CN113214370A - 酿酒酵母单一含硒蛋白的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种酿酒酵母单一含硒蛋白的制备方法。步骤如下：克隆酿酒酵母中含有半胱氨酸的蛋白相对应的基因，连接到原核表达载体上，转入原核表达宿主；构建好的菌株活化后转接到新鲜的LB培养基中培养，冰上冷却，然后加入终浓度为0.1‑0.5mM的IPTG，培养10h，加入终浓度为0.5‑2.5mM的硒源培养0.5‑1h；收集菌体，去除上清，然后用BindingBuffer重悬细胞，超声破碎，4℃，6500‑8500G离心20‑40min，取上清，用镍柱纯化目的蛋白，洗脱液为Elution Buffer。本发明获得了酿酒酵母单一含硒蛋白，纯化后的蛋白纯度高，成本廉价，操作简单。

Description

酿酒酵母单一含硒蛋白的制备方法

技术领域

本发明属于微生物学和发酵工程领域，具体涉及一种酿酒酵母单一含硒蛋白的制备方法。

背景技术

硒是人体不可或缺的微量元素，缺硒会表现为脱发、脱甲等症状。随着科学技术的发展， 硒的生物学功能逐渐被发现，目前，已知的硒的生物学功能包括：抗氧化，抗衰老，保护和 修复细胞，提高人体免疫力，预防癌变等等。硒的这些生物学功能主要以硒蛋白来实现。硒 的存在形式可分为有机硒和无机硒，常见的无机硒包括硒酸盐，亚硒酸盐和硒化物等，常见 的有机硒包括硒代甲硫氨酸，硒代半胱氨酸和硒代胱氨酸等。无机硒很难被人体直接吸收发 挥微量元素硒的生物学功能，而有机硒可以。此外，无机硒毒性较大，不适合用于动物和人 食用。传统的获得酿酒酵母含硒蛋白的方法是通过对富硒酵母破壁，纯化后获得含硒蛋白， 但是由于酿酒酵母壁厚，采用破壁和化学提纯获得含硒蛋白的效率不高，而且蛋白容易失活， 极大的限制了硒蛋白的应用。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种酿酒酵母单一含硒蛋白的制备方法。

为实现上述目的，本发明提供一种酿酒酵母单一含硒蛋白的制备方法，其特征在于：采 用原核表达系统异源表达酿酒酵母中一个含有半胱氨酸的蛋白，添加硒源，收集样品纯化分 离获得酿酒酵母单一含硒蛋白，步骤如下：

(1)克隆酿酒酵母中含有半胱氨酸的蛋白相对应的基因，连接到原核表达载体上，转入 原核表达宿主；

(2)诱导表达蛋白后，添加硒源：

将构建好的菌株活化后转接到新鲜的LB培养基中，然后加入IPTG，再加入硒源培养；

(3)收集菌体，去除上清，然后用Binding Buffer重悬细胞，超声破碎，取上清，用镍 柱纯化目的蛋白，洗脱液为ElutionBuffer。

作为优选方案，采用的表达系统为原核表达系统。

进一步地，采用的原核表达菌株为大肠杆菌BL21(DE3)，表达载体为pET26b。

更进一步地，所述步骤(2)中诱导表达条件为37℃，200rpm培养1.5h，冰上冷却5-10 min，然后添加终浓度为0.1-0.5mM IPTG，16-22℃，120-150rpm培养10h；添加硒源后共孵育时间为0.5-1h，共孵育条件为37℃，200rpm。

更进一步地，所述步骤(2)中添加的IPTG终浓度为0.1-0.5mM；添加的硒源终浓度为 0.5-2.5mM；所述添加的硒源为亚硒酸钠或亚硒酸钾。

更进一步地，所述步骤(3)中采用细胞破碎方法为超声破碎，收集破碎后上清所用的离 心参数为4℃，6500-8500G，20-40min。

更进一步地，所述步骤(3)中采用纯化蛋白方法为镍柱纯化，洗脱液为ElutionBuffer： 300-500mM咪唑，20mM Tris-HCl，0.5M NaCl，pH 7.9。

更进一步地，所述步骤(1)中从酿酒酵母中选取含有半胱氨酸的蛋白RPL14B，依据酿 酒酵母rpl14b基因序列设计引物如下：

pET26b-RPL14B-NdeI-pf：其序列如SEQ 1所示；

pET26b-RPL14B-XhoI-pr：其序列如SEQ 2所示；

N1-pf：其序列如SEQ 3所示；

N2-pr：其序列如SEQ 4所示。

本发明酿酒酵母单一含硒蛋白的制备方法中，选取酿酒酵母中含有半胱氨酸的蛋白，在 原核系统中异源表达该单一蛋白，加入硒源，富硒后离心收集菌体，超声破碎，离心取上清， 镍柱纯化蛋白，获得单一含硒蛋白；具体步骤如下：

把目标蛋白对应的基因序列克隆到原核表达载体pET26b上，构建的含硒蛋白表达菌株培 养条件为37℃，200rpm培养1.5h，冰上冷却5-10min，然后添加终浓度为0.1-0.5mMIPTG， 16-22℃，120-150rpm培养10h，添加硒源。

添加的硒源为亚硒酸钠，亚硒酸钾中的一种，其添加终浓度为0.5-2.5mM，添加后孵育 时间为0.5-1h，共孵育条件为37℃，200rpm。然后离心收集菌体，所用的离心参数为4-22℃， 4500-8500G，10-30min。

菌体用15-30mLBinding Buffer(20mM Tris-HCl，0.5M NaCl，pH 7.9)溶液重悬，采用 超声破碎，收集破碎后可溶性蛋白所用的离心参数为4℃，6500-8500G，20-40min。

纯化蛋白的方法为镍柱纯化，洗脱液为Elution Buffer(300-500mM咪唑，20mMTris-HCl， 0.5M NaCl，pH 7.9)。

本发明具有如下优点及有益效果：

1、本发明实现了对酿酒酵母单一含硒蛋白的富集，提取，提供了一种可作为潜在补硒产 品的制备方法。

2、本发明获得了酿酒酵母单一含硒蛋白，纯化后获得的蛋白纯度高。

3、本发明建立了酿酒酵母蛋白在原核中富硒，从而获得酿酒酵母单一含硒蛋白的方法。

4、本发明生产单一含硒蛋白生产工艺简单，条件温和，周期短，具有商业推广价值。

附图说明

图1是pET26b-rpl14b质粒图谱。

图2是纯化后重组含硒蛋白RPL14B的SDS-PAGE图。

图3是重组含硒蛋白RPL14B液相色谱-质谱/质谱图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明做进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1：一种酿酒酵母蛋白异源表达载体的构建方法

从酿酒酵母中选取含有半胱氨酸的蛋白RPL14B，依据酿酒酵母rpl14b基因序列(GenBank: BK006943.1)设计引物：

pET26b-RPL14B-NdeI-pf：CCATATGTCCACTGATTCTATTGT，其序列如SEQ 1所示；

pET26b-RPL14B-XhoI-pr：CCTCGAGAGCCTTAGCCAAAGCCTTCTTG，其序列如SEQ 2所示；

N1-pf：GAAATTATCGACCAAAAGAAGGTTTTGATTGATGGTCCAAAAG，其序列如 SEQ 3所示；

N2-pr：CTTTTGGACCATCAATCAAAACCTTCTTTTGGTCGATAATTTC，其序列如SEQ 4所示。

采用PCR扩增获得rpl14b去除内含子的DNA片段，用Xho I和Nde I双酶切PCR产物和 pET26b载体，然后把纯化后的酶切产物在16℃条件下过夜连接，连接产物转入大肠杆菌DH5α 中，提取转化子测序，选择正确的转化子，提取载体命名为pET26b-rpl14b(如图1所示)进 行下一步实验。提取DH5α中的pET26b-rpl14b载体，转入大肠杆菌BL21(DE3)中，保藏 于中国典型培养物保藏中心；保藏单位代码：CCTCC；保藏单位地址：中国.武汉.武汉大学； 保藏编号CCTCC NO：M2021046；保藏日期：2021年1月11日；分类命名：大肠杆菌Escherichia coli BL21/pET26b-rpl14b，用于后续实验。

实施例2：RPL14B蛋白异源表达

采用实施例1的方法构建RPL14B蛋白异源表达菌株，活化后的BL21:pET26b-rpl14b菌 株，转接到新鲜的500mL LB培养基(蛋白胨1％，酵母提取物0.5％，氯化钠0.5％)中， 培养条件为37℃，200rpm培养1.5h，冰上冷却10min，然后添加终浓度为0.1mM IPTG，16℃，150rpm培养10h，然后添加终浓度为2.5mM的硒源，孵育0.5h。然后离心收集菌 体，所用的离心参数为4℃，8500G，15min。

实施例3：RPL14B含硒蛋白的纯化及含硒鉴定

采用实施例1的方法获得菌体，用Binding Buffer(20mM Tris-HCl，0.5M NaCl，pH7.9) 洗3次后，用15mLBinding Buffer溶液重悬，然后采用超声破碎，破碎参数为超声4s，间隔 3s，破碎500次，然后离心去上清，离心参数为4℃，8500G，20min。采用纯化蛋白方法为镍柱纯化，洗脱液为Elution Buffer(300-500mM咪唑，20mM Tris-HCl，0.5M NaCl，pH7.9)。 洗脱液用10KMWCO的超滤管离心浓缩，用Binding Buffer溶液洗3次，离心条件为4℃， 4000G，30min。纯化后的蛋白跑SDS-PAGE胶(如图2所示)，目的蛋白在SDS-PAGE电泳后 呈现单一条带，表明目的蛋白纯度高。纯化后的蛋白采用液相色谱-质谱/质谱(LC-MS/MS)连用鉴定，结果(如图3所示)表明获得的蛋白半胱氨酸(Cys)位点被替代为硒代半胱氨酸 (SeCys)，即成功的提取到了酿酒酵母含硒蛋白。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制， 其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应 为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 武汉大学

<120> 酿酒酵母单一含硒蛋白的制备方法

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 24

<212> DNA

<213> 正向引物(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 1

ccatatgtcc actgattcta ttgt 24

<210> 2

<211> 29

<212> DNA

<213> 反向引物(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 2

cctcgagagc cttagccaaa gccttcttg 29

<210> 3

<211> 43

<212> DNA

<213> 正向引物(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 3

gaaattatcg accaaaagaa ggttttgatt gatggtccaa aag 43

<210> 4

<211> 43

<212> DNA

<213> 反向引物(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 4

cttttggacc atcaatcaaa accttctttt ggtcgataat ttc 43

Claims (10)

1.一种酿酒酵母单一含硒蛋白的制备方法，其特征在于：采用原核表达系统异源表达酿酒酵母中一个含有半胱氨酸的蛋白，添加硒源，收集样品纯化分离获得酿酒酵母单一含硒蛋白，步骤如下：

(1)克隆酿酒酵母中含有半胱氨酸的蛋白相对应的基因，连接到原核表达载体上，转入原核表达宿主；

(2)诱导表达蛋白后，添加硒源：

将构建好的菌株活化后转接到新鲜的LB培养基中，然后加入IPTG，诱导蛋白表达，再加入硒源培养；

(3)收集菌体，去除上清，然后用BindingBuffer重悬细胞，超声破碎，取上清，用镍柱纯化目的蛋白，洗脱液为ElutionBuffer。

2.根据权利要求1所述酿酒酵母单一含硒蛋白的制备方法，其特征在于：采用的表达系统为原核表达系统。

3.根据权利要求1或2所述酿酒酵母单一含硒蛋白的制备方法，其特征在于：采用的原核表达菌株为大肠杆菌BL21(DE3)，表达载体为pET26b。

4.根据权利要求1或2所述酿酒酵母单一含硒蛋白的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)中诱导表达条件为37℃，200rpm培养1.5h，冰上冷却5-10min，然后添加终浓度为0.1-0.5mMIPTG，16-22℃，120-150rpm培养10h；添加硒源后共孵育时间为0.5-1h，共孵育条件为37℃，200rpm。

5.根据权利要求3所述酿酒酵母单一含硒蛋白的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)中诱导表达条件为37℃，200rpm培养1.5h，冰上冷却5-10min，然后添加终浓度为0.1-0.5mMIPTG，16-22℃，120-150rpm培养10h；添加硒源后共孵育时间为0.5-1h，共孵育条件为37℃，200rpm。

6.根据权利要求1或2或5所述酿酒酵母单一含硒蛋白的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)中添加的IPTG终浓度为0.1-0.5mM；添加的硒源终浓度为0.5-2.5mM；所述添加的硒源为亚硒酸钠或亚硒酸钾。

7.根据权利要求1或2或5所述酿酒酵母单一含硒蛋白的制备方法，其特征在于：所述步骤(3)中采用细胞破碎方法为超声破碎，收集破碎后上清所用的离心参数为4℃，6500-8500G，20-40min。

8.根据权利要求6所述酿酒酵母单一含硒蛋白的制备方法，其特征在于：所述步骤(3)中采用细胞破碎方法为超声破碎，收集破碎后上清所用的离心参数为4℃，6500-8500G，20-40min。

9.根据权利要求1或2或5或8所述酿酒酵母单一含硒蛋白的制备方法，其特征在于：所述步骤(3)中采用纯化蛋白方法为镍柱纯化，洗脱液为ElutionBuffer：300-500mM咪唑，20mMTris-HCl，0.5MNaCl，pH7.9。

10.根据权利要求9所述酿酒酵母单一含硒蛋白的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中从酿酒酵母中选取含有半胱氨酸的蛋白RPL14B，依据酿酒酵母rpl14b基因序列设计引物如下：

pET26b-RPL14B-NdeI-pf：其序列如SEQ1所示；

pET26b-RPL14B-XhoI-pr：其序列如SEQ2所示；

N1-pf：其序列如SEQ3所示；

N2-pr：其序列如SEQ4所示。

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