酵母中硒蛋白的制备按照以下步骤进行:
1. 将10 g总硒含量为1000μg/g的富硒酵母菌体浸泡在100 ml的100 mmol/L,pH7.6的Tris-HCl缓冲液中,高压均质破碎,破碎后10000 rpm/min,4℃,离心30 min,收集上清液。再向离心上清液中加入质量百分比80%的硫酸铵,在3~5℃条件下磁力搅拌直至无蛋白沉淀产生,静置,然后10000 rpm/min,4℃,离心30 min,收集沉淀,再用少了缓冲液溶解沉淀,将溶解后的溶液放入透析袋中,透析,直至蒸馏水中无SO42-,透析完毕。用聚乙二醇脱水浓缩至较小体积,真空冷冻干燥制的粗蛋白。
2. 将粗蛋白干粉溶于少量Tris-HCl缓冲液,离心去除不溶物,上清液过0.22 μm的微孔滤膜后上葡聚糖凝胶柱(SephadexG-75),在流速为1 ml/min,检测波长为280 nm,洗脱液为100 mmol/LTris-HCl缓冲液条件下洗脱收集蛋白组分。即得到富硒酵母含硒蛋白。
实施例六:
本实验方式富硒酵母中硒蛋白的制备按照以下步骤进行:
1. 将10 g总硒含量为1500μg/g的富硒酵母菌体浸泡在50 ml的100 mmol/L,pH7.6的Tris-HCl缓冲液中,高压均质破碎,破碎后10000 rpm/min,4℃,离心30 min,收集上清液。再向离心上清液中加入质量百分比80%的硫酸铵,在3~5℃条件下磁力搅拌直至无蛋白沉淀产生,静置,然后10000 rpm/min,4℃,离心30 min,收集沉淀,再用少了缓冲液溶解沉淀,将溶解后的溶液放入透析袋中,透析,直至蒸馏水中无SO42-,透析完毕。用聚乙二醇脱水浓缩至较小体积,真空冷冻干燥制的粗蛋白。
2. 将粗蛋白干粉溶于少量Tris-HCl缓冲液,离心去除不溶物,上清液过0.22 μm的微孔滤膜后上葡聚糖凝胶柱(SephadexG-75),在流速为1 ml/min,检测波长为280 nm,洗脱液为100 mmol/LTris-HCl缓冲液条件下洗脱收集蛋白组分。即得到富硒酵母含硒蛋白。
实施例七:
本实验方式富硒酵母中硒蛋白的制备按照以下步骤进行:
1. 将20 g总硒含量为1500μg/g的富硒酵母菌体浸泡在100 ml的100 mmol/L,pH7.6的Tris-HCl缓冲液中,高压均质破碎,破碎后10000 rpm/min,4℃,离心30 min,收集上清液。再向离心上清液中加入质量百分比90%的硫酸铵,在3~5℃条件下磁力搅拌直至无蛋白沉淀产生,静置,然后10000 rpm/min,4℃,离心30 min,收集沉淀,再用少了缓冲液溶解沉淀,将溶解后的溶液放入透析袋中,透析,直至蒸馏水中无SO42-,透析完毕。用聚乙二醇脱水浓缩至较小体积,真空冷冻干燥制的粗蛋白。
2. 将粗蛋白干粉溶于少量Tris-HCl缓冲液,离心去除不溶物,上清液过0.22 μm的微孔滤膜后上葡聚糖凝胶柱(SephadexG-75),在流速为1 ml/min,检测波长为280 nm,洗脱液为100 mmol/LTris-HCl缓冲液条件下洗脱收集蛋白组分。即得到富硒酵母含硒蛋白。
本发明以富硒酵母菌体为原料,采用高压均质破碎,破碎效率高,能充分提取粗蛋白,再经过葡聚糖凝胶层析、阴离子交换层析对水溶性粗蛋白进行纯化,即制备得到3中含硒蛋白,与现有方法相比,纯化后获得蛋白中硒含量高,同时利用SDS-PAGE电泳后均为均一条带,说明制备的蛋白纯度高。
Claims (8)
1.一种富硒酵母中含硒蛋白的制备方法,其特征在于:包括以下步骤:酵母的高压匀质破碎,离心,沉淀,含硒粗蛋白收集,含硒蛋白洗脱收集。
2.根据权利要求1所述的富硒酵母中含硒蛋白的制备方法,其特征在于:所述酵母的高压匀质破碎之前将富硒酵母菌体浸泡在5~10倍体积的50-150 mmol/L,pH为7.4-7.8的Tris-HCl缓冲液中,高压均质破碎后以5000-15000 rpm/min,2-6℃,离心15-45 min,并收集上清液。
3.根据权利要求2所述的富硒酵母中含硒蛋白的制备方法,其特征在于:所述酵母的高压匀质破碎之前浸泡的Tris-HCl缓冲液pH为7.6,浓度为100 mmol/L,破碎后离心转速为10000 rpm/min,温度为4℃,离心时间为30 min。
4.根据权利要求1所述的富硒酵母中含硒蛋白的制备方法,其特征在于:所述含硒粗蛋白收集过程包括向离心上清液中加入质量百分比75%~90%的硫酸铵,在3~5℃条件下磁力搅拌直至无蛋白沉淀产生,静置,然后5000-15000 rpm/min,2-6℃,离心15-45 min,收集沉淀,再用少量缓冲液溶解沉淀,将溶解后的溶液放入透析袋中,透析,直至蒸馏水中无SO4 2-,透析完毕;用聚乙二醇脱水浓缩至较小体积,真空冷冻干燥制得粗蛋白。
5.根据权利要求4所述的富硒酵母中含硒蛋白的制备方法,其特征在于:所述离心转速为10000 rpm/min,温度为4℃,离心时间为30 min。
6.根据权利要求1所述的富硒酵母中含硒蛋白的制备方法,其特征在于:所述含硒蛋白洗脱收集过程在于将粗蛋白溶于少量Tris-HCl缓冲液,离心去除不溶物,上清液过0.22 μm的微孔滤膜后通过葡聚糖凝胶柱,在流速为0.5-3 ml/min,检测波长为280 nm,洗脱液为50-150 mmol/LTris-HCl缓冲液条件下洗脱收集蛋白组分。
7.根据权利要求6所述的富硒酵母中含硒蛋白的制备方法,其特征在于:所述葡聚糖凝胶柱条件参数为流速1 ml/min,洗脱液的缓冲液为100 mmol/LTris-HCl。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的富硒酵母中含硒蛋白的制备方法,其特征在于:包含以下步骤:(1)富硒酵母菌体浸泡在5~10倍体积的50-150 mmol/L,pH为7.4-7.8的Tris-HCl缓冲液中,高压均质破碎,破碎后5000-15000 rpm/min,2-6℃,离心15-45 min,收集上清;(2)向离心上清液中加入质量百分比75%~90%的硫酸铵,在3~5℃条件下磁力搅拌直至无蛋白沉淀产生,静置,然后5000-15000 rpm/min,2-6℃,离心15-45 min,收集沉淀,再用少了缓冲液溶解沉淀,将溶解后的溶液放入透析袋中,透析,直至蒸馏水中无SO4 2-,透析完毕;用聚乙二醇脱水浓缩至较小体积,真空冷冻干燥制得粗蛋白;(3)将粗蛋白干粉溶于少量Tris-HCl缓冲液,离心去除不溶物,上清液过0.22 μm的微孔滤膜后上葡聚糖凝胶柱,在流速为0.5-3 ml/min,检测波长为280 nm,洗脱液为50-150 mmol/LTris-HCl缓冲液条件下洗脱收集蛋白组分。
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WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20121114 |