CN102746413A - 蜂花粉多糖酶解破壁结合热水超声浸提方法 - Google Patents

Abstract

本发明是一种蜂花粉多糖酶解破壁结合热水超声浸提方法，包括以下步骤：将蜂花粉干燥、除杂、粉碎、过筛；酶解破壁；加热超声浸提；脱水；高氯酸除蛋白；二乙胺基乙基纤维素柱层析，洗脱；CTAB分离含酸性多糖沉淀和含中性多糖沉淀；溶解多糖深沉后经脱水、真空冷冻、干燥得到高纯度无杂质的蜂花粉多糖。本发明提取多糖比例提高66.03%，多糖得率高达18.54mg／g，比现有技术提取法提高了2.02倍；取得的蜂花粉多糖水相对茚三酮反应均呈阴性，无蛋白质残留,取得的蜂花粉多糖无杂质高纯度。

Description

蜂花粉多糖酶解破壁结合热水超声浸提方法

技术领域

本发明是一种蜂花粉多糖酶解破壁结合热水超声浸提方法，属化工技术领域。

背景技术

蜂花粉含有一定量的蛋白质、游离氨基酸、多种活性酶、多种维生素、核酸、矿物质、胡萝卜素、生长素、磷脂、糖类等营养成分，是一种无毒无副作用的纯天然高级绿色食品，被人们誉为营养素的浓缩体。现代研究证明，蜂花粉能够提成高机体T淋巴细胞（T淋巴细胞来源于胚肝或骨髓的原T细胞，在胸腺微环境中分化、发育，成熟后在外周血定居于淋巴组织；T细胞可介导细胞免疫应答，并辅助机体针对T细胞依赖性抗原产生体液免疫能力。）和巨噬细胞，具有提高血清免疫蛋白G（蛋白G具有高含量的人体免疫球蛋白，占总血清免疫球蛋白的80%左右，分子质量150kDa，是再次抗体应答中所产生的主要免疫球蛋白。）功能，增强人体机体免疫力，从而起到抑制肿瘤和抗癌作用，并且能够有效阻止放化疗损伤，保护人体机体。蜂花粉的生物活性与其含有丰富的多糖有着密切的关系，蜂花粉中的糖类主要是葡萄糖和果糖，还有双糖(麦芽糖和蔗糖)和多糖(淀粉、纤维素和果胶物质)。来源不同的蜂花粉中碳水化合物的含量也有差别，正常情况下，干蜂花粉所含碳水化合物中，平均值葡萄糖占9.9%、果糖占19%、总糖为31%、半纤维素为7.2%、纤维素为0.52%，其它成分所占比例不尽相同，不同植物品种对其含量有着直接影响。蜂花粉中含丰富的多糖，研究表明，从天然产物中分离出的多糖往往是一种免疫调节剂，它能激活免疫细胞，提高机体免疫功能，而对正常细胞没有毒和副作用。多糖作为免疫治疗药物正越来越受到重视，已经成为新药研究的热点之一；本发明的技术设计，是专用于蜂花粉多糖酶解破壁结合热水超声浸提方法。

蜂花粉多糖的提取现有技术：多糖是极性大分子化合物，易溶于水，不溶于乙醇。现有技术常见的多糖提取方法有：水提法、酸提法、碱提法、酶提法、超声提取法、微波提取法，目前研究中通常采用的方法是水提取法，因为这种方法具有不需要特殊设备、成本低等优点，但现有技术所述的水提法，未经酶解破壁，蜂花粉与水混合加热，细胞壁未完全破坏，提取效率低且费时；近几年来引入超声、微波提取法，提高了花粉多糖的提取效率，但是这些方法目前还仅限于实验室研究。

而酸提法、碱提法会引起多糖的水解，破坏多糖的立体结构和活性，而且对于酸碱的浓度确定也比较困难。因此这两种方法一般不应用于花粉多糖的提取。

现有技术蜂花粉多糖的脱蛋白方法有：Sevage脱蛋白法、NaOH脱蛋白法、TCA脱蛋白法和双氧水脱蛋白法，其方法都是一次脱蛋白，脱蛋白后的水茚三酮反应均呈阳性，结果表明多糖中仍有蛋白质残留，证明现有技术取得的蜂花粉多糖含有蛋白质。

专利号为2011103908202名称为五味子药渣中活性成分多糖的制备方法和专利号为2011103653237名称为一种石斛多糖的分离纯化方法 的两个发明中，都采用了Sevage脱蛋白法，其缺点是都需要用Sevage脱蛋白法重复脱蛋白5次左右，才能得到纯度较高的多糖，其操作步骤较繁琐。

发明内容

本发明的目的在于提供一种多糖提取效率高、脱蛋白效果好的蜂花粉多糖酶解破壁结合热水超声浸提方法。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案是该蜂花粉多糖酶解破壁结合热水超声浸提方法包括以下步骤：

a、将蜂花粉干燥、除杂和筛选后进行机械粉碎，粉碎后过筛，形成蜂花粉末；

b、在蜂花粉末中加入0.1%－1%质量的纤维素酶，再加入6－9倍质量的水，混合形成纤维素酶蜂花粉末混合液；

c、将所述纤维素酶蜂花粉末混合液加热至42度恒温90分钟；形成破壁后呈糊状的蜂花粉水溶液；

d、将所述破壁后呈糊状的蜂花粉水溶液加热至82度恒温，并用400W超声功率浸提，每次2.5小时，浸提2次；

e、将浸提后的蜂花粉水溶液与30%－40%质量的纯食用乙醇混合，静置24小时后分离将下层含蜂花粉多糖物质进行脱水、真空冷冻、干燥后形成蜂花粉粗多糖；

f、在蜂花粉粗多糖中加入30%-40%质量的高氯酸水溶液，充分混合后经离心、过虑除去蛋白质沉淀，取滤液得到一次脱蛋白蜂花粉粗多糖水溶液；

g、将一次脱蛋白蜂花粉粗多糖水溶液用二乙胺基乙基纤维素柱层析，依次用质量浓度为3%－6%的Na₂CO₃溶液和质量浓度为1%－3%的NaOH溶液进行洗脱，得到二次脱蛋白蜂花粉粗多糖水溶液；

h、在二次脱蛋白蜂花粉粗多糖水溶液中加入6%－9%质量的十六烷基三甲基溴化铵（简称CTAB），充分混匀后离心，取含酸性多糖沉淀；取滤液加入离子强度调节剂后离心过滤，取含中性多糖沉淀；

i、将蜂花粉酸性多糖沉淀和蜂花粉中性多糖沉淀用水溶解，然后脱水、真空冷冻、干燥后得到高纯度无杂质的蜂花粉多糖。

作为优选，所述的蜂花粉多糖酶解破壁结合热水超声浸提方法包括以下步骤：

a、将蜂花粉干燥、除杂和筛选后进行机械粉碎，粉碎后过筛，形成蜂花粉末；

b、在蜂花粉末中加入0.5%质量的纤维素酶，再加入9倍质量的水，混合形成纤维素酶蜂花粉末混合液；

c、将所述纤维素酶蜂花粉末混合液加热至42度恒温90分钟；形成破壁后呈糊状的蜂花粉水溶液；

d、将所述破壁后呈糊状的蜂花粉水溶液加热至82度恒温，并用400W超声功率浸提，每次2.5小时，浸提2次；

e、将浸提后的蜂花粉水溶液与1/3质量的纯食用乙醇混合，静置24小时后分离将下层含蜂花粉多糖物质进行脱水、真空冷冻、干燥后形成蜂花粉粗多糖；

f、在蜂花粉粗多糖中加入1/3质量的高氯酸水溶液，充分混合后经离心、过虑除去蛋白质沉淀，取滤液得到一次脱蛋白蜂花粉粗多糖水溶液；

g、将一次脱蛋白蜂花粉粗多糖水溶液用二乙胺基乙基纤维素柱层析，依次用质量浓度为5%的Na₂CO₃溶液和质量浓度为2%的NaOH溶液进行洗脱，得到二次脱蛋白蜂花粉粗多糖水溶液；

h、在二次脱蛋白蜂花粉粗多糖水溶液中加入9%质量的CTAB，充分混匀后离心，取含酸性多糖沉淀；取滤液加入离子强度调节剂后离心过滤，取含中性多糖沉淀；

i、将蜂花粉酸性多糖沉淀和蜂花粉中性多糖沉淀用水溶解，然后脱水、真空冷冻、干燥后得到高纯度无杂质的蜂花粉多糖。

本发明所述的i步骤中包括以下步骤: 

a、将含酸性多糖沉淀用水溶解后离心过滤，得到蜂花粉酸性多糖水溶液；将含中性多糖沉淀用水溶解后离心过滤，得到蜂花粉中性多糖水溶液；

b、将蜂花粉酸性多糖水溶液和蜂花粉中性多糖水溶液进行脱水、真空冷冻、干燥后得到高纯度无杂质的蜂花粉多糖。

做为优选，本发明所述的i步骤中包括以下步骤: 

a、将含酸性多糖沉淀和含中性多糖沉淀混合后用水溶解，离心过滤得到蜂花粉多糖水溶液；

b、将蜂花粉多糖水溶液进行脱水、真空冷冻、干燥后得到高纯度无杂质的蜂花粉多糖。

本发明二次脱蛋白蜂花粉粗多糖水溶液中含有蜂花粉酸性多糖和蜂花粉中性多糖。CTAB在低离子强度的溶液里，能沉淀核酸和酸性多聚糖，而蛋白质和中性多聚糖仍留在溶液里；在高离子强度的溶液里，与蛋白质和大多数酸性多聚糖以外的多聚糖形成复合物，只是不能沉淀核酸。CTAB复合物沉淀用水溶解后多糖类物质可重新溶解到水中，而蛋白质等其他大分子物质仍不溶解。利用上述的这些特性对二次脱蛋白蜂花粉粗多糖水溶液进行分离纯化。

本发明和现有技术相比具有以下优点：

1、本发明应用酶解破壁，其特征是蜂花粉与水和纤维素酶混合，在纤维素酶的作用下，使蜂花粉细胞壁得到酶解完全破坏融合在水中，形成破壁后呈糊状的蜂花粉的水溶液。而现有技术所述的水提法，未经酶解破壁，蜂花粉与水混合加热，细胞壁未完全破坏。所以本发明提取的多糖比与现有技术相比，提取多糖比例提高66.03%，多糖得率高达18.54mg／g，比现有技术提取法提高了2.02倍；

 2、本发明形成粗多糖后进行三次脱蛋白纯化多糖，取得的蜂花粉多糖水相对茚三酮反应均呈阴性，无蛋白质残留, 实现本发明取得无杂质高纯度的蜂花粉多糖。现有技术脱蛋白方法有：Sevage脱蛋白法、NaOH脱蛋白法、TCA脱蛋白法和双氧水脱蛋白法，其方法都是一次脱蛋白，脱蛋白后的水茚三酮反应均呈阳性，结果表明多糖中仍有蛋白质残留，证明现有技术取得的蜂花粉多糖含有蛋白质。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以下实施例是对本发明的解释而本发明并不局限于以下实施例。

实施例1：本实施例由以下步骤组成：

1、首先将蜂花粉进行干燥、除杂和筛选，机械粉碎后过筛，形成蜂花粉末；

2、在蜂花粉末中加入0.5%质量的纤维素酶，再加入9倍质量的水，混合形成纤维素酶蜂花粉末混合液； 

3、将纤维素酶蜂花粉末混合液进行加热，温度控制42度，酶分解反应时间90分钟；形成破壁后呈糊状的蜂花粉水溶液；

4、将破壁后呈糊状的蜂花粉水溶液进行加热，温度控制82度，超声功率400W，浸提2次，每次2.5小时，呈糊状的蜂花粉水溶液中的多糖在水溶液中完全分解；

5、在浸提后的蜂花粉水溶液中加入有机溶剂纯食用乙醇（蜂花粉水溶液与纯食用乙醇混合质量比为3：1）脱水，混合后形成分层，由于蜂花粉多糖易溶于水不溶于乙醇，使多糖重新析出到溶液的下层，静置分层时间控制24小时，分离后取下层物质真空冷冻，干燥后形成蜂花粉粗多糖；

6、蜂花粉粗多糖在常温中进行三次脱蛋白，其方法是：

一次脱蛋白是蜂花粉粗多糖与高氯酸水溶液混合（蜂花粉粗多糖与高氯酸水溶液混合质量比为3：1），强酸使蛋白质变性形成沉淀，通过离心除去蛋白质；取滤液得到一次脱蛋白蜂花粉粗多糖水溶液；

二次脱蛋白是将一次脱蛋白蜂花粉粗多糖水溶液中用二乙胺基乙基纤维素柱层析（柱层析是根据蛋白质混合物中不同蛋白组，在流动中经过多次反复分配，将不同蛋白组逐一分离），依次用浓度为5%的Na₂CO₃和浓度为2%的NaOH 进行洗脱，得到二次脱蛋白蜂花粉粗多糖水溶液；

三次脱蛋白是在二次脱蛋白蜂花粉粗多糖水溶液中加入9%质量的CTAB，充分混匀后离心，取含酸性多糖沉淀；取滤液加入离子强度调节剂后离心过滤，取含中性多糖沉淀；

7、将含酸性多糖沉淀和含中性多糖沉淀混合后用水溶解，离心过滤得到蜂花粉多糖水溶液；

8、将蜂花粉多糖水溶液进行脱水、真空冷冻、干燥后得到高纯度无杂质的蜂花粉多糖。

实施例2：本实施例由以下步骤组成：

1、首先将蜂花粉进行干燥、除杂和筛选，机械粉碎后过筛，形成蜂花粉末；

2、在蜂花粉末中加入0.1%质量的纤维素酶，再加入6倍质量的水，混合形成纤维素酶蜂花粉末混合液； 

3、将纤维素酶蜂花粉末混合液进行加热，温度控制42度，酶分解反应时间90分钟；形成破壁后呈糊状的蜂花粉水溶液；

4、将破壁后呈糊状的蜂花粉水溶液进行加热，温度控制82度，超声功率400W，浸提2次，每次2.5小时，呈糊状的蜂花粉水溶液中的多糖在水溶液中完全分解；

5、在浸提后的蜂花粉水溶液中加入30%质量的有机溶剂纯食用乙醇脱水，混合后形成分层，由于蜂花粉多糖易溶于水不溶于乙醇，使多糖重新析出到溶液的下层，静置分层时间控制24小时，分离后取下层物质真空冷冻，干燥后形成蜂花粉粗多糖；

6、蜂花粉粗多糖在常温中进行三次脱蛋白，其方法是：

一次脱蛋白是蜂花粉粗多糖与30%质量的高氯酸水溶液混合，强酸使蛋白质变性形成沉淀，通过离心除去蛋白质；取滤液得到一次脱蛋白蜂花粉粗多糖水溶液；

二次脱蛋白是将一次脱蛋白蜂花粉粗多糖水溶液中用二乙胺基乙基纤维素柱层析（柱层析是根据蛋白质混合物中不同蛋白组，在流动中经过多次反复分配，将不同蛋白组逐一分离），依次用浓度为3%的Na₂CO₃和浓度为1%的NaOH 进行洗脱，得到二次脱蛋白蜂花粉粗多糖水溶液；

三次脱蛋白是在二次脱蛋白蜂花粉粗多糖水溶液中加入6%质量的CTAB，充分混匀后离心，取含酸性多糖沉淀；取滤液加入离子强度调节剂后离心过滤，取含中性多糖沉淀；

7、将含酸性多糖沉淀和含中性多糖沉淀混合后用水溶解，离心过滤得到蜂花粉多糖水溶液；

8、将蜂花粉多糖水溶液进行脱水、真空冷冻、干燥后得到高纯度无杂质的蜂花粉多糖。

实施例3：本实施例由以下步骤组成：

1、首先将蜂花粉进行干燥、除杂和筛选，机械粉碎后过筛，形成蜂花粉末；

2、在蜂花粉末中加入1%质量的纤维素酶，再加入8倍质量的水，混合形成纤维素酶蜂花粉末混合液； 

3、将纤维素酶蜂花粉末混合液进行加热，温度控制42度，酶分解反应时间90分钟；形成破壁后呈糊状的蜂花粉水溶液；

4、将破壁后呈糊状的蜂花粉水溶液进行加热，温度控制82度，超声功率400W，浸提2次，每次2.5小时，呈糊状的蜂花粉水溶液中的多糖在水溶液中完全分解；

5、在浸提后的蜂花粉水溶液中加入40%质量的有机溶剂纯食用乙醇脱水，混合后形成分层，由于蜂花粉多糖易溶于水不溶于乙醇，使多糖重新析出到溶液的下层，静置分层时间控制24小时，分离后取下层物质真空冷冻，干燥后形成蜂花粉粗多糖；

6、蜂花粉粗多糖在常温中进行三次脱蛋白，其方法是：

一次脱蛋白是蜂花粉粗多糖与40%质量的高氯酸水溶液混合，强酸使蛋白质变性形成沉淀，通过离心除去蛋白质；取滤液得到一次脱蛋白蜂花粉粗多糖水溶液；

二次脱蛋白是将一次脱蛋白蜂花粉粗多糖水溶液中用二乙胺基乙基纤维素柱层析（柱层析是根据蛋白质混合物中不同蛋白组，在流动中经过多次反复分配，将不同蛋白组逐一分离），依次用浓度为6%的Na₂CO₃和浓度为3%的NaOH 进行洗脱，得到二次脱蛋白蜂花粉粗多糖水溶液；

三次脱蛋白是在二次脱蛋白蜂花粉粗多糖水溶液中加入8%质量的CTAB，充分混匀后离心，取含酸性多糖沉淀；取滤液加入离子强度调节剂后离心过滤，取含中性多糖沉淀；

7、将含酸性多糖沉淀和含中性多糖沉淀混合后用水溶解，离心过滤得到蜂花粉多糖水溶液；

8、将蜂花粉多糖水溶液进行脱水、真空冷冻、干燥后得到高纯度无杂质的蜂花粉多糖。

本发明二次脱蛋白蜂花粉粗多糖水溶液中含有蜂花粉酸性多糖和蜂花粉中性多糖。CTAB在低离子强度的溶液里，能沉淀核酸和酸性多聚糖，而蛋白质和中性多聚糖仍留在溶液里；在高离子强度的溶液里，与蛋白质和大多数酸性多聚糖以外的多聚糖形成复合物，只是不能沉淀核酸。CTAB复合物沉淀用水溶解后多糖类物质可重新溶解到水中，而蛋白质等其他大分子物质仍不溶解。利用上述的这些特性对二次脱蛋白蜂花粉粗多糖水溶液进行分离纯化。

本发明所述实施例中发实施例1效果最佳，本发明提取多糖比例提高66.03%，多糖得率高达18.54mg／g，比现有技术提取法提高了2.02倍；取得的蜂花粉多糖水相对茚三酮反应均呈阴性，无蛋白质残留,取得的蜂花粉多糖无杂质高纯度。

此外，需要说明的是，本说明书中所描述的具体实施例，其配比、工艺所取名称等可以不同。凡依本发明专利构思所述的构造、特征及原理所做的等效或简单变化，均包括于本发明专利的保护范围内。本发明所属技术领域的技术人员可以对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，只要不偏离本发明的结构或者超越本权利要求书所定义的范围，均应属于本发明的保护范围。

虽然本发明已以实施例公开如上，但其并非用以限定本发明的保护范围，任何熟悉该项技术的技术人员，在不脱离本发明的构思和范围内所作的更动与润饰，均应属于本发明的保护范围。

Claims (4)

1.一种蜂花粉多糖酶解破壁结合热水超声浸提方法，其特征在于包含以下步骤：

a、将蜂花粉干燥、除杂和筛选后进行机械粉碎，粉碎后过筛，形成蜂花粉末；

b、在蜂花粉末中加入0.1%－1%质量的纤维素酶，再加入6－9倍质量的水，混合形成纤维素酶蜂花粉末混合液；

c、将所述纤维素酶蜂花粉末混合液加热至42度恒温90分钟；形成破壁后呈糊状的蜂花粉水溶液；

d、将所述破壁后呈糊状的蜂花粉水溶液加热至82度恒温，并用400W超声功率浸提，每次2.5小时，浸提2次；

e、将浸提后的蜂花粉水溶液与30%－40%质量的纯食用乙醇混合，静置24小时后分离将下层含蜂花粉多糖物质进行脱水、真空冷冻、干燥后形成蜂花粉粗多糖；

f、在蜂花粉粗多糖中加入30%-40%质量的高氯酸水溶液，充分混合后经离心、过虑除去蛋白质沉淀，取滤液得到一次脱蛋白蜂花粉粗多糖水溶液；

g、将一次脱蛋白蜂花粉粗多糖水溶液用二乙胺基乙基纤维素柱层析，依次用质量浓度为3%－6%的Na₂CO₃溶液和质量浓度为1%－3%的NaOH溶液进行洗脱，得到二次脱蛋白蜂花粉粗多糖水溶液；

h、在二次脱蛋白蜂花粉粗多糖水溶液中加入6%－9%质量的十六烷基三甲基溴化铵，充分混匀后离心，取含酸性多糖沉淀；取滤液加入离子强度调节剂后离心过滤，取含中性多糖沉淀；

i、将蜂花粉酸性多糖沉淀和蜂花粉中性多糖沉淀用水溶解，然后脱水、真空冷冻、干燥后得到高纯度无杂质的蜂花粉多糖。

2.根据权利要求1所述的蜂花粉多糖酶解破壁结合热水超声浸提方法，其特征在于: 

a、将蜂花粉干燥、除杂和筛选后进行机械粉碎，粉碎后过筛，形成蜂花粉末；

b、在蜂花粉末中加入0.5%质量的纤维素酶，再加入9倍质量的水，混合形成纤维素酶蜂花粉末混合液；

c、将所述纤维素酶蜂花粉末混合液加热至42度恒温90分钟；形成破壁后呈糊状的蜂花粉水溶液；

d、将所述破壁后呈糊状的蜂花粉水溶液加热至82度恒温，并用400W超声功率浸提，每次2.5小时，浸提2次；

e、将浸提后的蜂花粉水溶液与1/3质量的纯食用乙醇混合，静置24小时后分离将下层含蜂花粉多糖物质进行脱水、真空冷冻、干燥后形成蜂花粉粗多糖；

f、在蜂花粉粗多糖中加入1/3质量的高氯酸水溶液，充分混合后经离心、过虑除去蛋白质沉淀，取滤液得到一次脱蛋白蜂花粉粗多糖水溶液；

g、将一次脱蛋白蜂花粉粗多糖水溶液用二乙胺基乙基纤维素柱层析，依次用质量浓度为5%的Na2CO3溶液和质量浓度为2%的NaOH溶液进行洗脱，得到二次脱蛋白蜂花粉粗多糖水溶液；

h、在二次脱蛋白蜂花粉粗多糖水溶液中加入9%质量的CTAB，充分混匀后离心，取含酸性多糖沉淀；取滤液加入离子强度调节剂后离心过滤，取含中性多糖沉淀；

i、将蜂花粉酸性多糖沉淀和蜂花粉中性多糖沉淀用水溶解，然后脱水、真空冷冻、干燥后得到高纯度无杂质的蜂花粉多糖。

3.根据权利要求1或2所述的蜂花粉多糖酶解破壁结合热水超声浸提方法，其特征在于所述的i步骤中包括以下步骤: 

a、将含酸性多糖沉淀用水溶解后离心过滤得到蜂花粉酸性多糖水溶液；将含中性多糖沉淀用水溶解后离心过滤得到蜂花粉中性多糖水溶液；

b、将蜂花粉酸性多糖水溶液和蜂花粉中性多糖水溶液进行脱水、真空冷冻、干燥后得到高纯度无杂质的蜂花粉多糖。

4.根据权利要求1或2所述的蜂花粉多糖酶解破壁结合热水超声浸提方法，其特征在于其特征在于所述的i步骤中包括以下步骤: 

a、将含酸性多糖沉淀和含中性多糖沉淀混合后用水溶解，离心过滤得到蜂花粉多糖水溶液；

b、将蜂花粉多糖水溶液进行脱水、真空冷冻、干燥后得到高纯度无杂质的蜂花粉多糖。