CN102775466A - 富硒酵母中含硒蛋白的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种富硒酵母中含硒蛋白的制备方法。主要包括下述步骤：（1）富硒酵母高压均质破碎后离心；（2）向离心上清液中加入质量百分比75%~90%的硫酸铵搅拌后离心收集沉淀，用缓冲液溶解沉淀后放入透析袋中透析，用聚乙二醇脱水浓缩至较小体积，真空冷冻干燥制得粗蛋白。（3）将粗蛋白干粉溶于少量Tris-HCl缓冲液，过0.22μm的微孔滤膜后上葡聚糖凝胶柱，在流速为0.5-3ml/min，检测波长为280nm，洗脱液为50-150mmol/LTris-HCl缓冲液条件下洗脱收集蛋白组分。本发明相对于现有技术破碎率高，粗蛋白提取充分，纯化后获得蛋白中硒含量高，同时指标的含硒蛋白纯度高。
Description
技术领域
本发明涉及一种富硒酵母中含硒蛋白的制备方法。
背景技术
硒是人和动物体必需的微量元素，是谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）的组成成分。硒还具有多种生物学功能，如具有抗氧化、抗癌、防衰老、提高人体免疫力、保护心脑血管等作用，它的生物学功能主要是以硒蛋白表现的。已发现的硒蛋白大多数是具有重要作用的酶，又称之为硒酶。目前已有大量研究表明人体40多种疾病如克山病、甲状腺肿、关节炎、糖尿病、白内障、癌症等与硒的营养状况有密切的关系，因此，对硒蛋白的研究已成为近年来的热点研究课题。如，陈汉杰等通过反复冻融提取酵母中的硒蛋白（陈汉杰等.硒酵母中硒蛋白的色谱分离和分析.暨南大学学报，1993,14（1）:60-62.），Laure等人利用超声破碎酵母细胞后提取含硒蛋白（Laure et al.Identification of selenium-containing proteins in selenium-rich yeast aqueous extract by 2D gel lectrophoresis, nanoHPLC–ICPMS and nanoHPLC–ESI MS/MS,Talanta, 2008,75:1140-1145.）等，现有富硒酵母中含硒蛋白的制备方法通常采用超声、酸提或反复冻融来破碎酵母细胞后提取含硒蛋白，但因为酵母细胞壁厚，超声破碎效率不高，化学方法提取后蛋白质易失活，后期纯化的蛋白较少，极大的限制了硒蛋白的应用。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术存在的不足，提供一种酵母破碎率高，蛋白提取失活少，提取含硒蛋白纯度高的方法。
本发明富硒酵母中含硒蛋白的制备方法包括以下步骤：酵母的高压匀质破碎，离心，沉淀，含硒粗蛋白收集，含硒蛋白洗脱收集。具体操作步骤如下：
1. 富硒酵母菌体浸泡在5~10倍体积的50-150 mmol/L，pH为7.4-7.8的Tris-HCl缓冲液中，高压均质破碎，破碎后5000-15000 rpm/min，2-6℃，离心15-45 min，收集上清液。再向离心上清液中加入质量百分比75%~90%的硫酸铵，在3~5℃条件下磁力搅拌直至无蛋白沉淀产生，静置，然后5000-15000 rpm/min，2-6℃，离心15-45 min，收集沉淀，再用少了缓冲液溶解沉淀，将溶解后的溶液放入透析袋中，透析，直至蒸馏水中无SO4 2-，透析完毕。用聚乙二醇脱水浓缩至较小体积，真空冷冻干燥制得粗蛋白。
作为优选，Tris-HCl缓冲液pH为7.6，浓度为100 mmol/L，离心转速为10000 rpm/min，温度为4℃，离心时间为30 min。
2. 将粗蛋白干粉溶于少量Tris-HCl缓冲液，离心去除不溶物，上清液过0.22 μm的微孔滤膜后上葡聚糖凝胶柱，在流速为0.5-3 ml/min，检测波长为280 nm，洗脱液为50-150 mmol/LTris-HCl缓冲液条件下洗脱收集蛋白组分。
作为优选，过葡聚糖凝胶柱条件参数为：流速1 ml/min作为洗脱液的缓冲液为100 mmol/LTris-HCl。
本发明以富硒酵母菌体为原料，首先制备水溶性粗蛋白，并通过硫酸铵沉淀蛋白，葡聚糖凝胶层析、阴离子交换层析对水溶性粗蛋白进行纯化，即制备得到目标含硒蛋白。
本发明的有益效果在于：因破碎率高，粗蛋白提取充分，纯化后获得蛋白中硒含量高，同时利用SDS-PAGE电泳后均为均一条带，说明制备的蛋白纯度高。
具体实施方式：
本发明技术方案不局限于以下所列举实施方案，还包括具体实施方式间的任意组合。
实施例一：
因酵母细胞壁较厚，细胞壁破碎的效率对蛋白提取的效率有很大的影响，因此对不同破碎条件下提取蛋白含量进行测定，以优选出破碎的方法。
表1.不同破碎条件下从富硒酵母中提取蛋白和硒的含量
| 名称 | 超声破碎 | 高压均质 | 反复冻融 | 酸-热水处理 |
| 蛋白含量(g/100ml) | 0.216±0.05 | 0.365±0.11 | 0.113±0.06 | 0.214±0.04 |
| 硒含量（mg/kg） | 630±13 | 986±16 | 321±10 | 587±13 |
注：n=3
从上述实验结果可知，高压均质破碎富硒酵母效率最高，比超声破碎、酸-热水处理高约1.7倍，比反复冻融破碎富硒酵母高越3.2倍。
实施例二：
本实验方式富硒酵母中硒蛋白的制备按照以下步骤进行：
1. 富硒酵母的培养是通过液体发酵培养，在发酵液中添加亚硒酸钠，通过酵母在生长过程中对无机硒的吸收、富集、转化为有机形态的硒，最后离心收集富集酵母菌体，收集的富硒酵母菌体，测定菌体的硒含量为1000 μg/g。取富硒酵母菌体10 g浸泡在50ml的100 mmol/L，pH7.6的Tris-HCl缓冲液中，超声破碎1h，破碎后10000 rpm/min，4℃，离心30 min，收集上清液。再向离心上清液中加入质量百分比75%的硫酸铵，在3~5℃条件下磁力搅拌直至无蛋白沉淀产生，静置，然后10000 rpm/min，4℃，离心30 min，收集沉淀，再用少了缓冲液溶解沉淀，将溶解后的溶液放入透析袋中，透析，直至蒸馏水中无SO42-，透析完毕。用聚乙二醇脱水浓缩至较小体积，真空冷冻干燥制得粗蛋白，粗蛋白含硒量为900 μg/g。
2. 将粗蛋白干粉溶于少量Tris-HCl缓冲液，离心去除不溶物，上清液过0.22 μm的微孔滤膜后取2 ml上葡聚糖凝胶柱（SephadexG-75），在流速为1 ml/min，检测波长为280 nm，洗脱液为100 mmol/LTris-HCl缓冲液条件下洗脱收集蛋白组分，即得到富硒酵母含硒蛋白。
实施例三：
本实验方式富硒酵母中硒蛋白的制备按照以下步骤进行：
1. 富硒酵母的培养是通过液体发酵培养，在发酵液中添加亚硒酸钠，通过酵母在生长过程中对无机硒的吸收、富集、转化为有机形态的硒，最后离心收集富集酵母菌体，收集的富硒酵母菌体，测定菌体的硒含量为1000 μg/g。取富硒酵母菌体10 g浸泡在50ml的100 mmol/L，pH7.6的Tris-HCl缓冲液中，高压均质破碎，破碎后10000 rpm/min，4℃，离心30 min，收集上清液。再向离心上清液中加入质量百分比75%的硫酸铵，在3~5℃条件下磁力搅拌直至无蛋白沉淀产生，静置，然后10000 rpm/min，4℃，离心30 min，收集沉淀，再用少了缓冲液溶解沉淀，将溶解后的溶液放入透析袋中，透析，直至蒸馏水中无SO42-，透析完毕。用聚乙二醇脱水浓缩至较小体积，真空冷冻干燥制得粗蛋白，粗蛋白含硒量为1200 μg/g。
2. 将粗蛋白干粉溶于少量Tris-HCl缓冲液，离心去除不溶物，上清液过0.22 μm的微孔滤膜后取2 ml上葡聚糖凝胶柱（SephadexG-75），在流速为1 ml/min，检测波长为280 nm，洗脱液为100 mmol/LTris-HCl缓冲液条件下洗脱收集蛋白组分，即得到富硒酵母含硒蛋白。
实施例四：
本实验方式富硒酵母中硒蛋白的制备按照以下步骤进行：
1. 将10 g总硒含量为1000μg/g的富硒酵母菌体浸泡在50 ml的100 mmol/L，pH7.6的Tris-HCl缓冲液中，高压均质破碎，破碎后10000 rpm/min，4℃，离心30 min，收集上清液。再向离心上清液中加入质量百分比90%的硫酸铵，在3~5℃条件下磁力搅拌直至无蛋白沉淀产生，静置，然后10000 rpm/min，4℃，离心30 min，收集沉淀，再用少了缓冲液溶解沉淀，将溶解后的溶液放入透析袋中，透析，直至蒸馏水中无SO42-，透析完毕。用聚乙二醇脱水浓缩至较小体积，真空冷冻干燥制的粗蛋白。
2. 将粗蛋白干粉溶于少量Tris-HCl缓冲液，离心去除不溶物，上清液过0.22 μm的微孔滤膜后上葡聚糖凝胶柱（SephadexG-75），在流速为1 ml/min，检测波长为280 nm，洗脱液为100 mmol/LTris-HCl缓冲液条件下洗脱收集蛋白组分。即得到富硒酵母含硒蛋白。
实施例五：
本实验方式富硒酵母中硒蛋白的制备按照以下步骤进行：
1. 将10 g总硒含量为1000μg/g的富硒酵母菌体浸泡在100 ml的100 mmol/L，pH7.6的Tris-HCl缓冲液中，高压均质破碎，破碎后10000 rpm/min，4℃，离心30 min，收集上清液。再向离心上清液中加入质量百分比80%的硫酸铵，在3~5℃条件下磁力搅拌直至无蛋白沉淀产生，静置，然后10000 rpm/min，4℃，离心30 min，收集沉淀，再用少了缓冲液溶解沉淀，将溶解后的溶液放入透析袋中，透析，直至蒸馏水中无SO42-，透析完毕。用聚乙二醇脱水浓缩至较小体积，真空冷冻干燥制的粗蛋白。
2. 将粗蛋白干粉溶于少量Tris-HCl缓冲液，离心去除不溶物，上清液过0.22 μm的微孔滤膜后上葡聚糖凝胶柱（SephadexG-75），在流速为1 ml/min，检测波长为280 nm，洗脱液为100 mmol/LTris-HCl缓冲液条件下洗脱收集蛋白组分。即得到富硒酵母含硒蛋白。
实施例六：
本实验方式富硒酵母中硒蛋白的制备按照以下步骤进行：
1. 将10 g总硒含量为1500μg/g的富硒酵母菌体浸泡在50 ml的100 mmol/L，pH7.6的Tris-HCl缓冲液中，高压均质破碎，破碎后10000 rpm/min，4℃，离心30 min，收集上清液。再向离心上清液中加入质量百分比80%的硫酸铵，在3~5℃条件下磁力搅拌直至无蛋白沉淀产生，静置，然后10000 rpm/min，4℃，离心30 min，收集沉淀，再用少了缓冲液溶解沉淀，将溶解后的溶液放入透析袋中，透析，直至蒸馏水中无SO42-，透析完毕。用聚乙二醇脱水浓缩至较小体积，真空冷冻干燥制的粗蛋白。
2. 将粗蛋白干粉溶于少量Tris-HCl缓冲液，离心去除不溶物，上清液过0.22 μm的微孔滤膜后上葡聚糖凝胶柱（SephadexG-75），在流速为1 ml/min，检测波长为280 nm，洗脱液为100 mmol/LTris-HCl缓冲液条件下洗脱收集蛋白组分。即得到富硒酵母含硒蛋白。
实施例七：
本实验方式富硒酵母中硒蛋白的制备按照以下步骤进行：
1. 将20 g总硒含量为1500μg/g的富硒酵母菌体浸泡在100 ml的100 mmol/L，pH7.6的Tris-HCl缓冲液中，高压均质破碎，破碎后10000 rpm/min，4℃，离心30 min，收集上清液。再向离心上清液中加入质量百分比90%的硫酸铵，在3~5℃条件下磁力搅拌直至无蛋白沉淀产生，静置，然后10000 rpm/min，4℃，离心30 min，收集沉淀，再用少了缓冲液溶解沉淀，将溶解后的溶液放入透析袋中，透析，直至蒸馏水中无SO42-，透析完毕。用聚乙二醇脱水浓缩至较小体积，真空冷冻干燥制的粗蛋白。
2. 将粗蛋白干粉溶于少量Tris-HCl缓冲液，离心去除不溶物，上清液过0.22 μm的微孔滤膜后上葡聚糖凝胶柱（SephadexG-75），在流速为1 ml/min，检测波长为280 nm，洗脱液为100 mmol/LTris-HCl缓冲液条件下洗脱收集蛋白组分。即得到富硒酵母含硒蛋白。
本发明以富硒酵母菌体为原料，采用高压均质破碎，破碎效率高，能充分提取粗蛋白，再经过葡聚糖凝胶层析、阴离子交换层析对水溶性粗蛋白进行纯化，即制备得到3中含硒蛋白，与现有方法相比，纯化后获得蛋白中硒含量高，同时利用SDS-PAGE电泳后均为均一条带，说明制备的蛋白纯度高。
Claims (8)
1.一种富硒酵母中含硒蛋白的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：酵母的高压匀质破碎，离心，沉淀，含硒粗蛋白收集，含硒蛋白洗脱收集。
2.根据权利要求1所述的富硒酵母中含硒蛋白的制备方法，其特征在于：所述酵母的高压匀质破碎之前将富硒酵母菌体浸泡在5~10倍体积的50-150 mmol/L，pH为7.4-7.8的Tris-HCl缓冲液中，高压均质破碎后以5000-15000 rpm/min，2-6℃，离心15-45 min，并收集上清液。
3.根据权利要求2所述的富硒酵母中含硒蛋白的制备方法，其特征在于：所述酵母的高压匀质破碎之前浸泡的Tris-HCl缓冲液pH为7.6，浓度为100 mmol/L，破碎后离心转速为10000 rpm/min，温度为4℃，离心时间为30 min。
4.根据权利要求1所述的富硒酵母中含硒蛋白的制备方法，其特征在于：所述含硒粗蛋白收集过程包括向离心上清液中加入质量百分比75%~90%的硫酸铵，在3~5℃条件下磁力搅拌直至无蛋白沉淀产生，静置，然后5000-15000 rpm/min，2-6℃，离心15-45 min，收集沉淀，再用少量缓冲液溶解沉淀，将溶解后的溶液放入透析袋中，透析，直至蒸馏水中无SO4 2-，透析完毕；用聚乙二醇脱水浓缩至较小体积，真空冷冻干燥制得粗蛋白。
5.根据权利要求4所述的富硒酵母中含硒蛋白的制备方法，其特征在于：所述离心转速为10000 rpm/min，温度为4℃，离心时间为30 min。
6.根据权利要求1所述的富硒酵母中含硒蛋白的制备方法，其特征在于：所述含硒蛋白洗脱收集过程在于将粗蛋白溶于少量Tris-HCl缓冲液，离心去除不溶物，上清液过0.22 μm的微孔滤膜后通过葡聚糖凝胶柱，在流速为0.5-3 ml/min，检测波长为280 nm，洗脱液为50-150 mmol/LTris-HCl缓冲液条件下洗脱收集蛋白组分。
7.根据权利要求6所述的富硒酵母中含硒蛋白的制备方法，其特征在于：所述葡聚糖凝胶柱条件参数为流速1 ml/min，洗脱液的缓冲液为100 mmol/LTris-HCl。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的富硒酵母中含硒蛋白的制备方法，其特征在于：包含以下步骤：（1）富硒酵母菌体浸泡在5~10倍体积的50-150 mmol/L，pH为7.4-7.8的Tris-HCl缓冲液中，高压均质破碎，破碎后5000-15000 rpm/min，2-6℃，离心15-45 min，收集上清；（2）向离心上清液中加入质量百分比75%~90%的硫酸铵，在3~5℃条件下磁力搅拌直至无蛋白沉淀产生，静置，然后5000-15000 rpm/min，2-6℃，离心15-45 min，收集沉淀，再用少了缓冲液溶解沉淀，将溶解后的溶液放入透析袋中，透析，直至蒸馏水中无SO4 2-，透析完毕；用聚乙二醇脱水浓缩至较小体积，真空冷冻干燥制得粗蛋白；（3）将粗蛋白干粉溶于少量Tris-HCl缓冲液，离心去除不溶物，上清液过0.22 μm的微孔滤膜后上葡聚糖凝胶柱，在流速为0.5-3 ml/min，检测波长为280 nm，洗脱液为50-150 mmol/LTris-HCl缓冲液条件下洗脱收集蛋白组分。
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| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20121114 |